BÀI TẬP CUỐI KỲ THỰC PHẨM CHỨC NĂNG

Phân tích vai trò sinh học của hợp chất chức năng trong thực phẩm chức năng  Vai trò của polyphenol Người ta đã chỉ ra rằng việc tiêu thụ polyphenol hạn chế sự phát triển của các tổn th

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP TP HCM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM

ccc

-BÀI TẬP CUỐI KỲ MÔN: THỰC PHẨM CHỨC NĂNG

POLYPHENOL NẤM MÈO CHIẾT XUẤT ETANOL

Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 17 tháng 11 năm 2021

1 Phân tích vai trò sinh học của hợp chất chức năng trong thực phẩm chức năng

 Vai trò của polyphenol

Người ta đã chỉ ra rằng việc tiêu thụ polyphenol hạn chế sự phát triển của các tổn thương mảng xơ vữa bằng cách ức chế quá trình oxy hóa lipoprotein tỷ trọng thấp, được coi là cơ chế chính trong sự hình thành tổn thương nội mô Tuy nhiên, những phát hiện mới cho thấy rằng polyphenol độc lập với các hoạt động chống oxy hóa thông thường của chúng có thể tạo ra các tác dụng có lợi tiềm năng Chúng cải thiện sự tồn tại của tế bào và bảo vệ chống lại sự độc tế bào bằng cách ức chế quá trình chết rụng, điều chỉnh tích cực

sự tăng sinh tế bào, nhưng cũng gây ra quá trình chết rụng và ngăn chặn sự phát triển của

khối u [8]

Polyphenol cũng đã được chứng minh là có tác dụng bảo vệ chống lại bệnh tim mạch vành Polyphenol có thể giảm hấp thu cholesterol, sự giảm hấp thụ này sẽ dẫn đến giảm phân phối cholesterol đến gan bởi tàn dư chylomicron, do đó sẽ điều chỉnh mRNA

của gan cho thụ thể LDL và giảm cholesterol huyết tương [12]

Polyphenol có thể phát huy các tác dụng chống ung thư thông qua nhiều cơ chế, bao gồm loại bỏ các tác nhân gây ung thư, điều chỉnh tín hiệu tế bào ung thư và tiến triển chu

kỳ tế bào, thúc đẩy quá trình chết rụng và điều chỉnh các hoạt động của enzyme Ngày càng có nhiều quan tâm đến tiềm năng của polyphenol trong việc cải thiện trí nhớ, khả năng học tập và nhận thức chung Tác động của polyphenol đối với nhận thức và chống lại các quá trình thoái hóa thần kinh dường như được thông qua sự tương tác của chúng với các con đường tín hiệu thần kinh và thần kinh đệm ảnh hưởng đến sự biểu hiện gen

và can thiệp vào cơ chế chết của tế bào [11]

Polyphenol có tác động lớn đến sức khỏe và phòng chống bệnh tật Người ta hiểu rằng với vai trò là chất chống oxy hóa, polyphenol có thể bảo vệ các thành phần cấu tạo

tế bào chống lại tác hại của quá trình oxy hóa và hạn chế nguy cơ mắc các bệnh thoái hóa khác nhau liên quan đến stress oxy hóa Theo các báo cáo hiện nay, số lượng các nghiên cứu trên người điều tra tác dụng bảo vệ của polyphenol đã tăng lên nhanh chóng trong thập kỷ qua và nhận thức khoa học ngày càng tăng Polyphenol có thể hoạt động như chất

ức chế enzyme hoặc chất khử enzyme cho telomerase, cycloxygenase và lipoxygenase

[10]

 Cơ chế giảm cholesterol trong máu của chiết xuất polyphenol của nấm mèo [7],[9]

