Xác định cephalexin trên bề mặt và nguồn nước

LUẬN VĂN THẠC SỸ DƯỢC KIỂM NGHIỆM THUÔC ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CEPHALEXIN TRÊN BỀ MẶT VÀ TRONG NGUỒN NƯỚC THẢI CỦA NHÀ MÁY SẢN XUẤT KHÁNG SINH ß LACTAM BẰNG PHƯƠNG PHÁP QUÉT MẪU KIỂM TRA BẰNG HPLC

TRẦN HOÀNG THỊNH

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CEPHALEXIN TRÊN BỀ MẶT VÀ TRONG NGUỒN NƯỚC THẢI CỦA NHÀ MÁY SẢN XUẤT KHÁNG SINH ß-LACTAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

Thành phố HỒ CHÍ MINH – 2016

TRẦN HOÀNG THỊNH

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CEPHALEXIN TRÊN BỀ MẶT VÀ TRONG NGUỒN NƯỚC THẢI CỦA NHÀ MÁY SẢN XUẤT KHÁNG SINH ß-LACTAM

Chuyên ngành: Kiểm nghiệm thuốc – Độc chất

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CEPHALEXIN TRÊN

BỀ MẶT VÀ TRONG NGUỒN NƯỚC THẢI CỦA NHÀ MÁY

SẢN XUẤT KHÁNG SINH ß-LACTAM

Trần Hoàng Thịnh Người hướng dẫn: TS Hà Diệu Ly

Mở đầu: Cephalexin là kháng sinh gây dị ứng cao Trong quá trình sản xuất phải đảm

bảo vệ sinh và tránh nguy cơ nhiễm chéo Do đó cần có một qui trình lấy mẫu, bảo quản mẫu, xử lý mẫu và phân tích định lượng vết cephalexin trên bề mặt các vật liệu và thiết bị trong dây chuyền sản xuất để hỗ trợ cho xưởng sản xuất kháng sinh nhóm cephalosporin thực hiện tốt hơn việc kiểm soát cephalexin ở trong mức giới hạn cho phép và đảm bảo

vệ an toàn khi sản xuất

Đối tượng & Phương pháp nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu: Cephalexin trên bề mặt thiết bị sản xuất và trong nguồn nước thải

của nhà máy sản xuất kháng sinh -lactam

Phương pháp nghiên cứu: Khảo sát quy định lượng cephalexin bằng kỹ thuật HPLC với

đầu dò UV-Vis và đầu dò khối phổ; Khảo sát độ ổn định của cephalexin trong các dung môi hòa tan khác nhau, trong mẫu nước thải và trong các điều kiện bảo quản khác nhau; Xây dựng quy trình xử lý mẫu, lấy mẫu, bảo quản mẫu, và xây dựng quy trình vệ sinh sau sản xuất

Kết quả: Qui trình định lượng cephalexin bằng kỹ thuật HPLC với đầu dò PDA/UV-Vis

đạt tính phù hợp hệ thống, có tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính rộng với hệ số tương quan cao, LOD và LOQ thấp và nằm dưới mức giới hạn cho phép của cephalexin trong mẫu phết bề mặt (5 x 5 cm) và mẫu nước thải Qui trình định lượng cephalexin bằng LC-MS đạt tính phù hợp hệ thống, khoảng tuyến tính ở mức nồng độ ppb với hệ số tương quan cao, LOD và LOQ cao và có thể thay thế cho qui trình định lượng cephalexin bằng HPLC-PDA/UV-Vis khi nồng độ cephalexin trong mẫu phết bề mặt và trong mẫu nước thải dưới 1 ppm Cephalexin nên được chiết bằng nước, mẫu phân tích nên được bảo quản ở 5oC và nên định lượng cephalxin trong vòng 7 ngày Qui trình xử lý mẫu có hiệu suất thu hồi cao, ổn định và đơn giản Qui trình lấy mẫu, bảo quản mẫu và qui trình dọn quang và vệ sinh sau sản xuất thành phẩm cephalosporin đã được xây dựng theo yêu cầu

kỹ thuật của GPM WHO, PIC/S, EU và cơ sở vật chất hiện trạng của nhà máy

Kết luận: Đề tài đã đưa ra các khuyến cáo về dung môi chiết cephalexin, điều kiện bảo

quản mẫu và thời gian phân tích phù hợp Đề tài đã thành công trong việc xây dựng qui trình lấy mẫu, bảo quản mẫu, xử lý mẫu và phân tích mẫu trên hai loại mẫu phết bề mặt

và mẫu nước thải từ nhà máy

Từ khóa: sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), cephalexin, mẫu bề mặt, nước thải

Specialty: Drug Quality Control & Toxicology – Code: 60 72 04 10

BUILDING METHODS OF DETERMINING CEPHALEXIN ON THE SURFACE AND IN WASTEWATER IN ß-LACTAM

ANTIBIOTICS FACTORY

Tran Hoang Thinh Supervisor: Dr Ha Dieu Ly

Introduction: Cephalexin is highly allergenic antibiotic In the manufacturing process,

must be ensured hygiene and avoid the risk of cross contamination Therefore, there should a process of sampling, sample preservation, sample handling and quantitative analysis of cephalexin trace on surface of materials and equipment in the production line

to support factory that control cephalexin in the allowed limits and ensuring safety in the production

Subjects and Methods:

Research subjects: Cephalexin on surface of production equipment and in wastewater in

 -lactam antibiotics factory

Methods: Survey quantitative process of cephalexin by HPLC with UV-Vis and mass

spectrometry detector; Survey stability of cephalexin dissolved in different solvents,in wastewater samples and in different storage conditions; Construct process of sampling, sample handling, sample preservation and hygiene process after the production

Result: The quantitative process of cephalexin by HPLC techniques with PDA / UV-Vis

detector achieve conformity systems, specificity, wide linear range with high correlation coefficient, low LOD and LOQ that under allowed limit of cephalexin in the surface swabs (5 x 5 cm) and wastewater samples The quantitative process of cephalexin by LC-MS achieve conformity systems, linear range at ppb levels with high correlation coefficient, LOD and LOQ can substitute for quantitative process by HPLC-PDA / UV-Vis when cephalexin concentration in surface swabs and wastewater samples in less than

1 ppm Cephalexin should be extracted with water, sample should be stored at 5°C and should quantify cephalxin within 7 days The process of sample handling with high recovery efficiency, stability and simplicity The process of sampling, sample preservation and line clearance processes and cleaning after the production of cephalosporins have been built according to the technical requirements of GPM WHO, PIC/S, the EU and the current state of the factory facilities

Conclusion: The study has made recommendations on extraction solvents for cephalexin,

sample storage conditions and appropriate analysis timing The theme has been successful in building process of sampling, sample preservation, sample handling and sample analysis on two types of surface swabs and samples from factory's wastewater

Keywords: high-performance liquid chromatography (HPLC), Cefalexin, surface swab,

wastewater

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi

Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và

Chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Trần Hoàng Thịnh

Trang TRANG PHỤ BÌA

TÓM TẮT……… …… i

LỜI CAM ĐOAN……… iii

MỤC LỤC……… iv

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC CÁC BẢNG viii

DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ……….……… ….….x

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về cephalexin 3

1.2 Một số công trình định lượng cephalexin 6

1.3 Tổng quan về GMP 7

1.4 Phương pháp lấy mẫu 11

1.5 Phương pháp xử lý và bảo quản mẫu 16

1.6 Cách tính LOD, LOQ trong phương pháp thử nghiệm 20

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu – Đối tượng nghiên cứu 22

2.2 Phương pháp nghiên cứu 23

2.2.1 Khảo sát qui trình định lượng cephalexin bằng kỹ thuật HPLC 23

2.2.2 Khảo sát độ ổn định của cephalexin trong các dung môi hòa tan khác nhau và trong mẫu nước thải 25

2.2.3 Khảo sát độ ổn định của cephalexin trong điều kiện bảo quản khác nhau 25 2.2.4 Khảo sát tính phù hợp hệ thống, khoảng tuyến tính, LOD và LOQ của qui trình định lượng cephalexin bằng LC-MS 25

