BÀI tập CUỐI kỳ học PHẦN hóa SINH học THỰC PHẨM NGUỒN gốc và PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN ENZYME POLYPHENOL OXIDASE từ lá TRÀ XANH

Mục tiêu nghiên cứu Polyphenol oxidase PPO là enzyme phân bố rộng rãi trong tự nhiên, có nhiều trong cácloài thực vật, động vật và vi sinh vật, xúc tác quá trình oxi hóa hợp chất phenol

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HCM

KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

BÀI TẬP CUỐI KỲ HỌC PHẦN HÓA SINH HỌC THỰC PHẨM

NGUỒN GỐC VÀ PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN ENZYME

POLYPHENOL OXIDASE TỪ LÁ TRÀ XANH

SVTH: NHÓM 20

TP HỒ CHÍ MINH, 2022

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HCM

KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

BÀI TẬP CUỐI KỲ HỌC PHẦN HÓA SINH HỌC THỰC PHẨM

NGUỒN GỐC VÀ PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN ENZYME

POLYPHENOL OXIDASE TỪ LÁ TRÀ XANH

SVTH: NHÓM 20

TP HỒ CHÍ MINH, 2022

LỜI CAM ĐOAN

Chúng tôi cam đoan “Bài tập cuối kỳ học phần Hóa sinh học thực phẩm” này là do chính chúng tôi thực hiện

Các nội dung trình bày trong bài tập là trung thực, không sao chép Các tài liệu tham khảo sử dụng trong bài được trích dẫn nguồn và chú thích rõ ràng

TP Hồ Chí Minh, tháng 1 năm 2022

SINH VIÊN THỰCớ HIỆN

NhNguyễn Thị Ngọc Nhớ

Trân

Lê Thị Bảo Trân

MỤC LỤC

DANH MỤC HÌNH ẢNH

DANH MỤC BẢNG BIỂU

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

MỞ ĐẦU

1 Mục tiêu nghiên cứu

Polyphenol oxidase (PPO) là enzyme phân bố rộng rãi trong tự nhiên, có nhiều trong cácloài thực vật, động vật và vi sinh vật, xúc tác quá trình oxi hóa hợp chất phenol thànhquinon với sự tham gia của oxi nguyên tử Hiện nay có rất nhiều công trình nghiên cứutrong và ngoài nước về PPO, các kết quả nghiên cứu cho thấy PPO thu nhận từ các nguồnkhác nhau có nhiều tính chất khác nhau Tốc độ hóa nâu của enzym được phản ánh bởilượng polyphenol oxidase hoạt động có trong thực phẩm đã tác động trực tiếp đến giá trịcảm quan, chất lượng của trái cây, rau củ Hầu hết các nghiên cứu điều tra phương pháp

để ức chế sự hóa nâu của enzym đều tập trung vào việc cản trở hoạt động của polyphenoloxidase mà dần quên những tác động có lợi của enzyme này trong công nghiệp thựcphẩm nói chung và trong quy trình chế biến, sản xuất trà nói riêng Ở Việt Nam cũngchưa có công trình nghiên cứu về phương pháp thu nhận PPO từ lá trà xanh

Xuất phát từ thực tiễn trên, nhóm chúng em tiến hành thực hiện nghiên cứu đề tài:

“Nguồn gốc và phương pháp thu nhận enzyme Polyphenol Oxidase từ lá trà xanh” từ

đó làm tiền đề khảo sát các hoạt tính của PPO trên cơ sở ứng dụng tính chất có lợi củaenzyme trong tạo màu cho thực phẩm, đồng thời kiềm chế tác hại của enzyme gây hiệntượng sẫm màu ở rau quả

2 Nội dung đề tài

Nội dung nghiên cứu bao gồm:

- Khái quát chung, thành phần và công dụng của cây trà

- Đặc điểm, phân loại và ứng dụng của enzyme PPO

- Nguồn thu nhận enzyme PPO

- Phương pháp thu nhận và các lưu ý trong trích ly chế phẩm enzyme

3 Bố cục báo cáo

Bài tập lớn được chia thành 3 mục chính:

