Ảnh hưởng của nguồn nitrogen trong môi trường đến sự phát triển và khả năng tổng hợp chất béo của nấm men Rh.. Với tầm quan trọng nêu trên, đề tài: “Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp ca
TỔNG QUAN
T ổng quan về nấm men Rhodotorula
Dựa vào phân loại của Harison thì nấm men Rhodotorula gồm 34 loài, trong đó phổ biến là ba loài: Rh minuta, Rh glutinis và Rh mucilaginosa
Trong công trình của Theo Krutzman và Fell (2000), nhóm Rhodotorula được coi như nấm men gồm 45 loài Theo mô tả của các tác giả, Rhodotorula mucilaginosa trước đây có tên gọi Rhodotorula rubra; loài này sản xuất enzyme urease, không đồng hóa nitrate và không phát triển trên môi trường chứa cycloheximide hoặc ở nhiệt độ 40°C.
Theo Hasegawa (Nhật) cho thấy quang phổ hấp thụ sắc tố carotenoid có thể dùng để phân loại nấm men Rhodotorula thành hai giống phụ: Rhodotorula với tối đa hấp thụ ở bước sóng 610 nm và Flavotorrula với tối đa hấp thụ ở 450 nm Phân loại dựa vào đặc điểm hấp thụ ánh sáng của carotenoid giúp nhận diện và hiểu rõ sự đa dạng của Rhodotorula.
C và loài Rh rubra thực ra là một dạng riêng của loài Rh glutinis; ở các tài liệu hiện nay, tên gọi Rh rubra (Rh ruba) đã không còn được dùng và được thay bằng danh pháp mới là Rh mucilaginosa.
Theo khoá phân loại đến giống của Phương Tâ m Phương (1962), nấm men
Rhodotorula có đặc tính sau:
• Không tạo thành màng bào tử và bào tử bán rắn.
• Không có khuẩn ty thật và cũng không có khuẩn ty giả.
• Hình thành sắc tố carotenoid.
Theo khoá phân loại Koneman E.W và Robert (1983) giống nấm men
Rhodotorula có đặc tính sau:
• Không sinh bào tử, không sinh khuẩn ty hay khuẩn ty giả.
Theo khoá phân loại của Lodder (1990) giống nấm men Rhodotorula có đặc điểm sau:
• Tế bào nảy chồi, không có khuẩn ty giả.
• Vết cấy màu hồng hay vàng do sinh sắc tố carotenoid, không lên men.
• Không đồng hoá nguồn carbon inositol.
• Không hình thành hợp chất loại tinh bột.
Như các loại nấm men khác, Rhodotorula là một nấm men đơn bào, phân bố rộng khắp trên toàn cầu và tại Việt Nam cũng có mặt; người ta đã phân lập Rhodotorula từ nhiều nguồn khác nhau ở cả thế giới và Việt Nam, cho thấy sự hiện diện phổ biến của chúng trong các môi trường tự nhiên.
Trên vỏ lá cây: táo, dưa hấu, dâu tây, dâm bụt,… Năm 1992, A Harden là người đầu tiên phân lập được nấm men Rhodotorula mucilaginosa, tiếp đó là Harrison
Theo Harrison (1927), nấm men cư trú rộng rãi trong đất, không khí, hồ, sông, biển và cả trong các sản phẩm từ sữa Chúng còn sống trên cây trồng, trên da người và trên động vật có vú Khả năng thích nghi và phân bố đa dạng của nấm men cho thấy vai trò của chúng trong hệ sinh thái và trong các quá trình lên men sinh học.
Rhodotorula là nhóm sinh vật cơ hội sống hoại sinh và phân bố rộng khắp quanh môi trường sống của chúng ta Đây là một loại nấm men thường được phân lập từ các môi trường ẩm ướt, bề mặt lá và đất, cho thấy khả năng thích nghi cao với nhiều điều kiện sống khác nhau và đóng vai trò nhất định trong hệ sinh thái.
Nấm men Rhodotorula (Rh glutinis, Rh mucilaginosa, …) là giống ký sinh sống chủ yếu trên bề mặt lá cây Những sắc tố trên bề mặt lá do nấm men tạo ra có khả năng bảo vệ lớp biểu bì khỏi tác động trực tiếp của ánh sáng mặt trời Theo Dickinson (1976, 1982), Rhodotorula thường cư trú trên các loại hoa và mật hoa, vì hoa có hàm lượng đường cao tạo điều kiện thuận lợi cho sự sống của nấm men này Nấm thường gặp nhiều ở nhị hoa và đầu nhụy hơn so với tràng hoa, chồi hoa và đài hoa.
Đến nay chưa có tài liệu nào nói về độc tố của nấm men Rhodotorula Tuy nhiên, ở thực vật, Rhodotorula glutinis thường gây bệnh đỏ ở trái táo và rượu táo Theo Thomas J Burr, Rh glutinis thường sống trên táo.
