Ảnh hưởng sự giảm biểu hiện protein dkk3 trên con đường tín hiệu EGFR ở dòng tế bào tPH5CH, huh6 clone 5 và RD

7 Hình 1.5 – Sơ đồ vị trí hoạt động phosphoryl hóa của EGFR trong quá trình truyền tín hiệu trong tế bào .... Một nghiên cứu sự biểu hiện Dkk3 ở tế bào ung thư xương ác tính Saos-2 thì

Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Hồ Huỳnh Thùy Dương và GS.BS Masayuki Noguchi đã cho tôi cơ hội được tham gia thực hiện đề tài

Tôi xin chân thành cám ơn TS Junko Kano đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các thầy, cô đã truyền thụ cho tôi những kiến thức quý báu

Cảm ơn các anh chị, các em trong phòng thí nghiệm sinh học phân tử (ĐH khoa học tự nhiên TpHCM) và các thành viên trong phòng thí nghiệm bệnh học chẩn đoán (ĐH Tsukuba) đã giúp đỡ, động viên tôi những lúc khó khăn

Nguyễn Thái Hoàng Tâm  

MỤC LỤC

Trang phụ bìa

Lời cảm ơn

Mục lục i

Danh mục các ký hiệu và các chữ viết tắt iii

Danh mục các bảng v

Danh mục các hình vi

LỜI MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Họ protein Dickkopf và protein Dickkopf 3 3

1.1.1 Dkks 3

1.1.2 Protein Dkk3 5

1.2 Con đường tín hiệu Wnt 7

1.3 Con đường tín hiệu tế bào thông qua thụ quan EGF .9

1.4 EGFR đối với ung thư và liệu pháp đích trong điều trị 12

CHƯƠNG 2 – VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu 15

2.1.1 Dòng tế bào 15

2.1.2 Hóa chất 16

2.2 Phương pháp 16

2.2.1 Nuôi cấy tế bào 16

2.2.2 Biến nạp siRNA vào tế bào nuôi cấy 17

2.2.3 Realtime RT-PCR sử dụng SYBRGreen 17

2.2.4 Western blot 18

2.2.5 RayBio®Phospho-EGFR (Tyr 1086) and Pan EGFR ELISA 21

2.2.6 Phân tích hình ảnh bằng phần mềm Imagine J 21

2.2.7 Phân tích và xử lý số liệu 22

CHƯƠNG 3 – KẾT QUẢ, THẢO LUẬN 3.1 Kết quả khảo sát hình thái tế bào 23

3.2 Kết quả khảo sát hoạt động tín hiệu của con đường EGFR 25

3.2.1 Tế bào tPH5CH 27

3.2.2 Tế bào HuH6 clone 5 28

3.2.3 Tế bào RD 29

3.3 Kết quả khảo sát hoạt động của EGFR 31

3.4 Thảo luận 35

CHƯƠNG 4 – KẾT LUẬN 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC TỪ VIẾT TẮT

Erk 1/2 : Extracellular-signal regulated kinase ½

HuH6 clone 5 : dòng tế bào ung thư gan Hepatoblastoma

NF-AT : Nuclear factor of activated T-cells (nhân tố phiên mã)

electrophoresis

Stat3 : Signal Tranducers and Activators of Transcription 3

TCF : T-cell factor (nhân tố phiên mã)

tPH5CH : dòng tế bào biểu mô gan đã được chuyển thành công

đoạn gen SV40 large T antigen

β-actin : một trong sáu đồng phân cấu trúc của protein actin βTrCP : β-transducing repeat-containing protein

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 – Sự biểu hiện bất thường của Dkks ở một số tế bào ung thư 6

Bảng 1.2 – Một số tác nhân đối kháng với hoạt động cuả EGF 14

Bảng 2.1 – Danh sách kháng thể sử dụng trong Western Blot 20

Bảng 3.1 – Kết quả tín hiệu đo p-EGFR và EGFR tổng bằng kỹ thuật ELISA 33

Trang

Hình 1.1 – Sơ đồ tác động của Dkk3 lên hai con đường truyền tín hiệu ở tế bào 3

Hình 1.2 – Mô hình cấu trúc phân tử của những protein thuộc họ Dickkopf 4

Hình 1.3 – Cơ chế tác động ức chế tín hiệu Wnt của một số Dkks 5

Hình 1.4 – Con đường tín hiệu Wnt 7

Hình 1.5 – Sơ đồ vị trí hoạt động phosphoryl hóa của EGFR trong quá trình truyền tín hiệu trong tế bào 9

Hình 1.6 – Sơ đồ hóa một số con đường hoạt động thông qua sự hoạt hóa EGFR 10

Hình 2.1 – Một số dòng tế bào sử dụng 15

Hình 3.1 – Hình thái tế bào khảo sát 24

Hình 3.2 – Tác động của việc ức chế protein Dkk3 lên con đường tín hiệu thông qua thụ quan EGF trên tế bào tPH5CH 27