Chương 1: Tổng quan

Chương 2: Nguồn gốc enzyme

Chương 3: Phương pháp thu nhận enzyme

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Cây trà

1.1.1 Giới thiệu chung

Cây trà có tên khoa học là Camellia sinensis, có nguồn gốc phát sinh ở miền

núi phía Nam Trung Quốc, Bắc Ấn Độ, miền Bắc Việt Nam Ngày nay, cây tràđược trồng phổ biến ở nhiều nơi trên thế giới, trong các khu vực nhiệt đới và cậnnhiệt đới Trà là loại cây xanh lưu niên mọc thành bụi hoặc các cây nhỏ, thôngthường được xén tỉa để chiều cao thấp hơn 2 mét khi được trồng để lấy lá Hoa củacây trà màu trắng ánh vàng, đường kính từ 2,5 – 4 cm, với 7 – 8 cánh hoa (1)

Hình 1.1 Lá trà tươi

1.1.2 Thành phần hóa học

Cây trà là cây công nghiệp có giá trị, thường từ khi trồng đến khi thu hoạchbúp trà và lá trà non là 3-5 năm và thời gian khai thác có thể lên đến 30 năm.Những thành phần chính ảnh hưởng đến các thông số công nghệ và chất lượng củatrà thành phẩm gồm độ ẩm, lượng caffein, polyphenol, các hợp chất nitơ, các sắc

tố, đặc biệt là hệ enzyme oxi hóa khử trong lá trà Trong lá trà tươi hàm lượng ẩmthường chiếm tỉ lệ 75 – 80% tùy thuộc vào độ non của lá trà (2; 3)

Trong lá trà có hai nhóm enzyme quan trọng trong quá trình sinh trưởng vàchế biến trà là nhóm enzyme oxi hóa khử và nhóm enzyme thủy phân Nhómenzyme thủy phân giữ vai trò quan trọng trong sự phân giải các hợp chất phức tạp,

đa phân tử, không hòa tan thành các chất có phân tử thấp và hòa tan góp phần làmtăng chất hòa tan trong trà và các chất này là tiền chất cho sự tạo thành các chấtmới tạo hương vị đặc trưng cho trà Nhóm enzyme oxi hóa khử gồm 2 enzyme là

polyphenol oxydase và peroxidase có vai trò đặc biệt trong chế biến trà, cơ chấtđặc hiệu của 2 enzyme này là polyphenol và tanin, ngoài ra chúng còn oxi hóađược purogallon, axit galic, purocathesol Sản phẩm của quá trình oxi hóa bởipolyphenol oxidase là theaflalin, thearubigin và các cấu tử tạo màu sắc và hương

vị nước trà, sản phẩm của quá trình oxi hóa bởi peroxidase là cathesol sẽ ngưng tụvới nhau theo từng cặp tạo hương vị cho trà (3)

Nhiều quan sát dịch tễ học nghiên cứu về việc tiêu thụ trà xanh có tác độngđáng kể đến các bệnh ung thư ở người Theo đánh giá của Carmen Cabrera vàcộng sự về việc sử dụng trà xanh ngăn ngừa các bệnh ung thư như sau: ung thưđường tiêu hóa, tuyến tụy ở Nhật Bản, ung thư buồng trứng ở Trung Quốc; ungthư miệng, họng và thanh quản ở phía bắc Italy, Thượng Hải; ung thư dạ dày, ởNhật Bản, phía nam Thổ Nhĩ Kỳ và Thụy Điển Tại Nhật Bản cũng đã nghiên cứu,những người tiêu thụ hơn 10 tách trà mỗi ngày sẽ giảm thiểu được các nguy cơ vềung thư phổi, gan, ruột kết, ung thư vú ở phụ nữ và ung thư tuyến tiền liệt ở namgiới (4)

Hình 1.2 Các loại trà thông dụng hiện nay

1.2 Enzyme Polyphenol Oxidase (PPO)

1.2.1 Đặc điểm

Polyphenol oxidase (PPO) là một metalloprotein có chứa nguyên tố đồng vàthuộc nhóm enzyme oxi hóa khử, xúc tác phản ứng oxi hóa hợp chất phenolic tạo sảnphẩm quinone, hình thành màu nâu trong trái cây và rau củ bị tổn thương. (5)

PPO có liên quan đến sự hình thành các sắc tố, sự loại phân tử oxy và cơ chếphòng thủ chống lại các tác nhân gây bệnh và côn trùng ở thực vật Vì cơ chấtphenolic của PPO là những tiền chất quan trọng hình thành nên rào cản vật lý, hạnchế sự lây lan mầm bệnh Ngoài ra, các hợp chất quinone hình thành sau xúc táccủa PPO có thể liên kết với các protein thực vật, làm giảm sự tiêu hóa protein từ