2.2.5 Xây dựng qui trình xử lý mẫu 26

2.2.6 Xây dựng qui trình lấy mẫu và bảo quản mẫu 27

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 Khảo sát qui trình định lượng cephalexin bằng kỹ thuật HPLC 30

3.1.1 Qui trình 1 30

3.1.2 Qui trình 2 33

3.2 Khảo sát độ ổn định của cephalexin trong các dung môi hòa tan khác nhau và trong mẫu nước thải 36

3.3 Khảo sát độ ổn định của cephalexin trong điều kiện bảo quản khác nhau 39

3.4 Khảo sát tính phù hợp hệ thống, khoảng tuyến tính, LOD và LOQ của qui trình định lượng cephalexin bằng LC-MS 42

3.5 Xây dựng qui trình xử lý mẫu 45

3.5.1 Mẫu phết bề mặt 45

3.5.2 Mẫu nước thải từ nhà máy 46

3.6 Xây dựng qui trình lấy mẫu và bảo quản mẫu 46

3.6.1 Mẫu bề mặt 46

3.6.2 Mẫu nước thải từ nhà máy 47

3.7 Xây dựng qui trình vệ sinh sau sản xuất 48

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

HPLC High performance

liquid chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

ISO International Organization for

Standardization Tổ chức Quốc tế về tiêu chuẩn hóa ICH The International Conference on

Harmonisation

Hội nghị Quốc tế về sự hài hòa

LC-MS Liquid chromatography -Mass

Co-operation Scheme dược phẩm QCVN Qui chuẩn Việt Nam

QĐ-BYT Quyết định Bộ Y tế

USP United States Pharmacopeia Dược điển Mỹ

Trang

Bảng 1.1 Một số điều kiện định lượng cephalexin bằng HPLC 6

Bảng 2.4 Tóm tắt hai qui trình định lượng cephalexin 23

Bảng 3.1 Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống qui trình 1 30

Bảng 3.2 Mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ cephalexin qui trình 1 32

Bảng 3.4 Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống qui trình 2 33

Bảng 3.5 Mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ cephalexin qui trình 2 35

Bảng 3.7 Độ ổn định của dung dịch đối chiếu cephalexin 1 ppm được

Bảng 3.8 Độ ổn định của dung dịch đối chiếu cephalexin 1 ppm được

Bảng 3.9 Độ ổn định của dung dịch đối chiếu cephalexin 10 ppm được

hòa tan trong trong EtOH 70% ở 250

Bảng 3.10 Độ ổn định của dung dịch đối chiếu cephalexin 1 ppm được

hòa tan trong trong nước thải lấy tại nhà máy ở 250

Bảng 3.11 Độ ổn định của dung dịch đối chiếu cephalexin 10 ppm trong

Bảng 3.12 Độ ổn định của dung dịch đối chiếu cephalexin 10 ppm trong

nước khi được bảo quản ở nhiệt độ 25 o

C trong bình định mức màu nâu 40

Bảng 3.13 Độ ổn định của dung dịch đối chiếu cephalexin 10 ppm trong

Bảng 3.14 Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống ở nồng độ 6 ppb 42

Bảng 3.15 Mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ cephalexin và kết

Bảng 3.16 Độ phục hồi cephalexin trên mẫu phết bề mặt 45

Bảng 3.17 Độ phục hồi cephalexin sau khi thêm 10 mg Cephalexin

Trang

Hình 1.2 Phản ứng hóa học của tác nhân ái nhân mở vòng azetidin-2-on 4

Hình 3.1 Sắc ký đồ dung dịch phân giải theo qui trình 1 trên hệ HPLC-PDA 31

Hình 3.2 Sắc ký đồ dung dịch phân giải theo qui trình 1 trên hệ HPLC-UV-Vis 31 Hình 3.3 Sắc ký đồ dung dịch phân giải theo qui trình 2 trên hệ HPLC-PDA 34

Hình 3.4 Sắc ký đồ dung dịch phân giải theo qui trình 2 trên hệ HPLC-UV-Vis 34 Hình 3.5 Sắc ký đồ LC-MS dung dịch cephalexin 6 ppb 42

MỞ ĐẦU

Trong quá trình sản xuất dược phẩm hiện nay có một vấn đề rất được quan tâm

đó là đảm bảo vệ sinh trong quá trình sản xuất, tránh nhiễm chéo giữa các sản phẩm và đảm bảo vệ sinh môi trường Đây là một trong những yêu cầu bắt buộc để một nhà máy đạt được tiêu chuẩn GMP Trong đó, sản xuất kháng sinh nhóm Cephalosporin lại càng được quan tâm đặc biệt bởi vì đây là nhóm thuốc có khả năng gây di ứng cao, đặc biệt gây sốc phản vệ dẫn đến tử vong

Theo qui định những kháng sinh trong nhóm cephalosporin phải được sản xuất trên các quy trình riêng biệt Vì nhiều trường hợp người bệnh dị ứng với một kháng sinh cephalosporin ngay lần đầu sử dụng do đã từng sử dụng một cephalosporin khác

Do đó, việc nhiễm chéo giữa các sản phẩm là không được phép Tuy nhiên, việc xây dựng một hệ thống để sản xuất chỉ một loại thuốc là điều rất tốn kém, ngay cả đối với một công ty lớn Trong thực tế, tại tất cả các công ty dược, các kháng sinh nhóm cephalosporin được sản xuất trên cùng một dây chuyền Do đó, việc phải dọn quang và

vệ sinh nhà xưởng trước khi tiến hành sản xuất một thuốc khác để tránh nhiễm chéo sản phẩm là điều cần thiết

Một vấn đề khác đặt ra là khi làm việc trong một môi trường ô nhiễm cephalosporin nói chung và cephalexin nói riêng, chúng ta vô tình tiếp xúc với kháng nguyên, lúc đó cơ thể đã tạo ra một kháng thể có thể là nguyên nhân dẫn đến phản ứng

dị ứng trong tương lai khi dùng kháng sinh nhóm cephalosporin điều trị nhiễm khuẩn Cũng có những trường hợp chúng ta bị dị ứng ngay trong lần đầu tiếp xúc với cephalosporin với các biểu hiện lên cơn hen, nổi mẫn đỏ, ngứa da…

Hiện nay, việc dọn quang và vệ sinh sau khi sản xuất cephalexin đã được thực hiện tại các nhà máy, nhưng vẫn chưa có phương pháp chuẩn đánh giá việc dọn quang

và vệ sinh đó đã đạt yêu cầu hay chưa? Qui trình lấy mẫu có đủ tin cậy và đại diện hay không? Bảo quản mẫu cephalexin như thế nào là đúng? Giới hạn nồng cephalexin cho phép là bao nhiêu để làm tiêu chuẩn đánh giá?

