Sinh học phân tử - Southern blot doc

3 2 1Khái niệm Các kiểu lai phân tử Các yếu tố ảnh hưởng Nguyên lí và điều kiện Mẫu dò Qui trình... ­1 trình tự cần biết được gắn trên gía thể Nguy ên tắc LAI TRÊN PHA RẮN... ­ Không thể

Southern blotSinh học phân tử

3 2 1

Khái niệm Các kiểu lai phân tử Các yếu tố ảnh hưởng Nguyên lí và điều kiện Mẫu dò

Qui trình

I Gi i thi u chung v phớ ệ ề ương pháp Southern blot.

- Đây là phĐây là phươ ươ ng pháp cho phép xác đ nh đng pháp cho phép xác đ nh đị ị ượ ượ c s có m t c a c s có m t c a ự ự ặ ủ ặ ủ

nh ng trình t nucleotide trên m t đo n ADN nào đó, trong ữ ự ộ ạ

nh ng trình t nucleotide trên m t đo n ADN nào đó, trong ữ ự ộ ạ

h n h p các đo n ADN khác nhau ỗ ợ ạ

h n h p các đo n ADN khác nhau ỗ ợ ạ

- Do E.M.Southern đ xu t vào năm 1975, t i đ i h c ề ấ ạ ạ ọ

 Là hi n tệ ượng 2 m ch DNA sau khi đã tách r i, s ạ ờ ẽ

k t h p l i v i nhau đi u ki n nhi t đ đế ợ ạ ớ ở ề ệ ệ ộ ược làm

C ác kiểu lai  phân tử

Lai trên pha rắn

Lai trong pha lỏngLai tại chỗ

Southern blot

S ự lai phân tử  xảy ra do:

­Chuyển động  nhiệt.

­ Nhiệt độ môi  trường thấp hơn 

Tm ít nhất vài độ

-1 trình tự bổ sung

­1 trình tự cần biết được gắn trên gía thể

Nguy ên tắc

LAI TRÊN PHA RẮN

Màng   Nitrocellulose: 

được sử dụng đầu tiên,  nay ít dùng, do:

­ Độ bền cơ học  kémkhó thao tác.

­ Không thể tách rời  các phân tử lai trên  màng để lai trở lai  với một mẫu dò  khác.

Màng   Nitrocellulose: 

được sử dụng đầu tiên,  nay ít dùng, do:

­ Độ bền cơ học  kémkhó thao tác.

­ Không thể tách rời  các phân tử lai trên  màng để lai trở lai  với một mẫu dò  khác.

Màng nylon được sử dụng  phổ biến:

­ Có thể tiếp nhận  500µg/cm 2

­ giữ DNA chắc hơn.

­Ít đứt gãy

­Cho phép lai nhiều  lần với mẫu dò khác  nhau

CÁC YẾU TỐ KĨ THUẬT TRONG LAI TRÊN PHA RẮN

Kh ó khăn:

­ Định lượng  phân tử kém  chính xác 

­ Hiệu quả lai  thấp (vận tốc  lai chậm đi 10  lần so với vận  tốc lai trên pha  lỏng).

Thu ận lợi:

­ Dễ dàng trong  thao tác. 

­ Dễ dàng tách  trình tự không lai 

ra khỏi phân tử lai. 

­ Ngăn cản sự tái  bắt cặp giữa 2  mạch đơn của  cùng một phân tử.

Lai trên màng 

rắn

Southern blot

- d ựa trên nguyên  tắc biến tính và  hồi tính của  phân 

tử DNA

- D ựa vào nguyên tắc 

bổ sung giữa các cặp  mucleotide: A­T, G­C  (các đoạn 

polynucleotide mạch  đơn có trình tự bổ  sung)

 Nguyên lí

III. PHƯƠNG PHÁP SOUTHERN BLOT

Nguy ên tắc Nguy ên tắc

­Biến tính mẫu ADN thành các  sợi đơn.

­Gắn mồi vào các sợi đơn.

­Tổng hợp các sợi ADN mới.

­Biến tính để tách chuỗi mới vừa  tổng hợp thành các sợi đơn.

­Tiếp tục quay về gắn mồi vào  các sợi đơn. 

TẠO MẪU DÒ

Đánh dấu  probe 

Giai đoạn 3 Giai đoạn 1

Lai với probe 

và kiểm tra bằng kỹ thuật phóng xạ tự ghi

Giai đoạn 2

QUI TRÌNH SOUTHERN BLOT

Giai đo n 1 ạ

Tách chiết DNA cần nghiên cứuCắt DNA nghiên cứu bằng enzyme cắt giới hạn

Tiến hành điện di hỗn hợp DNA vừa được cắt, trên gel agarose

Làm biến tính các dải băng DNA trên gel agarpose dd NAOH 0,4M  thành các sợi đơn

- Màng đ ượ c s d ng là màng nitocellulose ho c ử ụ ặ màng nylon.

• Đ m t phía dệ ừ ướ ượi đ c th m m t cách t nhiên lên ấ ộ ựtrên chuy n các m nh DNA t gel lên màng và bám ể ả ừ

ch t vào màng ( th i gian chuy n d a vào các phặ ờ ể ự ương pháp chuy n khác nhau).ể

Máy bloting

DNA có định trên màng lai kết hợp với probe(đã được  đánh dấu) theo nguyen tắc bổ sung

Rửa và loại bỏ mẫu không tham gia phản ứng lai  trên màng lai

Phát hiện vị trí lai nhờ phóng xạ tự ghi Đặt phim lên tấm lọc

Tráng phim để thu các vạch đen tại nơi phát xạ

GIAI ĐOẠN III

LAI VỚI MẪU DÒ  KẾT QUẢ

LAI TRÊN MÀNG ĐẶT PHIM LÊN TẤM LỌC TRÁNG PHIM

­ Nghiên cứu mối quan hệ họ hàng của nhiều nhóm loài thực vật, động vật. 

­ Phát hiện sự có mặt của gen cần tìm trong hệ genome sinh vật nghiên cứu

­ Phát hiện sự đa dạng DNA qua các cá thể khác nhau của 1 loài

­ Phát hiện các thể đột biến gen. 

­là kĩ thuật phân tích sự đa hình VỀ CHIỀU DÀI, của các mảnh DNA bị cắt đoạn.

DNA FINGERPRINTING

SO SÁNH 2 MẪU  TÌM RA THỦ PHẠM

Click to edit subtitle style