Hình 3.3 – Tác động của việc ức chế protein Dkk3 lên con đường tín hiệu thông qua thụ quan EGF trên tế bào HuH6 clone 5 28

Hình 3.4 – Tác động của việc ức chế protein Dkk3 lên con đường tín hiệu thông qua thụ quan EGF trên tế bào RD 30

Hình 3.5 – Độ hoạt động tín hiệu của Erk1 và Erk2 ở quần thể tế bào RD 31

Hình 3.6 – Hoạt động phosphoryl hóa tại vị trí Tyr1086 của thụ quan EGF trên những quần thể tế bào 32

Hình 3.7 – Biểu hiện mRNA EGFR ở những quần thể tế bào ức chế biểu hiện Dkk3 34 Hình 3.8 – Mối liên hệ giữa con đường tín hiệu Wnt và EGFR 35

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Dkk3 thuộc nhóm protein Dickkopf (Dkks) - có vai trò điều hòa hoạt động tín hiệu của những protein Wnt Tuy nhiên, vai trò điều hòa tín hiệu của Dkk3 lại chưa được ghi nhận rõ ràng Ảnh hưởng của Dkk3 lên con đường tín hiệu EGFR cũng chưa được đề cập đến (Hình 1.1)

Hình 1.1 – Sơ đồ tác động của Dkk3 lên hai con đường truyền tín hiệu ở tế bào

1.1 Họ protein Dickkopf và protein Dickkopf 3

1.1.1 Dkks [21]

Dkks là một trong năm họ protein có vai trò đối kháng trong hoạt động điều hòa con đường tín hiệu truyền tín hiệu Wnt được biết hiện nay Ở động vật có xương sống, họ protein Dkks là một nhóm gồm có bốn thành viên: Dkk-1, -2, -3 và -4 Chúng đều là những glycoprotein tiết ngoại bào, có trình tự khoảng 255-350 amino acid (aa) Cấu trúc phân tử của Dkks (Hình 1.2) chứa một vùng tín hiệu (vùng màu đỏ) và hai vùng bảo tồn, giàu cysteine, mỗi vùng có đặc điểm riêng về khoảng cách Cysteine và sự bảo tồn aa khác nhau – vùng DKK-N và “colipase fold” Vùng

“colipase fold” là vùng bảo tồn nhất giữa các loài động vật có xương sống và không xương sống, đồng thời cũng là vùng có hoạt tính ức chế tín hiệu Wnt “Colipase fold” là cấu hình đặc trưng của một nhóm các protein kích thước nhỏ; những protein này có chức năng chuyên biệt trong tương tác protein-protein, như những protein độc tố ở nhện, bò cạp và những protein ức chế protease Cấu trúc vùng “colipase fold” tồn tại những chuỗi β ngắn liên kết những cấu trúc “loop” và được ổn định bởi

những cầu nối disulfide tạo thành những cấu trúc “giống-ngón tay” (finger-like structure) có thể đóng vai trò trong việc tương tác với những bề mặt Vai trò hoạt động của vùng DKK-N chưa được biết đến Khoảng cách giữa hai vùng colipase fold và DKK-N ở Dkk-1 -2, -4 khoảng 50-55aa; riêng ở Dkk-3, khoảng cách giữa 2 vùng này ngắn hơn, chỉ khoảng 12aa

Hình 1.2 – Mô hình cấu trúc phân tử của những protein thuộc họ Dickkopf

Hầu hết những thành viên của Dkks đều có khả năng kìm hãm hoạt động truyền

tín hiệu của Wnt đặc biệt là theo con đường tín hiệu Wnt/β-catenin, ngoại trừ Dkk2

Dkk2 còn có khả năng thay thế Wnt truyền tín hiệu cho tế bào không thực hiện quá trình phân hủy β-catenin, chức năng này tùy thuộc vào trạng thái của tế bào (Hình 1.3.d) Wnt kích hoạt con đường truyền tín hiệu nội bào khi có sự gắn lên thụ quan của nó là Frizzed (Fz) Hoạt động gắn kết này dẫn đến việc lôi kéo protein bề mặt tế bào cạnh đó là LRP6 (Lipoprotein receptor-like protein) lại gần Fz kích hoạt con đường truyền tín hiệu Wnt (Hình 1.3.a) Dkk1 và những thành viên Dkks có khả năng liên kết phân tử với LRP6 dẫn đến việc khóa hoạt động truyền tín hiệu Wnt bằng cách tạo khoảng cách không gian giữa Fz và LRP6 (Hình 1.3.b) hay làm nhập bào LRP6 bằng cách tạo liên kết đồng thời giữa LRP6 với thụ quan Krm (Kremen) (Hình 1.3.c)

mức mRNA Chức năng của sgy vẫn còn chưa được biết đến một cách rõ ràng [18]

Gen mã hóa cho protein Dkk3 được cho là gen khởi nguồn cho những gen mã hóa cho những protein thành viên của họ Dkks Những kết quả nghiên cứu ở thủy

tức (Hydra) cho thấy dkk3 là gen xuất hiện duy nhất trong họ Dkks và Dkk3 đóng

vai trò như những tín hiệu phát triển then chốt ở loài này [4]

