Sinh học phân tử_Southern blot pps

Giới thiệu chung về phương pháp Southern blot.- Đây là phương pháp cho phép xác định được sự có mặt của những trình tự nucleotide trên một đoạn ADN nào đó, trong hỗn hợp các đoạn ADN kh

Southern blot

Sinh học phân tử

Nội dung seminar

3 2 1

Khái niệm Các kiểu lai phân tử Các yếu tố ảnh hưởng Nguyên lí và điều kiện Mẫu dò

Qui trình

I Giới thiệu chung về phương pháp Southern blot.

- Đây là phương pháp cho phép xác định được sự có mặt của

những trình tự nucleotide trên một đoạn ADN nào đó, trong hỗn hợp các đoạn ADN khác nhau

- Do E.M.Southern đề xuất vào năm 1975, tại đại học

Edingburd

- Được triển khai nhờ 1 số kĩ thuật nền tảng của công nghệ

sinh học phân tử như:

II Lai phân tử

1 Khái niệm

 Là hiện tượng 2 mạch DNA sau khi đã tách rời, sẽ

kết hợp lại với nhau ở điều kiện nhiệt độ được làm giảm từ từ, kết hợp với điều kiện thí nghiệm thích hợp.

 Đặc điểm:

– Đặc hiệu tuyệt đối: sự bắt cặp chỉ xảy ra giữa

2 trình tự hoàn toàn bổ sung cho nhau.

– Các trình tự bổ sung có thể là DNA hay RNA

 ptử DNA-DNA, RNA-RNA, các phân tử lai DNA-RNA

Các kiểu lai phân tử

Lai trên pha rắn

Lai trong pha lỏng Lai tại chỗ

Southern blot

Sự lai phân tử xảy ra do:

-Chuyển động nhiệt.

- Nhiệt độ môi trường thấp hơn

Tm ít nhất vài độ

-1 trình tự bổ sung.

-1 trình tự cần biết được gắn trên gía thể

Nguyên tắc

LAI TRÊN PHA RẮN

Màng Nitrocellulose:

được sử dụng đầu tiên, nay ít dùng, do:

- Độ bền cơ học kémkhó thao tác.

- Không thể tách rời các phân tử lai trên màng để lai trở lai với một mẫu dò khác.

Màng Nitrocellulose:

được sử dụng đầu tiên, nay ít dùng, do:

- Độ bền cơ học kémkhó thao tác.

- Không thể tách rời các phân tử lai trên màng để lai trở lai với một mẫu dò khác.

Màng nylon được sử dụng phổ biến:

- Có thể tiếp nhận 500µg/cm2.

- giữ DNA chắc hơn.

-Ít đứt gãy -Cho phép lai nhiều lần với mẫu dò khác nhau

CÁC YẾU TỐ KĨ THUẬT TRONG LAI TRÊN PHA RẮN

Khó khăn:

- Định lượng phân tử kém chính xác

- Hiệu quả lai thấp (vận tốc lai chậm đi 10 lần so với vận tốc lai trên pha lỏng)

Thuận lợi:

- Dễ dàng trong thao tác

- Dễ dàng tách trình tự không lai

ra khỏi phân tử lai

- Ngăn cản sự tái bắt cặp giữa 2 mạch đơn của cùng một phân tử

Lai trên màng

rắn

Southern blot

- dựa trên nguyên tắc biến tính và hồi tính của phân

tử DNA

- Dựa vào nguyên tắc

bổ sung giữa các cặp mucleotide: A-T, G-C (các đoạn

polynucleotide mạch đơn có trình tự bổ sung)

Nguyên lí

III PHƯƠNG PHÁP SOUTHERN BLOT

Nguyên tắc

- Phản ứng lai cần nhiệt độ cao

hoặc hóa chất gây biến tính DNA

(NaOH, Formaldehyt).

