PHẠM THỊ vân ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI ACID SALVIANOLIC b, TANSHINON IIA BẰNG PHƯƠNG PHÁP sắc ký LỎNG HIỆU NĂNG CAO và ĐÁNH GIÁ tác DỤNG hạ LIPID máu TRÊN THỰC NGHIỆM của CAO đặc PHƯƠNG THUỐC GIÁNG CHỈ ẩm LUẬN văn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHẠM THỊ VÂN ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI ACID SALVIANOLIC B, TANSHINON IIA BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO VÀ Đ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHẠM THỊ VÂN

ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI ACID SALVIANOLIC B, TANSHINON IIA BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG HẠ LIPID MÁU TRÊN

THỰC NGHIỆM CỦA CAO ĐẶC PHƯƠNG THUỐC

GIÁNG CHỈ ẨM

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC LIỆU - DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN

MÃ SỐ: 8720206

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Bùi Hồng Cường

HÀ NỘI - 2022

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này, với tình cảm chân thành, tôi xin bày tỏ lòng biết

ơn sâu sắc tới Ban Giám hiệu, phòng Sau đại học, cùng toàn thể các thầy cô trường Đại học Dược Hà Nội đã tận tình dạy bảo tạo điều kiện cho tôi có môi trường học tập tốt trong suốt thời gian tôi học tập, nghiên cứu tại Trường

Đặc biệt tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS.TS Bùi Hồng

Cường, người thầy luôn nhiệt tình giúp đỡ, hết lòng chỉ bảo và trực tiếp hướng dẫn,

định hướng, cũng như tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi được học tập, nghiên cứu trong suốt thời gian thực hiện đề tài, hoàn thành luận văn

Tôi xin gửi lời cảm đến ThS Nguyễn Thị Phượng và Khoa Dược lý - Sinh

hóa, Viện Dược liệu đã giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu đánh giá tác dụng hạ

lipid trên thực nghiệm của cao thuốc Giáng chỉ ẩm

Tôi xin cảm ơn toàn thể thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên tại Bộ môn Dược

học cổ truyền, đã luôn giúp đỡ tạo điều kiện giúp tôi hoàn thành luận văn

Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè và toàn thể đồng nghiệp đã luôn ủng hộ, động viên, giúp đỡ tôi trong trong suốt quá trình thực hiện luâ ̣n văn

Do kiến thức bản thân còn giới hạn, nên luận văn không tránh khỏi những hạn chế và thiếu sót Tôi mong nhận được sự góp ý, chỉnh sửa của quý thầy cô, bạn bè

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 21 tháng 04 năm 2022

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Phương pháp định tính, định lượng bằng HPLC 3

1.1.1 Phương pháp HPLC 3

1.1.2 Ứng dụng của phương pháp HPLC 4

1.1.3 Định tính, định lượng đồng thời Sal-B và Tan-IIA bằng HPLC 4

1.2 Tổng quan về lipid máu 5

1.2.1 Khái niệm về lipid máu 5

1.2.2 Phân loại 6

1.2.3 Con đường chuyển hóa và tác dụng của lipid trong cơ thể 6

1.2.4 Bệnh lý rối loạn lipid máu 7

1.2.5 Hiện trạng nghiên cứu thuốc YHCT điều trị RLLPM 8

1.3 Mô hình dược lý gây tăng lipid máu trên thực nghiệm 10

1.3.1 Mô hình dược lý thực nghiệm gây rối loạn lipid máu nội sinh 10

1.3.2 Mô hình dược lý thực nghiệm gây rối loạn lipid máu ngoại sinh 11

1.4 Phương thuốc Giáng chỉ ẩm 12

1.4.1 Công thức 12

1.4.2 Nguồn gốc và xuất xứ của phương thuốc 12

1.4.3 Công năng, chủ trị của phương thuốc 12

1.5 Thông tin cơ bản các vị thuốc 13

1.5.1 Đan sâm 13

1.5.2 Câu kỷ tử 15

1.5.3 Hà thủ ô đỏ 16

1.5.4 Sơn tra 18

1.5.5 Thảo quyết minh 19

1.6 Các nghiên cứu về phương thuốc Giáng chỉ ẩm 21

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 Đối tượng nghiên cứu 22

2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu 22

2.1.2 Động vật thí nghiệm 25

2.1.3 Thiết bị, máy móc 25

2.1.4 Thuốc, hóa chất, chất chuẩn 26

2.2 Phương pháp nghiên cứu 27

2.2.1 Định tính, định lượng đồng thời Sal-B và Tan-IIA trong cao đặc phương thuốc bằng HPLC 27

2.2.2 Đánh giá tác dụng hạ lipid máu trên thực nghiệm của cao đặc phương thuốc Giáng chỉ ẩm 32

2.3 Xử lí số liệu 34

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 35

3.1 Định tính, định lượng đồng thời Sal-B, Tan-IIA trong cao đặc phương thuốc Giáng chỉ ẩm bằng HPLC 35

3.1.1 Khảo sát điều kiện sắc ký và phương pháp chiết mẫu 35

3.1.2 Chuẩn bị dung dịch thử 40

3.1.3 Chuẩn bị dung dịch chuẩn 40

3.1.4 Thẩm định quy trình định lượng 41

3.1.5 Định tính bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao 52

3.1.6 Định lượng Sal-B, Tan-IIA trong các mẫu cao đặc 53

3.2 Đánh giá tác dụng hạ lipid máu trên thực nghiệm của cao đặc phương thuốc Giáng chỉ ẩm 54

3.2.1 Ảnh hưởng của cao chiết đến hàm lượng cholesterol toàn phần và triglycerid toàn phần 54

3.2.2 Ảnh hưởng của các cao chiết đến hàm lượng HDL-C, non-HDL-C, LDL-C 57

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 61

4.1 Về định tính, định lượng đồng thời Sal-B và Tan-IIA trong cao đặc phương thuốc Giáng chỉ ẩm 61

4.2 Về đánh giá tác dụng hạ lipid máu trên thực nghiệm 63

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 67

5.1 Kết luận 67

5.1.1 Về định tính, định lượng đồng thời Sal-B và Tan-IIA trong cao đặc phương thuốc Giáng chỉ ẩm 67

5.1.2 Về đánh giá tác dụng hạ lipid máu trên thực nghiệm 68

5.2 Kiến nghị 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC 1 PL-1 1.1 Hàm ẩm của các vị dược liệu trong phương thuốc Giáng chỉ ẩm PL-1 1.2 Hàm ẩm của cao đặc và tỷ lệ trung bình của cao khô so với dược liệu khô kiệt PL-1 PHỤ LỤC 2 PL-2 2.1 Phiếu kiểm nghiệm dược liệu Đan sâm PL-2 2.2 Phiếu kiểm nghiệm dược liệu Câu kỷ tử PL-5 2.3 Phiếu kiểm nghiệm dược liệu Hà thủ ô PL-7 2.4 Phiếu kiểm nghiệm dược liệu Sơn tra PL-9 2.5 Phiếu kiểm nghiệm dược liệu Thảo quyết minh PL-10 PHỤ LỤC 3 PL-11 3.1 Chất chuẩn acid Salvianolic B PL-11 3.2 Chất chuẩn Tanshinon IIA PL-14

MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

HDL-C High density lipoprotein cholesterol

(Lipoprotein cholesterol tỷ trọng cao)

HPLC High performance liquid chromatography

(Sắc kí lỏng hiệu năng cao)

IDL Intermediate density lipoprotein

(Lipoprotein cholesterol tỷ trọng trung bình)

LDL-C Low density lipoprotein cholesterol

(Lipoprotein cholesterol tỷ trọng thấp) LOD Limit of detection (Giới hạn phát hiện)

LOQ Limit of quantitation (Giới hạn định lượng) Non-HDL-C Non-High density lipoprotein cholesterol RLLPM Rối loạn lipid máu

Sal-B Acid salvianolic B

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Thuốc và hóa chất sử dụng 26

Bảng 2.2 Liều dùng quy đổi trên chuột nhắt trắng 32

Bảng 3.1 Thời gian lưu pic Sal-B và Tan-IIA ở các nhiệt độ cột khác nhau 37

Bảng 3.2 Diện tích pic Sal-B và Tan-IIA chiết ở các dung môi khác nhau 39

Bảng 3.3 Diện tích pic Sal-B và Tan-IIA khi chiết với nhiệt độ chiết khác nhau 39

Bảng 3.4 Diện tích pic Sal-B và Tan-IIA khi chiết với thời gian khác nhau 40

Bảng 3.5 Kết quả độ thích hợp hệ thống của Sal-B 43

Bảng 3.6 Kết quả độ thích hợp hệ thống của Tan-IIA 44

Bảng 3.7 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính định lượng Sal-B 45

Bảng 3.8 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính định lượng Tan-IIA 46

Bảng 3.9 Độ lặp lại và độ chính xác trung gian của Sal-B 47

Bảng 3.10 Độ lặp lại và độ chính xác trung gian của Tan-IIA 48

Bảng 3.11 Kết quả đô ̣ đúng Sal-B của phương pháp 49

Bảng 3.12 Kết quả đô ̣ đúng Tan-IIA của phương pháp 50

Bảng 3.13 Thời gian lưu (RT) của các pic sắc ký đồ mẫu thử 53

Bảng 3.14 Kết quả định lượng Sal-B và Tan-IIA trong các mẫu cao 54

Bảng 3.15 Ảnh hưởng của các cao chiết đến nồng độ của TC và TG 55

Bảng 3.16 Ảnh hưởng của các cao chiết đến nồng độ HDL-C, non-HDL-C, 57

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Các dược liệu trong phương thuốc Giáng chỉ ẩm 24