Dkk3 biểu hiện mạnh chuyên biệt ở những tế bào, những vùng mô riêng biệt có

khả năng tăng sinh, chuyển dạng và hoạt động chức năng mạnh, như: từ vùng tủy đến phần vỏ của tuyến thượng thận có khả năng sản sinh những hormone thiết yếu (Suwa T và cs, 2003); ở những túi nhỏ của tuyến tiền liệt (Kawano Y và cs, 2006) hay ở những quần thể tế bào beta tuyến tụy có khả năng sản xuất Insulin (Herman M

và cs, 2007); thậm chí ở cả những mạch máu mới đang được hình thành ở ung thư trực tràng (Zitt M và cs, 2008) Trong một nghiên cứu của Aslan H và cộng sự (2006) cho thấy sự biểu hiện Dkk3 ức chế việc hình thành xương nhưng không hề

ảnh hưởng đến sự hình thành sụn càng chứng tỏ Dkk3 có liên quan đến sự hoạt động chức năng sản xuất, chuyển hóa của tế bào (sản xuất chất, sản sinh tế bào…) Dkk3 biểu hiện khác nhau trong từng giai đoạn phát triển của phôi ruồi giấm và sự biểu hiện này giảm dần và mất hẳn khi cá thể trưởng thành Ở những cá thể trưởng thành thì hoạt động tăng sinh, chuyển hóa giảm dần Dkk3 còn được xác định chức năng như là một yếu tố kìm hãm khối u khi mà trong hầu hết các tế bào ung thư Dkk3 bị

ức chế biểu hiện (Bảng 1.1) và sự giảm biểu hiện Dkk3 ở những tế bào ung thư này

thường là do sự methyl hóa cao promoter gen Dkk3 Tuy nhiên, sự ức chế biểu hiện

Dkk3 ở các tế bào ung thư là không tuyệt đối, về sau có nhiều công trình nghiên cứu

đã phát hiện có những ung thư biểu hiện mạnh Dkk3, như hepatoblastoma và hepatocyte carcinoma… Việc giảm biểu hiện Dkk3 ở những tế bào ung thư này đều ảnh hưởng đến sức sống của những tế bào này Wen Y và cs (2008) đã ghi nhận giảm biểu hiện Dkk3 sẽ kích hoạt tín hiệu β-catenin/TCF-4 ở ung thư phổi; Jung IL

và cộng sự (2010) cho thấy “knockdown” gen Dkk3 gây cảm ứng apoptosis ở ung thư phổi (lung adenocarcinoma) do Dkk3 đóng vai trò làm giảm lượng ROS nội bào của những tế bào ung thư này…[1][10][12][14][16][23][28][31][32]

Bảng 1.1 – Sự biểu hiện bất thường của Dkks ở một số tế bào ung thư [21]

Trong khi những protein thành viên của họ Dkks có vai trò điều hòa tín hiệu

Wnt thì vai trò của Dkk3 trong con đường tín hiệu Wnt cũng không rõ ràng Một

nghiên cứu sự biểu hiện Dkk3 ở tế bào ung thư xương ác tính Saos-2 thì Dkk3 tham gia việc điều hòa con đường tín hiệu Wnt-beta-catenin và thông qua đó ức chế sự xâm lấn và khả năng di động của những tế bào ung thư này (Hoang HB và cs, 2004) hay trong một nghiên cứu khác Nakamura RE và cs (2007) đã chứng minh Dkk3 là nhân tố điều hòa dương của tín hiệu Wnt nghĩa là Dkk3 làm tăng tín hiệu Wnt…[11][20]

1.2 Con đường tín hiệu Wnt [26]

Hình 1.4 – Con đường tín hiệu Wnt 

Ở động vật đa bào, con đường truyền tín hiệu được kích hoạt bởi những phân tử Wnt (Wnt signaling pathway) là con đường tín hiệu then chốt của tế bào, tham gia trong các quá trình phát triển, tạo phôi và cả những quá trình phát sinh bệnh (ung

thư, …) Wnt gắn lên thụ quan của chúng có thể kích hoạt ba con đường tín hiệu sau (Hình 1.3):

- (1) Con đường chính (canonical) dẫn đến việc không phân hủy β-catenin trong tế bào, được biết đến như hoạt động chức năng chính của Wnt, Wnt/β-catenin Trong con đường này, phức hợp protein gồm Axin, APC (tumor-suppressor protein) và GSK-3 (Glycogen synthase kinase-3) có vai trò bắt giữ β-catenin trong tế bào Tế bào khi không có tín hiệu Wnt, ở tế bào chất,

β-catenin tạo thành một tổ hợp protein với Axin, GSK3β, APC và CK1α

(casein kinase Iα); lôi kéo βTrCP đến gắn vào βTrCP thực hiện ubiquitine hóa β-catenin β-catenin bị ubiquitine hóa sẽ bị phân cắt bởi hệ thống proteasome trong tế bào Trong khi, ở những tế bào có Wnt gắn lên thụ quan