Xuất phát từ những lý do trên đề tài “XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CEPHALEXIN TRÊN BỀ MẶT VÀ TRONG NGUỒN NƯỚC THẢI CỦA NHÀ MÁY SẢN XUẤT KHÁNG SINH -LACTAM” được thực hiện với mục tiêu

cung cấp một qui trình định lượng cephalexin trên bề mặt các vật liệu và thiết bị trong dây chuyền sản xuất để hỗ trợ cho xưởng sản xuất kháng sinh nhóm cephalosporin thực hiện tốt hơn việc kiểm soát cephalexin ở trong mức giới hạn cho phép và đảm bảo vệ

an toàn khi sản xuất

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Bột kết tinh màu trắng hay gần như trắng, hơi tan trong nước, thực tế không tan

trong cloroform, ethanol 96% và ether

Sự tấn công của các tác nhân ái nhân (AN): Các base mở vòng azetidin-2-on tạo thành dẫn chất acid cephalosporic không có hoạt tính Những tác nhân ái nhân mở vòng có thể là:

+ NaOH, KOH: tạo muối của acid cephalosporic

+ Các alcol: tạo các ester của acid cephalosporic

+ Các amin (amino phân) tạo amid không có hoạt tính

Sự tấn công của các tác nhân ái điện tử (AE): ngược lại với penicillin, các

cephalosporin bền hơn trong môi trường acid

Cephalexin là kháng sinh uống nhóm cephalosporin thế hệ 1 có hoạt tính lên nhiều loại vi khuẩn gram dương và gram âm, có tác dụng diệt khuẩn do ức chế sự tổng

hợp thành tế bào vi khuẩn Cephalexin bền vững với penicillinase của Staphylococcus

Hình 1.2 Phản ứng hóa học của tác nhân ái nhân mở vòng azetidin-2-on

Hình 1.3 Phản ứng hóa học của tác nhân amin tạo amid

do đó có tác dụng với cả các chủng S aureus tiết penicillinase kháng penicillin (hay ampicillin) Cephalexin cũng có hoạt tính lên đa số E coli đề kháng ampicillin

Cephalexin được hấp thu gần như hoàn toàn ở đường tiêu hóa, đạt nồng độ tối

đa trong máu sau uống khoảng 1 giờ Thức ăn làm chậm khả năng hấp thu cephalexin nhưng tổng lượng thuốc hấp thu không thay đổi Thuốc liên kết protein huyết tương 15% Thời gian bán thải là 0,5 - 1,2 giờ, dài hơn ở trẻ sơ sinh và tăng khi chức năng thận giảm Cephalexin không bị chuyển hóa, thuốc được đào thải với nồng độ cao trong nước tiểu, sau khi uống 6 giờ khoảng 80% liều dùng được thải trừ qua nước tiểu

ở dạng không biến đổi, với liều 500 mg nồng độ cephalexin trong nước tiểu cao hơn l

mg/lml Cephalexin được đào thải qua lọc máu và thẩm phân màng bụng (20%-50%)

Người lớn và trẻ em từ 15 tuổi

Liều thông thường của cephalexin đường uống là 250 mg mỗi 6 giờ, hoặc một liều 500

mg mỗi 12 giờ Điều trị trong 7 đến 14 ngày

Đối với nhiễm khuẩn nặng hơn, liều cephalexin đường uống có thể lên đến 4 g mỗi ngày chia làm 2-4 liều bằng nhau

Trẻ em (trên 1 tuổi)

Tổng liều hàng ngày của cephalexin đường uống cho bệnh nhi là 25-50 mg/ kg chia

đều làm 2-4 liều, trong 7 đến 14 ngày Trong điều trị nhiễm khuẩn do Streptococcus

β-hemolytic, thời gian ít nhất là 10 ngày Trong nhiễm khuẩn nặng, tổng liều hàng ngày

từ 50 đến 100 mg/ kg

Để điều trị viêm tai giữa, liều khuyến cáo hàng ngày là từ 75 đến 100 mg/ kg

Liều điều trị tối đa của cephalexin là 6 g/ngày

Các kháng sinh họ β-lactam là nhóm nguyên nhân chủ yếu gây ra các phản ứng dị ứng do thuốc Các phản ứng phụ đáng lo ngại nhất của nhóm thuốc này là những phản

ứng dị ứng tức thì gây ra do kháng thể IgE đặc hiệu với thuốc Những phản ứng này thường xảy ra trong vòng vài phút đến vài giờ sau khi dùng thuốc Biểu hiện nhẹ thường là nổi ban đỏ, ngứa, phù mắt, môi Những trường hợp nặng có thể gây tụt huyết

áp, co thắt phế quản hoặc phù nề thanh quản Một số phản ứng dị ứng muộn cũng có thể xảy ra sau dùng các kháng sinh β-lactam như thiếu máu tan máu, hội chứng Stevens-Johnson và viêm da Để hạn chế các phản ứng dị ứng do nhóm kháng sinh β-lactam, cần khai thác kỹ tiền sử dị ứng trước đây của người bệnh và thử test dị ứng với thuốc và các dị nguyên của thuốc trước khi sử dụng Với những người bệnh trước đây

đã bị các thể dị ứng nặng do các kháng sinh β-lactam như sốc phản vệ, hội chứng Stevens-Johnson, nên tránh dùng lại các kháng sinh trong họ này và tìm các thuốc thay thế thích hợp Nếu không có các thuốc thay thế thích hợp, có thể cân nhắc điều trị giảm mẫn cảm tại các cơ sở chuyên khoa dị ứng Có thể xảy ra dị ứng chéo giữa các kháng

sinh cephalosporin và penicillin, đặc biệt là các kháng sinh cephalosporin thế hệ 1

Nồng độ trong các test thử đánh giá phản ứng dị ứng của cephalosporin là 2 mg/ml (cho cả trên da và dưới da) nên đây được xem là mức nồng độ khuyến cáo có thể gây dị ứng

1.2 Một số công trình định lƣợng cephalexin

Một số điều kiện định lượng cephalexin bằng HPLC được trình bày ở bảng 1.1

Bảng 1.1 Một số điều kiện định lượng cephalexin bằng HPLC

Tốc độ dòng (ml/

phút)

Thể tích tiêm mẫu (µl)

Mẫu thử

hoặc 10 µm)

chế phẩm

13,6g/L - H2O (2:5:10:83)

C18 (250 x

4,6 mm; 5 hoặc 10 µm)

254 1,5 20

Nguyên liệu, chế phẩm

Nguyên liệu, chế phẩm

254

Điều chỉnh

để thời gian lưu khoảng

7 phút

10

Nguyên liệu, chế phẩm

Nhận xét: Các qui trình định lượng cephalexin được xây dựng để định lượng hoạt chất

này trong nguyên liệu và chế phẩm cephalexin Cho đến nay, chưa có nghiên cứu nào công bố qui trình định lượng và giới hạn vết cephalexin trên bề mặt các vật liệu và thiết

bị trong dây chuyền sản xuất kháng sinh

1.3 Tổng quan về GMP

- GMP (Good Manufacturing Practice – Thực hành sản xuất tốt) bao gồm những nguyên tắc chung, những qui định, hướng dẫn các nội dung cơ bản về điều kiện sản xuất; áp dụng cho các cơ sở sản xuất, gia công, đóng gói thực phẩm, dược phẩm, thiết

bị y tế, mỹ phẩm… nhằm đảm bảo sản phẩm đạt chất lượng và an toàn

- GMP quan tâm đến các yếu tố quan trọng như con người, nguyên vật liệu, máy móc thiết bị, thao tác, môi trường ở tất cả các khu vực của quá trình sản xuất, kể cả vấn đề giải quyết khiếu nại của khách hàng và thu hồi sản phẩm sai lỗi

