Nghiên cứu này được thực hiện nhằm mô tả đột biến trên codon 12 và 13 của gen KRAS, giúp quyết định chỉ định kháng thể đơn dòng cho bệnh nhân. Nghiên cứu thực hiện từ tháng 01/2011 đến tháng 05/2013, 173 bệnh nhân ung thư đại trực tràng được khảo sát đột biến codon 12 và 13 của gen KRAS tại Trung tâm Y Sinh học Phân tử - Đại học Y Dược TPHCM.
Trang 1TRÀNG BẰNG KỸ THUẬT COLD‐PCR VÀ GIẢI TRÌNH TỰ DNA
Hoàng Anh Vũ*, Hứa Thị Ngọc Hà**
TÓM TẮT
Giới thiệu: Tăng biểu hiện của thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu mô thường gặp trong ung thư đại trực
tràng (UTĐTT) và là đích điều trị của kháng thể đơn dòng. Tuy nhiên, sự kháng thuốc xảy ra khi có đột biến gen KRAS trong tế bào ung thư. Nghiên cứu này được thực hiện nhằm mô tả đột biến trên codon 12 và 13 của gen KRAS, giúp quyết định chỉ định kháng thể đơn dòng cho bệnh nhân.
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Từ tháng 01/2011 đến tháng 05/2013, 173 bệnh nhân UTĐTT
được khảo sát đột biến codon 12 và 13 của gen KRAS tại Trung tâm Y Sinh học Phân tử – Đại học Y Dược TPHCM. Chúng tôi sử dụng kỹ thuật COLD‐PCR (co‐amplification at lower denaturation temperature polymerase chain reaction) để khuếch đại exon 2 của gen KRAS từ bệnh phẩm là mô vùi nến. Sau đó, đột biến của gen KRAS được xác định bằng kỹ thuật giải trình tự chuỗi DNA.
Kết quả: 62 trường hợp có đột biến của gen KRAS (35,8%), trong đó 4 trường hợp mang đột biến ở cả hai
codon 12 và 13. Có tất cả 7 dạng đột biến được phát hiện, bao gồm 5 dạng đột biến ở codon 12 (Gly12Asp, Gly12Val, Gly12Ser, Gly12Ala và Gly12Cys) và 2 dạng đột biến ở codon 13 (Gly13Asp và Gly13Ser).
Kết luận: Đột biến codon 12 và 13 của gen KRAS thường gặp trên bệnh nhân Việt Nam bị UTĐTT. Kết
hợp kỹ thuật COLD‐PCR và giải trình tự chuỗi DNA phù hợp cho khảo sát các đột biến này từ bệnh phẩm giải phẫu bệnh.
Từ khóa: ung thư đại trực tràng, đột biến gen KRAS, giải trình tự chuỗi DNA, COLD‐PCR
ABSTRACT
DETECTION OF KRAS MUTATIONS IN COLORACTAL CANCER USING COLD‐PCR
AND DNA SEQUENCING
Hoang Anh Vu, Hua Thi Ngoc Ha
* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 17 ‐ Supplement of No 3 ‐ 2013: 51 ‐ 55
Background: Commonly over‐expressed in colorectal cancer, EGFR is an ideal target for monoclonal
antibody therapy. However, drug‐resistance was observed in patients whose tumor cells harbored KRAS mutations. We conduct this study to describe KRAS mutations at codons 12 and 13 for selecting patients suitable for monoclonal antibody indication.
Materials and methods: From January 2011 to May 2013, 173 patients with colorectal cancer were
analyzed for KRAS mutations at Center for Molecular Biomedicine – University of Medicine and Pharmacy, Ho Chi Minh City. COLD‐PCR (co‐amplification at lower denaturation temperature polymerase chain reaction) was used to amplify KRAS exon 2 from paraffin‐embedded tissue samples. Mutations were identified by direct DNA sequencing.