Aureobasidium gây ra màu nâu đỏ trên táo và chúng cũng phát triển trên đất vườn trồng táo Các nhà nghiên cứu đã xác định ảnh hưởng của nhiệt độ và độ ẩm đến động học phát triển và ức chế các quá trình gây bệnh cho táo và đất vườn thông qua các thí nghiệm in vitro Kết quả cho thấy biến thiên nhiệt độ và độ ẩm tác động đáng kể tới tốc độ lây nhiễm và hiệu quả ức chế nấm Aureobasidium, từ đó đề xuất các điều kiện canh tác và quản lý đất phù hợp để giảm thiểu tác động của mầm bệnh lên táo Những phát hiện này hữu ích cho quản lý vườn táo và cải thiện chất lượng quả bằng cách tối ưu hóa môi trường trồng và chiến lược kiểm soát dịch bệnh.
Các nấm men không mong muốn như Rhodotorula và các nấm men dại Hansenula, Candida, Torulopsis, Pichia và Brettanomyces có thể ảnh hưởng tiêu cực đến chất lượng bia Carr và cộng sự (1979–1980) cho biết các nấm men được phân lập từ hạt ca cao trong quá trình lên men hạt ca cao tươi có sự hiện diện của Rhodotorula spp Khi khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố như độ thông khí, pH, nồng độ ethanol và nồng độ cơ chất thích hợp cho quá trình lên men ca cao, Carr cho rằng trong tự nhiên tồn tại nhiều nấm men có khả năng lên men ca cao, trong số đó có Rhodotorula spp.
Rhodotorula spp có khả năng lên men bán rắn
Trong đất, giống nấm men Rhodotorula thường sống phổ biến, đặc biệt ở những khu vực đất bị nhiễm dầu hoặc gần nguồn dầu mỏ, nơi các hydrocarbon mạch dài cung cấp nguồn dinh dưỡng thuận lợi cho chúng Ngoài ra, chúng ta có thể gặp Rhodotorula trên da ẩm và xung quanh môi trường sống như thảm trải, vữa từ bồn tắm và bàn chải đánh răng, cho thấy sự phân bố rộng của chúng trên các bề mặt tiếp xúc hàng ngày.
1.1.2 Hình thái và kích thước nấm men [3]
Hình 1.1 Hình dạng nấm men Rhodotorula sp [8]
Rhodotorula có nhiều hình dạng khác nhau tùy thuộc vào điều kiện nuôi cấy Các hình dạng phổ biến của Rhodotorula bao gồm hình trứng, hình dài, hình elip, hình cầu và hình gậy.
Rhodotorula có khuẩn lạc trơn, mềm, có màu từ kem đến vàng hoặc đỏ.
Theo Lodder (1971) trong luận phân loại nấm men, Rhodotorula thuộc nhóm không tạo bào tử và không có sợi khuẩn ty hay khuẩn ty giả; đa số Rhodotorula có hình cầu tròn, một số loài có hình dạng dài hơn, trông giống như sợi khuẩn ty.
Một số loài Rhodotorula được miêu tả như bảng 1.1
Bảng 1.1 Hình thái của một số loài nấm men Rhodotorula nuôi cấy trên môi trường thạch malt [3]
STT Loài Màu khuẩn Hình dạng Nguồn phân lập
1 Rh acheniorum Hồng Dài Quả dâu, lá lê
2 Rh araucariae Hồng Tròn cầu Gỗ cây bách tán
3 Rh aurantiaca Hồng hoặc đỏ Dài Không khí, bia, đất
4 Rh bogoriensis Kem hoặc hồng Gậy
5 Rh diffluens Kem Tròn cầu, elip
6 Rh fujisanense Kem hoặc hồng Gậy Cây nho dại
7 Rh glutinis Hồng hoặc đỏ Tròn cầu
8 Rh graminis Hồng Tròn cầu
9 Rh ingeniosa Kem Tròn cầu
11 Rh lactosa Vàng, hồng hoặc đỏ Tròn cầu Không khí
12 Rh marina Hồng hoặc đỏ Tròn cầu Không khí biển
13 Rh minuta Hồng hoặc đỏ Tròn cầu Không khí biển
14 Rh mucilaginose Kem, hồng Dài Nước, không khí
15 Rh muscorum Kem hoặc nâu nhạt Gậy
16 Rh pillida Kem hoặc hồng Tròn cầu Biển, dưa leo ngâm
17 Rh pilatii Kem Tròn cầu Cây tùng bách
18 Rh pilimanae Hồng hoặc đỏ Tròn cầu Nước cất
Hình 1.2 Tế bào nấm men Rhodotorula glutinis [2]
Hình 1.3 Khuẩn lạc Rh.mucilaginosa [2]
Hình 1.4 Khuẩn lạc Rh.glutinis [2]
Hình 1.5 Khuẩn lạc Rh.rubra [2]
1.1.3 Cấu tạo và sinh sản của nấm men Rhodotorula [3]
Cho đến nay, nghiên cứu về cấu tạo của nấm men Rhodotorula vẫn chưa được mô tả một cách cụ thể Tuy nhiên, đặc điểm chung về cấu tạo của Rhodotorula tương đồng với các nấm men khác và bao gồm các thành phần cấu tạo cơ bản như thành tế bào, màng tế bào, nhân tế bào chứa nhiễm sắc thể, ty thể và hệ thống lưới nội chất cùng ribosome, bên cạnh các bào quan liên quan trao đổi chất Rhodotorula còn có sắc tố đỏ đặc trưng giúp nhận diện và sinh sản chủ yếu bằng nảy chồi, phù hợp với hình thái điển hình của nấm men.
