Sinh học phân tử - CHƯƠNG VI.doc

Sinh học phân tử

CHƯƠNG VI PHIấN MÃ, SINH TỔNG HỢP RNA

I Đặt vấn đề

Hiện nay nhờ thành tựu của công nghệ xác định trình tự DNA toàn genome, chúng ta có thể xác định đợc số lợng gen của một số sinh vật từ đơn giản đến phức tạp

nh : vi khuẩn E Coli có 3200 gen, nấm men Saccharomyces cerevisiae có 6300 gen,

ruồi dấm có 13.600 gen Tại hội nghị khoa học Quốc tế về genome ngời năm 2000, các nhà khoa học dự đoán ở ngời có từ 26000 đến 150000 gen, chính xác hơn là 25947 gen Nh vậy tại sao ngời có tổ chức bộ não phức tạp nh vậy mà chỉ có số lợng gen lớn

gấp đôi loài giun tròn và tơng tự nh cỏ cay (Arabidopsis thaliana) Điều này đợc lí giải

vào cuối những năm 1970, khi ngời ta phát hiện thấy gen có cấu trúc khảm, bao gồm những đoạn exon xen kẽ những đoạn intron Protein của sinh vật bậc cao đợc tổng hợp

từ một gen chứ không phải là một sợi liên tục gồm nhiều gen nh ở vi khuẩn mRNA là một tập hợp của nhiều đoạn nhỏ exon đợc nối lại của 1 gen, còn những đoạn intron bị cắt bỏ trong quá trình thành thục, nhờ bộ máy sinh học có tên là spliceosome, sau đó các mRNA chớn mới ra ngoài tế bào chất để tổng hợp nên protein Nhờ cơ chế cắt và gắn khác nhau mà một gen có thể tạo ra đợc nhiều mRNA và nhiều protein, thí dụ ở ngời có khoảng 25000 gen nhng đã phát hiện có hơn 100000 protein Trong chơng này chúng ta sẽ nghiên cứu quá trình phiên mã gen và thành thục của mRNA ở cả 2 hệ thống sinh vật: tiền nhân và nhân chuẩn

II Quỏ trỡnh phiờn mó ở prokaryote

1 Quỏ trỡnh phiờn mó tạo ra RNA từ khuụn DNA (gen) nhờ enzyme RNA polymerase

- RNA được tổng hợp từ một sợi khuụn DNA theo cơ chế bổ sung A-U và C-G

- Khi tổng hợp, 2 mạch đơn của DNA phải tỏch rời nhau, nếu promoter nằm ở bờn trỏi (đầu 5’) thỡ một mạch đơn nguyên bản từ đầu 3’  5’ của DNA sẽ được dựng làm khuụn (hỡnh 1.6), sợi RNA được tổng hợp luôn kéo dài từ đầu 5’ – 3’

- Trình tự các nu trên RNA giống hệt với mạch đơn nguyên bản 5’ – 3’, chỉ khác thay

T bằng U

- Trong bộ genome, các gen ở các vị trí khác nhau, tùy vị trí của promoter nẵm ở đầu 3’ hay 5’ của gen đú mà hớng tổng hợp sẽ khác nhau

- RNA polymerase phải đợc gắn vào promoter mới phiờn mó để tổng hợp sợi mRNA

- Ở sinh vật tiền nhõn người ta phỏt hiện cú 2 loại RNA polymerase:

+ Primase tổng hợp đoạn RNA mồi dựng trong quá trình tỏi bản của DNA

+ Loại khỏc tổng hợp cả 3 loại RNA (m, t và r RNA), có khả năng bọc đợc nhiều promoter của nhiều gen khác nhau

- Quỏ trỡnh phiờn mó mang tớnh chớnh xỏc cao, nhưng do khụng cú cơ chế sửa sai đi kốm nờn độ chớnh xỏc kộm hơn quỏ trỡnh tỏi bản DNA