Results: KRAS mutations were detected in 62 patients (35.8%) including 4 patients who carried double
mutations at both codons 12 and 13. In total, 7 types of mutations were found, of which 5 were at codon 12
* Bộ môn Giải Phẫu Bệnh, Đại học Y Dược TPHCM
** Trung tâm Y sinh học Phân tử, Đại học Y Dược TPHCM
Tác giả liên lạc: TS. Hoàng Anh Vũ ĐT: 0122 299 3537 Email: hoangvuxinh@yahoo.com
Trang 2Conclusion: High frequency of KRAS mutations were found in Vietnamese patients with colorectal cancer.
COLD‐PCR in combination with direct DNA sequencing is suitable for detecting KRAS mutations from pathological samples.
Keywords: colorectal cancer, KRAS gene mutation, DNA sequencing, COLD‐PCR
ĐẶT VẤN ĐỀ
Rối loạn các thụ thể tyrosine kinase, trong đó
có thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu mô (EGFR:
epidermal growth factor receptor), thường gặp
trong ung thư ở người, trở thành những đích
nhắm phân tử hiệu quả trong điều trị. Hoạt tính
tyrosine kinase của EGFR đóng vai trò quan
trọng trong sự điều khiển sự tăng sinh và sống
còn của tế bào, thông qua quá trình tự
phosphoryl hóa thụ thể EGFR hoặc thông qua 2
con đường truyền tín hiệu trung gian hạ nguồn
là con đường PIK3CA/AKT/mTOR và
RAS/RAF/MAPK(4). Sự hoạt hóa của protein
EGFR khởi động cho các dòng thác tín hiệu nội
bào, có liên quan đến một số con đường truyền
tin để gây ra những đáp ứng tế bào vô cùng
quan trọng bao gồm tăng sinh tế bào, biệt hóa tế
bào, sự di động và sinh tồn của tế bào. Trong
ung thư đại trực tràng (UTĐTT), protein EGFR
thường biểu hiện quá mức trên bề mặt tế bào,
được coi là nguồn gốc khởi phát các tín hiệu
tăng sinh tế bào quá độ trong khối u. Ức chế
hoạt tính tyrosine kinase của EGFR là một chiến
lược điều trị thích hợp, đã được nghiên cứu
nhiều trong UTĐTT. Tuy nhiên kháng thể đơn
dòng ức chế đặc hiệu sự hoạt hóa EGFR như
cetuximab hay panitumumab được chứng minh
chỉ có hiệu quả trong điều trị UTĐTT giai đoạn
tiến xa trên nhóm bệnh nhân không mang đột
biến gen KRAS, giúp kéo dài thời gian sống
thêm và thời gian sống không bệnh(2,8). Hiệp hội
ung thư Châu Âu và Hiệp hội ung thư Hoa kỳ
đều khuyến cáo chỉ điều trị cetuximab hay
panitumumab cho những bệnh nhân không
mang đột biến gen KRAS(1,16,17). Gen KRAS là một
thành viên của gia đình gen RAS, mã hóa cho
một guanosine triphosphate GTPase vốn có hai
trạng thái: trạng thái bất hoạt có gắn GDP và
trạng thái hoạt động có gắn với GTP. Là một
chất truyền tin hạ nguồn của EGFR, KRAS có vai trò quan trọng trong việc khởi phát và tiến triển của một số ung thư như carcinôm tuyến của đại tràng, phổi và tụy. Khi đột biến xảy ra sẽ làm mất hoạt tính ATPase và giữ phân tử protein KRAS ở trạng thái gắn ATP liên tục, dẫn đến hậu quả là các phân tử truyền tin hạ nguồn luôn hoạt động để duy trì tín hiệu tăng sinh tế bào(13).
Tại Việt Nam, kháng thể đơn dòng đã được chỉ định cho UTĐTT giai đoạn tiến xa. Nghiên cứu này được tiến hành nhằm xác định tần suất
đột biến tại codon 12 và 13 của gen KRAS ở bệnh
nhân UTĐTT bằng kỹ thuật COLD‐PCR (co‐ amplification at lower denaturation temperature) kết hợp với giải trình tự DNA, giúp quyết định lựa chọn kháng thể đơn dòng cho bệnh nhân một cách phù hợp. Kỹ thuật COLD‐PCR cho phép khuếch đại ưu thế dòng alen mang đột biến, giúp cải thiện độ nhạy của
kỹ thuật giải trình tự chuỗi DNA(10). Trong kỹ thuật này, sau khoảng 10 chu kỳ luân nhiệt đầu tiên với kỹ thuật PCR chuẩn, người ta sử dụng nhiệt độ biến tính thấp trong khoảng 80 – 900C chỉ đủ cho các mạch đôi dị hợp tử có mang đột biến trong sản phẩm PCR duỗi ra để được ưu tiên khuếch đại. Với những điều kiện tối ưu hóa, COLD‐PCR có thể giúp cho giải trình tự DNA đạt độ nhạy <1%, tương đương pyrosequencing
mà không cần trang bị thêm hệ thống mới(18).
