Báo cáo công nghệ vi sinh vật

Công nghệ VSV là công nghệ được phát triển dựa trên cơ sở kiến thức về giới VSV được áp dụng vào quy mô công nghiệp, với các quy trình công nghệ đặc trưng. Sản xuất SCP đòi hỏi phải vận dụng các kiến thức về lên men, công nghệ sản xuất sinh khối, nuôi cấy VSV.

CÔNG NGHỆ VI SINH VẬT

Chủ đề: Sản xuất protein đơn bào

Giảng viên hướng dẫn: PGS.TS Trần Quốc Dung

Học viên thực hiện:

Lớp: Thực vật học

Công nghệ vi sinh vật là gì?

 Trước khi có thuật ngữ Công nghệ sinh học VSV người ta đã nói đến VSV ứng dụng hay còn gọi là VSV công nghiệp, Công nghệ VSV hay Công nghệ lên men Đây là bộ phận lớn nhất của công nghệ sinh học, nó ra đời sớm nhất và có quá trình phát triển lâu dài nhất, có nhiều sản phẩm và doanh số lớn nhất

 Công nghệ VSV là công nghệ được phát triển dựa trên cơ sở kiến thức về giới VSV được áp dụng vào quy mô công nghiệp, với các quy trình công nghệ đặc trưng

Vai trò của protein đối với con người

 Protein là nguồn nito cho con người và động vật Protein cung cấp 20 loại acid amin cho con người.

 Về nhu cầu protein của người, nhiều nhà nghiên cứu cho biết dao động trong khoảng 80-120g/ngày.

I Các khái niệm chung

1 Protein đơn bào

 Protein đơn bào (Single-cell protein – SCP) là thuật ngữ thường dùng để chỉ phần protein thu được trong sinh khối khô của các tế bào hoặc tổng hợp protein tách chiết được từ môi trường nuôi cấy vi sinh vật, nấm men, nấm sợi, vi tảo; được sử dụng làm nguồn thức ăn cho con người hay thức

ăn chăn nuôi.

2 Công nghệ sản xuất protein đơn bào

 Công nghệ sản xuất SCP là công nghệ nuôi cấy và thu sinh khối các VSV Công nghệ sản xuất SCP bao gồm cả quá trình chuyển vị sinh học, biến đổi các sản phẩm phụ ít giá trị và chi phí thấp, thường là các chất thải, trở thành sản phẩm với giá trị dinh dưỡng và giá trị thị trường cao hơn.

 Sản xuất SCP đòi hỏi phải vận dụng các kiến thức về lên men, công nghệ sản xuất sinh khối, nuôi cấy VSV.

 Sản xuất SCP ở quy mô công nghiệp có một số đặc điểm như sau:

Sử dụng đa dạng các phương pháp, loại nguyên liệu thô và loại VSV khác nhau.

Có hiệu quả biến đổi cơ chất ban đầu cao.

Năng suất cao nhờ vào tốc độ tăng trưởng nhanh của các VSV.

Không phụ thuộc vào các yếu tố mùa hay thời tiết.

3 Đặc điểm của sản xuất protein đơn bào

 Chi phí lao động ít hơn nhiều so với sản xuất nông nghiệp

 Có thể sản xuất ở bất cứ địa điểm nào trên trái đất, không chịu ảnh hưởng của khí hậu thời tiết, các quá trình công nghiệp, dễ cơ khí hóa và tự động hóa

 Năng suất cao

 Sử dụng các nguồn nguyên liệu rẻ tiền và hiệu suất chuyển hóa cao

 Hàm lượng protein trong tế bào rất cao

 Chất lượng protein cao

 An toàn về mặt độc tố

 Những vấn đề về kĩ thuật: sinh khối của vi sinh vật phải được tách và xử lý

II Các nhóm VSV được sử dụng để sản xuất SCP

1 Yêu cầu đối với các chủng VSV sử dụng trong sản xuất

 Thời gian sinh trưởng ngắn.

 Có khả năng tạo thành lượng protein lớn.

 Có khả năng tận dụng tối đa các chất dinh dưỡng trong MTNC.

 Không có độc tố, không có khả năng gây bệnh.

