Điều hòa tín hiệu protein kinase

Cấu trúc CDK2CDK2 đơn phân bao gồm 298 axit amin gồm: • Thùy N amino acid 1–85 chứa o năm tấm β đối song o một xoắn C chính có chứa motif PSTAIRE tương tác với Cyclin • Thùy C được cấu

ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC – CÔNG NGHỆ SINH HỌC

MÔN: PROTEIN – CẤU TRÚC, CHỨC NĂNG VÀ CÔNG NGHỆ

ĐIỀU HÒA TÍN HIỆU PROTEIN KINASE

GVHD: TS Nguyễn Trí Nhân

PROTEIN KINASE

• Là enzyme xúc tác cho phản ứng phosphoryl hóa.

• Ở sinh vật nhân thực, sự phosphoryl hóa protein trên các gốc serine / threonine hoặc tyrosine có

lẽ là cơ chế điều hòa quan trọng nhất trong quá trình truyền tín hiệu.

I Kinase protein

CẤU TRÚC CƠ BẢN CỦA

Cơ chế hoạt hóa protein kinase

▪ Hầu hết các kinase ở dạng không hoạt động

▪ Hoạt hóa bằng cách tự phosphoryl hóa

▪ Hai trong số những protein kinase được hiểu rõ nhất là Src kinase và các kinase phụ thuộc cyclin (Cdks)

I Kinase protein

❑ Được phát hiện lần đầu tiên như 1

gen sinh ung (oncogene) ở gà gây

ra bởi virus Rous Sarcoma

❑ Đến năm 1978,ngta phát hiện ra

rằng Src cũng là 1 protein kinase

hoạt động

❑ Trong nguyên bào sợi, Src được

liên kết với màng ngoài nhân, túi

tiết và màng sinh chất- nơi nó có

thể tương tác với nhiều loại yếu tố

tăng trưởng và các thụ thể integrin.

6

II Src kinase

II Src kinase

CẤU TRÚC CỦA SRC-PROTEIN KINASE

II Src kinase

CƠ CHẾ HOẠT HÓA SRC-PROTEIN KINASE

10

II Src kinase

Proline 246,250,263

Tyr416

SH2 DOMAIN

11

- Trình tự quyết định khả năng liên kết với SH2:

Phosphotyrosine-acid Glutamic-acid Glutamic-isoleucine

II Src kinase

-> Quy định cấu hình ức chế hoạt động

Cấu hình hoạt hóa Src kinase

II Src kinase

CHỨC NĂNG CỦA SRC-TYROSINE KINASE

13

II Src kinase

II Src kinase

ĐIỀU HÒA CỦA PROTEIN TÍN HIỆU KINASE

KÍCH HOẠT CDK

III Cyclin-Dependent kinases

Vai trò của CDK

❖CDKs (Cyclin-Dependent Kinases) – là các enzyme điều khiển chu kỳ tế bào CDK tồn tại ở dạng dimer dị thể (heterodimer) và chỉ có hoạt tính xúc tác khi được gắn với cyclin hay nói cách khác cyclin là một protein điều hòa có vai trò hoạt hóa CDK.

CDK giúp tế bào chuyển pha, vượt qua các check point trong chu kỳ tế bào, phosphoryl hóa 1

số protein đích nhằm bất hoạt hay hoạt hóa chúng.

III Cyclin-Dependent kinases

III Cyclin-Dependent kinases

Vai trò của CDK

III Cyclin-Dependent kinases

Vai trò của CDK Ví dụ vai trò của CDK2 ở sinh vật nhân thực

Rb: retinoblastoma protein (1 TSG)p21: là một CKI (Cyclin-dependent kinase inhibitor)E2F: họ các yếu tố phiên mã (TF) ở eukaryote

III Cyclin-Dependent kinases

Cấu trúc CDK2

CDK2 đơn phân bao gồm 298 axit amin gồm:

• Thùy N (amino acid 1–85) chứa

o năm tấm β đối song

o một xoắn C chính có chứa motif PSTAIRE tương tác với Cyclin

• Thùy C được cấu tạo chủ yếu bởi

o các xoắn α

o Activation loop (T-loop) bao gồm

Thr160 được phosphoryl hóa

III Cyclin-Dependent kinases

Cấu hình ở trạng thái hoạt động

• Ball & stick xanh lá: peptide cơ chất

Vị trí liên kết với cơ chất của CDK2

III Cyclin-Dependent kinases

o Cyclin (hoạt hóa một phần)

o Phosphoryl hóa trên vùng xúc tác

nhờ CAK – CDK-Activating Kinase

(hoạt hóa hoàn toàn)

Activation of CDK kinase activity

Ở động vật có vú, kích hoạt quá trình photphoryl hóa bằng CAK chỉ có thể xảy ra khi cyclin được liên kết

Ở nấm men, việc kích hoạt này có thể diễn ra trước khi liên kết với cyclin.

III Cyclin-Dependent kinases

Sự thay đổi cấu hình của CDK2 (Hoạt hóa một phần)

Regulation of Cdk2 activation

(Petsko, G A., & Ringe, D (2004) Protein structure and function New Science Press)

III Cyclin-Dependent kinases

Sự thay đổi cấu hình của CDK2 (Hoạt hóa hoàn toàn)

(c) CDK2 + cyclin A +Thr 160

phosphorylation: Threonine 160 được

phosphoryl giúp mở rộng T-loop, mở rộng không

gian của catalytic cleft, tăng tương tác của

T-loop với cyclin A, cho phép T-T-loop tương tác

hiệu quả hơn với cơ chất

III Cyclin-Dependent kinases

Cyclin A tương tác với CDK2 tại xoắn C (motif

PSTAIRE) và T-loop tại xoắn L12 làm thay đổi vị trí chuỗi xoắn C và đưa chuỗi bên của Glu51 vào vị trí xúc tác bằng liên kết hydro với Lys33, tương tác với

ATP tại phosphate α.

T-loop dịch chuyển ra khỏi catalytic cleft, Thr160 được bộc lộ để CAK đến phosphoryl

hóa

Threonine 160 trong được phosphoryl nhờ CAK giúp mở rộng T-loop, cho phép T-loop tương tác hiệu quả hơn với cơ

26

III Cyclin-dependent kinases (CDK)

27

Cyclin-dependent kinase 2/cyclin A complex

d) Sự thay đổi cấu hình của CDK2 (Hoạt hóa hoàn toàn)

Tương tác của peptit cơ chất với phospho-CDK2

– cyclin A trong T-loop và các amino acid

Các tương tác từ phức hợp phospho-CDK2–cyclin A đến pro P+1 của peptit cơ chất bao gồm main-chain từ các amino acid 162–165, I148 và side-chain của E162 Khi hình thành phức hợp peptit-cơ chất, chỉ có một sự thay đổi cấu trúc đáng kể trong phospho-CDK2-cyclin A3 Sự hoán đổi vị trí của H161 từ bên trong ra bên ngoài và của E162 từ bên ngoài vào bên trong cho phép chuỗi bên của glutamate góp phần tương tác van der Waals với P + 1

Cấu trúc CDK2

CDK2 đơn phân bao gồm 298 axit amin gồm:

• Thùy N (amino acid 1–85) chứa

o năm tấm β đối song

o một xoắn C chính có chứa motif PSTAIRE tương tác với Cyclin

• Thùy C được cấu tạo chủ yếu bởi

o các xoắn α

o Activation loop (T-loop) bao gồm

Thr160 được phosphoryl hóa

Cấu trúc CDK2

CDK2 đơn phân bao gồm 298 axit amin gồm:

• Thùy N (amino acid 1–85) chứa

o năm tấm β đối song

o một xoắn C chính có chứa motif PSTAIRE tương tác với

• Catalytic loop giới hạn bởi 2 tấm β nhỏ nằm giữa thùy N và thùy C

• Catalytic cleft tạo thành do sự gấp cuộn của thùy N và thùy C

T-loop Catalytic loop

Kết luận

trọng trong quá trình truyền tín hiệu của sinh vật nhân thực, sự phosphoryl hóa tyrosine nằm ở trung tâm của việc kiểm soát chu kỳ tế bào nhân thực

tyrosine đều có cùng một nếp gấp đối với miền xúc tác, bên cạnh đó cấu trúc protein kinase còn có các tiểu đơn vị khác liên quan đến các chức năng điều hòa (SH2, SH3 của protein Src) hoặc nhắm mục tiêu hoạt động đến các cơ chất protein cụ thể

nó phải được kích hoạt trước bằng sự phosphoryl hóa ở activation loop (hoạt động)

protein khác (Cdk)