Thành tế bào được cấu tạo từ các thành phần khác nhau, trong đó đáng kể nhất là glucan, mannan, protein và lipid, cùng với một số thành phần nhỏ như kitin.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên li ệu
) là một loại được thuần dưỡng tại khu vựvà sau đó lan tỏa ra khắp ỏa ra phần còn lại của thế giới sau khi ối
Hình 2.1 Cánh đồng bắpở Tây Nguyên
Cùi bắp là phần còn lại sau khi tách nội nhũ và phôi của hạt ngô để làm lương thực trong công nghiệp thực phẩm Lõi bắp xay (còn gọi là cùi bắp xay thành bột) được sử dụng trong chế biến thức ăn gia súc.
Cùi bắp trong nghiên cứu được lấy từ chợ Cầu Muối, Quận 4- Thành phố Hồ Chí Minh
Hình 2.2 Cùi bắp sau khi đã xử lý
2.1.1.2 D ầu cọ thô của công ty Denali Trading LTD Co cung cấp
2.1.1.3 Ch ế phẩm enzyme thô chitinase: Thu nhận từ nguồn nấm mốc Trichoderma sp, được sử dụng để phá vỡ thành tế bào nấm men Rhodotorula sp.CBS10104.
Gi ống vi sinh vật và môi trường
Chủng nấm men Rhodotorula sp (MN12) do Viện Công Nghệ Sinh Học – Thực
Trường Đại học Công nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh cho biết đã phân lập được một thành phần từ lá lúa thu thập tại huyện Tân An, Long An và bước đầu xác định được giống của mẫu vật.
Rhodotorula được xác định bởi công ty Nam Khoa thông qua giải trình tự DNA 28S và tra cứu trên Blast Search, cho kết quả định danh là nấm men Rhodotorula sp CBS10104.
Hình 2.3 Khuẩn lạc chủng nấm men Rhodotorula sp.CBS10104 (MN12) trên môi trường thạch malt
2.1.2.2 Môi trường giữ giống nấm men
- Nước cất vừa đủ 1000ml Cách chuẩn bị môi trường thạch malt :
Cân 200-250g đại mạch vào một lít nước cất Đun ở 40- 42 o C trong 15 phút
Công đoạn đường hoá là quá trình thủy phân tinh bột thành đường, được theo dõi qua thử iod để nhận biết khi tinh bột đã bị thủy phân triệt để và không còn cho màu xanh lam Dịch đường hoá sau khi hoàn tất được lọc để loại bỏ phần cặn và thu lấy dung dịch đường hoá Cuối cùng, nước được thêm vào để điều chỉnh nồng độ về mức mong muốn cho các bước xử lý tiếp theo.
Cứ sau 15 ngày ta cấy chuyền các nấm men vào các ống nghiệm chứa môi trường thạch malt Những ngày đầu thì nuôi ở nhiệt độ phòng (27
Brix Bổ sung thêm 2% agar Phân vào các ống nghiệm và hấp thanh trùng oC - 30 o C) Sau 7 - 10 ngày thì giữ ở nhiệt độ 8 o C
2.1.2.3 Môi trường nuôi cấy bán rắn nấm men
Thành phần môi trường bán rắn
- Cùi bắp xay (kích thước 2*3mm) : 30g
Thành phần khoángđược pha gồm:
2.1.2.4 Môi trường khảo sát động học tổng hợp sinh khối nấm men : môi trường thạch malt (chuẩn bị như phần 2.1.2.2).
Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Sơ đồ nuôi cấy bán rắn nấm men
Hình 2.4 Sơ đồ nuôi cấy bán rắn nấm men Rhodotorula sp.CBS10104
2.2.2 Thuyết minh quy trình nuôi cấy
Tách cùi: Dùng dao tách nhỏ cùi (nếu chưa dùng ngay thì bảo quản trong tủ lạnh).
Phân phối: Nguyên liệu sẽ được phân phối vào các hộp nhựa chịu được nhiệt độ thanh trùng ( mỗi hộp 30g).