 Có sức bền cao, ít bị nhiễm trong quá trình nuôi cấy, dễ tách khỏi

dịch nuôi cấy.

2 Các nhóm VSV sử dụng trong sản xuất SCP

 Người ta sử dụng nhiều nhóm VSV khác nhau để sản xuất protein đơn bào, bao gồm:

Các nhóm vi khuẩn: Cellulomonas,

Nấm men: Candida, Saccharomyces,

Nấm sợi: Trichoderma, Fusarium, Rhizopus,

Các nhóm tảo: Spirulina, Chlorella,

Cellulomonas Saccharomyces Rhizopus

Chlorella

Thành phần Nấm Tảo Nấm men Vi khuẩn

Bảng 1 Trung bình các thành phần trong tế bào ở các nhóm VSV

chính (% khối lượng khô) theo Miller và Litsky (1976) [6]

Bảng 2 VSV và chất nền được dùng để sản xuất SCP

(Bhalla et al (2007)) [6]

Bacillus subtilis, Cellulomonas sp.,

Flavobacterium sp Thermomonospora fusca Cellulose, Hemicellulose

Methylomonas methylotrophus, M clara Methanol

Pseudomonas fluorescens Uric acid and other non-protein nitrogenous

compounds

Bảng 2 VSV và chất nền được dùng để sản xuất SCP

(Bhalla et al (2007)) [6]

Aspergillus fumigatus Maltose, Glucose

Aspergillus niger, A oryzae, Cephalosporium

eichhorniae, Chaetomium cellulolyticum Cellulose, Hemicellulose

Penicillium cyclopium Glucose, Lactose, Galactose

Rhizopus chinensis Glucose, maltose

Scytalidium aciduphlium, Thricoderma

viridae, Thricoderma alba Cellulose, Pentose

Bảng 2 VSV và chất nền được dùng để sản xuất SCP

(Bhalla et al (2007)) [6]

Amoco torula Ethanol

Candida tropicalis Maltose, Glucose

Candida utilis Glucose

Candida novellas n-alkanes

Candida intermedia Lactose

Saccharomyces cereviciae Lactose, pentose, maltose

Bảng 2 VSV và chất nền được dùng để sản xuất SCP

(Bhalla et al (2007)) [6]

Chlorella pyrenoidosa, Chlorella sorokiana,

Chondrus crispus, Scenedesmus sp., Spirulina sp.,

Porphyrium sp.

Carbone dioxide

3 Các nguồn nguyên liệu dùng để sản xuất SCP

 Các sản phẩm thải trong nông nghiệp

 Các sản phẩm phụ của các quá trình lên men công nghiệp

 Các sản phẩm, dịch chiết và dịch thủy phân từ nguyên liệu thực vật

 Các nguồn nguyên liệu có giá trị thương mại cao như khí đốt, methan, methanol và các n-alkan

III Quy trình sản xuất SCP

 Bước chuẩn bị:

lựa chọn loại VSV có giai đoạn sinh lý phù hợp.

khử trùng MTNC và các thiết bị dùng để giữ môi trường nuôi ở trạng thái sẵn sàng.

tách tế bào.

thu các tế bào ở phần dịch nổi.

tinh chế và xử lý, bộ ổn nhiệt để điều hòa nhiệt độ, dụng cụ xác định pH

và các thiết bị điều khiển khác để điều hòa các yếu tố cần thiết cho sự sinh trưởng ở mức độ ổn định.

III Quy trình sản xuất protein đơn bào

 Bước nuôi cấy: nuôi cấy VSV ở điều kiện thích hợp trong môi trường đã chuẩn bị

 Yêu cầu: kiểm soát nồng độ carbon ở mức độ thích hợp như cung cấp

đủ oxi để duy trì điều kiện hiếu khí.

 Các phương pháp thường được áp dụng: lên men nổi, lên men chìm và lên men trên pha rắn.