Mức cholesterol trong máu được biết đến là phản ánh tình trạng khỏe mạnh của cơ thể con người, và nhiều yếu tố như stress oxy hóa, chế độ ăn giàu cholesterol (CED) và rối loạn chức năng chuyển hóa lipid có thể dẫn đến mức cholesterol bất thường Mức cholesterol trong máu được biểu thị bằng ba chỉ số là cholesterol toàn phần (TC), lipoprotein cholesterol tỷ trọng thấp (LDL-C) và lipoprotein cholesterol tỷ trọng cao (HDL-C) Do đó, để xác định hạ cholesterol máu thì hầu như sử dụng các chỉ số trên để đánh giá

Chế độ ăn uống giàu cholesterol dường như sẽ tạo ra các gốc tự do, tiếp theo là stress oxy hóa và tăng cholesterol máu, chẳng hạn như làm giảm hoạt động của catalase

và superoxide dimutase (SOD - là enzyme giúp chuyển đổi những superoxide ảnh hưởng trong cơ thể thành các nhóm chất tốt hơn, khi kết hợp với các enzyme nội sinh như catalase thúc đẩy sản xuất chống oxy hóa, có tác dụng ngăn chặn quá trình oxy hóa) và

do đó làm tăng hàm lượng lipid peroxide (oxy hóa lipid trong cơ thể, đẩy nhanh các quá trình oxy hóa), dẫn đến việc sản xuất các chất trung gian độc hại

Với việc sử dụng chiết xuất etanol giàu polyphenol của nấm mèo (AAE) làm giảm đáng kể mức độ lipid peroxide, tăng cường các hoạt động của superoxide dimutase gan Cùng với đó, khi sử dụng polyphenol nấm mèo chiết xuất etanol sẽ giảm hoạt động của HMG-CoA reductase (là enzym giới hạn tốc độ trong quá trình sinh tổng hợp cholesterol) xúc tác sự hình thành mevalonate dẫn đến ức chế tổng hợp cholesterol Cholesterol có thể được bài tiết vào mật trực tiếp hoặc sau khi chuyển hóa thành axit mật Tổng hợp axit mật chỉ xảy ra ở gan, và cholesterol 7α-hydroxylase là enzym giới hạn tỷ lệ đầu tiên trong con đường này và cũng có vai trò trong chuyển hóa cholesterol

AAE sẽ kích hoạt cholesterol 7α-hydroxylase có tác dụng trong việc giảm cholesterol thông qua chuyển cholesterol thành 7α-hydroxylcholesterol (là tiền chất của axit mật, sự hình thành nó là quyết định cho tốc độ của tiến trình tạo axit mật) và đây là bước đầu trong việc tổng hợp thành axit mật ở gan Từ đó đã cho thấy rằng chức năng giảm cholesterol có thể được thực hiện thông qua việc chuyển đổi cholesterol thành axit mật trong gan

2 Thuộc tính sản phẩm

Quy trình tách chiết: [7]

- Thuyết minh quy trình:

Nấm mèo ở dạng khô được chuẩn bị đem đi nghiền và sàng qua lưới lọc (40-60 mắt lưới) sẽ thu được bột khô Bột này mang đi ngâm trong 6 lít etanol (75%) và được hồi lưu trong 2 giờ ở 80°C Quy trình này được lặp lại ba lần và huyền phù được lọc qua giấy lọc (Whatman số 2) để loại bỏ các dư lượng không tan trong etanol như chất xơ và các hợp chất polysaccharide sẽ thu được chất lỏng

Hình 1: Sơ đồ quy trình tách chiết AAE

Chiết xuất AAE

Cô đặc và đông khô

Lắng đọng Trích ly

Chiết với etanol nguyên chất

Cô đặc

Dư lượng Lọc

Hồi lưu bằng etanol Nghiền và sàng Nấm mèo dạng khô

Chất lỏng này được cô đặc trong thiết bị cô quay dưới áp suất giảm Dung dịch đậm đặc sau khi thu nhận được chiết bằng etanol nguyên chất trong 24 giờ ở 4°C (tỷ lệ dung dịch đậm đặc so với etanol là 1:4) Sau đó, tiến hành trích ly để loại bỏ các chất lắng đọng còn lại như chất xơ hòa tan trong nước, polysaccharide và các thành phần protein Dịch chiết etanol được cô đặc trong thiết bị cô quay dưới áp suất giảm và sau đó được làm đông khô Chế phẩm này được đặt tên là polyphenol nấm mèo chiết xuất etanol (AAE)