Hình 3.1 Hình ảnh phổ của Sal-B và Tan-IIA trong khoảng 230 - 350 nm 35

Hình 3.2 Sắc ký đồ của Sal-B và Tan-IIA với hệ pha động I (a), II (b), III (c) 36

Hình 3.3 Sắc ký đồ của Sal-B và Tan-IIA ở nhiệt độ cột 20℃ (a), 30℃ (b), 40℃ (c) 38

Hình 3.4 Sắc ký đồ các mẫu nghiên cứu 41

Hình 3.5 Phổ của mẫu thử và mẫu chuẩn Sal-B 42

Hình 3.6 Phổ của mẫu thử và mẫu chuẩn Tan-IIA 42

Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ và diện tích pic của Sal-B 45

Hình 3.8 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ và diện tích pic của Tan-IIA 46

Hình 3.9 Sắc ký đồ của Sal-B tại LOD 51

Hình 3.10 Sắc ký đồ của Tan-IIA tại LOD 52

Hình 3.11 Sắc ký đồ mẫu chuẩn 52

Hình 3.12 Sắc ký đồ mẫu cao đặc Giáng chỉ ẩm 53

Hình 3.13 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của các cao chiết đến nồng độ TC (a), TG (b) 56

Hình 3.14 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của các cao chiết đến nồng độ HDL-C (a), non-HDL-C (b), LDL- C (c) 59

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh tim mạch vẫn là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu ở cấp độ toàn cầu trong 20 năm qua Số ca tử vong do bệnh tim mạch tăng hơn 2 triệu người kể từ năm 2000, lên gần 9 triệu người vào năm 2019, và hiện chiếm 16% tổng số ca tử vong do mọi nguyên nhân [73] Các yếu tố nguy cơ gây nên bệnh tim mạch và đột quỵ là chế độ ăn uống không lành mạnh, lười vận động, sử dụng thuốc lá, chất kích thích Tác động của các yếu tố nguy cơ có thể biểu hiện ở mỗi người như tăng huyết áp, tăng đường huyết, rối loạn lipid máu (RLLPM) và thừa cân, béo phì Như vậy, rối loạn lipid máu là một trong các mục tiêu điều trị chính để phòng ngừa các bệnh tim mạch

Điều trị RLLPM phải kết hợp giữa điều chỉnh lối sống và điều trị bằng thuốc

Y học hiện đại sử dụng nhóm thuốc statin, fibrate, resin chelate hóa, acid nicotinic, các acid béo không no omega-3 có tác dụng hạ lipid máu nhanh, hiệu quả điều trị tốt nhưng đi kèm với nó là những tác dụng không mong muốn do thuốc gây ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe và sinh hoạt hàng ngày của bệnh nhân như đau đầu, chóng mặt, mất ngủ, rối loạn tiêu hóa, đau mỏi cơ, tiêu cơ,… [18], [23], [37] Vì vậy, xu hướng điều trị RLLPM hiện nay ưu tiên sử dụng các thuốc có nguồn gốc từ thiên nhiên vừa có hiệu quả điều trị vừa hạn chế được những tác dụng không mong muốn của thuốc tân dược

Phương thuốc Giáng chỉ ẩm có xuất xứ từ sách “Thiên gia diệu phương” công năng ích âm, hóa ứ, giáng chỉ; chủ trị can thận âm hư, khí trệ, huyết ứ, lipid trong

máu tăng [1], [26], biểu hiện lưng gối đau mỏi, ngũ tâm phiền nhiệt, mệt mỏi, đầu

choáng tai ù, tự hãn, miệng khô, họng ráo [19] ứng dụng trong điều trị RLLPM Theo một số tài liệu nghiên cứu chứng minh rằng, hai thành phần hóa học chính của

vị dược liệu Đan sâm có trong phương thuốc là acid salvianolic B và tanshinon IIA

làm giảm nồng độ của TC và TG, LDL-C, tăng HDL-C trong máu do đó có tác dụng làm hạ lipid máu [44], [58], [62], [65], [77] Vì vậy việc định tính, định lượng hai hoạt chất trên có ý nghĩa quan trọng trong đánh giá chất lượng của dược liệu và hiệu quả điều trị của phương thuốc

Năm 2021 trong báo cáo đề tài “Nghiên cứu điều chế cao đặc giàu acid salvianolic B từ phương thuốc Giáng chỉ và xây dựng một số chỉ tiêu chất lượng”

của Ths.Ds Hoàng Mạnh Tuấn [28] đã đạt được một số kết quả:

- Xây dựng được quy trình chiết xuất bằng nước nóng, điều chế cao đặc giàu acid salvianolic B từ phương thuốc Giáng chỉ ẩm

- Định tính được 5 thành phần dược diệu có trong phương thuốc Giáng chỉ ẩm

- Định lượng acid salvianolic B (Sal-B) trong cao đặc phương thuốc Giáng chỉ ẩm

Tuy nhiên, đề tài còn một số nội dung cần tiếp tục nghiên cứu:

- Đã xây dựng quy trình định lượng acid salvianolic B bằng phương pháp HPLC nhưng thời gian lưu dài (khoảng 30 phút), chưa xây dựng phương pháp định tính, định lượng tanshinon IIA (Tan-IIA) trong cao đặc

- Chưa nghiên cứu tác dụng sinh học của cao đặc phương thuốc Giáng chỉ ẩm

Để tiếp tục nghiên cứu, phát triển phương thuốc Giáng chỉ theo hướng ứng

dụng, đề tài “Định tính, định lượng đồng thời acid salvianolic B, tanshinon II A bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao và đánh giá tác dụng hạ lipid máu trên thực nghiệm của cao đặc phương thuốc Giáng chỉ ẩm” được thực hiện với

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Phương pháp định tính, định lượng bằng HPLC

1.1.1 Phương pháp HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) còn được gọi là sắc ký lỏng áp suất cao, là

kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng dưới áp suất cao Sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay loại cỡ là tuỳ thuộc vào loại pha tĩnh

sử dụng [3]

Khi phân tích sắc ký, các chất được hòa tan trong dung môi thích hợp và được cho qua cột bằng một dòng chất lỏng liên tục gọi là pha động Tốc độ di chuyển của các chất là khác nhau liên quan đến hệ số phân bố của chúng giữa hai pha tức là liên quan giữa ái lực tương đối của các chất này với pha tĩnh và pha động Thành phần pha động đưa chất phân tích di chuyển qua cột cần được điều chỉnh để rửa giải các chất phân tích với thời gian hợp lý [7]

Hình 1.1 Sơ đồ hệ thống HPLC

Trong đó: 1 - Bình chứa dung môi pha động

2 - Bộ phận khử khí

3 - Bơm cao áp

4 - Bộ phận tiêm mẫu (tiêm bằng syringe hay auto sampler)

5 - Cột sắc ký (pha tĩnh) để ngoài môi trường hay có thiết bị điều nhiệt

6 - Đầu dò detector (nhận tín hiệu)

7 - Hệ thống máy tính điện tử cài đặt phần mềm nhận tín hiệu, xử lý số liệu vàđiều khiển toàn bộ hệ thống

8 - Thiết bị in dữ liệu

1.1.2 Ứng dụng của phương pháp HPLC

Phạm vi ứng dụng của phương pháp HPLC rất rộng, hiện nay phương pháp HPLC là phương pháp rất phổ biến và được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như: thực phẩm, dược phẩm, môi trường…Vì ưu điểm của phương pháp này có độ nhạy cao, có khả năng định lượng tốt, mức độ chính xác cao, đặc biệt thích hợp để tách các chất khó bay hơi và các chất dễ bị phân hủy nhiệt nên nó được

sử dụng khá nhiều cho những mục đích sản xuất, nghiên cứu thí nghiệm, pháp lý và

y dược Đây là phương pháp được ứng dụng rất lớn trong ngành kiểm nghiệm nhất

là kiểm nghiệm thuốc, dược liệu HPLC là công cụ đắc lực nhất trong phép phân tích định tính và định lượng các thành phần hóa học, hoạt chất trong dược liệu, các loại dược phẩm đa thành phần

1.1.3 Định tính, định lượng đồng thời Sal-B và Tan-IIA bằng HPLC

Trong DĐVN V, hai thành phần hóa học Sal-B và Tan-IIA trong vị dược liệu Đan sâm được định tính, định lượng độc lập bằng sắc ký lớp mỏng và sắc ký lỏng Chưa đưa ra phương pháp định tính, định lượng đồng thời 2 hoạt chất trên

Hiện nay, trên thế giới đã đưa ra một số phương pháp định tính, định lượng đồng thời hai hoạt chất trên bằng HPLC, UPLC-MS [51], [69]