ĐỐI TƯỢNG ‐ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu
Chúng tôi tiến hành khảo sát đột biến gen
KRAS cho những bệnh nhân UTĐTT có nhu cầu
được điều trị bằng cetuximab trong thời gian từ tháng 01/2011 đến tháng 05/2013. Bệnh nhân được chẩn đoán xác định UTĐTT bằng tiêu chuẩn giải phẫu bệnh tại Bô môn Giải phẫu
Trang 3bệnh – Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí
Minh.
Tách chiết genomic DNA
Bệnh phẩm là mô vùi nến đã dùng để chẩn
đoán giải phẫu bệnh. Trường hợp là bệnh phẩm
phẫu thuật, vùng mô ung thư được đánh dấu
trên tiêu bản để phân biệt với vùng mô lành
xung quanh, rồi được cạo vào tube ly tâm 1,5
mL bằng các lưỡi dao mỏng riêng biệt (từ 2 – 4
tiêu bản). Những trường hợp bệnh phẩm sinh
thiết quá nhỏ không thể đánh dấu phân biệt
vùng ung thư và mô lành, nếu phần mô ung thư
chiếm ít nhất 30% thì được thu toàn bộ vào tube
ly tâm. Chúng tôi không đưa vào nhóm nghiên
cứu nếu mẫu sinh thiết chứa <30% lượng tế bào
ung thư để tránh khả năng âm tính giả do hạn
chế về độ nhạy của kỹ thuật giải trình tự chuỗi
DNA. Genomic DNA được ly trính bằng bộ kít
ReliaPrep™ FFPE gDNA Miniprep System
(Promega, Mỹ) theo hướng dẫn sử dụng của nhà
sản xuất.
Khuếch đại exon 2 của gen KRAS bằng kỹ
thuật COLD‐PCR
Cặp mồi được thiết kế bằng phần mềm
Oligo 4.1 dựa trên trình tự chuẩn của gen KRAS
mang accession number NG_007524 (mồi xuôi:
CTGTATCAAAGAATGGTCCTGCAC‐3’).
Trong mỗi tube PCR có tổng thể tích 50 μL, các
thành phần gồm có PCR buffer, dNTP (250 μM
cho mỗi loại), 2 loại mồi xuôi và ngược (0,5 μM
cho mỗi loại), 1,25 unit TaKaRa TaqTM HotStart
Polymerase (Takara, Nhật Bản) và 50 – 100 ng
genomic DNA. Chu kỳ luân nhiệt theo kỹ thuật
COLD‐PCR được thực hiện trên máy
GeneAmp® PCR system 9700 (Applied
Biosystems, Mỹ) bao gồm giai đoạn biến tính
ban đầu ở 980C trong 3 phút, theo sau bằng 10
chu kỳ gồm biến tính ở 980C trong 10 giây, gắn
mồi ở 600C trong 15 giây, tổng hợp chuỗi DNA ở
720C trong 40 giây. Tiếp theo, phản ứng tổng
hợp chuỗi DNA được thực hiện với 40 chu kỳ
gồm 5 bước: biến tính ở 980C trong 10 giây, tái
bắt cặp các sản phẩm PCR ở 700C trong 2 phút, phân tách các sản phẩm PCR ở 800C trong 10 giây, gắn mồi ở 600C trong 15 giây và tổng hợp chuỗi DNA ở 720C trong 40 giây. Phản ứng được kết thúc bằng giai đoạn kéo dài sản phẩm ở 720C trong 5 phút. Sản phẩm PCR được phát hiện bằng điện di trên thạch agarose 1,5% có nhuộm ethidium bromide và quan sát dưới màn soi gel Pringraph (Atto, Nhật Bản). Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng QIAquick Gel Extraction kit (Qiagen, Mỹ) và được kiểm tra lại bằng điện di trên thạch agarose 1,5%. Trong mỗi đợt thực nghiệm luôn có một tube chứng âm, trong đó genomic DNA được thay bằng nước cất đã dùng
để pha master mix.