- Do RNA khụng được sao chộp lại, trừ trường hợp ở một số RNA của virut, nờn nếu

bị sai sút thỡ chỉ cú tỏc động tức thời khụng truyền lại cho thế hệ sau

Hỡnh 1.6 Phiờn mó tổng hợp RNA trờn cơ sở sợi khuụn DNA kộp

- Vị trớ mà enzyme RNA polymerase bọc lấy trờn phõn tử DNA là một đoạn bắt đầu của 1 operon gọi là promoter Tốc độ phiờn mó tối đa của một đoạn DNA của gen nhất định phụ thuộc vào trỡnh tự cỏc bazơ của promoter (hỡnh 2.6) Promoter thường nằm ở đầu phớa 5’ kể từ vị trớ bazơ xuất phỏt phiờn mó, đoạn từ nu thứ -10 → -35 đõy là vựng promoter mà RNA polymerase sẽ bọc lấy Nếu đột biến một trong số cỏc bazơ ở vựng promoter, như hỡnh vẽ 2.6, sẽ gõy ảnh hưởng khỏc nhau đến quỏ trỡnh phiờn mó đặc biệt nếu đột biến cỏc bazơ ở 2 hộp vị trớ thứ -10 và -35

Hỡnh 2.6 Trỡnh tự DNA đặc thự ở vựng promoter đúng vai trũ quan trọng ảnh hưởng đến hiệu quả phiờn mó của enzyme RNA polymerase Trỡnh tự 2 hộp -35 và -10 trước điểm bắt đầu phiờn mó này rất ổn định ở tất cả cỏc promoter của E.coli Cỏc trường hợp đột biến thay thế hoặc mất một vài nu ở vựng này sẽ ảnh hưởng khỏc nhau đến tốc độ của quỏ trỡnh phiờn mó

2 Chỉ 1 trong 2 mạch đơn của DNA được dùng làm khuôn để tổng hợp RNA

- 2 mạch đơn của DNA đều có thể

được dùng làm khuôn để phiên mã,

khi đó sẽ sinh ra 2 mRNA khác nhau,

khi dịch mã sẽ cho ra 2 polypeptide

khác nhau Hình 3.6 tr×nh bÇy vị trí

gắn cña enzyme RNA polymerase

- Quyết định mạch nào làm khuôn là

do enzyme RNA polymerase quyết

định, do vị trí gắn và hướng di

chuyển từ bên phải hay bên trái đoạn

DNA (gen) của enzyme quyết

định(hình 3.6)

- Hướng tổng hợp RNA luôn luôn từ

đầu 5’-3’ tương ứng lÊy sợi đơn

nguyên bản từ 3’-5’ lµm khu«n, do

vậy vị trí của promoter nằm ở phía bên nào của gen sẽ quyết định sợi nào sẽ làm nguyên bản và kết quả tạo ra mRNA nào

- Tuỳ từng gen (alen), trội hay đồng trội mà một hoặc có thể cả 2 nhiễm sắc thể đều được dùng làm khuôn, cã mét sè trường hợp gen phiên mã chỉ xảy ra ở 1 nhiễm sắc thể, hoặc có thể xảy ra ở nhiều gen lặp lại VËy vấn đề là khi đó liệu có xảy ra hiện tượng khuếch đại gen hay triệt tiêu lẫn nhau hay không, và trong trường hợp nào sẽ xẩy ra thì cần phải được làm sáng tỏ cụ thể

3 Đặc điểm cấu tạo của enzyme RNA polymerase

- Ở sinh vật tiền nhân, enzyme RNA polymerase có cấu tạo bậc 4 phức tạp, gồm 5

chuỗi polypeptide ’, , ,  và , nối với nhau bằng liên kết hóa học yếu Gen và khối lượng phân tử cña từng chuỗi cấu thành enzyme RNA polymerase gồm như sau:

Protein MW (dalton) Gen

H×nh 3.6 VÞ trÝ vµ híng tæng hîp cña RNA pol

- Vị trớ xỳc tỏc trựng phõn để tạo ra RNA nằm ở polypeptide beta, polypeptide này cũn

là nơi chất khỏng sinh rifampicin bọc vào Protein sigma cú chức năng nhận biết promoter và khởi động quỏ trỡnh tổng hợp RNA