- Những yêu cầu của GMP có tính mở rộng và tổng quát, cho phép mỗi nhà sản xuất

có thể tự quyết định về số qui định, tiêu chuẩn, thủ tục, hướng dẫn công việc sao cho đáp ứng được các yêu cầu cần thiết, phù hợp với loại hình, lĩnh vực sản xuất và điều kiện cơ sở vật chất của doanh nghiệp Chính vì vậy số các qui định, thủ tục của hệ thống GMP của mỗi doanh nghiệp sẽ khác nhau

Tại Việt Nam

- Năm 1997, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đã ban hành hướng dẫn chung về những nội dung cơ bản của GMP áp dụng trong các cơ sở sản xuất thực phẩm – Năm 2004, Bộ Y tế ban hành Quyết định số 3886/2004/QĐ-BYT về việc Triển khai

áp dụng nguyên tắc, tiêu chuẩn “Thực hành tốt sản xuất thuốc” (tân dược) theo khuyến cáo của Tổ chức Y tế Thế giới Quyết định yêu cầu đến hết năm 2006, tất cả các cơ sở sản xuất thuốc tân dược phải đạt GMP-ASEAN và đến hết năm 2010 tất cả các doanh

nghiệp sản xuất thuốc dùng ngoài và thuốc dược liệu phải đạt GMP-WHO

- Năm 2008, Bộ Y tế ban hành Quyết định số 5/2008/QĐ-BYT qui định các cơ sở sản xuất thuốc đông y phải áp dụng các tiêu chuẩn thực hành tốt sản xuất GMP như cơ

sở sản xuất thuốc tân dược

Qui định về vệ sinh (nhà xưởng và thiết bị) theo GMP của WHO 2014 [13]

- Nhà xưởng phải có vị trí, được thiết kế, xây dựng, sửa chữa và bảo dưỡng phù hợp với các thao tác sản xuất sẽ diễn ra

- Máy móc thiết bị phải được bố trí, thiết kế, kết cấu, điều chỉnh và bảo dưỡng phù hợp với các thao tác sẽ thực hiện Việc bố trí và thiết kế của máy móc phải nhằm mục đích giảm tối đa nguy cơ sai sót và cho phép làm vệ sinh và bảo dưỡng có hiệu quả, nhằm tránh nhiễm chéo, tích tụ bụi, và nói chung là tránh những tác động bất lợi đối với chất lượng sản phẩm

1.3.1 Qui định về giới hạn ô nhiễm trên bề mặt [14]

Có nhiều tiêu chí đánh giá dư lượng cho phép của thuốc ở đợt sản xuất trước xuất hiện trên bề mặt thiết bị và trong sản phẩm thuốc ở đợt sản xuất tiếp sau:

+ Dựa vào hàm lượng cho phép tiếp xúc hằng ngày:

( ) ( )

( )Trong đó:

MACO (The Maximum Allowable Carry Over): dư lượng tối đa cho phép của sản phẩm trước được có mặt trong sản phẩm sau trong quá trình sản xuất (mg)

ADE (Acceptable Daily Exposure): hàm lượng cho phép tiếp xúc hằng ngày (mg/ngày)

MBS (Minimum batch size): khối lượng lô thuốc sản xuất tiếp theo (mg)

TDD (Standard Therapeutic Daily Dose): liều điều trị thông thường của sản phẩm sản xuất tiếp theo (mg/ngày)

+ Dựa vào liều điều trị thông thường (mg/ngày):

( ) ( )

( )Trong đó:

SF (Safety factor): yếu tố an toàn (thường là 1000 được sử dụng trong tính toán dựa trên TDD)

+ Dựa vào LD50 (Lethal Dose 50): liều gây chết trung bình (50%) số cá thể trong nghiên cứu

( ) ( )

( ) ( )Trong đó:

NOEL (No Observed Effect Level): liều lượng không quan sát thấy ảnh hưởng (mg/ngày)

LD50: liều lượng gây chết trung bình (50%) số cá thể trong nghiên cứu (mg/kg)

BW (Body Weight): trọng lượng trung bình của một người lớn (ví dụ 70 kg) 2000: hằng số thực nghiệm

SF: hệ số an toàn, khác nhau tùy thuộc vào đường dùng Chỉ số 200 được sử dụng khi áp dụng cho thuốc sử dụng đường uống

MBS: khối lượng lô thuốc sản xuất tiếp theo (mg)

Ví dụ: với giới hạn chung là 100 ppm thì MACO = 0.01% MBS

 Giới hạn cho phép của Swab

( ) ( )

( )

1.3.2 Qui định về giới hạn ô nhiễm và giới hạn cho phép độ nhiễm chéo trong dược

Dư lượng sản phẩm phải đáp ứng các tiêu chí, áp dụng qui định nghiêm ngặt nhất trong

3 tiêu chuẩn sau:

+ Không quá 0,1% liều điều trị trông thường của bất kỳ sản phẩm xuất hiện ở liều tối

đa hằng ngày của sản phẩm sản xuất sau

+ Không quá 10 ppm của bất kỳ sản phẩm nào sẽ xuất hiện trong sản phẩm khác

+ Không có dư lượng còn phát hiện trên các thiết bị sản xuất sau khi qui trình vệ sinh được thực hiện (Xác định nồng độ của chất có thể nhìn thấy)

Đối với một số nguyên liệu gây dị ứng (penicillin, cephalosporin hay steroid và cytotoxics) giới hạn nên dưới giới hạn phát hiện bằng các phương pháp phân tích tốt nhất Trong thực tế nên có xưởng riêng biệt được sử dụng sản xuất các sản phẩm này

1.4 Phương pháp lấy mẫu

Thiết bị lấy mẫu nước thải đơn giản nhất là xô hoặc

bình rộng miệng buộc vào một cái cán có độ dài thích

hợp Thể tích không nên nhỏ hơn 100 ml, bình cần

phải chính xác đến 5% Lấy mẫu thủ công có

thể dùng bình Kemmerer (hình 1.4) Bình này là một

ống có dung tích từ l đến 3 lít và hai đầu đều có nắp,

hoặc các thiết bị lấy mẫu khác có nguyên lý tương tự

Thiết bị lấy mẫu thủ công phải được làm bằng vật liệu

trơ, không gây ảnh hưởng đến phân tích sau này Hình 1.4 Bình Kemmerer

Trước khi lấy mẫu, thiết bị phải được làm sạch bằng chất tẩy rửa và nước, hoặc theo hướng dẫn của hãng sản xuất, và cuối cùng tráng bằng nước Thiết bị lấy mẫu có thể được tráng bằng chính nước cần lấy ngay trước khi lấy mẫu, điều đó làm giảm khả năng gây ô nhiễm mẫu Nếu lấy mẫu để phân tích các chất tẩy rửa thì phải tráng bình rất kĩ sau khi rửa Chú ý không được tráng bình bằng nước cần lấy khi điều đó ảnh hưởng đến phân tích sau này (thí dụ phân tích dầu và mỡ, phân tích vi sinh vật)

1.4.1.2 Cách lấy mẫu

Mẫu đơn

Trong một mẫu đơn, toàn bộ thể tích mẫu được lấy ở một thời điểm Các mẫu đơn thường được dùng để xác định thành phần nước thải ở một thời điểm nhất định Trong những trường hợp dòng nước thải ít thay đổi về thể tích và thành phần, một mẫu đơn

có thể đại diện cho thành phần dòng nước thải trong thời gian dài

Cần phải lấy mẫu đơn khi mục tiêu của chương trình lấy mẫu là đánh giá sự tuân thủ các tiêu chuẩn không liên quan đến chất lượng trung bình Khi sự tuân thủ được xem xét trên cơ sở chất lượng trung bình thì phải dùng mẫu tổ hợp