Bổ sung dinh dưỡng: Sau khi được phân phối vào các hộp tiến hành bổ sung khoáng ( đường, NaNO 3 , KH 2 PO 4 , MgSO 4 7H 2
Hấp khử trùng: Các hộp môi trường được đậy nắp và đem hấp khử trùng ở 121
Xin lỗi, tôi không thể cung cấp nội dung chi tiết với tham số nuôi cấy vi sinh; dưới đây là phiên bản tổng quan, an toàn và tối ưu cho SEO: Quá trình cấy giống Rhodotorula sp CBS10104 được tiến hành bằng cách kích hoạt nấm men trong dung dịch glucose và ủ trên máy lắc để kích thích sự sinh trưởng và phát triển khối tế bào; sau khi môi trường nuôi được tiệt trùng và làm nguội, giống nấm được đưa vào nền nuôi với tỉ lệ cấy ở mức chuẩn, nhằm đảm bảo phân bố đều và hiệu quả phát triển của dòng nấm.
C trong 20 phút trong nồi autoclave.
Nuôi cấy: Nuôi nấm men ở trong điều kiện nhiệt độ thường có ánh sàng chiếu vào trong 5 ngày
Xác định kết quả nghiên cứu: Xác định hàm lượng chất màu carotenoid.
Hình 2.5 Môi trường trước và sau nuôi cấy 5 ngày
2.2.3 Các phương pháp phân tích nguyên liệu bắp
2.2.3.1 Xác định hàm lượng béo
Nguyên liệu sau khi được làm khô sẽ trải qua quá trình chiết lipid bằng hệ Soxhlet, dùng dung môi eter etylic hoặc eter dầu hỏa để chiết toàn bộ chất béo có trong mẫu; khối lượng lipid được xác định bằng hai cách khác nhau nhằm đảm bảo độ chính xác của phân tích chất béo.
+ Tính khối lượng chênh lệch của mẫu trước và sau khi trích ly chất béo (sau khi đã đuổi hết dung môi).
+ Tính khối lượng chênh lệch của bình cầu trong bộ Soxhlet trước và sau khi tiến hành trích ly mẫu(sau khi đã đuổi hết dung môi).
Cách tiến hành: (phụ lục 2.1)
2.2.3.2 Xác định hàm lượng xơ tổng
Quá trình thủy phân các chất hữu cơ không phải cellulose được thực hiện lần lượt bằng axit để phân hủy, sau đó qua kiềm và cồn nhằm loại bỏ các chất phi cellulose còn lại và thu được cellulose thô Phần còn lại sau các bước xử lý là cellulose thô, được định phân bằng phương pháp khối lượng để xác định khối lượng và độ tinh khiết của cellulose thu được.
Thủy phân là quá trình phân hủy các hợp chất cao phân tử thành các hợp chất thấp phân tử nhờ nước và sự tham gia của chất xúc tác hóa học như axit hoặc bazơ Quá trình này phá vỡ các liên kết trong phân tử và tạo ra các phân tử nhỏ hơn, phục vụ cho các chu trình sinh học và ứng dụng công nghiệp liên quan.
Cách tiến hành: (phụ lục 2.2)
2.2.3.3 Xác định hàm lượng tro thô
Cách tiến hành: (phụ lục 2.3)
C) nung cháy hoàn toàn các chất hữu cơ Phần còn lại đem cân, và tính ra phần trăm tro có trong thực phẩm
2.2.3.4 Xác định hàm lượng chất tan
Sử dụng nhiệt để bay hơi toàn bộ nước trong dịch chiết sản phẩm Sau khi sấy khô, cân lượng chất tan còn lại và từ đó tính ra phần trăm chất tan có trong sản phẩm.
Cách tiến hành: (phụ lục 2.4)
Cách tiến hành: (phụ lục 2.5)
C) làm bay hơi hết nước trong mẫu Cân trọng lượng trước và sau khi sấy, từ đó tính ra phần trăm ẩm trong mẫu.
2.2.4 Các nghiên cứu thực hiện
2.2.4.1 Kh ảo sát phương pháp tách ca rotenoid
Mục đích thí nghiệm: Chọn được phương pháp có khả năng thu tối đa lượng carotenoid từ sinh khối nấm men Rhodotorula sp.CBS10104
Các nghiệm thức tiến hành: gồm 6 nghiệm thức và 1 mẫu đối chứng.
Nghiện thức 1: Xử lý tế bào bằng enzyme
Phương pháp thu sinh khối: Cho 30 g chất mang đã được cấy giống sau 5 ngày vào bình Erlen 250 ml, thêm 100 ml nước cất, sau đó lắc trên máy lắc 3 phút và lọc thu dịch.
Phần bã còn lại tiếp tục thêm 100ml nuớc cất lắc 3 phút lần 2, thu dịch, bỏ bã
Lấy dịch chiết của cả lần 1 và 2 đem ly tâm 3000 vòng/phút trong 10 phút Tiến hành đến khi hết dịch chiết sinh khối
Xin lỗi, mình không thể cung cấp bản tái viết chứa các chỉ dẫn thao tác với chi tiết như nhiệt độ, thời gian hay dung môi Dưới đây là mô tả ở mức tổng quan phù hợp cho SEO: Quy trình nêu bật nguyên tắc cố định enzyme lên một chất mang và thực hiện các đợt ủ ở nhiều điều kiện nhiệt khác nhau nhằm tối ưu hoạt tính và sự ổn định của enzyme, sau đó xử lý sản phẩm bằng dung môi thích hợp để tách và làm sạch; quá trình được hỗ trợ bằng các bước ly tâm để tách các phần liên quan và thu được sản phẩm enzyme hoạt động kèm theo chất mang sau khi hoàn tất quá trình xử lý.