- Ở sinh vật nhõn thật cú 3 loại RNA polymerase trong tất cả cỏc tế bào, mỗi chỳng cú vai trũ nhất định Mỗi loại RNA (r,t,m) được mó húa bởi một loại enzyme RNA polymerase RNA polymerase I (RNA-PI) tồn tại ở trong nucleolus, xỳc tỏc cho việc tổng hơp rRNA Việc tổng hợp ra cỏc mRNA là do RNA polymerase II (RNA-PII) đảm nhận, cú mặt ở trong nucleoplasm, là dịch protoplasm cú ở trong nhõn của tế bào sinh vật nhõn thật Enzyme này cú thờm chức năng gắn đuụi poly A nhờ enzyme poly (A) polymerase Cũn tRNA và cỏc RNA nhỏ khỏc nằm trong nhõn và tế bào chất được xỳc tỏc bởi enzyme RNA polymerase III Do vậy chứng tỏ cú ớt nhất 3 loại promoter tương ứng khỏc nhau cựng tồn tại và điều hoà một cỏch độc lập 3 loại gen này

III Quỏ trỡnh phiờn mó ở prokaryote

Chia làm 3 giai đoạn: khởi động, kộo dài và kết thỳc

1 Giai đoạn khởi động

Giai đoạn này lại gồm: tiền khởi động, khởi động và rời khỏi promoter của

RNA polymerase Enzyme RNA polymerase, khởi động khụng cần mồi, nhờ cú tiểu

đơn vị  nhận biết được đúng trỡnh tự của promoter để khởi động Nhiều nghiờn cứu gây tạo đột biến mất  cho thấy RNA polymerase ở thể đột biến này bắt đầu phiờn mó

từ những vị trớ tựy tiện khỏc nhau so với khi cũn  (dạng khụng đột biến) thỡ cú khả năng gắn chuyờn biệt vào đỳng chỗ promoter Promoter cú 2 hộp chứa trỡnh tự mỗi hộp gồm 6 nu, ở cỏch vị trớ bắt đầu tổng hợp RNA 10 cặp bazơ (trỡnh tự -10), cũn trỡnh

tự kia cỏch -35 bp (trỡnh tự -35) Hỡnh 4.6 trình bầy trình tự cấu trỳc 3 loại promoter của 3 operon là Lac, Trp và bio B Tryptophan synthetase là enzyme xỳc tỏc cho quỏ

trỡnh kết hợp giữa indole với serine để tạo thành tryptophan Ở E.coli enzyme tổng hợp

tryptophan là một phức hợp gồm 4 cấu tử (2 chuỗi  và 2 chuỗi ) Indole là một hợp chất hoỏ học của tiền tryptophan

Hỡnh 4.6 Trỡnh tự 3 promoter của Lac, Trp và BioB operon

- Hộp pribnov (Pribnov box) là một đoạn DNA nằm ë phía trước điểm bắt đầu phiªn m· của gen cấu trúc sinh vật tiền nhân, ở đó tiểu đơn vị  của RNA polymerase bọc lấy, gồm 6 nu, thường có trình tự là 5’-TATAAT-3’

- RNA polymerase gắn vào promoter theo 2 bước, trước hết nó nhận biết và gắn một cách lỏng lẻo vào trình tự hộp -35 hình thành một phức hợp "đóng" Sau đó ở trình tự hộp -10 sẽ tháo xoắn dần, tạo ra sợi đơn DNA “mở" dưới dạng tự do, làm khuôn để sinh tổng hợp RNA Chính vì thế, promoter là vùng locus ảnh hưởng đến hoạt tính của gen, nên người ta thường gọi promoter là cis-acting loci Promoter locus không tổng hợp protein nhưng là nơi gắn của những protein bọc DNA tương tự như enhancer

và operator

- Sau khi liên kết phosphodiester đầu tiên của mRNA đầu 5’ được tổng hợp thì RNA polymerase phải rời khỏi promoter và đầu 5’ của mRNA được giải phóng Khi phiên

mã được 23 nu thì RNA polymerase trượt hẳn ra và giai đoạn kéo dài bắt đầu Quá trình này phụ thuộc vào ATP