đó làm giảm giá trị dinh dưỡng của các loại động vật ăn cỏ

1.2.2 Tính chất:

PPO có trọng lượng phân tử khác nhau phụ thuộc vào nguồn enzyme,phương pháp tách chiết và tinh sạch enzyme (6) Trọng lượng phân tử chung củaPPO từ thực vật được chấp nhận khoảng 144,000 Da ; của nấm lớn khoảng128,000 Da Trong khi đó một số loại nấm khác có trọng lượng phân tử vàokhoảng 46,000 – 88,000 Da Ở động vật có vú rất ít tương đồng về trọng lượngphân tử của PPO (7) pH tối ưu cho hoạt động của PPO tùy thuộc vào nguồn củaenzyme có giá trị thay đổi từ 4 – 8 Nhiều thông số ảnh hưởng đến giá trị pH tối

ưu bao gồm : dung dịch đệm, độ tinh sạch enzyme, các giai đoạn phát triển vànguồn gốc của trái cây và rau củ Nghiên cứu pH tối ưu cho hoạt động của PPO cóthể cung cấp những thông tin cho việc nhận biết sự hoạt hóa và các gốc ion quan

trọng cho sự ngưng kết cơ chất và biến dưỡng (Kuby, 1991) Sự thay đổi pH trongdung dịch phản ứng gây bất hoạt PPO do sự thay đổi trong trạng thái ion củachuỗi amino acid liên quan trong phản ứng xúc tác, sự thay đổi trạng thái ion của

cơ chất, sự thay đổi trạng thái cân bằng của phản ứng liên quan đến H+ hay OH- (8)PPO thu nhận từ các nguồn khác nhau được nghiên cứu về pH tối ưu, nhiệt độ tối

ưu, trọng lượng phân tử, điểm đẳng điện và đặc tính động học của enzyme (9)

1.2.3 Phân loại

PPO có 3 dạng chính tùy thuộc vào cơ chất đặc hiệu và cơ chế phản ứng của

enzyme bao gồm tyrosinase, catechol oxidase và laccase (10).

Tyrosinase (E.C.1.14.18.1) là enzyme monooxygenase có chứa nguyên tốđồng, xúc tác 2 phản ứng khác nhau với sự có mặt phân tử oxy: o-hydroxyl hóa cơchất monophenol thành o-diphenol (hoạt tính monophenolase hoặc cresolase) vàquá trình oxy hóa tiếp theo chuyển o-diphenol thành o-quinone nhờ enzymediphenolase hay catecholase (8)

Hình 1.3 Cơ chế phản ứng của tyrosinaseCatechol oxidase (E.C.1.10.3.1) được biết với tên khác là o-diphenoloxidase, xúc tác phản ứng oxy hóa o - diphenol thành o-quinone tương ứng với sựtham gia phân tử oxy Tương tự như enyzme tyrosinase, vị trí tâm xúc tác củaenzyme catechol oxidase cũng gồm cặp ion Cu (CuA và CuB) Chính đặc điểm đónên enzyme catechol oxidase được xếp vào nhóm protein đồng “type-3” bao gồm

cả tyrosinase và heamocyanin Tuy nhiên không giống như tyrosinase, enzymecatechol oxidase thiếu hoạt tính hydroxylase nên vì thế không sử dụngmonophenol làm cơ chất (8)

Hình 1.4 Cơ chế phản ứng catechol oxidaseLaccase (E.C.1.10.3.2) thuộc nhóm enzyme oxidase có phổ cơ chất rất đadạng, xúc tác loại bỏ hydro từ nhóm hydroxil của monophenol, diphenol,polyphenol, dẫn xuất phenol, hợp chất phi phenol.

laccasePhân tử laccase là một glycoprotein (dimeric hay tetradimeric), mỗi monomerchứa khoảng 500 aminoacid và có trọng lượng phân tử khoảng 50-100 kDa Laccase

có chứa 4 nguyên tử đồng ở trung tâm hoạt động có vai trò quan trọng trong hoạtđộng xúc tác, các nguyên tử đồng được chia làm ba nhóm thành ba vùng oxi hóa khử

là vùng nguyên tử đồng T1, T2, T3 Vùng nguyên tử đồng T1 tham gia chủ yếu trongviệc nhận điện tử và truyền đến các vị trí khác Vùng nguyên tử đồng T2, T3 hìnhthành trung tâm gồm 3 nguyên tử đồng làm nhiệm vụ kích hoạt liên kết và chuyểnđiện tử với O2 tạo thành nước (8)