- Bài báo “Xác định đồng thời 5 hoạt chất ưa nước và kỵ nước được chiết xuất

từ rễ cây Đan sâm bằng HPLC” (Lu LL et all, 2015) Hàm lượng các hoạt chất (aldehyd protocatechuic, acid salvianolic B, tanshinon IIA, cryptotanshinone, danshensu) được định lượng ở bước sóng 281 nm, rửa giải bằng gradient nồng độ với độ tuyến tính tốt R2 > 0.9990 trong một khoảng nồng độ tương đối rộng [69]

- Bài báo “Định lượng đồng thời các hợp chất đã chọn từ các loại thảo

mộc Salvia bằng phương pháp HPLC và ứng dụng của chúng” (Hai-Ting Cheng et

al, 2012) Hàm lượng các hoạt chất (danshensu, aldehyd protocatechuic, acid rosemarinic, acid salvianolic B, dihydrotanshinon I, tanshinon I, cryptotanshinon và tanshinon IIA) được định lượng ở bước sóng 254 nm, 281 nm, 330 nm với độ tuyến tính tốt R2 > 0.9994 trong một khoảng nồng độ tương đối rộng [51]

- Bài báo “Định lượng đồng thời 6 thành phần trong cốm “Jiang-Zhi” bằng phương pháp UPLC –MS” Hàm lượng các hoạt chất (acid salvianolic B, tanshinon

IIA, danshensu, emodin, acid chlorogenlc, nulferin) đã được xác định với độ tuyến tính tốt R2 > 0.9992 trên các khoảng nồng độ khảo sát [68]

- Đề tài “Xây dựng phương pháp định tính, định lượng cao đặc Đan sâm” (Nguyễn Lan Hương, 2021) đã định tính, định lượng đồng thời hai hoạt chất acid Sal-B và Tan-IIA bằng phương pháp HPLC ở bước sóng 270 nm với độ tuyến tính tốt R2 > 0.9995 trên các khoảng nồng độ khảo sát [14]

1.2 Tổng quan về lipid máu

1.2.1 Khái niệm về lipid máu

Lipid máu là những phân tử kỵ nước, khó tan trong nước Lipid được tìm thấy trong màng tế bào, duy trì tính nguyên vẹn của tế bào và cho phép tế bào chất chia thành các ngăn tạo nên những cơ quan riêng biệt Lipid là tiền thân của một số hormon và acid mật là chất truyền tín hiệu ngoại bào và nội bào [5]

Lipid trong cơ thể gồm có: mô mỡ trung tính tức triglycerid, các phospholid, cholesterol và các acid bé tự do

- Cholesterol là một alcol vòng không no, là thành phần tham gia cấu tạo màng

tế bào

- Triglycerid cấu tạo gồm một phân tử glycerol và 3 acid béo, có 3 chức năng chính là: tạo nên mỡ trung tính dưới dạng dự trữ và cung cấp năng lượng, cách nhiệt, là lớp đệm để bảo vệ các cơ quan trong cơ thể

- Phospholipid là một phức hợp có nhiều dạng, có nhiều chức năng đặc hiệu như: truyền tin trong tế bào, chất làm căng bề mặt, tham gia cấu tạo màng tế bào

- Acid béo là những chuỗi cacbon có mạch thẳng được chia thành 2 nhóm chính: acid béo bão hòa và acid béo không bão hòa [2], [5]

Lipid không tan trong nước, không tan trong máu, vì vậy phải kết hợp với protein nhờ liên kết Vander - Walls để tạo thành lipoprotein Nhờ tạo thành lipoprotein nên các lipid tan được trong nước và vận chuyển đến các mô [5]

1.2.2 Phân loại

Các loại lipid máu theo kích thước:

- Chilomicron vi dưỡng chấp chứa triglycerid

- VLDL (very low density lipoprotein)

- LDL (low density lipoprotein)

- HDL (high density lipoprotein) [5]

1.2.3 Con đường chuyển hóa và tác dụng của lipid trong cơ thể

Lipid là nguồn cung cấp năng lượng chính cho cơ thể, tham gia cung cấp 25%

- 30% năng lượng cơ thể 1g lipid cung cấp đến 9,1 kcal Lipid là nguồn năng lượng

dự trữ lớn nhất trong cơ thể, dạng dự trữ là mỡ trung tính triglycerid tại mô mỡ Bình thường khối lượng mỡ thay đổi theo tuổi, giới và chủng tộc [5]

Quá trình chuyển hóa lipid theo hai chu trình ngoại sinh và nội sinh (Hình 1.2), khi hai chu trình này diễn ra bình thường thì sẽ không xảy ra tình trạng rối loạn lipid máu Trường hợp các yếu tố tạo nên 2 chu trình này bị tác động gây dư thừa hoặc thiếu sẽ gây rối loạn lipid máu [18]

Hình 1.2 Chuyển hoá lipoprotein nội và ngoại sinh

LPL: lipoprotein lipase; FFA: free fatty acids; VLDL: very low density lipoproteins; IDL: intermediate density lipoproteins; LDL: low density lipoproteins; LDLR: low-density lipoprotein receptor (Nguồn: Harisson - 2005)

* Chu trình ngoại sinh: Lipid sau khi đưa vào cơ thể qua đường thức ăn, một

phần được tiêu hóa ngay từ tá tràng; tại đó, dưới tác dụng của men lipase; các acid béo được chuyển thành dạng tự do rồi hấp thu vào cơ thể theo đường tĩnh mạch cửa

để vào gan, tham gia chu trình nội sinh [4], [23]

* Chu trình nội sinh: Lipid được hấp thu vào cơ thể qua đường thức ăn và

lipid được hình thành từ con đường nội sinh tại gan đều được đưa vào tuần hoàn chung bằng cách gắn với các apoprotein để tạo thành lipoprotein tỷ trọng rất thấp (VLDL) VLDL theo đường tuần hoàn tới mô mỡ tỷ trọng tăng lên và lần lượt biến thành lipoprotein tỷ trọng trung gian (IDL) đến lipoprotein tỷ trọng thấp (LDL) Sau khi trao cholesterol cho các tế bào theo nhu cầu, LDL chuyển thành lipoprotein tỷ trọng cao (HDL) [4], [23]

Ở người bình thường, quá trình tổng hợp và thoái hóa lipid - lipoprotein diễn

ra cân bằng và theo nhu cầu của cơ thể Do vậy, hàm lượng và tỉ lệ thành phần các loại lipoprotein, lipid trong máu được ổn định Khi mất cân bằng giữa hai quá trình này, rối loạn chuyển hóa lipid sẽ xảy ra dân đến bệnh lý rối loạn lipid máu

1.2.4 Bệnh lý rối loạn lipid máu

Theo Y học hiện đại, rối loạn lipid máu là tình trạng bệnh lý khi có một hoặc nhiều thông số lipid bị rối loạn (tăng cholesterol hoặc tăng triglicerid, hoặc tăng LDL-C, hoặc giảm HDL-C…) RLLPM thường được phát hiện cùng lúc với mội số bệnh lý tim mạch - nội tiết - chuyển hóa Đồng thời RLLPM cũng là yếu tố nguy cơ của bệnh lý này Nguyên nhân của RLLPM có thể do nguyên phát như di truyền hoặc thứ phát do phong cách sống không hợp lý Điều trị RLLPM thay đổi lối sống (tăng cường vận động thể lực, thay đổi chế độ ăn: hạn chế bia rượu, mỡ động vật…) hoặc dùng thuốc giảm lipid máu Điều trị RLLPM góp phần vào điều trị bệnh nguyên của nhiều bệnh tim mạch, nội tiết, chuyển hóa [5]

Theo Y học cổ truyền, hội chứng rối loạn lipid máu thuộc phạm vi chứng

“Đàm ẩm”, “Đàm thấp”…của y học cổ truyền Nguyên nhân gây chứng bệnh chính

là những nguyên nhân hình thành thủy, thấp, đàm ẩm trong cơ thể Thủy, thấp, đàm,

ẩm được hình thành do ngoại cảm lục dâm, nội thương thất tình, ăn uống thất

thường, lao lực quá độ hoặc cuộc sống quá nhàn rỗi làm rối loạn chức năng của các tạng phế, tỳ, can, thận khiến cho sự vận hóa thủy dịch trong cơ thể bị trở ngại, thủy dịch bị đình trệ lại mà thành, Theo Y học cổ truyền, RLLPM là tình trạng bản hư tiêu thực, bệnh xảy chủ yếu do 3 tạng: can, tỳ, thận hư (bản hư) dẫn tới tình trạng đàm thấp trở trệ, huyết ứ (tiêu thực) Vì vậy, trong quá trình điều trị cẩn chú ý phân biệt các biểu hiện thực hư của bệnh [18]

1.2.5 Hiện trạng nghiên cứu thuốc YHCT điều trị RLLPM

1.2.5.1 Các vị thuốc có tác dụng điều trị RLLPM

* Tác dụng lên các thành phần lipid của máu [17], [45]:

- Vị thuốc có tác dụng giảm cholesterol: Hà thủ ô, Đỗ tro ̣ng, Cam thảo, Bạch quả, Mô ̣t dược, Cát căn, Tang ký sinh

- Vị thuốc có tác dụng giả m triglycerid: Kim ngân hoa, Đại hoàng, Sài hồ, Linh chi, rễ Đại mạch, Thổ miết trù ng