Đòi hỏi một đoạn DNA (RNA)

đã biết được sử dụng làm mồi

“ Probe ” được đánh dấu

- Các vật liệu, trang thiết bị máy

móc chính xác: màng lai, máy

Blotting, buồng lai, máy PCR

Southern blot

-Gắn ADN vào Plasmid trong

điều kiện môi trường phù hợp

-Thực hiện biến nạp vào trong

-Thiết lập mồi và đánh dấu phóng xạ vào các mồi

-Biến tính mẫu ADN thành các sợi đơn

-Gắn mồi vào các sợi đơn

-Tổng hợp các sợi ADN mới

-Biến tính để tách chuỗi mới vừa tổng hợp thành các sợi đơn

-Tiếp tục quay về gắn mồi vào các sợi đơn

TẠO MẪU DÒ

Đánh dấu probe

- DNA dùng để tạo mẫu dò

- Tạo ra các vết khía sau đó bổ xung các

nucleotide tự do trong đó có các nucleotide,

- DNA này sau đó được bằng nhiệt độ

làm biến tính sợi kép thành hai sợi đơn

ĐÁNH DẤU ĐỒNG VỊ PHÓNG XẠ

- Mẫu dò được đánh dấu bằng enzyme

peroxidase.

- Sau khi cho màng lai tiếp xúc với mẫu dò (được đánh dấu phát quang sinh học), cơ chất của

perpxidase bị biến đổi, ánh sáng phát ra sẽ được

in trên phim  thu nhận được kết quả

ĐÁNH DẤU BẰNG PHÁT QUANG SINH HỌC

Giai đoạn 3Giai đoạn 1

Lai với probe

và kiểm tra bằng kỹ thuật phóng xạ tự ghi

Giai đoạn 2

QUI TRÌNH SOUTHERN BLOT

Giai đoạn 1

Tách chiết DNA cần nghiên cứu Cắt DNA nghiên cứu bằng enzyme cắt giới hạn Tiến hành điện di hỗn hợp DNA vừa được cắt, trên gel agarose

Làm biến tính các dải băng DNA trên gel agarpose dd NAOH 0,4M thành các sợi đơn

- Màng được sử dụng là màng nitocellulose hoặc màng nylon.

- Nguyên tắc: dựa vào nguyên tắc mao dẫn

• Đệm từ phía dưới được thấm một cách tự nhiên lên

trên chuyển các mảnh DNA từ gel lên màng và bám chặt vào màng ( thời gian chuyển dựa vào các phương pháp chuyển khác nhau).

- C ách tiến hành:

• Đặt gel lên giá chuyển máy Blotting để chuyển nguyên

vẹn các sợi ADN biến tính.

• dung dịch dẫn chuyển là NaOH 0,4M.

GIAI ĐOẠN II

Máy bloting

DNA có định trên màng lai kết hợp với probe(đã được đánh dấu) theo nguyen tắc bổ sung

Rửa và loại bỏ mẫu không tham gia phản ứng lai trên màng lai

Phát hiện vị trí lai nhờ phóng xạ tự ghi Đặt phim lên tấm lọc

Tráng phim để thu các vạch đen tại nơi phát xạ

GIAI ĐOẠN III

LAI VỚI MẪU DÒ  KẾT QUẢ

LAI TRÊN MÀNG ĐẶT PHIM LÊN TẤM LỌC TRÁNG PHIM

- Phát hiện sự đa dạng DNA qua các cá thể khác nhau của 1 loài

- Phát hiện các thể đột biến gen

-là kĩ thuật phân tích sự đa hình VỀ CHIỀU DÀI,

của các mảnh DNA bị cắt đoạn.

Nguyên lí:

- Dựa trên sự sai khác của phổ băng điện di và độ dài của các phân đoạn bị cắt bởi RE

- Số lượng đoạn cắt khác nhau được phân biệt

bằng điện di đồ nên còn được gọi là dấu vân tay (finger printing) đặc trưng cho từng phân tử DNA.

Kĩ thuật RFLP

Kỹ thuật RFLP

Các bước tiến hành:

 Tách chiết và tinh sạch DNA.

 Cắt các mẫu DNA bằng một cặp RE

 Điện di sản phẩm DNA sau khi đã xử lí

 Làm biến tính DNA bằng nhiệt độ cao.

 Chuyển lên màng lai nitrocellulose, hoặc

DNA FINGERPRINTING

SO SÁNH 2 MẪU  TÌM RA THỦ PHẠM

Tài liệu tham khảo

- Diễn dàn nhà sinh học trẻ : nhasinhhoctre.com

- youtube.com

- báck khoa toàn thư mở: vi.wikipedia.org

Click to edit subtitle style