1.2.4 Chức năng sinh học

Ở động vật, tyrosinase có vai trò trong tạo sắc tố của da, tóc, mắt bởi sự tổnghợp melanin Ở người PPO hoạt động quá nhiều hay quá ít là nguyên nhân của cácbệnh quan trọng như bệnh bạch tạng, bệnh đốm lang trắng hay khối u ác tính (10)

Ở côn trùng sự hóa cứng của biểu bì là quá trình quan trọng trong mỗi giai đoạn pháttriển để làm cứng và ổn định bộ xương ngoài Hoạt động laccase xúc tác cho sự oxi hóacác hợp chất catechol với các protein màng đóng vai trò quan trọng trong hình thành bộxương ngoài (10)

Ở thực vật bị tổn thương, enzyme oxi hóa hợp chất phenolic hình thành cấutrúc polymer bảo vệ thực vật chống lại côn trùng và vi sinh vật là nguyên nhân tạomàu nâu của trái cây và rau củ làm giảm chất lượng của thực phẩm Ngoàityrosinase, laccase có vai trò quan trọng ở thực vật, chúng tham gia vào quá trình

hóa gỗ của vách tế bào thực vật nhờ liên kết các monomer phenolic làm tăng độ cứng của thân và các bộ phận khác của thực vật (10)

Ở nấm, PPO mà đặc biệt là laccase có vai trò quan trọng trong sự phân giải lignin, hình thành bào tử và sắc tố nấm, phân giải chất độc, … (10)

Ở vi khuẩn, PPO có vai trò quan trọng trong hình thành melanin Melanin,một sắc tố polyphenolic, có tác dụng bảo vệ bào tử và tế bào vi khuẩn chống lại sựoxi hóa, các gốc tự do và tia UV (10)

1.2.5 Ứng dụng

PPO có khả năng oxi hóa các hợp chất thơm nên enzyme này được ứngdụng trong công nghiệp thực phẩm, công nghiệp giấy và bột giấy, công nghiệp dệtmay, công nghệ y học, mỹ phẩm và môi trường Sự quan tâm gần đây tập trungvào sử dụng peroxidase và PPO trong việc loại bỏ hợp chất phenolic từ nước thảicông nghiệp Laccase cố định có khả năng loại bỏ các chất ô nhiễm phenol vàchlorophenol PPO được sử dụng trong điều trị bệnh Parkinson do PPO xúc tácphản ứng cung cấp đủ lượng dopamine cho bệnh nhân mắc bệnh Parkinson (11;10)

CHƯƠNG 2: NGUỒN GỐC ENZYME PPO

2.1 Từ thực vật

PPO được tìm thấy trong phần lớn các mô của thực vật như táo (Harel et al.,1964), nho (Ivanov, 1966), lê (Rivas and Wtaker, 1973), khoai tây (Craft, 1966),trà (Zawistoski et al., 1991), hạt cacao, cà phê… ; trong vi sinh vật bao gồm vikhuẩn và nấm (Vamas-Vigyazo, 1981) ; trong động vật như côn trùng(Sugumaran, 1988; 1990), động vật chân khớp, động vật có vú và người (Witkop,1985) Vị trí của PPO trong tế bào thực vật phụ thuộc vào loài, độ tuổi và độ chíncủa trái cây và rau củ (12) Trong thực vật PPO là enzyme nằm trong thể hạt, tuynhiên khi trái cây, rau củ bị tổn thương hay lão hóa PPO ở dạng tự do trong tế bàochất Nhiều nghiên cứu cho biết gen mã hóa cho PPO có mức độ biểu hiện caotrong các cơ quan khi còn non và không biểu hiện trong mô trưởng thành PPO cóthể tìm thấy trong nhiều dạng thể hạt khác nhau như hạt bột (khoai tây), thể hạttrong biểu bì, thể hạt trong rễ, lục lạp của lá (8)

2.2 Từ động vật

Trong động vật như côn trùng (Sugumaran, 1988; 1990) , động vật chân khớp, động vật có vú và người (Witkop, 1985).