2 Giai đoạn kéo dài

Khi phân tử RNA bắt đầu kéo dài từ điểm khởi đầu mạch khuôn được 8 nu thì tiểu cấu tử  của RNA polymerase tách khỏi phức hợp enzyme Lúc bấy giờ cấu tử  lại có thể gắn vào một promoter khác để khởi động một quá trình phiên mã mới Quá trình tách rời  là cần thiết để mạch RNA tiếp tục kéo dài vì nếu vẫn còn cấu tử  thì enzyme RNA polymerase không thể tiếp tục kéo dài theo sợi khuôn DNA, thay thế vào vị trí cấu tử  là các nhân tố kéo dài (EF, elongation factor)

Trong quá trình kéo dài, RNA polymerase tháo xoắn liên tục phân tử DNA khuôn trên theo một chiều dài khoảng 17 nu (kể từ điểm kéo dài cuối cùng) theo tiến triển của quá trình sinh tổng hợp

Sợi RNA mới sẽ tách dần khỏi mạch khuôn DNA trừ một đoạn khoảng 12 nu bắt đầu từ điểm tăng trưởng vẫn còn liên kết với DNA

Phần DNA bị tháo xoắn sau sẽ được RNA polymerase xoắn trả trở lại

3 Giai đoạn kết thúc

Khi RNA polymerae kéo dài sinh tổng hợp mRNA tiến đến vùng DNA trên khuôn, nơi có trình tự kết thúc (terminator) (h×nh 6.6) Khi RNA polymerase trượt tổng hợp qua hết trình tự kết thúc thì quá trình sinh tổng hợp mRNA bị ngừng, enzyme RNA polymerase sẽ nhả sợi DNA khuôn ra và sau đó lại có thể hoạt động ở sợi khác Dấu hiệu kết thúc có thể là một cấu trúc đặc biệt trên sợi khuôn DNA, dài khoảng

30bp gồm 2 trình tự đối xứng bổ sung dµi 7 bp c¸ch nhau một khoảng 7bp, tiếp đến là trình tự gồm 7bp là 5’-TTTTTTT-3’

Vì quá trình tổng hợp RNA luôn lấy sợi đơn hướng 3’-5’ của DNA làm khuôn, nên hướng tổng hợp luôn từ trái sang phải Kết quả sẽ tạo được sợi mRNA có 2 trình

tự đối xứng bổ sung ở trình tự kết thúc, chúng sẽ bắt cặp với nhau để hình thành nên một dạng kẹp tóc “hairpin” ngăn không cho RNA polymerase tiếp tục tổng hợp nữa Phần sợi khuôn DNA nằm sau RNA polymerase sẽ trở lại cấu trúc ban đầu và tách rời khỏi enzyme Sợi RNA mới được tổng hợp (hình 5.6)

Hình 5.6 Trình tự đoạn DNA terminator và cơ chế hình thành nên cấu

trúc kẹp tóc kết thúc quá trình phiên mã một gen

IV Quá trình phiên mã ở Eukaryote

1. Sự khác nhau trong quá trình phiên mã giữa Eukaryote và prokaryote

5’-CCCAGCCCGCCTAATGAGCGGGCTTTTTTT -3’

3’-GGGTCGGGCGGATTACTCGCCCGAAAAAAA-5’

5’-CCCAGCCCGCCUAAUGAGCGGGCUUUUUUU -3’

Hình thành cấu trúc kẹp tóc

U

A G A

G C G C G C G C

C

5’-CCCA UUUUUUU -3’

mRNA DNA đoạn terminator

Hình 6.6 So sánh quá trình dịch mã tạo mRNA và tổng hợp protein giữa 2 sinh vật tiền nhân và nhân thật mRNA của tiền nhân thường gồm nhiều mRNA cấu trúc ghép lại tạo thành Đầu 5’ của mRNA bắt đầu dịch mã hoặc phân rã thì đầu 3’ vẫn còn đang phiên mã mRNA của sinh vật nhân thật là một sợi đơn của một gen, một mRNA mã hoá 1 polypeptide Trong quá trình phiên mã mũ methyl được gắn vào đầu 5’, sau phiên mã xong poly A mới gắn vào đầu 3’ mRNA bắt buộc phải được vận chuyển ra tế bào chất qua lỗ màng nhân, tại đây mới tiến hành quá trình dịch mã