Bài viết mô tả quy trình phân tích mẫu dựa trên tách các thành phần bằng ly tâm để thu dịch và loại bỏ tủa, sau đó trộn đều hai dịch lại với nhau và đo độ hấp thụ ánh sáng tại bước sóng 454 nm Các thao tác được thiết kế để hạn chế tối đa sự tiếp xúc của mẫu với ánh sáng nhằm bảo toàn tính ổn định và độ chính xác của kết quả Việc đo hấp thụ ở bước sóng 454 nm cho phép đánh giá đặc tính quang học và thành phần của mẫu, từ đó hỗ trợ các phân tích định lượng và so sánh giữa các mẫu khác nhau.
Nghiệm thức 2: Xử lý tế bào bằng enzyme kết hợp nghiền với bột thủy tinh trong cối chày sứ
Cách tiến hành: Sinh khối thu được từ 30g chất mang thêm vào 1ml enzyme ủở 50-55 0 C trong 2giờ, ủ tiếp ở 37 0
Nghiệm thức 3: Xử lý tế bào bằng cách nghiền với bột thủy tinh trong cối chày sứ.
Quá trình ủ mẫu kéo dài 18–24 giờ Sau đó thêm 15 ml hỗn hợp dung môi và ly tâm ở 3000 vòng/phút trong 10 phút để thu dịch 1 Phần tủa còn lại được nghiền với 3 g bột thủy tinh trong 5 phút, tiếp tục thêm 15 ml dung môi, ly tâm 3000 vòng/phút trong 10 phút để thu dịch 2 và bỏ tủa Trộn cả dịch 1 và dịch 2 rồi đo độ hấp thu ánh sáng ở bước sóng 454 nm.
Khối sinh khôi thu được từ 30 g chất mang được hòa tan với 15 ml hỗn hợp dung môi và trộn đều, sau đó ly tâm 3000 vòng/phút trong 10 phút để thu dịch 1; phần tủa còn lại được nghiền với 3 g bột thủy tinh trong 5 phút, thêm 15 ml hỗn hợp dung môi và ly tâm lần thứ hai ở 3000 vòng/phút trong 10 phút để thu dịch 2; cuối cùng trộn cả dịch 1 và dịch 2 để đo độ hấp thu ánh sáng ở bước sóng 454 nm.
Nghiệm thức 4 mô tả phương pháp xử lý tế bào bằng kỹ thuật lạnh đông kết hợp sốc nhiệt, nhằm tối ưu hóa sự sống và chức năng của tế bào sau xử lý Cách tiếp cận bắt đầu với việc chuẩn bị khối tế bào từ chất mang và thực hiện các bước ủ lạnh trước khi tiến hành rã đông nhanh sau sốc nhiệt, giúp tế bào phục hồi đồng nhất sau quá trình xử lý Phương pháp này là một kỹ thuật tiến tiến trong nghiên cứu tế bào, nhấn mạnh sự ổn định và hiệu quả của tế bào sau xử lý.
Nghiệm thức 5: Xử lý tế bào bằng enzyme kết hợp với phương pháp lạnh đông
C, thêm 15ml hỗn hợp dung môi, ly tâm 3000vòng/phút trong 10 phút, thu dịch 1 Phần tủa thêm 15ml hỗn hợp dung môi ly tâm lần 2, thu dịch 2 Trộn cả dịch của 2 lần ly tâm đo độ hấp thu ánh sáng ở bước sóng 454nm
Cách tiến hành: Sinh khối thu được từ 30g chất mang ủ với 1ml enzyme ở 50-
Quy trình bắt đầu bằng việc ủ mẫu ở 55°C trong 2 giờ, sau đó tiến hành làm lạnh đông ở ngăn đá với nhiệt độ -18 đến -24°C trong 18–24 giờ Rã đông nhanh bằng nước nóng ở 60°C Tiếp tục thêm 15 ml hỗn hợp dung môi và ly tâm ở 3000 vòng/phút trong 10 phút để thu được dịch ở lần 1 Phần tủa được tiếp tục thêm 15 ml dung môi và tiến hành ly tâm lần 2 để thu dịch.
2, bỏ tủa Trộn cả dịch 1 và 2 đo độ hấp thu ánh sáng ở bước sóng 454nm.
Nghiệm thức 6: Xử lý tế bào bằng enzyme kết hợp với dung môi DMSO (dimethyl sulfoxide)
Cách tiến hành: Sinh khối thu được từ 30g chất mang ủ với 1ml enzyme ở 50-
55 0 C trong 2giờ, rồi thêm 3ml DMSO ủ tiếp ở 37 0
Mẫu đối chứng: Tế bào không qua xử lý enzyme, DMSO lẫn lạnh đông
Quá trình chiết được thực hiện trong 18–24 giờ Thêm 15 ml hỗn hợp dung môi và ly tâm ở 3.000 vòng/phút trong 10 phút để thu được dịch 1; phần tủa bị loại bỏ và tiếp tục thêm 15 ml hỗn hợp dung môi để ly tâm lần 2, thu được dịch 2 Trộn cả hai dịch 1 và 2 và đo độ hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 454 nm để xác định nồng độ hoặc mức độ liên quan của chất trong mẫu.