.Wikipedia site:vi.abadgar-q.comVùng bản lề được bảo tồn của CDK trong tế bào nhân thực hoạt

động như một cầu nối thiết yếu giữa vòng giàu Gly và vòng kích

hoạt CDK được đặc trưng bởi một thùy đầu N chủ yếu là tấm

beta xoắn được kết nối qua vùng bản lề này với một thùy đầu C

chi phối xoắn alpha Khi thảo luận về vòng lặp T và vòng giàu

Gly, điều quan trọng cần lưu ý là những vùng này, phải có khả

năng tương tác về mặt không gian để thực hiện các chức năng

sinh hóa của chúng, nằm trên các thùy đối diện của chính CDK

Do đó, vùng bản lề này, có thể thay đổi độ dài một chút giữa

loại CDK và phức hợp CDK-cyclin, kết nối các vùng điều hòa

thiết yếu của CDK bằng cách kết nối các thùy này và đóng vai

trò quan trọng trong cấu trúc kết quả của phức hợp CDK-cyclin

bằng cách định hướng đúng ATP để dễ dàng xúc tác cho các

phản ứng phosphoryl hóa bởi phức chất đã lắp ráp.Wikipedia

site:vi.abadgar-q.com

Có tính đặc hiệu đáng kể trong đó cyclin liên kết với CDK.[3] Hơn nữa, liên kết cyclin xác định tính đặc hiệu của phức hợp cyclin-CDK đối với các chất nền cụ thể.[3] Cyclins có thể liên kết trực tiếp chất nền hoặc định vị CDK vào một khu vực dưới tế bào nơi chất nền được tìm thấy Tính đặc hiệu của cơ chất S cyclins được truyền đạt bởi lô kỵ nước (tập trung vào trình tự MRAIL),

có ái lực với các protein cơ chất có chứa mô típ RXL (hoặc Cy) kỵ nước Cyclin B1 và B2 có thể bản địa hóa Cdk1 vào hạt nhân và Golgi, tương ứng, thông qua trình tự bản địa hóa bên ngoài vùng liên kết CDK.[1]

• Trong cấu trúc của phức hợp pCDK2/cyclin A hoạt hóa hoàn toàn, nhóm phosphate của pThr160 tiếp xúc với

ba arginines, Arg50 từ xoắn PSTAIRE C, vị trí của Arg50 được điều chỉnh bằng chuyển động của xoắn C khi liên kết cyclin A, Arg126 đứng trước aspartat xúc tác D127,

và Arg150 từ T-loop được điều chỉnh bằng sự thay đổi cấu hình của xoắn L12 khi liên kết với cyclin A

• Hai arginine (Arg50 và Arg150) hình thành liên kết hydro với cyclin A, trong khi Arg126 liên kết hydro với Tyr180 Phosphosite được Ile270 trên cyclin A che chắn một phần.

• Vị trí của pThr160 trung hòa điện tích dương của ba gốc Arginine

Phụ lục

glycine Vòng lặp -rich (vòng lặp giàu Gly) được thấy trong các chất cặn 12-16 trong CDK2 mã hóa mô típ GXGXXG được bảo tồn trên cả mô hình nấm men và động vật Vùng điều tiết có thể bị phosphoryl hóa khác biệt tại các gốc không phải glycine trong mô típ này, làm cho vị trí này tuân theo Wee1 và / hoặc Myt1 phosphoryl hóa kinase ức chế và Cdc25 khử phosphoryl ở động vật có vú Quá trình phosphoryl hóa thuận nghịch này tại vòng giàu Gly trong CDK2 xảy ra ở Y15, nơi hoạt động đã được nghiên cứu thêm Nghiên cứu về dư lượng này đã chỉ ra rằng quá trình phosphoryl hóa thúc đẩy sự thay đổi cấu trúc ngăn cản liên kết ATP và cơ chất bằng cách can thiệp vào các vị trí liên kết cần thiết này trong vòng hoạt hóa của phức hợp CDK-cyclin Hoạt động này được hỗ trợ bởi tính linh hoạt đáng chú ý

mà vòng giàu Gly có trong cấu trúc của hầu hết các CDK cho phép nó quay về phía vòng hoạt hóa để có tác dụng đáng kể trong việc giảm ái lực cơ chất mà không có những thay đổi lớn trong cấu trúc phức hợp CDK-cyclin tổng