- Các yếu tố ảnh hưởng:

 Lọc

Vật liệu lọc: mỗi loại vật liệu lọc khác nhau sẽ cho hiệu quả lọc khác nhau Diện

tích màng lọc: tốc độ lọc tỉ lệ thuận với diện tích màng lọc Mặt khác, diện tích màng lọc

càng nhỏ thì lượng tạp chất đọng lại càng nhiều làm tăng độ dày của màng, và vì thế sự tăng tốc độ lọc theo thời gian càng nhanh

 Cô đặc

Khi áp suất hơi trên bề mặt sản phẩm càng thấp thì nhiệt độ sôi của sản phẩm càng thấp Vì vậy việc tạo được độ chân không trong thiết bị cô đặc sẽ giảm được nhiệt độ sôi của sản phẩm Khi nồng độ chất khô càng lớn thì nhiệt độ sôi càng cao Trong quá trình

cô đặc, nồng độ chất khô tăng dần nên nhiệt độ sôi của sản phẩm cũng tăng dần Nhiệt độ sôi thấp thì tính chất sẽ ít bị biến đổi

Thời gian cô đặc phụ thuộc vào phương pháp làm việc của thiết bị và cường độ bốc hơi của sản phẩm Các thiết bị cho nguyên liệu vào, sản phẩm ra liên tục và sản phẩm có cường độ bốc hơi lớn thì thời gian lưu lại của sản phẩm trong thiết bị càng ngắn

Cường độ bốc hơi của sản phẩm phụ thuộc vào cường độ trao đổi nhiệt giữa hơi nóng và sản phẩm bốc hơi Cường độ trao đổi nhiệt được đặc trưng bằng hệ số truyền nhiệt của quá trình cô đặc Hệ số truyền nhiệt càng lớn thì cường độ bốc hơi càng cao

 Trích ly

Nhiệt độ sẽ làm suy yếu các tương tác phenol-protein và phenol-polysaccharide trong nguyên liệu thực vật từ đó tốc độ khuếch tán của polyphenol từ bên trong nguyên liệu ra ngoài dung môi nhiều hơn Tuy nhiên, nâng nhiệt độ lên đến một mức độ nào đó

có thể làm phân hủy đồng thời các chất chống oxy hóa

Thời gian trích ly kéo dài làm tăng nguy cơ phân hủy và oxy hóa polyphenol do tiếp xúc lâu với các yếu tố môi trường không thuận lợi như nhiệt độ, ánh sáng và oxy Mặt

khác, thời gian trích ly lâu làm mất thời gian cũng có khả năng làm mất dung môi bằng cách bốc hơi trực tiếp ảnh hưởng đến tỷ lệ giữa nguyên liệu và dung môi

Dự kiến:

- Thuyết minh quy trình:

Chiết xuất AAE sau khi được tách chiết sẽ tiến hành phối trộn thêm phụ liệu, sau đó định hình (viên nén), đóng gói và cho ra sản phẩm là viên nén chiết xuất nấm mèo Ở bước phối trộn phụ liệu, sử dụng một số phụ liệu không gây ảnh hưởng đáng kể đến thành phần cũng như tác dụng của sản phẩm

Tá dược được thêm vào nhằm đảm bảo khối lượng, đồng thời cải thiện độ trơn chảy, khả năng chịu nén và điều hòa sự hòa tan cho viên nén Tuy nhiên, nếu dùng loại tá dược không phù hợp, hoặc tỷ lệ không chính xác, thời điểm và phương pháp sử dụng tá dược không hợp lý thì chúng sẽ ảnh hưởng ngược lại đến chất lượng sản phẩm

