Nghiên cứu tác dụng bảo vệ tế bào gan của me rừng (Phyllanthus emblica L. Euphorbiaceae) trên thực nghiệm

Kết quả đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào gan của cao định chuẩn quả Me rừng trên mô hình gây độc gan bằng CCl4 .... Kết quả đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào gan của cao định chuẩn quả Me r

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ UYÊN

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG BẢO VỆ

TẾ BÀO GAN CỦA ME RỪNG

(PHYLLANTHUS EMBLICA L

EUPHORBIACEAE) TRÊN THỰC NGHIỆM

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI-2019

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ UYÊN

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG BẢO VỆ

TẾ BÀO GAN CỦA ME RỪNG

(PHYLLANTHUS EMBLICA L

EUPHORBIACEAE) TRÊN THỰC NGHIỆM

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC LÝ- DƯỢC LÂM SÀNG

MÃ SỐ: 8720205

Người hướng dẫn khoa học: 1 PGS.TS Nguyễn Thùy Dương

2 PGS.TS Đỗ Thị Hà

HÀ NỘI-2019

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin cảm ơn Sở Khoa học và Công nghệ Thành phố Hà Nội đã tài trợ cho đề tài này, là một phần của đề tài “Nghiên cứu bào chế thực phẩm bảo vệ sức khoẻ dạng viên nang cứng có tác dụng bảo vệ gan từ quả Me rừng (Phyllanthus emblica L.)”, mã

số 01C-06/03-2017-3

Với tất cả lòng kính trọng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thùy Dương đã rộng lòng trao cho tôi cơ hội làm nghiên cứu thực nghiệm, đã luôn cổ vũ, đưa ra những nhận xét nghiêm khắc, quan trọng trong suốt quá trình làm nghiên cứu của tôi; đã cẩn thận đọc từng câu chữ, hiệu đính tỉ mỉ và nhiệt thành giúp tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn đặc biệt tới PGS.TS Đỗ Thị Hà đã đưa ra ý tưởng, đã chia sẻ, ủng hộ và ân cần góp ý với tôi để hoàn thiện quyển luận văn này

Với lòng yêu mến và kính phục, tôi xin dành tặng quyển luận văn này tới Ths Phạm Đức Vịnh, người thầy đã dạy dỗ tôi những điều quan trọng cùng đầy lòng yêu thương và tận tụy

Cảm ơn em Trần Thảo Hương, một người cộng sự mà tôi vô cùng quý mến đã đồng hành cùng tôi trong chặng đường làm đề tài này Có thể nói, trong những ngày tháng bộn bề công việc, nếu không có sự hỗ trợ của em thì tôi gặp nhiều khó khăn đến nhường nào

Cảm ơn toàn thể thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên, các em sinh viên đang nghiên cứu khoa học tại bộ môn Dược lực, trường Đại học Dược Hà Nội đã luôn san sẻ công việc, giúp đỡ tôi trong quá trình tôi thực hiện và hoàn thiện luận văn này

Và cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới gia đình, bạn bè đã đồng hành, động viên, chia sẻ với tôi trong gần hai năm học tập và nghiên cứu dưới mái trường Dược thân yêu!

Hà Nội, ngày 31 tháng 3 năm 2019

Nguyễn Thị Uyên

MỤC LỤC

DANH MỤC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

PHẦN 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Một số cơ chế liên quan đến tổn thương tế bào gan 3

1.1.1 Vai trò của stress oxy hóa và các gốc tự do đối với tổn thương tế bào gan 3 1.1.2 Vai trò của AMPK đối với tổn thương tế bào gan 7

1.2 Thông tin về dược liệu Me rừng 11

1.2.1 Đặc điểm thực vật 11

1.2.2 Phân bố, thu hái và chế biến 12

1.2.3 Thành phần hóa học 13

1.2.4 Tác dụng dược lý của Me rừng 14

1.3 Các nghiên cứu đánh giá tác dụng bảo vệ gan của Me rừng 20

1.3.1 Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của Me rừng in vivo 21

1.3.1.1 Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của Me rừng trên mô gây độc gan bằng CCl 4 ……… 21

1.3.1.2 Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của Me rừng trên mô hình gây độc gan bằng ethanol……… 22

1.3.1.3 Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của Me rừng trên một số mô hình gây độc gan bằng các tác nhân khác nhau 23

1.3.2 Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của Me rừng in vitro 23

PHẦN 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.1 Nguyên vật liệu thí nghiệm 26