Thực hiện giải trình tự chuỗi DNA
Sản phẩm PCR đã được tinh sạch sẽ được thực hiện phản ứng cycle sequencing với BigDye Terminator Version 3.1 từ Applied Biosystems, theo 2 chiều xuôi và ngược. Sản phẩm sau đó được kết tủa bằng ethanol, hòa tan trong Hi‐Di formamide, biến tính ở 950C trong 2 phút trước khi làm lạnh đột ngột. Trình tự DNA được đọc bằng máy ABI 3130 Genetic Analyzer, với POP‐7 polymer và capillary 50 cm (Applied Biosystems, Mỹ). Kết quả được phân tích bằng phần mềm SeqScape. Quy trình chẩn đoán đột biến gen được thực hiện tại Trung tâm Y Sinh học Phân tử, Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh.
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Đặc điểm mẫu nghiên cứu
Có tất cả 173 bệnh nhân được chọn vào nghiên cứu, gồm 95 nam và 78 nữ (tỷ lệ nam/nữ
là 1,2/1). Bệnh nhân nhỏ tuổi nhất là 19 tuổi, lớn nhất 100 tuổi, với trị số trung vị là 54 tuổi. Khối
u ở đại tràng chiếm nhiều hơn so với ở trực tràng: 122 trường hợp ở đại tràng (70,5%) và 51 trường hợp ở trực tràng (29,5%). Hầu hết bệnh nhân đã được ghi nhận tổn thương có xâm nhập đến lớp thanh mạc (38,7%) hoặc khối u ở giai đoạn tiến xa (36,4%).
Trang 4KRAS đột biến đóng vai trò quan trọng cả
trong hình thành ung thư cũng như sự đề kháng
với điều trị. Trong ung thư đại trực tràng, sự
hiện diện của đột biến gen KRAS là một yếu tố
tiên lượng xấu độc lập và tiên đoán kháng với
điều trị chống EGFR(8). Đột biến KRAS thường
tập trung ở codon 12 và 13, ngoài ra cũng có thể
gặp ở codon 61 và 146 với tần suất rất thấp(7,12).
Tại codon 12 và 13, có 14 kiểu đột biến khác
nhau của gen KRAS đã được ghi nhận trên thế
giới. Vì chưa có số liệu nào về đột biến gen
KRAS trên bệnh nhân Việt Nam, chúng tôi chọn
kỹ thuật giải trình tự chuỗi DNA để có thể phát
hiện được tất cả các kiểu thay đổi nucleotide ở
codon 12 và 13.
Nhằm tăng khả năng phát hiện đột biến gen
KRAS, chúng tôi thực hiện đồng thời 2 giải
pháp. Trước tiên, trong bước nhận mẫu nghiên
cứu chúng tôi chỉ khảo sát đột biến khi bệnh
phẩm có ít nhất 30% số lượng tế bào ung thư.
Tiếp đó, kỹ thuật COLD‐PCR được dùng để
khuếch đại exon 2 có chứa codon 12 và 13. Đây
là kỹ thuật được phát minh bởi Li và cộng sự,
giúp phát hiện được đột biến gen bằng giải trình
tự DNA ngay cả khi chỉ có <1% tế bào mang đột
biến trong mẫu khảo sát(10).