III Quy trình sản xuất protein đơn bào

 Bước sau nuôi cấy : cần thu sinh khối của VSV Hiện này có nhiều phương pháp để cô đặc dịch nuôi cấy như lọc, để lắng, li tâm và dùng các màng bán thấm

 Yêu cầu: việc loại bỏ lượng nước là rất cần thiết → giữ các chất ổn định để lưu trữ Protein đơn bào cần được sấy khô đến độ ẩm 10% hoặc làm cô đặc lại và biến tính để đề phòng chúng bị hỏng.

1 Nguyên liệu và xử lý nguyên liệu

 Các dạng nguyên liệu chứa carbohydrate thường là các phụ phẩm và chế phẩm sau:

Các sản phẩm chứa saccharose của công nghiệp chế biến đường (rỉ đường mía, rỉ đường củ cải, bã mía, cặn rỉ đường, nước rửa thô )

Nước thải của các nhà máy sữa còn chứa nhiều lactose.

Dịch kiềm sulfit có chứa nhiều pentose, hexose, dịch thủy phân gỗ.

Các nguyên liệu chứa tinh bột và xellulose khác.

 Rỉ đường được dùng để làm cơ chất cho nhiều quá trình lên men vì:

Giá thành rẻ hơn các nguyên liệu chứa đường khác.

Ngoài saccharose, rỉ đường còn chứa một số chất vô cơ, hữu cơ và các vitamin có giá trị.

Bảng 4 Thành phần của rỉ đường củ cải và rỉ đường mía

50 – 110

5000 – 8000 Khoảng 1,3

48 – 56

9 – 12

2 – 4 1,5 – 5,0 0,4 – 0,8 0,06 0,6 – 2,0 1,0 – 3,0

15 – 55

2500 – 6000

1,8

Xử lý rỉ đường:

Thông thường rỉ đường được oxi hóa bằng acid sulfuric tới pH=4 và đun nóng tới

120-1500C trong 1 phút để kết tủa một số chất vô cơ và chất lửng Cần phải loại bỏ một phần các chất sinh trưởng, đồng thời bổ sung các muối khoáng cần thiết (ure 0,15%, HK2PO40,35%, Mg, Ca) và có thể phải thêm hỗn hợp các acid amin dạng protein thủy phân

Khi chuẩn bị phối trộn, rỉ đường phải được sử lý tách biệt trong các khâu pha loãng, điều chỉnh pH, đun nóng, làm trong, khử trùng

Thanh trùng ở nhiệt độ 1200C

nấm men C.utilis và C.pseudotropical rất thích hợp trong môi trường trên.

1.3 Chủng nấm men

 Đối với nguyên liệu là rỉ đường, dung dịch đường, nấm men thường dùng là Saccharomyces

cerevisiae, Candidas utilis.

 Đối với nguyên liệu là tinh bột hay nước thải tinh bột, dùng chủng nấm men tương ứng là

Endomycopis fibuligera hoặc phối hợp giữa Endomycopis với Candidas tropicalis.

Endomycopis fibuligera

2 Lên men

 Lên men trong bioreactor được thông khí tốt cần phá bọt, trong dịch lên men diễn ra quá trình truyền khối, truyền nhiệt, tăng sinh khối tế bào và điều chỉnh hoạt tính sinh học.

2.1 Các thiết bị trước lên men

 Bể hay bồn (tank) chứa cơ chất ban đầu.

 Thiết bị làm gãy vụn và nghiền nguyên liệu thô.

 Thiết bị để xử lý nguyên liệu như đường hóa bột.

 Thiết bị để trộn nguyên liệu và pha chế môi trường nuôi.

 Thiết bị khử trùng.

Thiết bị nồi lên men 10 lít

2.2 Bioreactor

 Bioreactor là vật chứa các tế bào, chiết xuất tế bào hay các enzyme thực hiện phản ứng sinh học Thiết kế bioreactor phải đảm bảo vô trùng và cung cấp tiết kiệm nguyên liệu Ngoài ra bồn còn thỏa mãn các yêu cầu:

Hình: Hệ thống nhân giống (bioreactor) 100m3

2.3 Các thiết bị sau lên men

 Thiết bị tách tế bào: các bồn lắng, các loại máy ly tâm, bộ lọc ép hay lọc chân không trống quay