Tính đặc hiệu cơ chất CDK2 nhận dạng trình tự SPXR/K

(Ser-Proline-X-Arginine/Lysine) Peptide được sử dụng trong nghiên cứu là cơ chất peptide tối ưu với trình tự HHASPRK Peptide được liên kết trong một cấu trúc mở rộng qua vị trí xúc tác trên bề mặt thùy C của kinase và T- loop.

Túi chứa proline ở vị trí P + 1 được tạo ra bởi một cấu trúc đặc biệt của phân đoạn hoạt hóa trong đó valine (Val164) thông qua một cấu trúc thuận tay trái được ổn định bằng cách tiếp xúc từ oxy cacbonyl của nó với arginine (Arg169) Sự liên kết của bất kỳ amino acid nào ngoại trừ proline sẽ không thuận lợi vì liên kết hydrogen không được bù trừ từ nitơ chuỗi chính của cơ chất Trong phức hợp CDK2 / cyclin A không được phosphoryl hóa, Val163 có một cấu trúc khác và chặn vị trí liên kết peptide, do đó giải thích cách những thay đổi cấu trúc được tạo ra bởi quá trình phosphoryl hóa trên đoạn hoạt hóa dẫn đến sự hoạt hóa thông qua việc tạo ra vị trí nhận dạng peptide.

Phụ lục

Vòng lặp kích hoạt , còn được gọi là vòng lặp T, là vùng CDK

(giữa các mô-típ DFG và APE trong nhiều CDK) hoạt động về mặt enzym khi CDK liên kết với đối tác cụ thể theo chức năng của nó Trong phức hợp CDK-cyclin, vùng hoạt hóa này bao gồm một xoắn αL-12 được bảo tồn và chứa dư lượng phosphoryl hóa chính (thường là Threonine cho các đối tác CDK-cyclin,

nhưng cũng bao gồm Serine và Tyrosine) làm trung gian cho enzym hoạt động của CDK Chính tại phần dư cần thiết này

(T160 trong phức hợp CDK2, T177 trong phức hợp CDK6) diễn

ra quá trình phosphoryl hóa ATP-enzym của phức hợp

CDK-cyclin bằng CAK (CDK-cyclin hoạt hóa kinase, đề cập đến phức hợp CDK7-Cyclin H trong tế bào người) Sau khi thủy phân ATP để phosphoryl hóa tại vị trí này, các phức hợp này có thể hoàn

thành chức năng dự kiến của chúng, đó là sự phosphoryl hóa các mục tiêu tế bào Điều quan trọng cần lưu ý là trong CDK 1, 2

và 6, vòng lặp T và vùng đầu cuối C riêng biệt là các vị trí chính của liên kết cyclin trong CDK và các cyclin nào được liên kết với mỗi CDK này được trung gian bởi trình tự cụ thể của vòng lặp T của vị trí kích hoạt Các vị trí liên kết cyclin này là các vùng có độ biến thiên cao nhất trong CDK mặc dù có sự tương đồng trình

tự tương đối cao xung quanh mô típ Xoắn αL-12 của thành

phần cấu trúc này.Wikipedia site:vi.abadgar-q.com

Vòng thắt hoạt hóa (Activation Loop)

Vùng aa596-aa600 hình thành tương tác kị nước mạnh mẽ với vòng thắt P của cấu hình bất hoạt của kinase, khóa kinase ở trạng thái bất hoạt cho tới khi vòng thắt hoạt hóa được

phosphoryl hóa, làm lỏng lẻo các tương tác này bằng sự có mặt của điện tích âm Điều này kích hoạt sự chuyển sang trạng thái hoạt động của kinase Đặc biệt, L597 và V600 của vòng thắt hoạt hóa tương tác với G466, F468, và V471 của vòng thắt P để giữ miền kinase bất hoạt cho tới khi nó được phosphoryl hóa