Ở động vật PPO được tìm thấy trong ti thể của tế bào biểu bì tạo sắc tố, trong tôn hùm PPO được tách chiết từ lớp da nằm giữa cơ và xương ngoài (8)

đó trà trồng trong bóng dâm có nồng độ polyphenols nhỏ và nồng độ axit amin caohơn Búp và lá đầu tiên của trà có nồng độ polyphenols cao nhất và giảm dần ở các ládưới Ước tính có khoảng 30.000 hợp chất polyphenolic trong trà Khi thành tế bàotrong lá trà bị phá vỡ, hai enzyme này làm xúc tác cho quá trình polyphenol oxy hóavới oxy trong không khí, khiến lá trà chuyển sang màu nâu

Polyphenol oxidase và polyphenol có trong lá chè nên khi bị dập, cắt, thái, thì sự phối hợp giữa các giai đoạn oxi hóa và khử của sự hô hấp bị phá vỡ, các o-quinon được tạo thành do sự õi hóa các polyphenol có thể trùng hợp với axitamin,amin để hình thành các sản phẩm cos màu, đây là nguyên nhân gây hiện tượngthâm đen khi vò lá chè

Việc này xảy ra với hầu hết các loại thực phẩm tự nhiên, trong đó có trà Tuynhiên, người làm trà từ ngàn xưa đã biết lợi dụng việc này để làm ra các loại tràlên men như trà đen chẳng hạn Trà đen là loại trà được lên men hoàn toàn, ngườilàm trà sau khi hái sẽ để lá trà lên men tự nhiên bằng cách ủ để thúc đẩy quá trìnhnày Các enzyme hoá nâu hoạt động mạnh nên lá trà dần chuyển từ xanh sang nâu,màu nâu đỏ đặc trưng của trà đen chính là được “nhuộm” từ hai enzyme này

Tương tự như các enzym khác làm xúc tác khiến táo, khoai tây, bơ và chuốichuyển sang màu nâu Polyphenol oxidase và Peroxidase có thể bị biến tính hoặckhử hoạt tính bằng cách sử dụng nhiệt để không thể xảy ra hiện tượng hóa nâu

Trong thực tế, đây là một trong những bước đầu tiên trong sản xuất trà xanh;

đó là lý do tại sao lá trà xanh thành phẩm vẫn giữ được màu xanh lá cây (và cũng

là lí do tại sao táo hoặc khoai tây khi được nấu chín vẫn giữ được màu trắng) Hailoại Enzyme: Polyphenol oxidase và Peroxidase dễ bị vô hiệu hóa ở khoảng 150oF(65,5oC) Các enzyme cũng có thể bị vô hiệu hóa bằng cách đơn giản là làm mất

độ ẩm của lá trà trong một khoảng thời gian Đây cũng là những gì xảy ra trongquá trình làm héo khi sản xuất

2.5 Ưu và nhược điểm của enzyme

Qua những đặc điểm, tính chất và chức năng sinh học của Polyphenol oxidase(PPO), ta có thể rút ra được những ưu, nhược điểm để tối ưu quá trình thu nhận và ứngdụng hiệu quả enzyme PPO trong công nghiệp thực phẩm PPO được coi là một enzymequan trọng, đã và đang được nghiên cứu rất nhiều trong một số loài thực vật Sự oxy hóacác hợp chất phenol là nguyên nhân chính gây ra sự nâu hóa ở nhiều loại trái cây và rauquả trong quá trình chín, thu hoạch, bảo quản và vận chuyển (13; 14) Điều này làm ảnhhưởng đến giá trị cảm quan, chất lượng dinh dưỡng, làm giảm sức mua người tiêu dùng

và ảnh hưởng đến ngành công nghiệp sản xuất và chế biến thực phẩm

Ức chế PPO gây hiện tượng hóa nâu trong phần lớn các sản phẩm thực phẩm tươi làmục tiêu của nhiều ngành công nghiệp thực phẩm Có nhiều phương pháp để ức chếenzyme hóa nâu, tuy nhiên việc lựa chọn phương pháp phù hợp tùy thuộc vào nguồn gốccủa PPO, rút ngắn quy trình sản xuất, phụ thuộc vào giá thành của phương pháp và sựchấp nhận của người tiêu dùng đối với phương pháp lựa chọn (8)

Tuy nhiên, trong ngành công nghiệp chế biến trà – đặt biệt là trà Oolong, enzymePPO đã được sử dụng trong nghiên cứu này để thu dịch trích enzyme từ lá trà nguyên.PPO lại đóng vai trò hết sức quan trọng PPO xúc tác oxy hóa thành phần tannin đến sảnphẩm cuối là theaflavin và thearubigin, là các cấu tử tạo ra màu vàng và màu đỏ vàhương vị của nước pha trà

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN ENZYME 3.1 Quy trình thu nhận enzyme từ thực vật

3.1.1 Sơ đồ quy trình thu nhận enyzme từ thực vật

Nguyên liệu