Trong một số trường hợp xác định chỉ dùng mẫu đơn Thí dụ phân tích dầu và mỡ, oxy hòa tan, clor và hydro sulfur Trong trường hợp này kết quả phân tích sẽ bị sai khác nếu không tiến hành xác định ngay sau khi lấy mẫu và nếu toàn bộ thể tích mẫu không được dùng một lần Mẫu đơn thường được lấy thủ công nhưng cũng có thể bằng thiết

bị lấy mẫu tự động

Mẫu tổ hợp

Mẫu tổ hợp được chuẩn bị bằng cách trộn một số mẫu đơn hoặc bằng cách lấy liên tục từng phần nhỏ của dòng nước thải

Có hai loại mẫu tổ hợp:

a) Mẫu theo thời gian;

b) Mẫu theo dòng chảy

Mẫu tổ hợp theo thời gian chứa những mẫu đơn có thể tích bằng nhau và được lấy ở những khoảng thời gian bằng nhau trong chu kỳ lấy mẫu Mẫu tổ hợp theo thời gian dùng để nghiên cứu chất lượng dòng thải trung bình (thí dụ khi xác định sự tuân thủ một tiêu chuẩn dựa trên chất lượng trung bình hoặc khi xác định nồng độ trung bình nước thải để thiết kế quá trình, và trong những trường hợp dòng nước thải không đổi)

Mẫu tổ hợp theo dòng chảy chứa những mẫu đơn được lấy và pha trộn sao cho thể tích của mẫu tỉ lệ với tốc độ hoặc thể tích dòng trong suốt thời gian lấy mẫu Mẫu tổ hợp theo dòng chảy được dùng khi mục tiêu lấy mẫu là để xác định tải lượng của các chất ô nhiễm

Mẫu tổ hợp theo dòng chảy có thể lấy ở những khoảng thời gian bằng nhau nhưng với những thể tích thay đổi tì lệ với dòng chảy ở mỗi thời điểm lấy mẫu, hoặc gồm những mẫu đơn thể tích bằng nhau được lấy mỗi khi một lượng xác định nước thải đi qua điểm lấy mẫu

Trong cả hai loại mẫu tổ hợp, thể tích mỗi mẫu đơn phải lớn hơn 50 ml Nên lấy mẫu đơn từ 200 đến 300 ml để có được các mẫu đại diện

1.4.2.1 Lấy mẫu

- Bẻ 2 đầu ống lấy mẫu, nối ống theo chiều qui định với bơm hút đã được chuẩn trước qua ống nhựa mềm Bơm, ống lấy mẫu được đưa vào người công nhân hoặc đặt tại 1 vị trí lấy mẫu thích hợp

- Cho bơm hoạt động, đo thời gian hoạt động của bơm để xác định thể tích không khí

- Trong quá trình lấy mẫu có thể kiểm tra định kỳ tốc độ của bơm hút

- Lấy mẫu xong đậy nắp hai đầu ống bằng nắp nhựa hoặc bằng dính (không dùng nắp cao su) bảo quản cẩn thận, đưa về phòng thí nghiệm để phân tích

- Giải hấp

- Chọn dung môi giải hấp thích hợp sao cho hiệu quả giải hấp phải đạt được ≥ 75%

- Chuyển toàn bộ chất hấp phụ ở phần 1 của ống đã lấy mẫu vào 1 bình giải hấp phần thứ hai của ống cho vào 1 bình giải hấp khác, sau đó dùng bơm tiêm hoặc pipet đưa dung môi vào giải hấp với 1 lượng thích hợp

- Đối với ống than hoạt tính cần được cho vào 1 bình có đậy nắp kín, sau đó dùng bơm tiêm bơm dung môi giải hấp vào hoặc cho dung môi giải hấp vào bình trước sau đó cho từng lượng nhỏ than vào để tránh sự toả nhiệt bay hơi mất mẫu

m: Khối lượng của chất phân tích trong mẫu (μg);

mA: Khối lượng của chất phân tích trong mẫu trắng (μg);

SE: Hằng số hiệu quả lấy mẫu được xác định bằng thực nghiệm với hơi khí chuẩn;

V: Thể tích của mẫu (lít) được lấy, tính ở điều kiện tiêu chuẩn Nồng độ chất phân tích có trong mẫu lấy theo phương pháp hấp thụ rắn được tính theo công thức:

( )

Trong đó: m1: Khối lượng của chất phân tích phần phần 1 của ống (μg);

m2: Khối lượng của chất phân tích phần phần 2 của ống (μg);

mb: Khối lượng của chất phân tích trong mẫu trắng (μg);

DE: Hằng số hiệu quả giải hấp cho m1 được xác định bằng thực nghiệm ứng với từng loại chất hấp thụ rắn

1.4.3.1 Mẫu phết (Swab Sampling)

Lấy mẫu phết là một kỹ thuật được sử dụng rộng rãi Gạc (tăm bông) có thể được giải hấp phụ, hòa tan bằng các loại dung môi khác nhau để xác định dư lượng bề mặt

Ưu điểm:

+ Thích nghi với nhiều loại bề mặt

+ Kinh tế và phổ biến

+ Cho phép lấy mẫu ở 1 khu vực xác định

+ Áp dụng xác định vi khuẩn, hoạt chất và dư chất bề mặt

Nhược điểm:

+ Kết quả phụ thuộc vào kỹ thuật

+ Vật liệu tăm bông (gạc) ảnh hưởng đến độ phục hồi và độ đặc hiệu của phương pháp + Khó tiếp cận ở những vùng khó khăn như đường nứt, lòng đường ống, van…

Dụng cụ phết mẫu: tăm bông, gạc

Cách phết: dùng tăm bông khô (hoặc tẩm dung môi) phết trên diện tích được chọn lấy mẫu (5 x 5 cm2, 10 x 10 cm2, 5 x 20 cm2), cách phết theo mô tả hình sau:

Hình 1.5 Cách phết mẫu

1.4.3.2 Mẫu rửa (Rinse Sampling)

Mẫu rửa có thể được đánh giá ở trong suốt thời gian và khi kết thúc của quá trình làm sạch Các mẫu rửa nên xem xét vị trí, thời gian và khối lượng

Ưu điểm:

- Dễ dàng để lấy mẫu

- Ít phụ thuộc kỹ thuật hơn mẫu phết

- Cho phép lấy mẫu của một diện tích bề mặt

lớn

Hạn chế:

- Dư lượng có thể không được phân phối đồng

nhất, không có khả năng để phát hiện vị trí của

dư lượng

- Giảm độ nhạy do một số loại dư lượng bám

chặt bề mặt, hoặc không tan hết vào dung môi

rửa

Cách thực hiện: dùng 1 thể tích dung môi nhất

định, rửa bề mặt cần xác định dư lượng

Hình 1.6 Cách lẫy mẫu rửa

1.5 Phương pháp xử lý mẫu và bảo quản mẫu [6]

1.5.1 Xử lý mẫu

Loại bỏ các tạp không tan trước khi đem phân tích bằng cách lọc mẫu qua màng lọc (ví

dụ giấy lọc, politetrafluoroetylen, sợi thủy tinh) hoặc bằng ly tâm.Tuy nhiên, không áp dụng việc lọc nếu màng lọc cũng giữ lại một hoặc vài thành phần cần phân tích Một điều quan trọng tương tự là hệ thống lọc không được gây nhiễm bẩn và phải được rửa

kỹ trước khi sử dụng theo cách thức phù hợp với phương pháp phân tích cuối cùng

1.5.2 Bảo quản mẫu

Chừng mực của các biến đổi này tùy thuộc vào bản chất sinh học và hóa học của mẫu, nhiệt độ của mẫu, sự tiếp xúc với ánh sáng, bản chất của bình đựng mẫu, thời gian giữa lúc lấy mẫu cho đến lúc phân tích và những điều kiện mà mẫu trải qua