Trong tổng số 173 trường hợp đã khảo sát,
chúng tôi phát hiện 62 bệnh nhân có mang đột
biến gen KRAS, chiếm tỷ lệ 35,8%. Tần suất đột
biến này tương đồng với hầu hết các nghiên cứu
trước đây, vốn dao động trong khoảng 27 –
43%(2,3,5,11). Đặc biệt, trong nghiên cứu này, chúng
tôi phát hiện có 4 bệnh nhân mang đột biến ở cả
2 codon 12 và 13. Đây là những minh họa về
tính đa dòng tế bào trong ung thư nói chung và
UTĐTT nói riêng. Chúng tôi không thấy có mối
liên quan giữa tình trạng đột biến gen KRAS với
vị trí khối u, nhưng đột biến có khuynh hướng
thường gặp hơn trên bệnh nhân nam so với
bệnh nhân nữ (Bảng 1). Bệnh nhân trẻ tuổi (dưới
40 tuổi) cũng ít gặp đột biến gen KRAS hơn so
với nhóm bệnh nhân lớn tuổi. Đây là những ghi
nhận mới, cần được nghiên cứu thêm trong thời gian tới.
Bảng 1: Tương quan giữa đặc điểm bệnh nhân và đột
biến KRAS.
Đặc điểm Đột biến gen
KRAS
Không đột biến gen
Số trường hợp
Tỉ lệ (%)
Số trường hợp
Tỉ lệ (%)
Giới: Nam
Nữ
40 (42,1%)
22 (28,2%)
55 (57,9%)
56 (71,8%)
< 0,01
Tuổi: ≤40
>40
4 (16,7%)
58 (38,9%)
20 (83,3%)
91 (61,1%)
< 0,01
Vị trí: trực tràng đại tràng
20 (36,4%)
42 (35,6%)
35 (63,6%)
76 (64,4%)
0,44
Có tất cả 7 kiểu đột biến tại codon 12 và 13 được phát hiện trên 62 bệnh nhân trong nghiên cứu này (Bảng 2 và Hình 1). Thường gặp nhất là các đột biến Gly12Asp và Gly12Val của codon
12 và Gly13Asp của codon 13. Các số liệu này hoàn toàn tương đồng với các nghiên cứu trước đây trên thế giới(6,9). Kết quả nghiên cứu của chúng tôi giúp ích cho việc xác định những bệnh nhân phù hợp cho chỉ định kháng thể đơn dòng, đồng thời cũng là cơ sở quan trọng cho việc thiết
kế các bộ kít chẩn đoán bằng ASO‐PCR (allele‐ specific oligonucleotide‐PCR) để phát hiện những đột biến gặp trên bệnh nhân Việt Nam.
Bảng 2: Phân phối các đột biến gen KRAS.
Kiểu đột biến
Số trường hợp
Tỷ lệ (n = 173)
Thay đổi nucleotide
Thay đổi amino acid
Cần chú ý rằng tình trạng không đột biến ở
codon 12 và 13 của gen KRAS chưa đủ đảm bảo
cho bệnh nhân có đáp ứng với cetuximab hoặc panitumumab. Các yếu tố kháng thuốc khác bao
gồm đột biến codon 61 và 146 của gen KRAS, đột biến codon 12, 13 và 61 của gen NRAS, đột
Trang 5biến codon 600 của gen BRAF, đột biến exon 9
và 20 của gen PIK3CA(3,14,15) nên được khảo sát
trong các nghiên cứu tiếp theo.
KẾT LUẬN
Đột biến gen KRAS thường gặp trong
UTĐTT ở bệnh nhân Việt Nam. Phát hiện đột
biến gen KRAS bằng kỹ thuật COLD‐PCR kết
hợp giải trình tự chuỗi DNA nên được thực hiện
cho bệnh nhân muốn được được trị bằng kháng
thể đơn dòng cetuximab.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Allegra CJ, Jessup JM, Somerfield MR, Hamilton SR,
Hammond EH, Hayes DF, et al (2009). American Society of
Clinical Oncology provisional clinical opinion: testing for
KRAS gene mutations in patients with metastatic colorectal
carcinoma to predict response to anti‐epidermal growth factor
receptor monoclonal antibody therapy. J Clin Oncol;
27(12):2091‐6.
2 Amado RG, Wolf M, Peeters M, Van Cutsem E, Siena S,
Freeman DJ, et al (2008). Wild‐type KRAS is required for
panitumumab efficacy in patients with metastatic colorectal
cancer. J Clin Oncol.;26(10):1626‐34.
