GIẢI TRÌNH TỰ DNA pot

HAI PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ DNAPhương pháp hoá học giải trình tự DNA của Maxam & Guilbert 1977 Nobel hóa học 1980 phương pháp giải trình tự Walter Gilbert Phương pháp enzyme giải t

GIẢI TRÌNH TỰ DNA

DNA SEQUENCING

2 HAI PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ DNA

Phương pháp hoá học giải trình tự DNA

của Maxam & Guilbert (1977)

Nobel hóa học 1980 (phương pháp giải trình tự)

Walter Gilbert

Phương pháp enzyme giải trình tự của

Frederick Sanger (1977)

Nobel hoá học 1958 (cấu trúc protein: Insulin)

Nobel hóa học 1980 (phương pháp giải trình tự)

2.1 GIẢI TRÌNH TỰ DNA BẰNG PP HÓA HỌC

1 Đánh dấu một đầu của đoạn DNA bằng gốc phospho

3 Điện di mẫu DNA đã xử lý trong 4 ống nghiệm này trên 4 hàng của một gel polyacrylamide biến tính

Autoradiography

Dựa trên nguyên tắc dùng enzyme polymerase để tạo sợi bổ sung từ mồi cho sợi khuôn, nhưng do trong

bị chặn lại và kết quả là sẽ có các sợi bổ sung với độ dài khác nhau

2.2 GIẢI TRÌNH TỰ DNA BẰNG PP ENZYM

ddNTP dNTP

Bốn phản ứng polymer hoá

xảy ra trong 4 ống riêng biệt

Tỉ lệ dNTP và ddNTP

= 100 : 1 Mồi được đánh dấu

T 3’ C G C A G T C C T A G C T T A G C G

G 5’

A C G

T

Áp gel điện di lên phim (mồi đánh dấu bằng phóng

xạ hay bằng hoá quang), các vạch điện di trên gel

sẽ hiện trên phim.

ĐÁNH DẤU ddNTP

Sequence-specific primer

1 Gắn ddNTP ngẫu

nhiên, khi xẩy ra,

p/ứng ngừng.

2 Vì nhiều copy của

DNA đích được tạo

GIẢI TRÌNH TỰ BẰNG ĐIỆN DI MAO QUẢN

1 Dùng gel polyacrylamide biến

tính, có độ phân giải cao, có

thể phân biệt các đoạn DNA

khác nhau chỉ 1 nucleotid.

2 Gel polyacrylamide thường

chứa urea (tác nhân làm biến

tính DNA)

Bước 2: Phản ứng chu kỳ giải trình tự (cycle sequencing reaction)

denaturation

Primer annealing

Product extension

PCR machine Tủa sản phẩm giải trình tự

loại bỏ chất đánh dấu thừa

Bước 3: Điện di trên máy giải trình tự

1 Mỗi ddNTP được gắn một màu khác nhau.

2 Sản phẩm PCR được phân loại dựa trên kích

thước (khác nhau 1 nt), khi chạy qua khu vực

phát hiện sẽ được phân tích nhờ chùm tia laser

và bộ phận detector.

3 Dữ liệu được ghi nhận gồm cường độ huỳnh

quang thu được và màu sắc của mỗi đoạn DNA.

4 Trình tự của đoạn DNA được đọc theo chiều 5’ đến 3’, từ trái sang phải.

Automated DNA Sequencing with Fluorescent Dyes

Mỗi ddNTP có một màu khác nhau, ddTTP đỏ, ddGTP đen,…

1 Tối ưu hóa phản ứng PCR phải thật sự hoàn chỉnh

Hệ thống giải trình tự Trugene

Siemens Medical Solutions Diagnostics

CEQ 8000 (Beckman Coulter)

ABI 3130 ABI 3130 XL

4 Cappilaries 16 Cappilaries

CÁC HỆ THỐNG GIẢI TRÌNH TỰ TỰ ĐỘNG

ABI 3730

5 PYROSEQUENCING

Giải trình tự bằng phương pháp tổng hợp, không điện di

= pyrophosphate

=pyrophosphate

Peaks in pyrogram reflect nucleotide sequence

Mostafa Ronaghi và Pal Nyrén tại Royal Institute of Techology ở Stockholm 1990s

~500 MB on one plate, in just a few hours

Step 1: DNA đích, Primer, ủ với enzym DNA polymerase, ATP sulfurylase, luciferase, apyrase, và cơ chất là APS

(adenosine 5’phosphosulphat) và luciferin

Step 2: 4 dNTP được đưa vào phản ứng DNA

polymerase xúc tác gắn dNTP vào sợi DNA tiếp theo

vào, sẽ phóng thích 1 pyrophosphat (PPi)

ATP tạo thành cung cấp

năng lượng cho luciferin

- Genotype virus và vi khuẩn

Đặc biệt là loại mới, nguy

Pyrosequencing technology

(DNA) n + dNTP Polymerase (DNA) n-1 + PPi

STEP 1: Hybridization of sequencing primer to ssDNA

Incorporation dNTP with release of PPi

STEP 2: Conversion of to ATP by sulfurylase

Released ATP drives conversion of

luciferin to oxyluciferin by enzym luciferase.

which produces light that is detected by the CCD

and results in a pyrogram

Apyrase

Apyrase

dNTP dNTP + dNMP + phosphate ATP ADP + AMP + phosphate

STEP 3: Degradation of unincorporated dNTP’s and excess ATP by apyrase After degradation the next dNTP

is added

STEP 4: The complementary DNA strand is build up as the process continues The sequence is determined from the signal peaks in the pyrogram

6.1 Giải trình tự bộ gen người

HGP (10/1990): Viện quốc gia Y tế Hoa kỳ (3 tỉ USD)

- 6/2000: Crag Venter và Francis Collins

97% bộ gen người được giải mã

- 4/2003 (kỷ niệm 50 năm mô hình DNA của W-C)

Hoàn tất giải mã bộ gen người

- Bước vào kỷ nguyên Post-genomic và Proteomic

- Giá thành 2001: 1us / 1bp,

10 đến 15 năm nữa: 0,01 us/ 1bp

6 ỨNG DỤNG CỦA GIẢI TRÌNH TỰ DNA

6.2 Định danh VSV: VK kỵ khí: giải trình tự một

đoạn đặc hiệu cho giống và loài ở gen 16S

6.3 Định danh nấm: giải trình tự một đoạn đặc hiệu cho giống và loài ở gen 28S rDNA

6.3 Xác định genotype của các VR, VSV…

HCV: genotype 1 (1a, 1b), 2 (2a, 2b, 2c)…

HPV: high-risk, low-risk…

6.4 Phát hiện các đột biến, đột biến kháng thuốc

 HBV kháng lamivudine: Lamivudin ức chế virus và

làm giảm tình trạng viêm Đột biến thường xảy ra trong vùng YMDD (tyrosine, methionine, aspartate, aspartate) của protein polymerase của virus

 Lao kháng thuốc Rifampicine, INH…

Sau khi xác định trình tự một đoạn DNA quan tâm, so sánh với ngân hàng dữ liệu gene của NCBI

(National Center Biotechnology Information)

…

Genome Sequencer FLX System

1 million high-quality reads per run and

read lengths of 400 bases

Genome Analyzer Iix - Illumina

MỘT SỐ HỆ THỐNG GIẢI TRÌNH TỰ MỚI