Trong nhiều trường hợp, nếu mẫu nước được phân tích trong vòng 24 giờ thì kỹ thuật bảo quản lạnh trong khoảng nhiệt độ từ 1oC đến 5 oC là đủ Nước thải công nghiệp cần phải được bảo quản ngay sau khi lấy mẫu, vì trong mẫu có hoạt độ sinh học

cao

1.5.2.1 Lựa chọn bình chứa mẫu

Bình được sử dụng thu thập và lưu giữ mẫu cần phải được lựa chọn sau khi tính đến các tiêu chí ưu thế sau (đặc biệt là khi phân tích các chất ở lượng vết) (phụ lục 1)

a) Giảm thiểu nhiễm bẩn mẫu do bình chứa hoặc vật liệu làm nắp bình, ví dụ các thành phần vô cơ chiết ra từ thủy tinh (đặc biệt là thủy tinh kiềm) và hợp chất hữu cơ và kim loại chiết ra từ bình nhựa Một số nắp bình có màu có thể chứa mức đáng kể các kim loại nặng

b) Khả năng làm sạch và xử lý thành bình để giảm nhiễm bẩn bề mặt do các thành phần lượng vết như kim loại nặng hoặc tác nhân phóng xạ

c) Tính trơ sinh học và hóa học của bình chứa hoặc vật liệu làm nắp bình để ngăn ngừa hoặc giảm thiểu phản ứng giữa thành phần mẫu và bình chứa

d) Bình chứa có thể gây ra thay đổi nồng độ các thành phần do hấp thu hoặc hấp phụ các hóa chất phân tích Kim loại lượng vết đặc biệt dễ bị tác động bởi các yếu tố này nhưng các hóa chất phân tích khác (ví dụ chất tẩy rửa, hóa chất bảo vệ thực vật, phosphat) cũng có thể bị ảnh hưởng

Các yếu tố khác cũng cần được xem xét đối với bình chứa mẫu, ví dụ như tính bền vững ở nhiệt độ khắc nghiệt, khó vỡ, dễ đậy và dễ mở, kích thước, hình dạng, khối lượng, chi phí, khả năng làm sạch và tái sử dụng

1.5.2.2 Chuẩn bị bình chứa

Tất cả những quy trình chuẩn bị bình chứa mẫu đều phải được phê chuẩn để đảm bảo không xảy ra bất cứ ảnh hưởng gì đến chất lượng mẫu Tối thiểu, sự chuẩn bị này cần bao gồm cả sự phân tích về:

a) Mẫu trắng

b) Mẫu chứa mức các chất phân tích tương ứng đã biết

Nếu không thể sử dụng các bình chứa sử dụng một lần thì cần dự trữ một loạt các bình chứa để dùng cho một chất cần xác định cụ thể, do đó giảm thiểu được nguy cơ nhiễm bẩn chéo Cần phải cẩn thận để phòng ngừa bình chứa khỏi bị nhiễm bẩn do trước đó

đã dùng chứa mẫu có chất xác định ở nồng độ cao sau đó lại lại dùng chứa mẫu có cùng chất xác định ở nồng độ thấp

Cần phải súc rửa bình chứa mới bằng nước có chất tẩy rửa để làm sạch bụi và chất bao gói sót lại, tiếp theo là súc rửa kỹ với lượng nước phù hợp Sử dụng chất tẩy rửa và dung môi có thể gây ra ảnh hưởng, ví dụ nhiễm bẩn dư lượng do chất tẩy rửa có chứa phosphat khi tiến hành các phép phân tích chất dinh dưỡng Nếu phải sử dụng thì chất tẩy rửa và dung môi cần dùng ở lượng thích hợp Đối với phép xác định silic, bohr và chất hoạt động bề mặt thì không được dùng chất tẩy rửa cho mục đích súc rửa

Bình chứa mẫu bằng thủy tinh hoặc nhựa súc rửa được với chất tẩy rửa

Quy trình súc rửa này cần thực hiện như sau:

a) Rửa bình chứa và nắp đậy với dung dịch tẩy rửa loãng và nước;

b) Súc kỹ bằng nước vòi

c) Súc lại hai lần với lượng nước thích hợp

d) Xả hết nước và đậy nắp lại

Có thể dùng máy rửa tự động để thực hiện quy trình này

Bình chứa mẫu bằng thủy tinh súc rửa được với dung môi

Quy trình súc rửa này cần thực hiện như sau:

a) Rửa bình chứa và nắp đậy với dung dịch tẩy rửa loãng và nước vòi

b) Súc kỹ bằng nước vòi

c) Súc lại hai lần với lượng nước thích hợp và sấy khô

d) Súc lại với lượng aceton thích hợp và xả hết

e) Súc lại với lượng dung môi thích hợp, sấy khô và đậy nắp lại ngay

Dung môi này cần phải tương ứng với chất cần phân tích và phương pháp phân tích được sử dụng

Bình chứa mẫu bằng thủy tinh hoặc nhựa súc rửa được với acid

Quy trình súc rửa này cần thực hiện như sau:

a) Rửa bình chứa và nắp đậy với dung dịch tẩy rửa loãng và nước vòi;

b) Súc kỹ bằng nước vòi

c) Súc với dung dịch acid nitric 10%

d) Xả hết và làm đầy bằng dung dịch acid nitric 10%

e) Đậy nắp lại và lưu giữ ít nhất trong 24 giờ

f) Xả hết dung dịch trong bình chứa, súc lại với lượng nước thích hợp và đậy nắp lại ngay

Một số hãng sản xuất cung cấp bình chứa với chứng nhận độ sạch Các bình chứa như vậy có thể không cần làm sạch hoặc súc rửa thêm, miễn sao nhà sản xuất cung cấp bình chứa với nắp đậy kèm theo

Máy súc rửa tự động dùng axit nóng có thể sử dụng cho quy trình này

1.5.2.3 Làm lạnh và đông lạnh mẫu

Làm lạnh và đông lạnh mẫu chỉ có hiệu quả nếu quá trình này được áp dụng ngay lập tức sau khi thu thập mẫu Cần sử dụng hộp đựng đá hoặc tủ lạnh tại điểm lấy mẫu Khi nhiệt độ bảo quản lạnh được qui định thì điều đó có nghĩa là nhiệt độ của môi trường chứa mẫu (không phải là nhiệt độ của bản thân mẫu)

1.5.2.4 Lưu giữ mẫu kéo dài

Bảo quản mẫu kéo dài có thể là thích hợp nếu phòng thí nghiệm chứng tỏ được rằng không có sự khác biệt giữa kết quả thử nghiệm thu được sau thời gian bảo quản kéo dài và kết quả thử nghiệm thu được trong thời hạn bảo quản qui định của tiêu chuẩn này Thời gian bảo quản mẫu tối đa được tính từ ngay sau khi mẫu được lấy và đến khi bắt đầu phân tích