2.1.1 Hóa chất, thuốc thử 26

2.1.2 Thiết bị thí nghiệm 26

2.2 Đối tượng nghiên cứu 27

2.2.1 Dược liệu và mẫu nghiên cứu 27

2.2.2 Động vật thí nghiệm 27

2.3 Nội dung nghiên cứu 27

2.3.1 Đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào gan của cao định chuẩn quả Me rừng trên mô hình in vivo 27

2.3.2 Đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào gan của cao định chuẩn quả Me rừng in vitro…… 28

2.4 Phương pháp nghiên cứu 29

2.4.1 Phương pháp đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào gan của cao định chuẩn quả Me rừng trên mô hình in vivo 29

2.4.1.1 Phương pháp đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào gan trên mô hình gây độc gan cấp bằng CCl 4 29

2.4.1.2 Phương pháp đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào gan trên mô hình gây độc gan mạn bằng ethanol 30

2.4.1.3 Phương pháp xác định các thông số nghiên cứu của mô hình in vivo 32

2.4.2 Phương pháp đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào gan của cao định chuẩn quả Me rừng in vitro 35

2.4.2.1 Xác định nồng độ cao định chuẩn quả Me rừng bằng phương pháp MTT dùng để đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào gan in vitro 35

2.4.2.2 Đánh giá khả năng ức chế tích tụ lipid của cao định chuẩn quả Me rừng trên tế bào HepG2 bằng thử nghiệm Oil Red O 36

2.4.2.3 Đánh giá tác dụng hoạt hóa AMPK và ức chế ACC trên tế bào HepG2 của cao định chuẩn quả Me rừng bằng phương pháp Western blot 37

2.5 Phương pháp xử lý số liệu 39

PHẦN 3 KẾT QUẢ 40

3.1 Kết quả đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào gan của cao định chuẩn quả Me

rừng in vivo 40

3.1.1 Kết quả đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào gan của cao định chuẩn quả Me rừng trên mô hình gây độc gan bằng CCl4 40 3.1.1.1 Ảnh hưởng của cao định chuẩn quả Me rừng đến hoạt độ ASAT và ALAT

huyết thanh của chuột bị gây độc gan bằng CCl 4 40 3.1.1.2 Ảnh hưởng của cao định chuẩn quả Me rừng đến hàm lượng MDA trong gan của chuột bị gây độc gan bằng CCl 4 41

3.1.1.3 Ảnh hưởng của cao định chuẩn quả Me rừng đến hàm lượng GSH trong gan

của chuột bị gây độc gan bằng CCl 4 42 3.1.1.4 Ảnh hưởng của cao định chuẩn quả Me rừng đến hoạt độ SOD trong gan chuột bị gây độc gan bằng CCl 4 44 3.1.1.5 Ảnh hưởng của cao định chuẩn quả Me rừng đến hình ảnh vi thể của gan chuột bị gây độc gan bằng CCl 4 45

3.1.2 Kết quả đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào gan của cao định chuẩn quả Me rừng trên mô hình gây độc gan bằng ethanol 47 3.1.2.1 Ảnh hưởng của cao định chuẩn quả Me rừng đến hoạt độ ASAT và ALAT

huyết thanh của chuột bị gây độc gan bằng ethanol 47

3.1.2.3 Ảnh hưởng của cao định chuẩn Me rừng đến hàm lượng GSH trong gan của

chuột bị gây độc bằng ethanol 50

3.1.2.4 Ảnh hưởng của cao định chuẩn quả Me rừng đến hoạt độ SOD trong gan của

chuột bị gây độc bằng ethanol 51 3.1.2.5 Ảnh hưởng của cao định chuẩn quả Me rừng đến hình ảnh vi thể của gan của chuột bị gây độc gan bằng ethanol 52

3.2 Kết quả đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào gan của cao định chuẩn quả Me

rừng in vitro 54

3.2.1 Xác định nồng độ cao định chuẩn quả Me rừng bằng phương pháp MTT dùng để đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào gan in vitro 54

3.2.2 Khả năng ức chế tích tụ lipid trên tế bào HepG2 của cao định chuẩn quả Me rừng bằng thử nghiệm Oil Red O 55 3.3.3 Khả năng hoạt hóa AMPK và ACC trong tế bào HepG2 của cao định chuẩn quả Me rừng bằng phương pháp Western Blot 58

DANH MỤC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

Aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide AMP activated protein kinase

Alanin amino transferase Aspartat amino transferase Catalase

Carbon tetraclorid carnitine palmitoyl transferase I Dimethyl sulfoxid

Dimethylformamid 5,5′-Dithiobis (2-nitrobenzoic acid) 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl liver hepatocellular cells Glutathion dạng khử Glutathion peroxidase Interleukin 1 beta Malonyl-CoA decarboxylase Malondialdehyd