Fz sẽ kích hoạt phân tử protein Dishevelled (Dsh) chuyển sang trạng thái hoạt động Dsh hoạt động có khả năng ức chế hoạt động của Auxin-APC-GSK3, không cho phức hợp này tương tác gắn kết với β-catenin, không lôi kéo βTrCP β-catenin không bị phân hủy có khả năng di chuyển vào nhân kết hợp với những tác nhân phiên mã như TCF/LEF (T-cell factor/lymphocyte enhancer factor) cảm ứng sự biểu hiện một số gen mục tiêu Ở tế bào ung thư, một số gen bị đột biến liên quan đến việc tạo phức hợp Axin-GSK3-APC-CK1α-βcatenin làm β-catenin không bị bắt giữ và không bị ubiquitine hóa

- (2) Con đường hoạt hóa RhoA/Rho kinase (ROCK) và c-Jun kinase (JNK) (non-canonical) dẫn đến việc sắp xếp bộ khung xương tế bào thuận lợi cho

sự phân bào và khả năng xâm lấn

- (3) Con đường “Wnt/Ca2+” dẫn tới việc phóng thích Ca2+ nội bào thông qua việc hoạt hóa phospholipase C (PLC) và protein kinase C (PKC) Lượng ion

Ca2+ nội bào tăng lên dẫn tới việc khử phosphoryl hóa của NF-AT (Nuclear

factor of activated T-cells, một nhân tố phiên mã) NF-AT di chuyển vào nhân tác động đến sự biểu hiện gen

1.3 Con đường tín hiệu sống của tế bào thông qua thụ quan EGF (EGFR signaling pathway) [7][27][9]

Hình 1.5 – Sơ đồ vị trí hoạt động phosphoryl hóa của EGFR trong quá trình truyền tín hiệu

trong tế bào [27]

Thụ quan EGF (Epidermal Growth Factor Rceptor - EGFR) là một glycoprotein xuyên màng và là thụ quan của các nhân tố tăng trưởng biểu bì Cấu hình của EGFR gồm: một vùng thụ quan nằm ngoài tế bào (extracellular receptor domain), một vùng xuyên màng và một vùng nội bào (intacellular domain) Vùng cấu trúc nằm trong tế bào chất này có chức năng tyrosine kinase (RTKs), có khả năng chuyển nhóm phosphate từ phân tử năng lượng ATP sang vị trí amino acid Tyrosine của phân tử protein mục tiêu EGFR biểu hiện với số lượng từ 40 000 đến 100 000 thụ quan trên

một tế bào bình thường, với chức năng kích hoạt những con đường dẫn truyền tín hiệu tham gia điều hòa sự tăng sinh, biệt hóa và sức sống của tế bào Những ligand của EGFR được biết đến cho đến nay gồm: nhân tố tăng trưởng biểu bì (EGF-Epidermal growth factor), amphiregulin, nhân tố tăng trưởng chuyển đổi α (TGFα – Transforming Growth factor α), nhân tố tăng trưởng giống EGF gắn heparin (HB-EGF), amphiregulin, betacellulin và epiregulin Khi có sự gắn lên của một trong những ligand, EGFR dimer-hóa chính nó dẫn tới quá trình tự phosphoryl hóa (autophosphorylation) tại những vị trí tyrosine ở vùng cấu trúc nằm trong tế bào chất Những tyrosine được phosphoryl hóa này sau đó có khả năng lôi kéo những phân tử “adaptor” (Grb2, Shc,…), hay những tyrosine kinase nội bào khác đến thực hiện vai trò khuếch đại tín hiệu bằng cách sản sinh những phân tử tín hiệu thứ cấp và chuyển chúng đến những con đường tín hiệu quan trọng trong tế bào Tùy vào những vị trí tyrosine trên EGFR được phsophoryl hóa sẽ quyết định việc truyền tín hiệu tiếp theo trong tế bào thông qua con đường nào kế tiếp (Hình 1.5)

Hình 1.6 – Sơ đồ hóa một số con đường hoạt động thông qua sự hoạt hóa EGFR [34]

Sau đây là một số con đường tín hiệu quan trọng trong tế bào thông qua sự kích hoạt của EGFR (Hình 1.6)