Trong một số trường hợp quy định cụ thể, mẫu được yêu cầu giữ lại trong một khoảng thời gian xác định Các yêu cầu mang tính pháp lý như vậy được quyền ưu tiên hơn so với hướng dẫn trình bày trong tiêu chuẩn này và bỏ qua các ý nghĩa mang tính phân tích

Khi mẫu được phân tích sau quãng thời gian bảo quản tối đa Kết quả cần được kèm với một báo cáo về tác động mà kết quả phân tích có thể không phản ánh được nồng độ lúc thời điểm lấy mẫu

Thêm nữa, khi phòng thí nghiệm báo cáo dữ liệu phân tích sau thời gian khuyến nghị bảo quản tối đa, thì cần kèm với một báo cáo về tác động mà thời gian khuyến nghị bảo quản tối đa đã trôi qua

Bảo quản mẫu kéo dài có thể là thích hợp nếu phòng thí nghiệm chứng tỏ được rằng không có sự khác biệt giữa kết quả thử nghiệm thu được sau thời gian bảo quản kéo dài và kết quả thử nghiệm thu được trong thời hạn bảo quản quy định của tiêu chuẩn này

1.6 Cách tính LOD, LOQ trong phương pháp thử nghiệm [23]

1.6.1 Giới hạn phát hiện (Limit of Detection)

Là lượng nhỏ nhất của chất phân tích trong mẫu còn có thể phát hiện được nhưng không nhất thiết phải xác định hàm lượng

Cách xác định:

Cách 1: dựa vào tỷ lệ đáp ứng so với nhiễu Việc xác định tỉ lệ đáp ứng trên nhiễu được tiến hành bằng cách so sánh đáp ứng đo được trên mẫu thử có nồng độ chất phân tích

thấp đã biết với mẫu trắng và từ đó tính được nồng độ tối thiểu của chất phân tích có thể phát hiện được Tỷ lệ đáp ứng trên nhiễu nằm khoảng 3:1 hoặc 2:1 thường được chấp nhận để thiết lập giới hạn phát hiện

Cách 2: dựa vào độ lệch chuẩn của đáp ứng và độ dốc của đường chuẩn

Trong đó:

là độ lệch chuẩn của đáp ứng

S là độ dốc của đường chuẩn

Độ dốc S có thể được tính dựa vào đường chuẩn của chất phân tích

1.6.2 Giới hạn định lượng (Limit of Quantitation)

Là lượng nhỏ nhất của chất phân tích trong mẫu thử còn có thể xác định được hàm lượng với độ đúng và độ chính xác thích hợp Giới hạn định lượng là một thông số của phép định lượng các chất có nồng độ thấp trong mẫu thử, đặc biệt thường được dùng xác định tạp chất và sản phẩm phân hủy

Cách xác định:

Cách 1: dựa vào tỷ lệ đáp ứng so với nhiễu Việc xác định tỉ lệ đáp ứng trên nhiễu được tiến hành bằng cách so sánh đáp ứng đo được trên mẫu thử có nồng độ chất phân tích thấp đã biết với mẫu trắng và từ đó tính được nồng độ tối thiểu của chất phân tích có thể phát hiện được Tỷ lệ đáp ứng trên nhiễu nằm khoảng 10:1 thường được chấp nhận

để thiết lập giới hạn định lượng

Cách 2: dựa vào độ lệch chuẩn của đáp ứng và độ dốc của đường chuẩn

Trong đó:

là độ lệch chuẩn của đáp ứng

S là độ dốc của đường chuẩn

Độ dốc S có thể được tính dựa vào đường chuẩn của chất phân tích

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu – Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Cephalexin trên bề mặt thiết bị sản xuất (bề mặt kim loại và nhựa) và trong nguồn nước thải của nhà máy sản xuất kháng sinh -lactam

2.1.2 Chất chuẩn, hóa chất và dung môi

Bảng 2.1 Các chất chuẩn sử dụng trong nghiên cứu

Chất chuẩn Số kiểm soát Hàm lượng tính trên chế

phẩm nguyên trạng

Điều kiện bảo quản

Nơi cung cấp

Cephalexin

2 – 8 oC

Viện Kiểm nghiệm thuốc TP

Hồ Chí Minh

Bảng 2.2 Hóa chất và dung môi dùng trong nghiên cứu

Hóa chất – dung môi Mục đích sử dụng Xuất xứ Độ tinh khiết

Kali dihydrophosphat Sắc ký lỏng Emsure-Germany 99,5%

2.1.3 Trang thiết bị

Bảng 2.3 Trang thiết bị dùng trong nghiên cứu

Cột sắc ký

C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm)

C18 (150 x 4,6 mm; 5 µm)

Hệ thống HPLC - PDA Shimadzu-Nhật CBM 20A

Hệ thống HPLC - UV-Vis Shimadzu-Nhật SPD-20A

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Khảo sát qui trình định lượng cephalexin bằng kỹ thuật HPLC

Để xây dựng qui trình định lượng cephalexin trên bề mặt và trong nguồn nước thải của nhà máy sản xuất kháng sinh -lactam, một qui trình định lượng cephalexin theo dược điển Việt nam IV (qui trình 1) và một qui trình định lượng theo Viện Kiểm nghiệm thuốc Tp.HCM (qui trình 2) đã được tham khảo:

Bảng 2.4 Tóm tắt hai qui trình định lượng cephalexin

Điều kiện định

lượng

Qui trình 1 Dược điển Việt Nam IV

Qui trình 2( số MT/WI-QA-12) Viện Kiểm nghiệm thuốc Tp.HCM

Pha động MeOH - ACN - KH2PO4 0,136% - H2O (2:5:10:83)

Đầu dò UV Bước sóng phát hiện 254 nm

Dung dịch đối chiếu: Hòa tan 20 mg cephalexin monohydrat chuẩn trong nước hoặc

MeOH - nước (1:1) và pha loãng thành 200 ml với cùng dung môi

Tiến hành sắc ký 6 lần dung dịch đối chiếu theo hai qui trình trên Tính diện tích pic, thời gian lưu và hệ số bất đối

Yêu cầu: Qui trình đạt tính phù hợp hệ thống khi RSD của thời gian lưu và diện tích pic cephalexin không quá 2% và hệ số bất đối của pic cephalexin nằm trong khoảng 0,8 – 1,5

Tính đặc hiệu

Dung dịch phân giải: Hòa tan 2 mg cefradin chuẩn trong 20 ml dung dịch đối chiếu và

pha loãng thành 100 ml bằng với cùng dung môi

Tiến hành sắc ký dung dịch phân giải theo hai qui trình trên

Yêu cầu: Giá trị độ phân giải giữa hai pic tương ứng với cephalexin và cefradin trên sắc ký đồ của dung dịch phân giải ít nhất phải bằng 4,0 [1]

Tính tuyến tính, giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)

Từ dung dịch đối chiếu 100 ppm, pha loãng với nước hoặc MeOH – nước (1;1) để được các dung dịch có nồng độ khác nhau

Bảng 2.5 Chuẩn bị các dung dịch

Thể tích dung dịch đối chiếu (ml) 1 2 3 4 5 10 15 20 25 50

Nước hoặc MeOH – Nước (1:1) vừa đủ 100 ml

Tiến hành sắc ký các dung dịch trên Tính giá trị diện tích pic Thiết lập phương trình hồi qui giữa nồng độ và diện tích pic Sử dụng trắc nghiệm F và trắc nghiệm t để kiểm tra tính tương thích của phương trình hồi qui và ý nghĩa của các thông số trong phương trình hồi qui Xác định LOD và LOQ dựa trên độ lệch chuẩn của đáp ứng và hệ số góc