- Vị thuốc giả m cả cholesterol và triglycerid: Thảo quyết minh, Ngũ linh chi, Đông trùng hạ thảo, Nhân sâm, Đan sâm, Hải tảo, Sơn tra, Trạch tả, Tam thất

- Nhóm có tác dụng tăng HDL-C: Hà thủ ô, Sài hồ, Thổ miết trùng

* Tác dụng theo cơ chế [17], [45]:

- Ức chế hấ p thu lipid từ ngoài vào:

+ Tăng cường nhu đô ̣ng ruô ̣t, thúc đẩy bài tiết lipid: Đại hoàng, Hà thủ ô, Thảo quyết minh, Cốt khí

+ Ức chế sự hấp thu lipid trong ruô ̣t: Đâ ̣u xanh, Rong biển, Bồ hoàng

- Ức chế sự tạo thành cholesterol và triglycerid:

+ Ức chế sự tạo thành cholesterol: Trạch tả, Nghê ̣, Hà thủ ô, Bồ hoàng + Ức chế sự tạo thành triglycerid: Trạch tả, Linh chi

1.2.5.2 Một số bài thuốc và chế phẩm có tác dụng điều trị RLLPM

Đã có rất nhiều các bài thuốc, chế phẩm nghiên cứu về RLLPM ở Việt Nam

và trên thế giới:

- Bài thuốc “Bán hạ bạch truâ ̣t thiên ma thang” (Hoàng Khánh Toàn và cộng

sự, 1999) sau 2 tháng điều trị bằng thuốc sắc 1 thang/ngày có tác dụng làm giảm 16% TC, 31,5% TG, làm tăng 19,8% HDL-C và làm giảm 20,2% LDL-C [27]

- Bài thuốc LP4 (Lê Văn Thành, 2003) gồm Hà thủ ô 20 g, Đan sâm 20 g, Thổ phục linh 20 g, nấ m Linh chi 5 g, Thảo quyết minh 20 g, Sơn tra 20 g; Nghiên cứu tiến hành trên 52 bê ̣nh nhân RLLPM, thuốc đã làm giảm TC 8,8%, giảm TG 6,85%, giả m LDL-C 11,2% đồng thời làm tăng HDL-C 11,2% [30]

- Bài thuốc “Giáng chỉ thang gia giảm” (Vũ Viê ̣t Hằng và cộng sự, 2005), gồm Đan sâm 18 g, Ngưu tất 12 g, Hoàng tinh 18 g, Sơn tra 12 g, Hà thủ ô 18 g, Nấm linh chi 18 g, Trạch tả 18 g Bài thuốc có tác dụng làm giảm các chỉ số TC, TG, LDL-C và làm tăng HDL-C [11]

- Cốm tan “Tiêu phì linh” (Hà Thị Thanh Hương, 2012) gồm các vị: Thảo quyết minh, Sơn tra, Hà diê ̣p, Hà thủ ô đỏ, Nga truâ ̣t, Trạch tả Điều trị 70 bệnh nhân mắc hội chứng RLLPM, sau 60 ngày thấy có tác dụng làm giảm cholesterol 17,19%, triglyceride 26,82%, LDL-C 18,29% và làm tăng HDL-C 10,57% [13]

- Viên nén "Hạ mỡ" (Nguyễn Thù y Hương, 2004, 2013) gồm Hà thủ ô, Ngưu tấ t, Sa nhân, Thảo quyết minh, Sơn tra, Đại hoàng Sau 2 tháng điều trị thấy thuốc

có tác dụng làm giảm chỉ số cholesterol và LDL-C [15], [16]

- Viên nang cứ ng “Ruvintat”, bào chế từ Hoa hòe, Dừa cạn, Mã đề, Câu đằng, Ngưu tất, Muồng trâu, Vông nem và Râu ngô (Dương Thị Mô ̣ng Ngo ̣c và cộng sự, 2012) có tác dụng làm giảm các chỉ số TC, LDL-C và TG nhưng không làm thay đổi nồng độ HDL-C [21]

- Bài thuốc "Đan sâm cát căn", gồm Đan sâm và Cát căn Có tác dụng làm giả m cholesterol tự do và este hóa trong các bạch cầu đơn nhân in vivo; giảm nhẹ

nồng độ TC và LDL-C ở những bê ̣nh nhân mắc bê ̣nh đô ̣ng mạch vành; giảm nồng

đô ̣ TC và LDL ở phụ nữ mãn kinh có tăng TC máu [52], [64]

- Bài thuốc "Linh quế truật cam thang", gồm Phục linh, Quế chi, Bạch truâ ̣t, Cam thảo có tác dụng làm giảm nồng độ TG và TC ở chuột gây mô hình gan nhiễm mỡ [87]

- Bài thuốc “Huyết phủ trục ứ thang”, gồm Sài hồ, Đương quy, Sinh địa, Bạch thược, Hồng hoa, Đào nhân, Chỉ thực, Cam thảo, Cát cánh, Xuyên khung, Ngưu tất

Trên mô hình chuột gây RLLPM thấy có tác dụng làm giảm trị số TC và LDL-C; tăng HDL-C; TG không đổi, ngoài ra còn làm giảm tích lũy acetyl-glycoprotein; tăng tổng hợp glutathione; ức chế sản xuất interleukin tiền viêm IL8 [76], [88]

1.3 Mô hình dược lý gây tăng lipid máu trên thực nghiệm

Để nghiên cứu thuốc điều trị RLLPM, trước hết phải gây được mô hình tăng lipid máu Nhiều loài động vật đã được sử dụng và nhiều mô hình dược lý cũng đã được nghiên cứu và áp dụng thành công trên động vật thực nghiệm Các mô hình có thể thuộc loại: gây tăng cholesterol hoặc lipid máu ngoại sinh (đưa cholesterol và mỡ theo đường thức ăn), gây tăng cholesterol máu nội sinh (gây tăng tổng hợp

cholesterol) hoặc phối hợp cả hai loại này [40]

1.3.1 Mô hình dược lý thực nghiệm gây rối loạn lipid máu nội sinh

Chất hay được sử dụng để gây mô hình tăng lipid máu nội sinh là tween 80 (Polysorbate 80) (Cheymol và cs, 1965), triton WR-1339 (Tyloxapol) (Frans ID và cộng sự có cải tiến) và poloxamer 407 (P-407) (Thomas P Johnston (2004), được chứng minh có cơ chế là làm tăng tổng hợp cholesterol tại gan

Tween 80 hay Polysorbate 80 là một chất hoạt động bề mặt không ion hóa, là dẫn xuất của sorbitol và acid oleic Tác dụng gây tăng lipid máu của tween 80 được quan sát thấy lần đầu tiên ở trên thỏ bởi Kellner, Correll và Ladd [81], [90], và sau

đó là ở trên chuột nhắt bởi Cornforth, Hart, Rees và Stock [91] Nguyễn Tiến Chung

sử dụng tween 80 trên thỏ theo mô hình của Kell, Correll và Ladd bằng cách tiêm tĩnh mạch vành tai dung dịch tween 80 20% với liều 2,5 mL/kg cân nặng trong NaCl 0,9%, kết quả cho thấy nồng độ TC tăng 78,41% và TG là 622,64% [45] Triton WR-1339 (isooctyl-polyoxy-ethylene phenol) là chất diện hoạt, dùng đường toàn thân trên chuột nhắt hoặc chuột cống nhịn đói hoặc không nhịn đói sẽ gây tăng TC và TG huyết thanh [38] Theo một nghiên cứu của Nandakumar và cộng sự, sử dụng mô hình của Moreover Paoletti gây tăng cholesterol bằng triton WR-1339 đường tiêm tĩnh mạch liều 200mg/kg trên chuột nhắt, nồng độ TC tăng

290 % và TG tăng 415% [71]

Chứng tăng cholesterol gồm 2 giai đoạn [61] :

+ Giai đoạn I: sau 24 giờ, nồng độ cholesterol huyết tăng lên đột ngột gấp khoảng 3 lần so với nhóm đối chứng

+ Giai đoạn II: nồng độ cholesterol huyết giảm dần và sau 72 giờ nồng độ Cholesterol gần như bằng với nồng độ nhóm đối chứng

Cơ chế tăng cholesterol máu do triton được giải thích do tác động đến sự tiếp nhận lipid huyết tương ở các mô (ức chế hoạt động của emzym lipoprotein lipase và thả trừ VLDL) [53], [57]

1.3.2 Mô hình dược lý thực nghiệm gây rối loạn lipid máu ngoại sinh

Nhiều nhà nghiên cứu trên thế giới sử dụng chuột cống trắng trưởng thành với mô hình gây tăng cholesterol bằng bổ sung vào chế độ ăn 1% cholesterol, 1% acid mật (acid cholic) và 0,5% kháng giáp trạng propylthiouracil (PTU) trong vòng 4 tuần Bổ sung acid cholic và PTU là một biện pháp để làm tăng hấp thu cholesterol, giảm chuyển hóa cholesterol thành acid mật, vì vậy nồng độ cholesterol huyết thanh tăng nhanh và mạnh hơn Nassiri và cộng sự đã cải tiến mô hình này bằng cách cho chuột uống 10 mL/kg cân nặng hỗn hợp dầu cholesterol gồm: 10 mg cholesterol, 3 g propylthiouracil và 10g acid cholic, dầu lạc vừa đủ 100 mL Kết quả cho thấy ở nhóm sử dụng 10mL hỗn hợp dầu cholesterol/kg/ngày, cholesterol tăng lên 9,65 ± 0,1 mmol/L trong khi ở nhóm chứng là 3,7 ± 0,1 mmol/L [41]