3 Benvenuti S, Sartore‐Bianchi A, Di Nicolantonio F, Zanon C,
Moroni M, Veronese S, et al (2007). Oncogenic activation of the
RAS/RAF signaling pathway impairs the response of
metastatic colorectal cancers to anti‐epidermal growth factor
receptor antibody therapies. Cancer Res;67(6):2643‐8.
4 Ciardiello F, Tortora G (2008). EGFR antagonists in cancer
treatment. N Engl J Med;358(11):1160‐74.
5 Di Fiore F, Blanchard F, Charbonnier F, Le Pessot F, Lamy A,
Galais MP, et al (2007). Clinical relevance of KRAS mutation
detection in metastatic colorectal cancer treated by Cetuximab plus chemotherapy. Br J Cancer;96(8):1166‐9.
6 Domagala P, Hybiak J, Sulzyc‐Bielicka V, Cybulski C, Rys J, Domagala W (2012). KRAS mutation testing in colorectal cancer as an example of the pathologistʹs role in personalized targeted therapy: a practical approach. Pol J Pathol;63(3):145‐
64.
7 Edkins S, OʹMeara S, Parker A, Stevens C, Reis M, Jones S, et
al. (2006) Recurrent KRAS codon 146 mutations in human colorectal cancer. Cancer Biol Ther;5(8):928‐32.
8 Karapetis CS, Khambata‐Ford S, Jonker DJ, OʹCallaghan CJ, Tu
D, Tebbutt NC, et al (2008). K‐ras mutations and benefit from cetuximab in advanced colorectal cancer. N Engl J Med;359(17):1757‐65.
9 Kristensen LS, Kjeldsen TE, Hager H, Hansen LL (2012). Competitive amplification of differentially melting amplicons (CADMA) improves KRAS hotspot mutation testing in colorectal cancer. BMC Cancer.12:548.
10 Li J, Wang L, Mamon H, Kulke MH, Berbeco R, Makrigiorgos
GM (2008). Replacing PCR with COLD‐PCR enriches variant DNA sequences and redefines the sensitivity of genetic testing. Nat Med;14(5):579‐84.
11 Lievre A, Bachet JB, Boige V, Cayre A, Le Corre D, Buc E, et al (2008). KRAS mutations as an independent prognostic factor in patients with advanced colorectal cancer treated with cetuximab. J Clin Oncol;26(3):374‐9.
12 Oliveira C, Westra JL, Arango D, Ollikainen M, Domingo E, Ferreira A, et al (2004). Distinct patterns of KRAS mutations in colorectal carcinomas according to germline mismatch repair defects and hMLH1 methylation status. Hum Mol Genet;13(19):2303‐11.
13 Roberts PJ, Der CJ (2007). Targeting the Raf‐MEK‐ERK mitogen‐activated protein kinase cascade for the treatment of cancer. Oncogene;26(22):3291‐310.
14 Sartore‐Bianchi A, Martini M, Molinari F, Veronese S, Nichelatti M, Artale S, et al (2009). PIK3CA mutations in colorectal cancer are associated with clinical resistance to EGFR‐targeted monoclonal antibodies. Cancer Res;69(5):1851‐
7.
15 Sullivan KM, Kozuch PS (2011). Impact of KRAS Mutations on Management of Colorectal Carcinoma. Patholog Res Int:219309.
16 Van Cutsem E, Nordlinger B, Cervantes A (2010). Advanced colorectal cancer: ESMO Clinical Practice Guidelines for treatment. Ann Oncol;21 Suppl 5:v93‐7.
17 Van Cutsem EJ, Oliveira J, Kataja VV (2005). ESMO Minimum Clinical Recommendations for diagnosis, treatment and follow‐up of advanced colorectal cancer. Ann Oncol;16 Suppl 1:i18‐9.
18 Zuo Z, Chen SS, Chandra PK, Galbincea JM, Soape M, Doan S,
et al (2009). Application of COLD‐PCR for improved detection
of KRAS mutations in clinical samples. Mod Pathol.;22(8):1023‐
31.
Ngày nhận bài báo 08‐06‐2013 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 20‐06‐2013 Ngày bài báo được đăng: 15–07‐2013