1.3.1 Con đường Ras/MAPK

Sau khi EGFR được gắn phối tử và tự phosphoryl hóa tại vị trí tyrosine thuộc vùng cấu trúc nằm trong tế bào chất, những protein như Grb2 (growth factor receptor bound protein 2) có vùng cấu trúc gắn lên những vị trí phosphotyrosine của EGFR, đồng thời với một vùng cấu trúc khác có khả năng gắn với SOS (nhân tố trao đổi Guanine) Phức hợp EGRF-Grb2-SOS làm SOS có khả năng gắn GTP cho Ras Ras được hoạt hóa cảm ứng hoạt tính kinase của Raf kinase, một protein kinase có khả năng phosphoryl hóa tại các vị trí serine/threonine, Raf kinase sẽ phosphoryl hóa và kích hoạt MEK, một serine/threonine kinase khác MEK sẽ thực hiện phosphoryl hóa và kích hoạt protein kinase phân bào MAPK (hay còn gọi là Erk – Extracellular-signal regulated kinase) dẫn đến sự phân bào của tế bào MAPK có hai đồng phân MAPK-p44 (Erk1) và MAPK-p42 (Erk2) Những tác nhân đích cuối dòng của MAPK là p90rsk và phospholipase A2, những tác nhân này liên quan đến

sự tăng sinh và biệt hóa tế bào

1.3.2 Con đường PI3K/Akt

EGFR ở trạng thái hoạt động có khả năng hoạt hóa phosphatidyl inositol-3 kinase (PI3K) Kinase này tạo phosphatidyl inositol triphosphate (PIP3) PIP3 lôi kéo và tương tác với Akt (hay còn gọi là protein kinase B – PKB) thông qua vùng tương đồng pleckstrin (PH) Akt tham gia điều hòa tín hiệu của nhiều quá trình sinh học thiết yếu của tế bào Aktcó khả năng kích hoạt sự biểu hiện của một số protein cảm ứng apoptosis, như những protein bất hoạt những protein thành viên của họ Bcl-2); ức chế sự biểu hiện của BIM thông qua tác động lên nhân tố phiên mã như FOXO và p53 Akt phosphoryl hóa Mdm2, một E3 ubiquitin ligase; Mdm2 có tác

dụng thúc đẩy nhanh sự phân hủy p53; giảm hoạt động của caspase-9 Một trong

những chức năng được bảo tồn nhất của Akt là vai trò làm tăng sinh khối tế bào thông qua sự hoạt động của phức hợp mTOR-1 và được điều hòa bởi những tín hiệu

của nhân tố tăng trưởng và dinh dưỡng Hoạt động của Akt kích thích tăng sinh tế bào thông qua những tương tác với những tác nhân cuối dòng trong sự điều hòa chu trình tế bào như hoạt động phosphoryl hóa những nhân tố ức chế hoạt động kinase phụ thuộc vào chu trình tế bào (p21Cip1/WAF1 và p27Kip1) và ngăn cản tác động

ức chế chu trình tế bào của chúng

1.3.3 Con đường Stat3

EGFR hoạt hóa con đường này thông qua Src hay Jak Hai phân tử này sẽ tương tác và phosphoryl hóa Stat3, dẫn tới sự dimer hóa của Stat3 Stat3 di chuyển vào nhân, tại đây Stat3 gắn trình tự gồm 9bp (TTCNNNGAA) lên vùng điều hòa của những gen mục tiêu tham gia điều hòa phiên mã

1.4 EGFR đối với ung thư và liệu pháp đích trong điều trị (targeted therapy)

[7][6]

1.4.1 Ung thư liên quan đến hoạt động của EGFR

Những nghiên cứu vào những năm 1980 cho thấy những thay đổi trên con đường tín hiệu EGFR liên quan đến sự chuyển dạng ác tính ở những khối u Thêm vào đó,

EGFR của tế bào tương đồng với gen ung thư (oncogene) v-erb (virus tăng sinh

hồng cầu ở chim) Gen này mã hóa cho một thụ quan EGF bị thiếu vùng gắn EGF nhưng vẫn có vùng xuyên màng và vùng tham gia kích thích sự tăng sinh tế bào Hoạt động bất thường của EGFR còn tham gia vào sự chuyển dạng ác tính của những tế bào bị nhiễm virus Sự biểu hiện vượt mức EGFR trở thành “dấu ấn” cho

sự chuyển dạng ác tính ở tế bào khối u Sự chuyển dạng ác tính là hậu quả của sự rối loạn điều hòa EGFR xuất hiện ở người bởi những cơ chế khác nhau, như: biểu hiện vượt ngưỡng thụ quan EGF, những đột biến hoạt động, những biến đổi trong quá trình dimer hóa, sự hoạt hóa những nhân tố tăng trưởng tự tiết, giảm bớt hay tăng cường sự nhập bào những thụ quan đã được hoạt hóa, sự thiếu tính chuyên biệt cùa những phosphatases để khử những mảnh tyrosine của EGFR đã được phosphoryl

hóa, và giảm bớt sự tái sản xuất Trong đó, sự biểu hiện vượt ngưỡng gen egfr không

do sự khuếch đại bản sao của gene, và sự hoạt hóa EGFR bởi TGF-α trong chu trình

tự tiết, là hai cơ chế chính thường xảy ra trong quá trình diễn tiến và phát triển ung thư Hơn nữa, EGFR bị đột biến ở một vài bệnh ung thư và đặc biệt phổ biến ở ung thư nguyên bào thần kinh sợi (glioblastoma)