Tại Việt Nam, Đoàn Thị Nhu và cộng sự đã gây mô hình tăng cholesterol máu bằng cách cho thỏ đực uống cholesterol hoà tan trong dầu lạc với liều 0,5 g/kg/ngày kéo dài liên tục trong 2 tuần [22], [35] Khi áp dụng mô hình này, Nguyễn Phương Thanh đã sử dụng hàm lượng cholesterol là 0,1 g/mL, acid cholic 0,01g/mL, PTU 0,05 g/mL, dầu lạc 1mL Kết quả nghiên cứu cho thấy tăng rõ rệt nồng độ TC ở nhóm uống hỗn hợp dầu cholesterol với liều 1 mL/100g chuột/ngày (tăng gấp 2,04

lần) so với nhóm chứng sinh học [29]

1.4 Phương thuốc Giáng chỉ ẩm

1.4.1 Công thức

- Đan sâm (Radix et Rhizoma Salviae miltiorrhizae) 5,0 g

- Hà thủ ô đỏ (Radix Fallopiae multiflorae) 3,5 g

- Thảo quyết minh (Semen Cassiae torae) 5,0 g

1.4.2 Nguồn gốc và xuất xứ của phương thuốc

Phương thuốc “Giáng chỉ ẩm” có xuất xứ trong “Thiên gia diệu phương” (Những bài thuốc đông y hay của muôn nhà) với liều lượng như sau:

- Đan sâm (Radix et Rhizoma Salviae miltiorrhizae) 20,0 g

- Hà thủ ô đỏ (Radix Fallopiae multiflorae) 15,0 g

- Thảo quyết minh (Semen Cassiae torae) 15,0 g

Cách dùng và đường dùng: Sắc nhỏ lửa với khoảng 1500 ml nước, chứa vào nước phích nước nóng làm trà uống dần nhiều lần

Hiệu quả lâm sàng của phương thuốc: Theo dõi 31 ca, sau hai tháng thì giảm thể trọng, lipid huyết giảm rõ rệt [1]

1.4.3 Công năng, chủ trị của phương thuốc

- Công năng: Ích âm, hóa ứ, giáng chỉ [1], [26]

- Chủ trị: Trị can thận âm hư, khí trệ, huyết ứ, lipid trong máu tăng [1], [26], biểu hiện lưng gối đau mỏi, ngũ tâm phiền nhiệt, mệt mỏi, đầu choáng tai ù, tự hãn, miệng khô, họng ráo [19]

- Giải thích phương thuốc:

+ Trong phương thuốc Đan sâm bổ huyết, hoạt huyết hóa ứ là chủ dược + Hà thủ ô, Câu kỷ tử bổ can thận âm, bổ huyết là thần trị can thận âm hư, huyết hư

+ Sơn tra, Thảo quyết minh thư can, tán ứ, thanh hóa nhiệt đàm là tá giúp tiêu tích dầu mỡ

+ Câu kỷ tử là sứ giúp bổ can thận ích khí huyết dẫn thuốc tới nơi bị bệnh

1.5 Thông tin cơ bản các vị thuốc

1.5.1 Đan sâm

1.4.1.1 Tên khoa học: Radix et Rhizoma Salviae miltiorrhizae [8], [20]

1.4.1.2 Bộ phận dùng: Rễ và thân rễ phơi hoặc sấy khô của cây Đan sâm - Salviae

miltiorrhiza Bunge [8], [20], [33]

1.4.1.3 Thành phần hóa học:

- Các diterpenoid quinon: Tanshinon I, II, III, tanshindiol A, B, C…[20] Có

khoảng 49 diterpenoid quinon được tìm thấy trong Đan sâm [77]

- 36 acid phenolic thân nước: Acid salvianolic A, B, C, D, G, F, acid caffeic,

acid rosmarinic … [54], [77]

- Một số các chất khác: Salvianonol, salvianon, 2α-acetoxysugio, palmitoyl

arucadiol, neotanshinlacton [77]

1.4.1.4 Tác dụng sinh học

- Tác dụng hạ lipid máu: Sal-B có trong Đan sâm có tác dụng hạ nồng độ TC

trong huyết tương, kèm theo giảm đáng kể nồng độ TC, TG, LDL-C và làm tăng HDL-C [44], [58], [62], [77]

- Chống xơ vữa: Tan-IIA và Sal-B trong Đan sâm có thể làm mất sự tăng sinh của các tế bào cơ trơn mạch máu và làm giảm sự tăng sản nội bào trong sự phát triển của chứng xơ vữa động mạch [65], [77]

- Chống tăng huyết áp: Tan-IIA làm giảm áp lực động mạch phổi trung bình ở chuột bị tăng huyết áp do thiếu oxy [59], [77]

- Chống thiếu máu cơ tim: Acid salvianolic trong Đan sâm có khả năng điều trị bệnh thiếu máu cục bộ ở bệnh nhân mắc bệnh mạch vành [66], [77] Tanshinon

II có tác dụng bảo vệ cơ tim chống lại những rối loạn về chức năng và chuyển hóa gây ra bởi thiếu hụt oxy [33]

- Những nghiên cứu lâm sàng cho thấy có mối liên quan giữa tác dụng tăng cường tuần hoàn máu của Đan sâm trong YHCT với sự chẩn đoán của y học hiện đại về tác dụng điều trị bệnh tim mạch, viêm mạch tạo huyết khối nghẽn và huyết khối tắc mạch não [33] Ở Trung Quốc, Nhật Bản, Hoa Kỳ và Châu Âu, Đan sâm đã được sử dụng rộng rãi để điều trị các bệnh mạch máu bao gồm xơ vữa động mạch, tăng huyết áp, tăng lipid máu và đột quỵ [46], [63], [77]

1.4.1.5 Tác dụng, công dụng theo y học cổ truyền

- Tính vị: Vị đắng, tính hơi hàn [20], [24], [33]

- Quy kinh: Tâm, can [8], [33]

- Công năng, chủ trị: Hoạt huyết, thông kinh, giảm đau, thanh tâm lương huyết Chủ trị: Kinh nguyệt không đều, kinh nguyệt bế tắc, hành kinh đau bụng, huyết tích hòn cục, đau thắt ngực, mất ngủ, tâm phiền [8], [20], [24], [33]

- Dược liệu phải chứa không ít hơn 0,2% Tan-IIA (C19H18O3) tính theo dược liệu khô kiệt

1.4.2.1 Tên khoa học: Fructus Lycii [8], [20]

1.4.2.2 Bộ phận dùng: là quả chín phơi hay sấy khô của cây Khởi tử (Khủ khởi) -

Lycium barbarum L [20], [24], [33]

1.4.2.3 Thành phần hóa học:

- Betain, caroten, acid nicotinic, các nguyên tố vi lượng như canxi, sắt [20]

- Scopoletin, beta-sitosterol, axit p-coumaric, glucose, daucosterol [83]

- Acid amin, acid béo và các polysacarid [86]

1.4.2.4 Tác dụng sinh học

- Tăng cường miễn dịch: Nước sắc Câu kỷ tử tăng cường hoạt động của men lysozym trong huyết thanh, nâng cao hiệu quả kháng thể kháng hồng cầu của huyết thanh và tăng số lượng tế bào có kháng thể hình thành trong tổ chức lách [33]

- Hạ cholesterol huyết, đường huyết: Các polysacarid có trong dịch chiết Câu

kỷ tử làm giảm đáng kể nồng độ LDL, TC, triacylglycerol (TAG) và glucose huyết [33], [70]

- Tác dụng bảo vệ gan: Betain trong dịch chiết Câu kỷ tử có tác dụng bảo vệ gan trong các bệnh gan nhiễm mỡ [70], làm giảm nhẹ tổn thương gan do CCl4 gây ra bằng cách tăng cường hoạt động chống oxy hóa và giảm chất trung gian gây viêm [39]

- Tác dụng đối với hệ thống máu: Câu kỷ tử có tác dụng ngăn ngừa hiện tượng giảm bạch cầu do cyclophophamid gây nên trong điều trị ung thư thực nghiệm trên chuột cống trắng [33]

- Tác dụng chống oxy hóa: chủ yếu là do carotenoid, flavonoid, acid ascobic

và các dẫn xuất của nó và polyphenol [86]

- Tác dụng chống ung thư: Các polysaccharid chiết xuất từ Câu kỷ tử có tác dụng chống ung thư và cải thiện miễn dịch [86]

1.4.2.5 Tác dụng, công dụng theo y học cổ truyền:

- Tính vị: Vị ngọt, tính bình [20], [24], [33]

- Qui kinh: Qui vào kinh phế, can và thận [20], [24], [33]

- Công năng, chủ trị: Tư bổ can, thận, ích tinh, sáng mắt Chủ trị: Hư lao tinh suy biểu hiện đau thắt lưng, đầu gối, chóng mặt, ù tai, nội nhiệt gây tiểu đường, huyết

hư, mờ mắt [8], [24]

- Liều dùng: 9 - 15 g, sắc uống hoặc dùng dạng hoàn tán [33]