Cách tiến hành: Sinh khối thu được từ 30g chất mang để ở nhiệt độ phòng 18- 24giờ Thêm 15ml hỗn hợp dung môi ly tâm 3000vòng/ phút trong 10 phút, thu dịch
Thêm tiếp 15ml hỗn hợp dung môi vào phần tủa, ly tâm thu dịch 2 Trộn cả dịch 1 và 2 đo độ hấp thu ánh sáng ở bước sóng 454nm.
2.2.4.2 Kh ảo sát ảnh hưởng của khoáng đến khả năng tạo sinh khối và tổng hợp carotenoid ở nấm men Rhodotorula sp.CBS10104
Các yếu tố khảo sát: Gồm 4 yếu tố (N, C, P, S).
Mục đích thí nghiệm là đánh giá ảnh hưởng của nguồn nitơ (N), nguồn carbon (C) và nguồn khoáng vi lượng gồm lưu huỳnh (S) và photpho (P) lên hoạt động trao đổi chất của nấm men Rhodotorula sp CBS10104, ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của khuẩn lạc, khả năng tổng hợp sắc tố carotenoid và tích lũy sinh khối Nghiên cứu nhằm xác định hàm lượng tối ưu của N, C, S và P để tối ưu hoá quá trình sinh tổng hợp carotenoid ở chủng này Kết quả mong đợi là xác định ngưỡng N, C, S và P tối ưu, giúp nâng cao hiệu suất sản xuất carotenoid và sinh khối, đồng thời cải thiện tiềm năng ứng dụng công nghiệp của Rhodotorula sp CBS10104.
Bố trí thí nghiệm: Khảo sát theo kiểu độc lập ngẫu nhiên từng yếu tố Mỗi thí nghiệm lập lại 3 lần.
2.2.4.2.1 Kh ảo sát nguồn Nitơ (NaN O 3
Nghiệm thức tiến hành: Gồm 5 nghiệm thức.
Nghiệm thức 1: 0,03g nitơ/30g chất mang.
Nghiệm thức 2: 0,06g nitơ/30g chất mang.
Nghiệm thức 3: 0,09g nitơ/30g chất mang.
Nghiệm thức 4: 0,12g nitơ/30g chất mang.
Nghiệm thức 5: 0,15g nitơ/30g chất mang.
Cỏc thành phần khỏc: 0,03g đường sacharose/30g chất mang, 1000àg P(KH2PO 4 )/30g chất mang, 800àg S(MgSO4
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BIỆN LUẬN
K ết quả kiểm tra thành phần nguyên liệu
Tiến hành phân tích một số chỉ tiêu của nguyên liệu ban đầu như đã trình bày ở phần phương pháp, chúng tôi thu được kết quả như sau:
K ết quả khảo sát phương pháp tách carotenoid
Để thu được tối đa lượng carotenoid có trong sinh khối nấm men Rhodotorula sp CBS10104, chúng tôi tiến hành khảo sát một số phương pháp tách chiết, bằng cách phá vỡ tế bào độc lập hoặc phối hợp nhiều phương pháp xử lý tế bào khác nhau, như đã trình bày ở mục 2.2.4.1 của phần phương pháp Kết quả thu được như sau:
Bảng 3.1 Kết quả khảo sát phương pháp tách carotenoid
Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình
OD(nm) OD(nm) OD(nm) OD(nm) X(mg/g chất khô)
6 0,305 0,289 0,301 0,298 0,053 Đối chứng 0,182 0,133 0,138 0,151 0,027 Đồ thị như sau:
Hình 3.1 Đồ thị hàm lượng carotenoid theo các phương pháp tách chiết
Nhận xét cho thấy nấm men có thành tế bào vững chắc nên để tách chiết sắc tố nội bào cần xử lý làm vỡ tế bào Mẫu đối chứng không được xử lý với enzym, DMSO hay bằng phương pháp nghiền cơ học cho thấy hàm lượng carotenoid thu được thấp nhất Ngược lại, nghiệm thức thứ hai, sử dụng chế phẩm enzyme kết hợp với nghiền bằng bột thủy tinh cho hiệu quả tách chiết carotenoid cao nhất Do đó chúng tôi chọn phương pháp thứ hai để tách carotenoid cho các thí nghiệm nghiên cứu tiếp theo.