Tế bào được ghi nhận có sự biểu hiện EGFR mạnh: tế bào biểu bì (epithelial) và trung bì (mesenchymal) Cấp độ biểu hiện EGFR ở khối u không quan trọng bằng độ hoạt động của EGFR đối với những tác nhân có khả năng gây ung thư cũng như những tác nhân đáp ứng trong trị liệu Những nhân tố tác động đến trạng thái hoạt hóa gồm sự đột biến, dimer hóa của thụ quan và sự tăng biểu hiện của những ligand Tuy nhiên, sự phức tạp của việc truyền tín hiệu phụ thuộc vào những tương tác của bốn thụ quan và sự gắn kết của chúng với ligand

1.4.2 Liệu pháp đích đối với EGFR trong điều trị ung thư

Liệu pháp đích (targeted thrapy) gần đây được coi là phương thức điều trị ung thư quan trọng Hầu hết những con đường tín hiệu được nghiên cứu ứng dụng trong liệu pháp đích đều liên quan đến EGFR Việc biểu hiện mạnh EGFR ở ung thư liên quan mạnh mẽ đến những rủi ro cao trong sự tái phát/di căn, giảm sức sống, và kháng lại những liệu pháp hóa-xạ trị của ung thư Kháng thể đơn dòng kháng EGFR hay nhân tố ức chế Tyrosine kinase hiện nay đều được sử dụng lâm sàng trong điều trị ung thư Với việc gia tăng lợi ích của những tác nhân này và giá trị của nhiều tác nhân mới trong tương lai, kiến thức về liệu pháp kháng EGFR thích hợp với giai đoạn hiện tại của liệu pháp điều trị ung thư và với những hướng nghiên cứu mới trong lĩnh vực ung thư học (oncology)

Sự hoạt hóa của EGFR dẫn đến sự tăng sinh, kháng apoptosis, và sự bám trải của

tế bào EGFR được biểu hiện vượt ngưỡng ở nhiều khối u rắn và sự biểu hiện mạnh này liên quan đến giai đoạn phát triển và sự dự đoán tiến triển xấu của ung thư Vài năm gần đây, sự gia tăng số lượng thử nghiệm lâm sàng trong việc kiểm soát những khối ung thư rắn ác tính (như ung thư vú, ruột kết, tuyến tụy, đầu và cổ, thận, dạ dày

và phổi) càng có giá trị cho thấy hiệu quả lâm sàng của những kháng thể đơn dòng kháng EGFR và những tác nhân phân tử nhỏ (dạng uống) ức chế Tyrosine kinase

(TKIs – Tyrosine Kinase Inhibitors) Những thuốc đánh vào hoạt động của EGFR ở những khối u rắn ác tính được phát triển từ những năm 1980 Trong những năm gần đây là sự phát triển những kháng thể đơn dòng kháng EGFR và những phân tử nhỏ

ức chế tyrosine kinase của EGFR (Bảng 1.2)

Bảng 1.2 – Một số tác nhân đối kháng với hoạt động cuả EGFR [6]

STT Tác nhân kháng EGFR Cơ chế tác động

1 Erlotinib TKI của phức hợp HER1/EGFR

2 Gefitinib TKI của EGFR

TKI của HER2/neu và EGFR, khóa những vị trí

tự phosphoryl hóa trên thụ quan

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP

1 Vật liệu

1.1 Dòng tế bào

Hình 2.1 – Một số dòng tế bào sử dụng A: tế bào tPH5CH; B – tế bào HuH6 clone 5; C – tế bào RD

1.1.1 Dòng tPH5CH (normal human hepatocyte): là những tế bào biểu mô

gan người không tái tạo (nonneoplastic hepatocytes) đã được Masayuki Noguchi và nhóm nghiên cứu (National Cancer Center Research Institute, Tokyo, Japan – 1995) thiết lập từ gan người giải phẫu và đã được chuyển vào thành công đoạn lớn gen kháng nguyên T của virus SV40 (SV40 large T antigen) không làm đột biến gen p53 như những ung thư gan thường có Có thể nói đây là dòng tế bào gan bình thường ở

người có khả năng tăng sinh trong in vitro nhưng không hình thành khối

u khi được nuôi cấy khảm trên chuột “nude”, rất hữu ích làm mô hình nghiên cứu đối chiếu với những mô hình ung thư gan ác tính ở người (human hepatocarcinogenesis) [22]

1.1.2 Dòng HuH6-clone 5 (hepatoblastoma-JCRB0401): là dòng tế bào ung

thư gan được phân lập từ trẻ em Có hình thái tế bào giống tế bào biểu

mô Hepatoblastoma là những tế bào ung thư gan giống với những tế bào

có khả năng tái sinh gan trong suốt sự phát triển phôi và bào thai, những

tê bào này vẫn phụ thuộc vào những nhân tố tăng trưởng 50%

Hepatoblastoma mang đột biến liên quan đến gen β-catenin [24]

A B C

1.1.3 Dòng RD (rhabdomyosarcoma): là dòng tế bào ung thư cơ xương

người được phân lập từ khối u cơ xương chậu ác tính của một bé gái 7 tuổi vào năm 1968 (Mc Allister và cộng sự, 1969)