- Kiêng kỵ: Tỳ vị hư yếu, đại tiện sống phân không nên dùng [8]

1.4.2.6 Định tính, định lượng:

* Định tính [8]:

- Phương pháp sắc ký lớp mỏng (Phụ lục 5.4)

- Trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải có các vết có cùng màu sắc và giá trị

Rf với các vết trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu

1.4.3.1 Tên khoa học: Radix Fallopiae multiflorae [8], [31]

1.4.3.2 Bộ phận dùng: là rễ củ phơi khô của cây Hà thủ ô đỏ - Fallopia multiflora

(Thunb) Haraldson Syn/Polygonum multiflorum (Thunb.) [8], [20], [31]

1.4.3.3 Thành phần hóa học:

- Stilben là thành phần hóa học đặc trưng trong Hà thủ ô đỏ Có khoảng 21

stilben đã được phân lập và chiết xuất bao gồm: các stilben glucopyranosid,

resvesratrol, polydatin, polygonumosid A, B, C, D …[67]

- Quinon là thành phần đặc trưng khác trong Hà thủ ô đỏ Quinon và các dẫn xuất của chúng đã được phân lập và xác định, và hầu hết trong số đó là anthraquinon bao gồm: Emodin, rhein, chrysophanol, physcion, fallacinol [67]

- Các flavonoid trong Hà thủ ô đỏ bao gồm tricin, rutin, luteolin, quercetin,

kaempferol, isoorientin, apigenin, hyperosid, vitexin và quercetin-3-O-arabinosid

[49], [50], [85] Flavonostilben glycosid được phân lập từ Hà thủ ô đỏ và được xác định là polygonflavanol [47], [67]

- Trong hà thủ ô đỏ rất giàu phospholipid bao gồm: phosphatidyl ethanolamin, copaene, eicosane, acid hexanoic, este methyl acid hexadecanoic, este ethyl exadecanoic, este methyl octadecanoic, ethyl oleat, docosanoicaxit methyl este, acid ethyl etradecanoic, squalen [49], [50],

- Ngoài ra còn có tinh bột, các chất vô cơ K, Ca, Mn, Ni, Cr… [33]

1.4.3.4 Tác dụng sinh học

- Tác dụng chống lão hóa: 2,3,5,4’-tetrahydroxystilben-2-O-β-D-glucosid

trong Hà thủ ô đỏ, có thể dùng để điều trị bệnh Alzheimer và bệnh Parkinson thông qua cơ chế ức chế acetylcholinesterase, bảo vệ thần kinh, chống oxy hóa và tăng cường nhận thức [66], [67], [78]

- Ức chế acetylcholinesterase (AchE): Emodin-8-O-β-D-glucopyranosid (EG), có

tác dụng ức chế AchE hoạt động điều trị chứng mất ngủ và rối loạn chức năng não [67]

- Tác dụng chống oxy hóa: Dịch chiết của Hà thủ ô đỏ có khả năng chống oxy hóa trong mô hình chuột do D-galactose gây ra sự lão hóa [67], [75]

- Tác dụng điều hòa miễn dịch: Do các polysacarid và anthraquinon glycosid làm tăng mức IL-2 huyết thanh và các thông số huyết học, tăng cường chất chống oxy hóa, và thúc đẩy quá trình tạo máu của tế bào lách [48], [67]

- Tác dụng giảm lipid máu: chủ yếu là của một số các thành phần, chẳng hạn

như: 2,3,5,4'-tetrahydroxystilben-2-O-β-D-glucopyranosid (TSG), polysacarid và

anthraquinon [55], [79], [80]

- Ngoài các tác dụng trên, các thành phần hóa học có trong Hà thủ ô đỏ còn có các tác dụng khác như bảo vệ gan, tăng chiều dài tóc, chống nhồi máu não và chống rối loạn huyết khối,…[67]

1.4.3.5 Tác dụng, công dụng theo y học cổ truyền:

- Tính vị: vị đắng, chát, tính ấm [24], [32]

- Qui kinh: vào 2 kinh can, thận [8], [24], [32]

- Công năng chủ trị: Dưỡng huyết, bổ can thận, nhuận tràng thông tiện, làm xanh tóc Chủ trị huyết hư, cơ thể mệt nhọc vô lực, thở ngắn hơi, thiếu máu, da xanh gầy khô sáp, chóng mặt, nhức đầu, râu tóc bạc sớm, ra mồ hôi trộm, tim loạn nhịp, mất ngủ, táo bón [8], [24] Chữa các chứng bệnh tăng cholesterol huyết, mất ngủ, hồi hộp, đánh trống ngực [32]

- Liều dùng: Ngày dùng 12 - 20 g Dạng thuốc sắc, thuốc rượu hoặc thuốc bột [20]

1.4.4.1 Tên khoa học: Fructus Mali [8]

1.4.4.2 Bộ phận dùng: Quả chín đã thái lát (phiến) và chế biến khô của cây Sơn tra

(Malus doumeri Bois A Chev) [8]

1.4.4.3 Thành phần hóa học:

- Tanin, đường, acid citric, tartric… [31], [32], [34]

- Các acid phenolic: acid chlorogenic, acid protocatechuic, acid cafferic, acid cinnamic [82]

- Các flavonoid: Quercetin, isoquercitrin, phloretin-2′-xyloglucosid, phlorizin, epicatechin, luteolin, hyperosid [82]

- Các triterpenoid: acid ursolic, acid oleanolic, acid corosolic và acid maslinic [82]

1.4.4.4 Tác dụng sinh học

- Tác dụng điều chỉnh lipid máu: Dịch chiết cồn quả Sơn tra có tác dụng giảm

hàm lượng TG, TC máu chuột nhắt trắng bị gây RLLPM bởi chế độ ăn giàu lipid [12]

- Tác dụng chống oxy hóa: Flavonoid có trong quả sơn tra có tác dụng chống oxy hóa nội bào trong đó 2 hoạt chất phlorizin, phloretin-2′-xyloglucosid có tác dụng mạnh nhất [82]

- Tác dụng chống tăng sinh tế bào, chống ung thư: acid oleanolic và acid ursolic có hoạt tính chống ung thư vú mạnh, có thể ức chế ung thư tế bào tăng sinh thông qua apoptosis ngoại sinh Ngoài ra, các hợp chất khác như luteolin, quercetin

và isoquercitrin cũng có hiệu quả chống ung thư [82]

1.4.4.5 Tác dụng, công dụng theo y học cổ truyền:

- Tính vị: Vị chua, ngọt, chát tính bình [34]

- Quy kinh: Nhập vào 3 kinh tỳ, vị, can [8], [24], [34]

- Công năng chủ trị: Tiêu thực tích, hành ứ hóa đàm Chủ trị: Các chứng ăn không tiêu, đau bụng, đầy trướng, ợ chua, đàm ẩm, bụng kết hòn cục, sản hậu ứ huyết đau bụng [8], [25]

- Liều dùng: Ngày dùng 4-10 g Dạng thuốc sắc, dùng riêng hoặc phối hợp với

vị thuốc khác [31]

- Kiêng kỵ: Người tỳ vị hư nhược, không có tích trệ không dùng [24], [36]

1.4.4.6 Định tính, định lượng:

- Hiện chưa có chỉ tiêu định tính, định lượng Sơn tra ở Dược điển Việt Nam V

1.5.5 Thảo quyết minh

1.4.5.1 Tên khoa học: Semen Cassiae torae [31]

1.4.5.2 Bộ phận dùng: Hạt già đã phơi hay sấy khô của cây Thảo quyết minh –

- Tác dụng an thần: Trên điện não đồ làm tăng các thành phần sóng chậm, giảm các sóng nhanh, giảm hoạt hóa với tế bào thần kinh của thể lưới, vỏ não [34]

- Tác dụng nhuận tràng, tẩy: Anthraglucosid trong thảo quyết minh có tác dụng tăng cường sự co bóp của ruột, làm đại tiện dễ dàng, phân mềm và lỏng [34]

- Ngoài ra Thảo quyết minh còn có các tác dụng khác như kháng khuẩn, kháng nấm, giúp giải độc arsen [34], tác dụng làm suy giảm thiếu máu cục bộ cơ tim và tái tưới máu ở mô hình chuột mắc bệnh tiều đường tuýp 2 với chế độ ăn nhiều chất béo streptozotocin [78]

1.4.5.5 Tác dụng, công dụng theo y học cổ truyền:

- Tính vị: Vị mặn, tính bình [20], [32]

- Quy kinh: Qui vào 2 kinh can và thận [20], [32]

- Công năng chủ trị: Tả can minh mục, an thần, nhuận tràng Chủ trị: Đau mắt

đỏ, sợ ánh sáng, mắt mờ, chảy nước mắt (sao vàng), đại tiện bí kết (dùng sống) [8] Ngoài ra còn có tác dụng lợi mật, nhuận gan, giúp cho tiêu hóa được tốt [24]

- Liều dùng: Ngày dùng 6 - 12g Dạng thuốc sắc hoặc giã giập, hãm như chè [31]

- Kiêng kị: Người đi ỉa lỏng không nên dùng [8], [31]

1.4.5.6 Định tính, định lượng:

* Định tính [8]: bằng phương pháp hóa học

* Định lượng chrysophanol và aurantio - obtusin

- Phương pháp sắc ký lỏng [45]