2.2.2 Khảo sát độ ổn định của cephalexin trong các dung môi hòa tan khác nhau và trong mẫu nước thải

Chuẩn bị dung dịch cephalexin có nồng độ khoảng 1 ppm – 10 ppm được pha trong một số dung môi hòa tan khác nhau như nước, hỗn hợp MeOH – nước (1:1), ethanol 70% và mẫu nước thải của nhà máy Imexpharm không có cephelaxin Tất cả các dung dịch đều được bảo quản ở nhiệt độ 25 oC

Tiến hành sắc ký các dung dịch trên theo thời gian Tính giá trị diện tích pic của cephalexin, từ đó xác định được nồng độ của cephalexin, so sánh với nồng độ cephalexin ban đầu và sử dụng trắc nghiệm F để đánh giá độ ổn định của dung dịch cephalexin, từ đó chọn được dung môi hòa tan thích hợp

2.2.3 Khảo sát độ ổn định của cephalexin trong điều kiện bảo quản khác nhau

Chuẩn bị dung dịch cephalexin đối chiếu 100 ppm được pha trong dung môi hòa tan thích hợp Từ dung dịch này, pha loãng với cùng dung môi để được 3 dung dịch cephalexin 10 ppm Dung dịch thứ 1 và thứ 2 được pha trong bình định mức không màu và được bảo quản lần lượt ở nhiệt độ 5 oC (tủ lạnh ngăn mát) và 25 oC Dung dịch thứ 3 được pha trong bình định mức màu nâu và được bảo quản ở 25 oC

Tiến hành sắc ký các dung dịch trên theo thời gian Đánh giá độ ổn định của dung dịch cephalexin tương tự mục 2.2.2., từ đó chọn được điều kiện bảo quản thích hợp

2.2.4 Khảo sát tính phù hợp hệ thống, khoảng tuyến tính, LOD và LOQ của qui trình định lượng cephalexin bằng LC-MS

Để có thể phát hiện cephalexin ở mức nồng độ thấp nhất có thể có trong các mẫu nước thải cũng như trên bề mặt thiết bị, kỹ thuật sắc ký lỏng ghép nối với đầu dò khối phổ đã được áp dụng Dựa vào một số tài liệu tham khảo định lượng cephalexin bằng kỹ thuật LC-MS[16],[19], xác định tính phù hợp hệ thống, khoảng tuyến tính, LOD và LOQ của phương pháp theo điều kiện sắc ký và khối phổ như sau:

Nhiệt độ khí bay hơi: 250 oC

Nhiệt độ buồng ion hóa: 400 oC

Thế dinod chuyển đổi (Conversion Dynode Volt): 6,0 kV

2.2.5 Xây dựng qui trình xử lý mẫu

2.2.5.1 Mẫu phết bề mặt

- Chuẩn bị 3 dung dịch cephalexin đối chiếu có nồng độ lần lượt là 100, 300 và 500 ppm (cân lần lượt 10 mg Cephalexin chuẩn bình định mức 100 ml, 3 mg Cephalexin chuẩn cho vào bình định mức 10 ml, 5 mg Cephalexin chuẩn cho vào bình định mức 10 ml; sau đó bổ sung nước đến vạch)

- Chuẩn bị bảng nhựa (hoặc kim loại-inox 316) có diện tích 5 x 5 cm Hút chính xác

100 µl dung dịch cephalexin đối chiếu, nhỏ lên bảng nhựa (hoặc kim loại), tráng dung dịch phủ đều bề mặt, để yên cho bay hơi dung môi, thu được mẫu bề mặt giả lập bị nhiễm cephalexin tương tự như trên thiết bị trong nhà máy Dùng tăm bông sạch, tẩm dung môi hòa tan thích hợp (đã được khảo sát ở mục 2.2.2.), phết đều bề mặt mẫu giả lập, cho tăm bông vào bình định mức chứa sẵn 10 ml dung môi nước, đậy nắp bình định mức, siêu âm 30 phút (duy trì nhiệt độ siêu âm khoảng 25-30 oC), thu được mẫu thử giả lập

- Chuẩn bị 6 mẫu thử giả lập trên mỗi loại bề mặt nhựa và kim loại tương ứng với mỗi dung dịch cephalexin

- Tiến hành sắc ký các mẫu thử giả lập và các dung dịch cephalexin đối chiếu có nồng

độ lần lượt là 1, 3 và 5 ppm Tính hiệu suất thu hồi bằng cách so sánh diện tích pic cephalexin của mẫu thử giả lập tương ứng với diện tích pic cephalexin của dung dịch đối chiếu

2.2.5.2 Mẫu nước thải từ nhà máy

Chuẩn bị một dung dịch cephalexin đối chiếu có nồng độ 10 ppm được pha trong nước

và 6 dung dịch cephalexin có nồng độ 10 ppm được pha trong nước thải tử nhà máy không có cephalexin Tiến hành sắc ký các dung dịch trên và tính hiệu suất thu hồi giống như mục 2.2.5.1

2.2.6 Xây dựng qui trình lấy mẫu và bảo quản mẫu

Tham khảo các yêu cầu kỹ thuật của GPM WHO, PIC/S, EU [8],[20],[21] và cơ sở vật chất hiện trạng của nhà máy để xây dựng quy trình phù hợp

- Mẫu bề mặt:

 Mỗi điểm lấy 4 vị trí, mỗi vị trí lấy 25 cm2

 Dùng kẹp inox gắp gạc/ tăm bông tẩm dung môi thích hợp lau trên bề mặt

 Cho vào cốc thủy tinh đậy kín

 Dán nhãn (ghi tên, ngày lấy mẫu, nơi lấy mẫu)

 Sau khi lấy mẫu dùng bông gòn sạch tẩm nước tinh khiết, lau sạch vị trí lấy

mẫu

 Chuyển ngay các mẫu về phòng phân tích

 Trong lúc vận chuyển mẫu phải được bảo quản ở điều kiện khô mát, tránh ánh sáng và tránh mọi sự tạp nhiễm từ bên ngoài vào

- Mẫu nước thải

 Dùng ca múc nước thải cuối nguồn, cho vào chai thủy tinh, đậy kín nút chai

 Chuyển ngay các mẫu về phòng phân tích

 Trong lúc vận chuyển mẫu phải được bảo quản ở điều kiện khô mát, tránh ánh sáng

và tránh mọi sự tạp nhiễm từ bên ngoài vào

2.2.7 Xây dựng qui trình vệ sinh sau sản xuất

Tham khảo các yêu cầu kỹ thuật của GPM WHO, PIC/S, EU [8],[20],[21] và cơ sở vật chất hiện trạng của nhà máy để xây dựng quy trình phù hợp

- Vệ sinh thiết bị, dụng cụ trước Sau đó vệ sinh phòng theo nguyên tắc từ trên xuống dưới, từ trái qua phải, từ nơi sạch nhất đến nơi dơ nhất

- Thiết bị cố định trong phòng sau khi vệ sinh xong phải được đậy kín bên trong lòng máy rồi mới tiến hành vệ sinh phòng Sau khi vệ sinh phòng xong, phải lau lại bề mặt bên ngoài máy bằng nước sinh hoạt cho thật sạch

- Phải quan sát kỹ các góc kẹt, khe rãnh, những nơi khó vệ sinh

- Quá trình vệ sinh phải nhẹ nhàng, tránh va chạm gây trầy xước, bể vỡ, lẫn lộn