Đặc điểm tế bào:

- Có nguồn gốc phát triển từ trung bì (messenchymal origin) của phôi

- Có hình thái tế bào dạng que

- Đột biến liên quan đến gen ras, gen Rb-1 (retinoblastoma)

1.2 Hóa chất

1.2.1 Môi trường nuôi cấy tế bào D’MEM F12 (Dulbecco’s modified

Eagle’s medium F12) được bổ sung nhân tố tăng trưởng EGF

(100ng/ml), insulin (10µg/ml), glucagon (4µg/ml), linoleic acid (5µg/ml), hydrocortisone (10-6M), selenium (10-7M), transferrin (5µg/ml), FBS 10%

1.2.2 Môi trường OPTI-MEM I không huyết thanh (Sigma)

1.2.3 Dung dịch PBS (-) 1X

1.2.4 Dung dịch Trypsin 2,5%/EDTA 0,5M

2 Phương pháp

2.1 Nuôi cấy tế bào

- Tế bào được cấy chuyền khi đã đạt độ phủ 70-80% diện tích bình nuôi cấy: loại

bỏ môi trường cũ, và rửa sạch môi trường bằng dung dịch PBS (-) 1X

- Tách tế bào bằng cách ủ tế bào với dung dịch Trypsin/EDTA 0.25% và quan sát

tế bào dưới kính hiển vi (khoảng 3 phút)

- Khi tế bào bắt đầu co tròn, loại bỏ nhanh Trypsin/EDTA, vỗ nhẹ hai thành bình Thêm 1 ml môi trường nuôi cấy Dùng pipette huyền phù nhẹ tế bào Chuyển dịch tế bào vào bình nuôi cấy Bổ sung môi trường nuôi cấy vào bình

- Ủ trong tủ ấm 5% CO2, 370C

2.2 Nhiễm siRNA vào tế bào nuôi cấy

Sử dụng quy trình chuyển siRNA của Invitrogen cho dòng tế bào SK-N-SH

(“Transfecting Stealth RNAi or siRNA into SK-N-SH cells using Lipofectamine

RNAiMAX) đã được tính toán cho quy mô nuôi tế bào trên đĩa 10mm

Chuẩn bị môi trường chuyền siRNA:

+ Cho thử nghiệm chuyển Dkk3 siRNA (si*): pha loãng Dkk3 siRNA

5’CCUGGCAAACUUACCUCCCAGCUAU3’) trong 2ml môi trường Opti-MEM I

(không có huyết thanh) để đạt hàm lượng cuối cùng là 120pmol

+ Cho thử nghiệm âm (chứng) (-*): pha loãng Universal negative siRNA

(Invitrogen) trong 2ml môi trường Opti-MEM I (không có huyết thanh) để đạt hàm

lượng cuối cùng là 120pmol

+ Bổ sung 20µl Lipofectamine RNAiMAX và trộn đều nhẹ nhàng, ủ ở nhiệt độ

phòng khoảng 10-20phút (có thể ủ tối đa 45 phút)

Tế bào chuẩn bị cho quá trình nhiễm siRNA được nuôi trước trong môi trường

không bổ sung kháng sinh sau 24 giờ đạt mật độ 30-50% độ phủ Chuyển 2ml dịch

(si*)/(-*) vào đĩa nuôi cấy Di chuyển nhẹ nhàng đĩa để trộn đều

Ủ tế bào đã chuyển siRNA ở tủ 37oC, 5%CO2 sau 24 giờ; tế bào chuyển siRNA

được thay môi trường nuôi cấy và tiếp tục ủ trong khoảng thời gian khảo sát là

24giờ, 48giờ và 72giờ

2.3 Realtime RT-PCR sử dụng SYBRGreen

Đây là phương pháp định lượng RNA dựa trên kỹ thuật phiên mã ngược (reverse

transcription) phối hợp với kỹ thuật PCR có sử dụng các chất phát huỳnh quang

SYBRGreen Các phân tử SYBRGreen không phát huỳnh quang ở dạng tự do trong

môi trường, chỉ phát huỳnh quang khi gắn chèn vào mạch đôi DNA Cường độ

huỳnh quang đo được tương ứng với số lượng bản sao DNA được nhân bản tại thời điểm đo

Quy trình như sau :

- Tách chiết RNA tổng số của các lô quần thể tế bào với mật độ tế bào đạt tế bào 5-6.106 tế bào/ml giống nhau giữa các lô bằng RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen)

- Kiểm tra chất lượng RNA tổng số sau khi tách bằng đo mật độ quang và điện di trên gel

- Thực hiện phản ứng chuyển RNA thành cDNA theo bộ kit cDNA (Applied Biosystems)

- Tiến hành phản ứng RT-PCR (sử dụng Power SYBR® Green PCR Master Mix-Applied Biosystems)

* 18S rRNA (chứng nội/ TAKARA BIO.INC)

* egfr (TAKARA BIO.INC/Primer set ID: HA087479))