Với dược chất không tan trong nước thì tá dược tan trong nước như các đường lactose, sorbitol, … có thể cải thiện tính thấm và tăng hấp thu Còn với các dược chất dễ tan trong nước thì việc sử dụng các tá dược không tan trong nước như các dẫn chất cellulose sẽ giúp điều hòa sự hòa tan, làm giảm tốc độ hấp thu và đảm bảo độ bền cho viên nén

Sản phẩm

Đóng gói Định hình (viên nén) Phối trộn phụ liệu

Chiết xuất AAE

Hình 2: Sơ đồ quy trình sản xuất dự kiến

Bên cạnh đó, để viên nén tránh khỏi các yếu tố gây ảnh hưởng đến chất lượng như

ẩm, ánh sáng, không khí có thể sử dụng lớp bao phim phủ bên ngoài Việc sử dụng lớp bao phim này có ý nghĩa trong việc duy trì hình dạng, đường nét của viên nén; bao phim tan ở dạ dày 2 – 5 %, tan ở ruột 5 – 15%

Tá dược bao được sử dụng với rất nhiều mục đích khác nhau như để bảo vệ, che đi mùi vị cũng như hỗ trợ tăng tính thẩm mỹ Một số phụ liệu có thể sử dụng là các loại đường mía nhằm bảo vệ sản phẩm mà không ảnh hưởng đến đặc tính của sản phẩm

 Thuộc tính sản phẩm

Sản phẩm viên nén chiết xuất nấm mèo sau khi hoàn thành sẽ có nhiều hình dạng khác nhau như hình tròn, hình trứng, hình thuôn,… Mỗi viên sẽ có trọng lượng là 250mg, mang màu sắc đặc trưng của nguyên liệu và không có mùi Tuy nhiên, trong quá trình phủ lớp bao phim để tránh hư hỏng sản phẩm thì màu sắc bên ngoài có thể thay đổi nhưng bên trong viên nén vẫn giữ được màu sắc tự nhiên vốn có của nấm mèo là màu nâu nhạt

Đối với việc đóng gói và bảo quản Sản phẩm sẽ được cho vào trong lọ có chèn thêm bông, gói hút ẩm và nút đậy Nắp được vặn chặt và phải được bảo quản ở nơi có điều kiện tốt và đặc biệt là tránh ánh nắng trực tiếp

3 Các nguyên tắc chung trong nghiên cứu và phát triển thực phẩm chức năng

Mỗi loại thực phẩm chức năng bất kể là sản phẩm nào đi chăng nữa, trước khi được công bố ra thị trường tiêu thụ chúng phải được tiến hành các thử nghiệm lâm sàng để đảm bảo về độ an toàn cho những nhà tiêu dùng đã tin tưởng mà sử dụng Khi việc thử nghiệm lâm sàng đã hoàn tất và thu thập được những thông tin cần thiết, phù hợp với tiêu chí sản phẩm thì sẽ tiến hành nộp hồ sơ công bố thực phẩm chức năng Trong đó, những yêu cầu về đăng ký bản công bố hợp quy, báo cáo kiểm nghiệm hiệu quả về công dụng, kết quả kiểm nghiệm, ghi nhãn và quảng cáo sản phẩm phải phù hợp theo quy định của luật thực phẩm chức năng đã ban hành trước đó  

Mô hình thí nghiệm: [7]

Theo Chen, G và cộng sự (2011) đã đưa ra mô hình nghiên cứu rằng chiết xuất

ethanol của Auricularia auricula (AAE) có tác dụng hạ cholesterol máu đáng kể, cải

thiện tình trạng chống oxy hóa, giảm mức cholesterol toàn phần, chỉ số xơ vữa động mạch, tăng mức độ cholesterol lipoprotein mật độ cao và sự bài tiết qua phân của axit

mật Nghiên cứu giúp chứng minh AAE ngăn ngừa tăng cholesterol trong máu chứa các hợp chất polyphenol