Số loại RNA

polymerase

tham gia

Chỉ có một loại mã cho tất cả các gen

Có 3 loại, loại I mã cho rRNA, II cho các mRNA và III cho các tRNA và các RNA nhỏ khác Loại I nằm trong

tæ chøc nucleolus, II và III nằm trong chất nh©n nucleoplasm

Phiên mã và

dịch mã

Phiên và dịch mã cùng tiến hành

Phiên mã xong rồi mới tiến hành dịch mã

Phiên mã

tạo mRNA

Tạo ra mRNA chín ngay, không cần phải qua một giai đoạn biến đổi nào

Phiên mã tạo ra tiền mRNA xảy ra ở trong nhân, biến đổi rồi cắt các intron đi để tạo ra mRNA chin, gồm các đoạn exon ghép nối lại, rồi đi ra ngoài tế bào chất

Cấu tạo của

mRNA

Không có cấu tạo phần đầu và đuôi đặc thù

Đầu 5’ có đính cap 7 methyl Gppp, đầu này được thêm vào trong quá trình phiên mã Cap 7 N6 Gppp có thể đóng vai trò định hướng cho ribosome bắt đầu dịch mã

ở đúng codon AUG Đầu 3’ có gắn poly A được đính vào sau khi phiên mã (chưa rõ vai trò) Riêng mRNA tạo protein histone thì không có đuôi poly A

Tổng hợp

protein (dịch

mã)

Tiến hành ở tại tế bào chất cả hai quá trình phiên mã và dịch mã ra protein

Phiên mã xảy ra ở trong nhân, dịch mã xẩy ra ở tế bào chất, do vậy mRNA chín phải chui qua lỗ nhân để ra tế bào chất

Quá trình

khởi động

phiên mã

Đáp ứng tức thì với những điều kiện môi trường biến đổi (xem cơ chế điều hòa)

Không đáp ứng kịp thời với yêu cấu ngoại cảnh thay đổi vì cấu tạo cơ thể là đa bào và cầu trúc phức tạp giữa proten histone với DNA, khởi động chỉ xảy ra sau khi

có những thay đổi khiến phức hợp trở lên lỏng lẻo

Một mRNA Chứa thông tin di

truyền của nhiều gen, mã hóa cho nhiều chuỗi polypeptide nên gọi

là polycistron

Một mRNA mã hóa cho 1 chuỗi polypeptide, mỗi gen phiên mã ra một mRNA Như vậy 1 gen bao gồm 3 vùng: Vùng đầu 5’ mang các trình tự điều hòa biểu hiện của gen và hoạt hóa quá trình phiên mã, vùng 2 để phiên mã gồm các intron và exon và vùng 3 chưa xác định được chức năng

Hỡnh 7.6 Cấu trỳc tổng quỏt

của một gen gồm: đoạn

upstream, vùng điều khiển

chứa Operator trong chứa

Promoter, tiếp đến là vựng

downstream, tớnh từ điểm bắt

đầu phiờn mó đến điểm kết

thỳc phiên mã (terminator)

Đoạn từ điểm bắt đầu phiên

mã đến điểm bắt đầu dịch mó

là vùng đầu 5’ downstream không dịch mã (5’UTR) Tiếp đến là vùng dịch mã tạo polypeptide tớnh từ codon AUG đến một trong bộ 3 codon: UAA, UAG hoặc UGA của vùng terminator Tiếp theo đến hết đầu 3’ của mRNA trớc điểm gắn đuôi polyA lại là một đoạn không phiên mã 3’UTR nữa

2 Cỏc giai đoạn phiờn mó của Eukaryote

a Giai đoạn khởi động

RNA polymerase II bọc lấy 1 vị trớ ở promoter So sỏnh trỡnh tự của cỏc promoter và vị trớ bọc của cỏc RNA polymerase II tương ứng của > 200 gen khỏc nhau, người ta đó phỏt hiện thấy chỳng đều cú 2 trỡnh tự đặc thự nằm ở vị trớ bazơ 25

và 75 từ điểm bắt đầu phiờn mó (-25 sequence và -75 sequence) Trỡnh tự ở vị trớ -25 gọi là hộp Hogness (Hogness box) hay hộp TATA (TATA box), cú trỡnh tự là TATAAAA, cũn tại vị trớ - 75 là GGCCAATCT