- Tính mức độ tăng biểu hiện tương đối của gene là tỉ lệ tương đối giữa egfr và 18SRNA Giá trị tính được cho phép định lượng tương đối mRNA của gene đặc hiệu giữa mẫu có và không có xử lý thuốc

Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần

Quy trình:

• Chuẩn bị dịch ly giải tế bào

- Tế bào được nhiễm dkk3siRNA sau những khoảng thời gian khảo sát (24 giờ,

48 giờ và 72 giờ) được loại bỏ hoàn toàn môi trường bằng PBS(-)1X

- Tế bào được thu nhận bằng thao tác cào bằng que cào tế bào (Scrapper)

- Ly tâm 2500vòng/phút ở 4oC trong 10phút

- Loại bỏ dịch nổi, thu cặn tế bào

- Ủ cặn tế bào trong 30µl dịch ly giải RIPA (Thermo 89901) (đã được bổ sung phosphatase inhibitor và EDTA trước khi sử dụng) trên đá trong 5phút

- Chuẩn bị dung dịch nạp mẫu (4X, 0.2M DTT): 400µl + 100µl DTT 1M

- Pha loãng dịch ly giải protein đạt hàm lượng protein tổng số trong một mẫu là 30µg/15µl mẫu

- Bổ sung 5µl dung dịch nạp mẫu 4X, trộn đều

• Đánh dấu protein mục tiêu (quy trình thông thường)

- Blocking màng chuyển thẩm trong dung dịch blocking (SuperBlocking + 0.05%Tween20), 2giờ ở 4oC

- Ủ lắc màng với 10ml dịch kháng thể sơ cấp (độ pha loãng như bảng ) qua đêm ở

4oC

- Rửa màng với 15ml dung dịch rửa (PBS1X + 0.05%Tween20

+10%Superblocking) trong 10phút, 5 lần

- Ủ lắc màng với 10ml dịch kháng thể thứ cấp (độ pha loãng đối như bảng)

• Đánh dấu protein mục tiêu (theo hướng dẫn sử dụng của hệ thống Snap i.d

[hãngMillipore] cho đánh dấu β-actin)

• Phát hiện protein mục tiêu

- Sử dụng bộ kít phát hiện tín hiệu hóa quang “Supersignl West Femto” (Pierce)

- Hiện phim từ 1-30 phút tùy theo tín hiệu protein nhận được

Bảng 2.1 – Danh sách kháng thể sử dụng trong Western Blot

Kháng thể Mã/Hãng Độ pha loãng cuối cùng

Anti-Dkk3 R&D system 1:1000 Anti-P-Akt

Cell signaling

1:2000 Anti-P-Erk1/2 1:2500 Anti-P-Stat3 1:5000 Anti-Akt 1:5000 Anti-Erk1/2 1:5000 Anti-Stat3 1:5000 Anti-β-actin Sigma 1:10000

2.5 RayBio®Phospho-EGFR (Tyr 1086) and Pan EGFR ELISA

Là một thử nghiệm đo sự phosphoryl hóa tại vị trí Tyrosine 1086 của thụ quan EGF và Pan EGFR (tổng lượng protein EGFR có trong tế bào) thông qua sự hiện màu Quy trinh thực hiện theo hướng dẫn của bộ kít RayBio®Phospho-EGFR (Tyr 1086) and Pan EGFR ELISA

Độ hoạt động của EGFR được tính theo công thức sau: P-EGFR = tín hiệu đo được của P-EGFR/tín hiệu EGFR tổng số trong tế bào

2.6 Phương pháp phân tích ImagineJ

ImageJ (http://rsb.info.nih.gov//ij/index.html) có thể được sử dụng để so sánh độ đậm nhạt của những băng trên gel agarose hay western blot Những băng kết quả muốn so sánh cần được ghi nhận lại qua những file ảnh nên ở dạng tif để giữ lại được lượng thông tin nhiều nhất của hình ảnh gốc ban đầu

Công thức tính định lượng tương đối sự hoạt động (HĐ) của protein mục tiêu ở

lô quần thể tế bào nhiễm dkk3siRNA (Psi) với lô quần thể tế bào chứng (Pc) từ kết quả Western blot:

Đ PsiPctrong đó:

• Psi là tỉ lệ tín hiệu từ ImageJ của băng protein phosphoryl hóa với băng protein không được phosphoryl hóa ở lô quần thể tế bào nhiễm dkk3siRNA

• Pc tỉ lệ tín hiệu từ ImageJ của băng protein phosphoryl hóa với băng protein không được phosphoryl hóa ở lô quần thể tế bào chứng

Ví dụ: tính hoạt động của protein Akt

2.7 Phương pháp phân tích và xử lý số liệu

Số liệu thu được từ những thử nghiệm được xử lý thống kê bằng phần mềm Microsoft Excel, thử nghiệm student’s two tail t-test được dung để đánh giá sự khác biệt về mặt thống kê giữa lô nhiễm dkk3siRNA và lô không nhiễm dkk3siRNA với

độ tin cậy là 1-P

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ, THẢO LUẬN