 Chuẩn bị

- Nguyên liệu: viên nén AAE được nghiền thành bột

- Động vật thử nghiệm: chuột đực 5 tuần tuổi

- Số lượng thí nghiệm: 36 con chuột

- Điều kiện: Các con vật được nhốt vào lồng nhựa trong phòng có chu kỳ sáng - tối (8:8), nhiệt độ 23 ± 2oC và độ ẩm 55 ± 5%

 Phân nhóm và mô hình hóa

Những con chuột sau khi chuẩn bị sẽ được nuôi thích nghi trong một tuần bằng chế

độ ăn thường xuyên và bổ sung nước Vào tuần thứ hai sẽ được chia ngẫu nhiên thành ba nhóm, mỗi nhóm bao gồm 12 con chuột như sau:

Nhóm I được đặt tên là EG, nhóm thực nghiệm này cho ăn chế độ ăn giàu

cholesterol (CED) và 150 mg bột viên nén AAE.

Nhóm II được đặt tên là RD, được cho ăn chế độ ăn bình thường

Nhóm III được đặt tên là CEDC, nhóm này được bố trí chỉ cho ăn chế độ giàu cholesterol (CED)

Vào tuần thứ 8 – cuối giai đoạn thử nghiệm, các mẫu phân của mỗi nhóm được thu thập, đông khô và đem đi bảo quản ở nhiệt độ trước khi sử dụng Sau đó, gan được cắt

bỏ, mang đi cân và bảo quản ở nhiệt độ -80oC cho đến khi phân tích

 Phương pháp tiến hành

- Lấy mẫu máu:

Vào tuần thứ 2, 4, 6 và 8 của giai đoạn thử nghiệm, các mẫu máu được lấy bằng cách sử dụng ống mao dẫn không gây mê, sau 16 giờ nhịn ăn Các mẫu máu được đặt trong một ống nhựa và ủ ở 37oC trong 15 phút, sau đó tiến hành ly tâm trong 8 phút với tốc độ 4.000 vòng/phút Các mẫu huyết thanh sau đó được bảo quản ở -20oC cho đến khi phân tích

- Phân tích lipid huyết thanh và gan:

Cấu hình lipid huyết thanh bao gồm cholesterol toàn phần (TC), lipoprotein-cholesterol mật độ thấp (LDL-C), lipoprotein-lipoprotein-cholesterol mật độ cao (HDL-C) và triglycerid (TG) được xét nghiệm bằng cách sử dụng bộ dụng cụ enzyme Sau đó sẽ tiến hành xác định chỉ số xơ vữa (AI)

Lipid gan được chiết xuất từ 300 mg gan của chuột với chloroform: methanol (2: 1) theo phương pháp của Folch và cộng sự Sau khi chiết, 1 ml dịch chiết sẽ được làm khô dưới dòng nitơ Các cặn lipid khô được hòa tan trong nước cất Cholesterol toàn phần (TC) và triglycerid (TG) gan được phân tích với cùng một bộ enzyme như trên để phân tích huyết thanh

- Xác định tình trạng chống oxy hóa gan:

Tổng khả năng chống oxy hóa (TAC) được xác định trong các chất đồng nhất của gan và được đo bằng phản ứng của phenanthroline và Fe2+ bằng máy quang phổ ở bước sóng 520 nm

Đối với phép đo SOD, các gốc superoxide được tạo ra bởi NADPH và phenazine methosulfate (PMS) trong điều kiện không có acid và được đo ở bước sóng 560 nm

- Hoạt động của HMG-CoA reductase ở gan:

Hoạt động của HMG-CoA reductase ở chuột được xác định bằng phương pháp của Edwards và cộng sự Các microsome gan phân lập được trộn với một lượng tương đương 50% glycerol trong dung dịch đệm phosphat Microsome gan dùng để chỉ các cấu trúc được hình thành bởi các tế bào gan, phụ trách các biến đổi trao đổi chất quan trọng liên quan đến bộ máy enzyme của mạng lưới nội chất