 Thiết bị phá vỡ tế bào: thu nhận các sản phẩm nội bào

 Thiết bị cô đặc: làm bốc hơi, lọc màng, trao đổi ion, hấp thu

 Thiết bị dùng cho các phản ứng tạo sản phẩm

2.4 Vận hành quy trình lên men

 Nhân giống

 Các thông số kĩ thuật của bioreactor

 Các phương thức lên men

 Điều khiển phản ứng sinh học

 Thu sản phẩm và tinh chế

2.4.1 Nhân giống

 Trong giai đoạn đầu của quá trình lên men phải tạo điều kiện cho sự sinh sản của VSV đạt số lượng nhất định Đối với quy mô nhỏ từ 10 l – 20 l trong phòng thí nghiệm có thể sử dụng giống nuôi từ bình Erlenmeyer

 Trong sản xuất quy mô công nghiệp: người ta thường sử dụng chuỗi các bồn lên men Tiến trình: ống giống được giữ ở nhiệt độ thấp → nuôi với 10ml môi trường → nuôi 20ml → nuôi 3 lít → nuôi 30 lít → 300 lít và có thể hơn

Hệ thống lên men 5 lít Smax GX

2.4.2 Các thông số kĩ thuật của bioreactor

 Oxygen hòa tan: cần được cung cấp liên tục, thường là khí vô trùng Không được sục khí vào và khuấy đều trong dung tích của bioreactor Cần có thiết bị theo dõi lượng oxygen hòa tan

 Nhiệt độ: nếu như nhiệt độ dưới mức tối ưu thì VSV phát triển chậm → sản phẩm tạo thành hạn chế Nếu nhiệt độ quá cao → chết tế bào → giảm năng suất tạo thành sản phẩm

 pH ~ 5-7: trong lên men, các sản phẩm trao đổi chất giải phóng vào môi trường có thể làm thay đổi pH dịch lên men → cần theo dõi và điều chỉnh.

 Khuấy trộn đều môi trường nuôi cấy → ảnh hưởng đến tỉ lệ trao đổi oxygen và làm gia tăng nhiệt độ do ma sát

2.4.3 Các phương thức lên men

 Lên men gián đoạn: môi trường nuôi cho vào một lần vào bồn lên men, cấy giống

và thực hiện lên men đến thu sản phẩm

 Lên men gián đoạn bổ sung dinh dưỡng: khi nguồn dinh dưỡng ban đầu giảm, có thể bổ sung thêm

 Lên men liên tục: nguồn dinh dưỡng ban đầu được bổ sung liên tục và dịch lên men được lấy bớt ra liên tục → bioreactor ở trạng thái ổn định → sản phẩm tạo ra tốt hơn

2.4.4 Điều khiển phản ứng sinh học

 Ở giai đoạn đầu cần các điều kiện cho tế bào sinh sản nhanh để tạo sinh khối lớn

 Ở giai đoạn sau các tế bào được khống chế để thực hiện tối đa các phản ứng mong muốn

2.4.5 Thu sản phẩm và tinh chế

 Thu sản phẩm là công việc tốn kém Các kĩ thuật của công nghệ hóa học, công nghệ thực phẩm được sử dụng chủ yếu ở bước này Cần tách nước của tế bào ra khỏi sản phẩm Tiếp theo, từ dịch lên men thu đúng sản phẩm mong muốn

2.5 Chế biến SCP thành thực phẩm

 Để sử dụng hiệu quả các protein VSV làm thức ăn cho người, cần các điều kiện sau:

 Giải phóng protein tế bào bằng cách phá hủy hay thủy phân thành tế bào

 Làm giảm hàm lượng acid nucleic trong tế bào

2.5.1 Phá hủy thành tế bào

Xử lý hóa học: dùng acid, base, cơ chất hòa

Phân giải bằng enzyme: enzyme thủy phân,

dùng phage, tự thủy phân Nghiền ướt, sử dụng các hạt nghiền, dùng sóng âm để phá hủy tế bào, nén tế bàoDùng các phương pháp vật lý: làm đông

lạnh – để tan, sốc thẩm thấu, dùng nhiệt và

sấy khô

Dùng áp suất sao ở nhiệt độ thấp

Bảng: Một số phương pháp thường sử dụng để phá hủy thành tế bào VSV

2.5.2 Loại bỏ acid nucleic

 Một số phương pháp:

Tách acid nucleic bằng rượu, muối, acid và kiềm.