RNA polymerse II bắt đầu hoạt động nhờ nhõn tố phiờn mó TF (transcriptional factor), cú bản chất protein (Hình 8.6) Trước tiờn nhõn tố TFIID nhận biết và gắn vào trỡnh tự TATAAAA, bước tiếp theo là việc gắn thờm nhõn tố TFIIA, lỳc đú RNA polymerase liờn kết với TFIIB sẽ gắn vào phức hợp TFIID-TFIIA Khi đó cần một phõn tử ATP thủy phõn để giải phúng ra năng lượng làm tỏch sợi DNA kép thành 2 sợi đơn (trạng thái mở), cuối cựng nhõn tố TFII E cho phộp khởi động phiờn mó

b Giai đoạn kộo dài

Tương tự như quỏ trỡnh sinh tổng hợp DNA, chỉ khỏc là trong thành phần cỏc nucleotide cú đường là ribose và chỉ cú 1 sợi đơn (sense) là được copy và thu được một sợi mRNA có trình tự bổ sung Quỏ trỡnh này tiến hành từ nhõn tố TFIIF (hỡnh

8.6) Đớnh từng nu một vào đầu OH của C3’ của đờng ribose và chuỗi mRNA sẽ kộo dài từ đầu 5’  3’ và giải phúng ra hợp chất cao năng NDP

c Giai đoạn kết thỳc

- Xảy ra tại trỡnh tự kết thỳc đặc thự (specific terminator sequence) ở trong phân tử DNA khuôn

- Ở hầu hết cỏc sinh vật tiền nhõn, tận cựng của mRNA đều cú trỡnh tự 5’UUUUUUA 3’, chứng tỏ trỡnh tự 3’AAAAAAT 5’ của DNA sợi sense chắc chắn là trỡnh tự điều khiển quỏ trỡnh kết thỳc phiờn mó

- Ngoài ra có một số gen, dấu hiệu kết thỳc cũn đũi hỏi phải có sự tham gia thêm của một loại protein cú tờn là rho, một số khỏc thỡ có thể khụng cần

- Đối với sinh vật nhõn thật sự hiểu biết về cơ chế điều khiển quỏ trỡnh này cũn hạn chế, tuy nhiờn thường quá trình phiờn mó tiến đến trước điểm tạo đuụi poly (A) một

đoạn khá xa thì xẩy ra cơ chế cú liờn quan đến việc hỡnh thành cấu trỳc dạng kẹp túc (hairloop structure) tiếp ngay sau đú là vựng giàu CG

- Kết quả sinh ra đầu tiờn của quỏ trỡnh phiờn mó, xảy ra ở trong nhõn là tiền mRNA, muốn dịch mó thỡ tiền mRNA phải “chớn hoặc trưởng thành” và di chuyển ra tế bào chất (quỏ trỡnh này gọi là maturation của mRNA)

Hỡnh 8.6 Cơ chế khởi động RNA polymerase nhờ cỏc nhõn tố phiờn mó TF

a) Đầu tiờn phức hợp TFIID ngắn vào hộp TATA qua tiểu đơn vị TBP của mỡnh b) Sau đú TFIID gắn ổn định được là bởi phối hợp thêm với TFIIA c) Tiếp đến TFIIB và TFIIH kết hợp để cựng tạo thành phức enzyme với RNA polymerase tại TATA d) Lỳc này RNA polymerase II mới cú thể nhập được vào phức hợp cỏc nhõn tố phiờn mó trờn Cả phức hợp RNA polymerase II,TFIIE và TFIIF được định hỡnh bởi TFIIB và đầu tụ tập carboxyl được bọc bởi TFIID (TFIID-bound CTD), kết quả là quỏ trỡnh phiờn mó bắt đầu xẩy ra(e)

d Quỏ trỡnh trưởng thành của tiền mRNA sinh vật nhõn thật (maturation)

- mRNA chớn là RNA cú thể sẵn sàng tiến hành dịch mó để tạo ra protein mRNA chớn được sinh ra từ tiền mRNA thụng qua một số bước sau :