Huyền phù được đồng nhất và ủ ở 37oC trong 60 phút để có thể hòa tan HMG-CoA reductase Hoạt tính của HMG-CoA reductase thu được bằng cách thử nghiệm enzyme trong dung dịch đệm photphat cùng một số hóa chất phù hợp và được xác định ở 37oC bằng quang phổ kế

- Xác định cholesterol trung tính trong phân và axit mật:

Cholesterol trung tính trong phân được chiết xuất và phân tích theo phương pháp của Martensson Mẫu phân được đồng nhất với 2 ml hỗn hợp gồm NaOH 10 mol/l và ethanol 96% (1: 2) và giữ ở 70oC trong 45 phút Các mẫu được làm mát đến nhiệt độ phòng sau đó ly tâm ở 1000 × g trong 5 phút Phần nổi phía trên được loại bỏ và chiết bằng n-hexan ba lần Các pha hexan kết hợp được rửa bằng ethanol 70% cho đến khi trung tính để phân tích cholesterol trung tính

Các pha thấp hơn được axit hóa bằng HCl và chiết bằng chloroform: methanol (2:1)

để phân tích axit mật Cholesterol và coprostanol được phân tích bằng sắc ký khí Tổng

số cholesterol trung tính được biểu thị bằng phần trăm tổng số cholesterol trong phân cộng với coprostanol Steroid có tính axit trong phân được xác định bằng một bộ enzyme

 Thu thập thông tin

- Trọng lượng cơ thể, lượng thức ăn và hiệu quả cho ăn.

- Lipid huyết thanh và cấu hình chỉ số xơ vữa.

- Cấu hình lipid gan.

- Tình trạng chống oxy hóa gan.

- Hoạt động của HMG-CoA reductase ở gan.

- Bài tiết cholesterol trung tính và axit mật qua phân.

Luật thực phẩm chức năng

Như vậy, để sản phẩm thực phẩm chức năng có thể được công bố và bán ra thị trường thì phải đáp ứng được các yêu cầu sau:

- Để có thể kinh doanh thực phẩm chức năng phải có giấy chứng nhận cơ sở đủ điều kiện an toàn thực phẩm theo quy định tại Thông tư số 26/2012/TT-BYT Thành phần hồ

sơ xin giấy chứng nhận cơ sở đủ điều kiện an toàn vệ sinh thực phẩm bao gồm: [1]

+ Đơn đề nghị cấp Giấy chứng nhận cơ sở đủ điều kiện an toàn vệ sinh thực phẩm

+ Giấy chứng nhận đăng ký kinh doanh thực phẩm chức năng

+ Bản thuyết minh về cơ sở vật chất, trang thiết bị, dụng cụ bảo đảm điều kiện an toàn vệ sinh thực phẩm

+ Giấy xác nhận tập huấn kiến thức về an toàn vệ sinh thực phẩm của chủ cơ sở và người trực tiếp kinh doanh

+ Giấy xác nhận đủ sức khoẻ chủ cơ sở và của người trực tiếp kinh doanh thực phẩm chức năng

- Quá trình thực hiện trình tự, hồ sơ công bố sản phẩm hợp quy và công bố phù hợp quy định an toàn thực phẩm đối với sản phẩm thực phẩm chức năng nhập khẩu và sản xuất trong nước được thực hiện đúng điều lệ Những quy định đó phải phù hợp với điều

6, điều 7 của Nghị định Chính phủ và các điều 4, 5, 7, 9 của Bộ Y tế [2],[6]

- Báo cáo thử nghiệm hiệu quả về công dụng: Sản phẩm phải thử nghiệm hiệu quả

về công dụng đối với sức khỏe con người và việc thử nghiệm này phải được thực hiện tại

các tổ chức có chức năng nghiên cứu khoa học về y học [4]

- Việc kiểm nghiệm thực phẩm chức năng để công bố phù hợp quy định an toàn thực phẩm và kiểm nghiệm định kỳ phải tuân thủ các quy định tại Thông tư

số 19/2012/TT-BYT hướng dẫn việc công bố hợp quy và công bố phù hợp quy định an