- Dược liệu phải chứa không dưới 0,2% chrysophanol (C15H10O4) và không dưới 0,08% aurantio - obtusin (C17H1407), tính theo dược liệu khô kiệt

1.6 Các nghiên cứu về phương thuốc Giáng chỉ ẩm

Có rất ít các nghiên cứu về phương thuốc Giáng chỉ ẩm Một số đề tài chỉ tập trung nghiên cứu các vị thuốc như Đan sâm, Hà thủ ô Hiện tại, có 02 đề tài nghiên cứu về phương thuốc này ở Việt Nam tập trung nghiên cứu về phương pháp chiết xuất hoặc nghiên cứu tác dụng của thuốc thang trên lâm sàng mà chưa có nghiên cứu về cao đặc phương thuốc với tác dụng hạ lipid máu trên thực nghiệm:

- Bài thuốc “Giáng chỉ ẩm”, gồm Đan sâm 20 g, Hà thủ ô 20 g, Sơn tra 20 g, Kỷ

tử 15 g, Thảo quyết minh 20 g (Phan Viê ̣t Hà, 1998) Nghiên cứu trên 30 bê ̣nh nhân bị RLLPM, thuốc là m giảm TC 13,54%, giảm LDL-C 15,23%, giảm TG 32,67%, tăng HDL-C 17,07% sau 40 ngày điều trị [10]

- Bài thuốc “Giáng chỉ ẩm”, gồm Đan sâm 20 g, Câu kỷ tử 10 g, Hà thủ ô đỏ

15 g, Sơn tra 15 g, Thảo quyết minh 15 g (Hoàng Mạnh Tuấn, 2020) Nghiên cứu điều chế cao đặc giàu acid salvianolic B từ phương thuốc Giáng chỉ và xây dựng một số chỉ tiêu chất lượng [28]

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu

- Các vị thuốc Đan sâm, Câu kỷ tử, Hà thủ ô đạt tiêu chuẩn Dược điển Trung Quốc 2015 [45]; Sơn tra, Thảo quyết minh đạt tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam V [8] (Phụ lục 2) Các vị thuốc trong phương thuốc được cung cấp bởi Công ty trách nhiệm hữu hạn Đông dược Dân Lợi và được trình bày ở Hình 2.1 Các dược liệu

được chế biến theo phương pháp cổ truyền [8], [45]:

+ Đan sâm: Rửa sạch để ráo nước, ủ mềm, thái lát mỏng 2 - 4 mm, sấy khô + Câu kỷ tử: Loại tạp, sấy khô

+ Hà thủ ô đỏ: Rửa sạch, ngâm nước vo gạo 1 ngày đêm Rửa lại, đổ nước đậu đen vào cho ngập, nấu đến khi gần cạn củ trở nên mềm Lấy ra bỏ lõi (nếu có) thái phiến dày 2 - 4 mm, sấy khô

+ Sơn tra: Rửa sạch, ủ mềm, thái phiến dày 2 - 4 mm, sấy khô

+ Thảo quyết minh: Loại bỏ tạp chất, rửa sạch, sấy khô

- Cao đặc phương thuốc Giáng chỉ ẩm chiết nước: Cao đặc được bào chế qua 2 giai đoạn:

+ Chiết xuất: Cân các vị thuốc đã chế biến theo công thức: Đan sâm 200 g, Câu kỷ tử 154 g, Hà thủ ô đỏ (chế) 154 g, Sơn tra 200g, Thảo quyết minh 200 g Tổng khối lượng dược liệu cho 1 mẻ chiết là 908 g Chiết bằng nước 2 lần ở 80˚C, mỗi lần 2 giờ, tỷ lệ DM/DL = 8 lần sử dụng bếp hồng ngoại Kangaroo và nồi inox Gala Plus, thu dịch chiết

+ Cô cao: Sau khi thu dịch chiết, tiến hành lọc và cô dịch chiết dưới áp suất giảm bằng máy cô quay chân không với tốc độ 50 vòng/phút, nhiệt độ < 60℃ đến thể chất lỏng sánh, loại tạp bằng ethanol 70%, thu dịch lọc, tiếp tục chuyển sang cô cách thủy ở 80˚C đến thể chất cao đặc (độ ẩm < 20%) [28]

Tiến hành chiết 3 mẻ cao Tỷ lệ cao/dược liệu (tính theo cao khô, dược liệu khô kiệt) trung bình là 22,83% (Phụ lục 1)

- Cao đặc phương thuốc Giáng chỉ ẩm chiết ethanol 70%: Cao đặc được bào chế qua 2 giai đoạn:

+ Chiết xuất: Cân các vị thuốc đã chế biến theo công thức: Đan sâm 200 g, Câu kỷ tử 154 g, Hà thủ ô đỏ (chế) 154 g, Sơn tra 200 g, Thảo quyết minh 200 g Tổng khối lượng dược liệu cho 1 mẻ chiết là 908 g Thêm dung môi chiết lần 1 tỷ lệ DM/DL = 8 lần, ngâm 72 giờ ở nhiệt độ phòng sau đó rút dịch chiết Tiếp tục thêm dung môi lần 2 tỷ lệ DM/DL = 7 lần, ngâm 72 giờ ở nhiệt độ phòng sau đó rút dịch chiết Gộp dịch chiết thu được của 2 lần chiết

+ Cô cao: Sau khi thu dịch chiết, tiến hành lọc và cô dịch chiết dưới áp suất giảm bằng máy cô quay chân không với tốc độ 50 vòng/phút, nhiệt độ < 60℃ đến thể chất lỏng sánh, tiếp tục chuyển sang cô cách thủy ở 80˚C đến thể chất cao đặc (độ ẩm < 20%) [28]

Tiến hành chiết 3 mẻ cao Tỷ lệ cao/dược liệu (tính theo cao khô, dược liệu khô kiệt) trung bình là 27,97% (Phụ lục 1)

- Cao đặc placebo: Chuẩn bị như cao đặc phương thuốc Giáng chỉ ẩm nhưng

bỏ Đan sâm

Hình 2.1 Các dược liệu trong phương thuốc Giáng chỉ ẩm

2.1.2 Động vật thí nghiệm

- Động vật thí nghiệm: Chuột nhắt trắng chủng Swiss albino, 5 - 6 tuần tuổi, trọng lượng 24 ± 2 g, khỏe mạnh được cung cấp bởi Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương Chuột được nuôi 7 ngày trong phòng chăn nuôi trong điều kiện nhiệt độ duy trì 25 ± 1oC, độ ẩm không khí và ánh sáng thích hợp Chuột được nuôi bằng thức ăn tiêu chuẩn do Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp Chuột uống nước tự do theo nhu cầu

2.1.3 Thiết bị, máy móc

- Cân phân tích AND GR200 (A&D, Nhật Bản) độ chính xác 0,1 mg

- Cân phân tích Mettler Toledo XPE105 (Mettler Toledo, Thụy Sĩ) độ chính xác 0,01 mg

- Máy đo độ ẩm Precisa XM60 (Precisa, Thụy Sĩ)

- Máy cô quay chân không IKA® RV 8 (IKA, Đức)

- Bể siêu âm WUC-D22H (Daihan Scientific, Hàn Quốc)

- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) (Shimadzu, Nhật Bản) bao gồm: Bơm LC-30AD, detector mảng diod (DAD) SPD-M20A, hệ thống tiêm mẫu tự động SIL-20A, bộ phận ổn nhiệt CTO-10AS của Shimadzu, cột sắc ký Shim-pack GIST C18

- Hệ thống lọc chân không, màng lọc 0,45 µm x 47 mm Supelco (Mỹ), màng lọc syringe 0,45 µm Shimadzu (Shimadzu, Nhật Bản), lọ đựng mẫu (vial) 1,5 ml Shimadzu (Shimadzu, Nhật Bản)

- Máy định lượng sinh hóa bán tự động Humanlyzer H2000 (Đức)

- Máy ly tâm thường

- Máy lắc Voltex (IKA)

- Nồi inox Gala Plus

- Bếp hồng ngoại Kangaroo điều chỉnh được nhiệt độ

- Tủ sấy Memmert (Memmert, Đức)

- Bếp cách thuỷ

- Bình định mức, bình nón, pipet chính xác các loại, micro pipet và các dụng cụ thủy tinh cần thiết khác cần cho phân tích

2.1.4 Thuốc, hóa chất, chất chuẩn

(Nước cất siêu sạch) HPLC Trường ĐH Dược Hà Nội

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Định tính, định lượng đồng thời Sal-B và Tan-IIA trong cao đặc phương thuốc bằng HPLC

2.2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

- Cao đặc Giáng chỉ ẩm chiết nước

- Cao đặc Giáng chỉ ẩm chiết ethanol 70%

- Cao đặc placebo Đan sâm

2.2.1.2 Chuẩn bị dung dịch thử và dung dịch mẫu

Tham khảo tài liệu [8], [69] để khảo sát quy trình xử lý mẫu cao định lượng

Dung dịch chuẩn:

+ Cân chính xác khoảng 15,02 mg chất chuẩn Sal-B (hàm lượng 99,34%) cho vào bình định mức 5 mL, thêm khoảng 4 mL methanol 70%, lắc cho tan hết

và thêm vừa đủ đến vạch 5 mL bằng methanol 70%, lăc đều

+ Tiếp tục cân chính xác khoảng 5,76 mg chất chuẩn Tan-IIA (hàm lượng 98,09%) cho vào bình định mức 10 mL, thêm khoảng 8 mL methanol 70%, lắc cho tan hết và thêm vừa đủ đến vạch 10 mL bằng methanol 70%, lắc đều

+ Hút chính xác 0,275 ml dung dịch chất chuẩn Tan-IIA cho bình định mức 5 mL chứa dung dịch chất chuẩn Sal-B đã pha Lắc đều thu được thu được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ Sal-B 2828,60 µg/mL và Tan-IIA 29,46 µg/mL

Từ dung dịch chuẩn gốc này pha dãy chuẩn có nồng độ của Sal-B trong khoảng: 88,39 - 2828,60 g/mL và nồng độ của Tan-IIA trong khoảng: 0,92 - 29,46 g/mL

Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 0,2 g cao vào bình nón có nút mài 50

ml, thêm chính xác 25 ml dung môi, cân, chiết siêu âm Để nguội, cân lại, bổ sung khối lượng mất đi bằng dung môi Lắc đều, lọc qua màng lọc syringe 0,45 µm thu được dung dịch tiêm sắc ký Khảo sát dung môi chiết, thời gian chiết và nhiệt độ chiết để chọn phương pháp chiết tối ưu

2.2.1.3 Điều kiện sắc ký

Chương trình sắc ký lỏng được khảo sát ban đầu dựa trên các điều kiện sắc ký

được tham khảo trong tài liệu [45], [69]

- Pha tĩnh: cột sắc ký C18 (250 x 4,6mm, 5µm)

- Pha động: acetonitril (dung môi A) và acid phosphoric 0,1% (dung môi B) theo chương trình rửa giải gradient, khảo sát 3 hệ pha động:

Hệ I: 0 - 20 phút, 26,5% A; 20 - 21 phút, 26,5% - 86,5% A; 21 - 35 phút, 86,5% A; 35 - 36 phút, 86,5% - 26,5% A; 36 - 40 phút, 26,5% A

Hệ II: 0 - 20 phút, 26% A; 20 - 21 phút, 26% - 90% phút; 21 - 35 phút, 90% A; 35 - 36 phút, 90% - 26% A; 36 - 40 phút, 26% A

Hệ III: 0 - 24,5 phút, 25% A; 24,5 - 25 phút, 25% - 61% A; 25 - 31 phút, 61% A; 31 - 45 phút, 61% - 90% A; 45 - 45.5 phút, 90% - 61% A; 45.5 - 50 phút, 61% A; 50 - 50.5 phút, 61% - 25% A; 50.5 - 55 phút, 25% A

 Định lượng Sal-B và Tan-IIA

Tiêm riêng biệt 10 µl các dung dịch chuẩn vào máy sắc ký, ghi nhận sắc ký

đồ, diện tích của pic Sal-B, Tan-IIA Xây dựng đường hồi quy tuyến tính biểu diễn

sự phụ thuộc giữa diện tích pic và nồng độ dung dịch chuẩn (g/ml) theo phương trình y = ax + b

Tiêm 10 l dung dịch thử, ghi nhận sắc ký đồ, diện tích của pic Sal-B, IIA Nồng độ Sal-B, Tan-IIA trong dung dịch thử (µg/ml) được tính theo công thức:

Tan-a

b S

X

cd t

25(%)

Trong đó:

St: Diện tích pic Sal-B, Tan-IIA trên sắc ký đồ của dung dịch thử Ct: Nồng độ của Sal-B, Tan-IIA trong dung dịch thử (µg/ml)

a: Giá trị hệ số góc của đường hồi quy tuyến tính

b: Giá trị hệ số chắn của đường hồi quy tuyến tính

mcd: Khối lượng cao đặc (g)

H: Hàm ẩm của cao đặc (%)

2.2.1.4 Thẩm định phương pháp định lượng

Quy trình định lượng được thẩm định theo hướng dẫn của AOAC [42] và ICH [60] bao gồm tính đặc hiệu, tính tương thích hệ thống, khoảng tuyến tính, độ chính xác (độ lặp lại, độ chính xác trung gian), độ đúng, giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

 Độ đặc hiệu:

* Tiến hành sắc ký các loại mẫu sau đây theo quy trình phân tích:

Dung dịch mẫu trắng (dung môi)

Dung dịch placebo

Dung dịch chuẩn hỗn hợp Sal-B, Tan-IIA

+ Trên sắc kí đồ của mẫu dung môi và mẫu placebo không xuất hiện pic có thời gian lưu tương ứng với pic Sal-B, Tan-IIA

 Độ phù hợp của hệ thống:

Đánh giá độ phù hợp của hệ thống là phép thử nhằm đánh giá độ ổn định của toàn hệ thống phân tích bao gồm bởi các yếu tố như: máy móc thiết bị, hệ thống điện, cách tiến hành phân tích

Tiến hành: Sắc ký 6 lần liên tiếp dung dịch chuẩn Sal-B, Tan-IIA

Yêu cầu: RSD ≤ 2,7%

 Độ tuyến tính:

- Pha một dãy dung dịch chuẩn Sal-B, Tan-IIA ở các nồng độ thích hợp Tiến hành sắc ký như điều kiện đã lựa chọn

- Xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ

Sal-B, Tan-IIA trong các dung dịch chuẩn

Yêu cầu: Hệ số tương quan R ≥ 0,99

* Độ chính xác trung gian:

Thực hiện như phần độ lặp lại nhưng vào ngày khác

Xác định giá trị trung bình và giá trị RSD (%) hàm lượng hoạt chất có trong các mẫu ở mỗi ngày và giữa hai ngày

*Yêu cầu: Giá trị RSD (%) kết quả định lượng mỗi ngày (n = 6) và của cả 2

ngày (n=12) ≤ 2,7% đối với Sal-B và ≤ 5,3% đối với Tan-IIA (mức khuyến cáo của AOAC ở mức hàm lượng từ 1% đến dưới 10% và từ 0,01% đến dưới 0,1% tương ứng [42])

 Độ đúng:

* Tiến hành:

- Độ đúng được thực hiện bằng cách thêm một lượng đã biết chất chuẩn (dung dịch chuẩn gốc) vào mẫu ở mức nồng độ Sal-B, Tan-IIA khoảng 50% so với mẫu thử để thu được mẫu ở 3 mức nồng độ khác nhau bằng 75%, 100% và 125% so với mẫu thử, tiến hành chuẩn bị mẫu theo quy trình và sắc ký theo điều kiện đã chọn, mỗi nồng độ thực hiện 3 lần

- Xác định tỷ lệ (%) tìm lại được so với nồng độ ban đầu

* Yêu cầu: Tỷ lệ thu hồi ở mỗi mức nồng độ trong khoảng 97,0 - 103,0% đối

với Sal-B và 90 - 107% đối với Tan-IIA (mức khuyến cáo của AOAC ở mức hàm lượng từ 1% đến dưới 10% và từ 0,01% đến dưới 0,1% tương ứng [42])

 Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)

Pha loãng dần dung dịch mẫu thử, tiêm vào hệ thống sắc ký Xác định giới hạn phát hiện LOD của Sal-B và Tan-IIA tại nồng độ cho S/N khoảng 3

LOQ được tính theo công thức:

LOQ = 3,3 x LOD

2.2.1.5 Ứng dụng định tính, định lượng đồng thời Sal-B và Tan- IIA trong cao đặc Giáng chỉ ẩm

Sử dụng phương pháp đã xây dựng để định tính, định lượng đồng thời Sal-B

và Tan-IIA trong một số mẫu cao đặc Giáng chỉ ẩm

2.2.2 Đánh giá tác dụng hạ lipid máu trên thực nghiệm của cao đặc phương thuốc Giáng chỉ ẩm

Đánh giá tác dụng hạ lipid máu của phương thuốc Giáng chỉ ẩm sử dụng mô hình dược lý gây tăng lipid máu nội sinh bằng triton WR - 1339 của Frans ID và cộng sự có cải tiến [56], [61] được tiến hành như sau:

* Chuẩn bị mẫu thử

+ Cao đặc phương thuốc Giáng chỉ ẩm chiết nước

+ Cao đặc phương thuốc Giáng chỉ ẩm chiết Ethanol 70%

* Chuẩn bị hóa chất

+ Nước cất

+ Thuốc hạ lipid máu Fenofibrat 100 mg

+ Tyloxapol

* Xác định liều dùng trên chuột nhắt trắng [6]

Liều dùng trên người được tính cho người cân nặng 50kg với liều dược liệu

dự kiến 22 g/ngày Quy đổi sang chuột nhắt trắng được liều dùng như bảng sau:

Bảng 2.2 Liều dùng quy đổi trên chuột nhắt trắng

Tên thuốc/ cao thuốc

Liều dùng trên người (g/kg/ngày)

Liều dùng trên chuột nhắt trắng (g/kg/ngày)

* Thiết kế thí nghiệm:

- Đối tượng: Động vật thí nghiệm: Chuột nhắt trắng chủng Swiss albino,

5-6 tuần tuổi, trọng lượng 24±2g, khỏe mạnh được cung cấp bởi Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ương