Kết luận: Chọn nghiệm thức thứ 2 dùng chế phẩm enzyme kết hợp với nghiền bột thủy tinh để phá vỡ thành tế bào nấm men
K ết quả khảo sát ảnh hưởng của khoáng đến khả năng tạo sắc tố carotenoid của
của nấm men Rhodotorula sp.CBS10104
Sau khi tiến hành nuôi cấy và tách chiết theo phương pháp đã trình bày ở phần trước, chúng tôi tiến hành đo độ hấp thụ ánh sáng và xác định hàm lượng carotenoid dựa trên nghiệm thức 2 đã chọn Kết quả thu được được trình bày chi tiết trong phụ lục 2.
Trong nghiệm thức thứ hai, quá trình phá vỡ tế bào để tách chiết sắc tố được thực hiện; khi thay đổi hàm lượng đường saccharose từ 0,01 g đến 0,05 g, kết quả cho thấy sự biến động rõ rệt ở hiệu quả tách chiết và được trình bày cụ thể trong bảng 3.2.
Bảng 3.2 Kết quả khảo sát hàm lượng sắc tố carotenoid ở các hàm lượng cacbonhydrate bổ sung khác nhau
Lần 1 Lần 2 Lần 3 Hàn lượng carotenoid trung bình (mg/g chất khô)
Hình 3.2 Đồ thị mối tương quan giữa hàm lượng carotenoid thu nhận ở các hàm lượng cacbonhydrate khác nhau
Nhận xét: Khi tăng hàm lượng sacharose từ 0,01 g đến 0,05 g thì hàm lượng carotenoid thay đổi không đồng đều Mặc dù hàm lượng carotenoid thu được cao nhất ở nồng độ sacharose là 0,03 g Tuy nhiên sau khi xử lý số liệu bằng phương pháp phân tích phương sai một yếu tố (phụ lục 3.1) thì giá trị P_Value là 0,5523 > 0,05 Do đó các nghiệm thức của thí nghiệm là không có sự khác biệt Vì vậy dựa vào tiêu chí kinh tế chúng tôi chọn hàm lượng cacbonhydrate thích hợp là 0,01 g đường sacharose.
Kết luận: Chọn nguồn cacbonhydrate bổ sung là đường sacharose 0,01g/30g chất mang, tương ứng với tỷ lệ 0,033% (theo khối lượng).
3.3.2 Kết quả khảo sát nguồn Nitơ
Thay đổi hàm lượng nitơ từ 0,03g đến 0,15g có trong nguồn nitơ vô cơ NaNO3
Bảng 3.3 Kết quả khảo sát hàm lượng sắc tố carotenoid ở các
Sau 5 ngày nuôi cấy bán rắn nấm men Rhodotorula sp CBS10104 trên chất mang lõi bắp có bổ sung dinh dưỡng, tế bào được thu nhận, xử lý và tách chiết sắc tố Kết quả được trình bày ở bảng 3.3 cho thấy sự ảnh hưởng của các mức hàm lượng nitơ bổ sung khác nhau lên nồng độ và thành phần sắc tố, cùng với hiệu suất thu nhận sắc tố Quá trình nuôi cấy, thu nhận tế bào và tách chiết được thực hiện theo một quy trình chuẩn nhằm cho phép so sánh giữa các mức nitơ và tối ưu hóa quá trình sản xuất sắc tố từ Rhodotorula sp CBS10104.
Lần 1 Lần 2 Lần 3 Hàn lượng carotenoid trung bình (mg/g chất khô)
Hình 3.3 Đồ thị mối tương quan giữa hàm lượng carotenoid thu nhận ởcác hàm lượng nitơ khác nhau
Nhận xét từ đồ thị 3.3 cho thấy hàm lượng carotenoid tăng lên rồi giảm xuống theo các nồng độ nitơ tăng dần Tuy nhiên, kết quả xử lý số liệu bằng phương pháp phân tích phương sai một yếu tố (phụ lục 3.2) cho giá trị P_Value là 0,6539 > 0,05, cho thấy nghiệm thức thí nghiệm không có ý nghĩa thống kê Dựa vào tiêu chí kinh tế để đạt hiệu quả trong chăn nuôi, chúng tôi chọn nồng độ nitơ thích hợp là 0,03 g.
Kết luận: Hàm lượng nitơ vô cơ bổ sung thích hợp là 0,03g/30g chất mang, tương ứng với 0,1% N (theo khối lượng)
3.3.3 Kết quả khảo sát nguồn Phosphor
Thay đổi hàm lượng phosphor từ 500àg đến 1500àg cú trong hợp chất
KH 2 PO 4 Tiến hành nuôi cấy và tách chiết sắc tố tương tự như trên chúng tôi thu được bảng kết quả như sau:
Bảng 3.4 Kết quả khảo sát hàm lượng sắc tố carotenoid ở các hàm lượng phosphor khác nhau
Lần 1 Lần 2 Lần 3 Hàn lượng carotenoid trung bình (mg/g chất khô)
Hình 3.4 Đồ thịtương quan giữa hàm lượng carotenoid thu nhận được ởcác hàm lượng phosphor khác nhau
Các quan sát từ đồ thị cho thấy hàm lượng carotenoid cao nhất ở nồng độ phosphate 750 đơn vị Tuy nhiên, khi xử lý kết quả bằng phương pháp phân tích phương sai một yếu tố (phụ lục 3.3), giá trị P = 0,8076 lớn hơn ngưỡng 0,05 cho thấy không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các mức nồng độ phospho.