Tách acid nucleic khỏi sinh khối VSV bằng kiềm ở nhiệt độ cao, tuy nhiên phương pháp này có thể tạo ra chất độc (lysinoalanine).

Xử lý bằng anhydrid để biến đổi cấu trúc nucleoprotein ở nấm men.

Sử dụng các enzyme nuclease để phân giải acid nucleic.

2.6 Ưu nhược điểm của SCP

 Ưu điểm:

 VSV có tốc độ nhân đôi và tăng trưởng nhanh, thu sinh khối trong thời gian ngắn

 VSV có hàm lượng protein tương đối cao

 Các VSV có khả năng sử dụng một số nguồn carbon phong phú để tạo thành năng lượng, trong đó có một số nguyên liệu được tái sử dụng từ nguồn chất thải nông nghiệp hay công nghiệp

 Các chủng VSV với năng suất cao cũng như thành phần chất dinh dưỡng phù hợp có thể được chọn lọc và nuôi cấy với số lượng lớn trong điều kiện PTN, đồng thời cũng

có tiềm năng áp dụng ở quy mô công nghiệp

 Sinh khối VSV dùng để thu SCP không phụ thuộc vào mùa cũng như biến đổi khí hậu

Nhược điểm:

 Nhiều loài VSV có thể tạo ra các chất gây độc cho cơ thể người và động vật Vì vây, khi lựa chọn một loài VSV để tiến hành sản xuất phải đảm bảo nó không chứa bất kì chất độc nào

 Đôi khi sử dụng sinh khối VSV làm nguồn thức ăn bổ sung có thể dẫn đến khó tiêu hoặc không tiêu hóa được, thậm chí gây phản ứng dị ứng cho con người

 Hàm lượng acid nucleic cao trong sinh khối khô của nhiều loài VSV cũng là một yếu tố gây ảnh hưởng không mong muốn cho con người Quá trình hấp thụ acid nucleic quá mức → lắng đọng acid uric, gây ra một số bệnh như gout hay hình thành sỏi thận

 Có khả năng chứa các hợp chất gây độc hay gây ung thư cho con người

KẾT LUẬN

 Các VSV có nhiều ưu điểm thuận lợi cho nuôi quy mô lớn công nghiệp trong bioreactor Quá trình lên men công nghiệp gồm 3 công đoạn chủ yếu: trước lên men, lên men và sau lên men Sản xuất lớn cần hệ thống thiết bị tương ứng với các công đoạn của quy trình công nghệ Bioreactor là thiết bị trung tâm có cấu tạo thích hợp để bảo đảm tốt các điều kiện cho sự phát triển của giống sản xuất

 Các sản phẩm của công nghệ lên men VSV gồm các nhóm: sinh khối tế bào, các enzyme, các sản phẩm tái tổ hợp gen

 Trong tương lai, CNSH VSV sẽ tiếp tục phát triển với nhiều ứng dụng mới nhằm giải quyết vấn đề trọng đại như biến sinh khối thực vật thành nguồn năng lượng hay SCP

để giải quyết nạn thiếu hụt protein của nhân loại

Tài liệu tham khảo

1. Trần Hoàng Dũng, 2012, Sản xuất protein trong y học, Nxb Trường Đại học Nguyễn Tất

Thành, khoa Công nghệ sinh học

2. Phạm Thành Hổ, 2005, Nhập môn công nghệ sinh học, Nxb Giáo dục

3. Biền Văn Minh (Chủ biên), 2013, Giáo trình Vi sinh vật học công nghiệp, Nxb ĐHQG

Hà Nội

4. Vũ Văn Vụ, Nguyễn Mộng Hùng, Lê Hồng Điệp (2010), Công nghệ sinh học, NXB

Giáo dục Việt Nam

5. A.T Nasseri, S Rasoul-Amini, M.H Morowvat and Y Ghasemi, 2011 single Cell

Protein: Production and Process American Journal of Food Technology, 6: 103-116