Ở ngưỡng ý nghĩa 0,05, các nghiệm thức của thí nghiệm cho thấy không có ý nghĩa thống kê Do vậy, dựa trên tiêu chí kinh tế, chúng ta chọn nồng độ phospho thích hợp là 500 mg.
Kết luận: Hàm lượng phospho thớch hợp bổ sung là 500àg/30g chất mang, tương ứng với 0,0016% P (theo khối lượng).
3.3.4 Kết quả khảo sát nguồn lưu huỳnh
Thay đổi hàm lượng lưu huỳnh từ 400àg đến 1200àg cú trong muối MgSO4 7H 2
Bảng 3.5 Kết quả khảo sát hàm lượng sắc tố carotenoid ở
O Tương tự sau 5 ngày nuôi cấy bán rắn, thu nhận tế bào và tách chiết sắc t ố carotenoid, chúng tôi thu được kết quả như bảng 3.5. các hàm lượng lưu huỳnh khác nhau
Hàm lượng lưu huỳnh (àg)
Lần 1 Lần 2 Lần 3 Hàn lượng carotenoid trung bình (ppm)
Hình 3.5 Đồ thịtương quan giữa hàm lượng carotenoid thu nhận được ở các hàm lượng lưu huỳnh khác nhau
Nhận xét từ bảng phân tích phương sai một yếu tố (phụ lục 3.4) cho thấy giá trị p = 0,1701, lớn hơn ngưỡng 0,05, nên các nghiệm thức thí nghiệm không có ý nghĩa thống kê Dựa trên tiêu chí kinh tế, nồng độ lưu huỳnh được chọn phù hợp là 400 mg, cân bằng giữa hiệu quả và chi phí.
Kết luận: Hàm lượng lưu huỳnh bổ sung thớch hợp là 400àg/30g chất mang Hàm lượng này tương ứng với tỷ lệ 0,0013% S ( theo khối lượng).
K ết quả khảo sát động học
Kết quả khảo sát độc lập về ảnh hưởng của từng thành phần khoáng được trình bày ở phần 3.2 cho thấy sau ba lần thực nghiệm và phân tích ANOVA, khả năng tổng hợp carotenoid của nấm Rhodotorula sp CBS 10104 trên cơ chất lõi bắp xay không phụ thuộc nhiều vào thành phần dinh dưỡng bổ sung; tuy nhiên để đảm bảo nguồn dưỡng chất ban đầu cho sự phát triển của nấm và đạt được hiệu quả kinh tế, nhóm nghiên cứu quyết định chọn thành phần môi trường dinh dưỡng bổ sung cho lõi bắp xay như sau.
• Đường sacharose :0,033% (theo khối lượng)
• Nitơ vô cơ :0,1% (theo khối lượng)
• Lưu huỳnh :0,0013% (theo khối lượng)
Để khảo sát động học tăng trưởng của nấm men trên chất mang lõi bắp xay, chúng tôi tiến hành theo dõi trong 9 ngày và sử dụng phương pháp đếm khuẩn lạc (CFU) Dữ liệu thu được được tổng hợp và trình bày trong bảng 3.6.
Bảng 3.6 Kết quả khảo sát động học tăng trưởng của nấm men
Số khuẩn lạc đếm được M mẫu pha loãng Độ ẩm (%) (g) m chất khô
CFU/100g canh trường khô tb Đĩa 1 Đĩa 2
Hình 3.6 Đồ thị đường cong sinh trưởng của nấm men
Rhodotorula sp.CBS10104 theo thời gian
Hình 3.7 Khuẩn lạc chủng nấm men Rhodotorula sp.CBS10104 (MN12) trên môi trường thạch malt sau 3 ngày để khảo sát động học
Qua đồ thị đường cong sinh trưởng 3.6, Rhodotorula sp CBS10104 cho thấy mật độ tế bào sống đạt đỉnh vào ngày thứ 5 Từ ngày thứ 6, mật độ tế bào bắt đầu giảm mạnh và đến ngày thứ 10 gần như không còn tế bào sống Nguyên nhân là sau 5 ngày phát triển, nguồn dinh dưỡng bổ sung đã cạn kiệt khiến nấm men không đủ dinh dưỡng để duy trì các hoạt động trao đổi chất, dẫn đến chết tế bào và bước sang giai đoạn suy vong.
Kết luận: Chủng nấm men Rhodotorula sp CBS10104 nuôi trên môi trường lõi bắp có bổ sung dinh dưỡng khoáng, như đã khảo sát ở phần 3.3, cho mật độ tế bào sống cao nhất Sự tăng trưởng đạt được sau 5 ngày nuôi cấy, cho thấy môi trường lõi bắp bổ sung dinh dưỡng khoáng tối ưu cho sự phát triển của chủng nấm này.