3-(4, 5-dimethyl-2-thiazolyl)-2, 5-diphenyl-2H-tetrazolium bromid Nitrotetrazolium clorid

Phosphoryl ACC Phosphoryl AMPK

Sterol regulatory element-binding protein Superoxid dismutase

Reactive oxygen species Tetrahydrofuran

Transforming growth factor beta Tumor necrosis factor alpha Very low-density lipoprotein

DANH MỤC BẢNG

4 Bảng 1.4 Tác dụng trên bệnh đái tháo đường của Me rừng 19

5 Bảng 3.1

Ảnh hưởng của cao định chuẩn quả Me rừng so đến hoạt độ ASAT và ALAT huyết thanh của chuột bị gây độc gan bằng CCl4

40

6 Bảng 3.2 Tỷ lệ tế bào HepG2 sống sót khi ủ với cao định chuẩn quả

Me rừng ở các mức nồng độ khác nhau 54

DANH MỤC HÌNH VẼ

1 Hình 1.1 Vai trò stress oxy hóa đối với tổn thương gan 6

2 Hình 1.2 Hệ thống cân bằng oxy hóa khử ở trong gan 6

3 Hình 1.3 Vai trò của AMPK trong bệnh gan nhiễm mỡ 9

4 Hình 1.4 Vai trò của AMPK trong bệnh gan do rượu 11

30

8 Hình 2.3

Sơ đồ thiết kế thí nghiệm đánh giá tác dụng bảo vệ gan của cao định chuẩn quả Me rừng trên mô hình gây độc gan bằng ethanol

31

9 Hình 2.4 Sơ đồ phản ứng tạo phức giữa MDA và acid

10 Hình 2.5 Sơ đồ phản ứng khử của anion superoxid và NBT 34

11 Hình 3.1 Ảnh hưởng của cao định chuẩn quả Me rừng đến hàm

lượng MDA trong gan chuột bị gây độc gan bằng CCl4

40

12 Hình 3.2

Ảnh hưởng của cao định chuẩn quả Me rừng đến hàm lượng GSH trong gan của chuột bị gây độc gan bằng CCl4

43

13 Hình 3.3 Ảnh hưởng của cao định chuẩn quả Me rừng đến hoạt độ

SOD trong gan của chuột bị gây độc gan bằng CCl4

44

Hình 3.4 Hình ảnh minh họa ảnh hưởng của cao định chuẩn quả

Me rừng trên vi thể tế bào gan chuột bị gây độc gan bằng

46

14 Hình 3.5

Ảnh hưởng của cao định chuẩn quả Me rừng đến hoạt độ ASAT huyết thanh của chuột bị gây độc gan bằng ethanol

48

15 Hình 3.6 Ảnh hưởng của cao định chuẩn quả Me rừng đến hàm

lượng MDA trong gan của chuột bị gây độc bằng ethanol 49

16 Hình 3.7 Ảnh hưởng của cao định chuẩn quả Me rừng đến hàm

lượng GSH trong gan của chuột bị gây độc bằng ethanol 50

17 Hình 3.8 Ảnh hưởng của cao định chuẩn quả Me rừng đến hoạt độ

SOD trong gan của chuột bị gây độc bằng ethanol 52

18 Hình 3.9

Hình ảnh minh họa ảnh hưởng của cao định chuẩn quả

Me rừng trên vi thể tế bào gan của chuột bị gây độc gan bằng ethanol

59

3.13

Ảnh hưởng của cao định chuẩn quả Me rừng ở các nồng

độ khác nhau lên tỷ lệ biểu hiện của p-AMPK/β-actin 59

3.14

Ảnh hưởng của cao định chuẩn quả Me rừng ở các mức nồng độ khác nhau lên tỷ biểu hiện của p-ACC/ β-actin 60

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh gan đang ngày một gia tăng và là gánh nặng bệnh tật lớn ở nhiều quốc gia trên thế giới Nhiều nguyên nhân được biết đến có thể gây tổn thương gan, bao gồm nhiễm virus viêm gan, nhiễm HIV, gan nhiễm mỡ do chế độ ăn giàu chất béo, sử dụng rượu quá mức, rối loại tự miễn, rối loạn lipid máu, nhiễm nấm, phơi nhiễm các chất hóa học và các loại thuốc gây độc gan [11] Hiện nay, trong số các phương pháp điều trị các bệnh về gan, nghiên cứu và phát triển thuốc mới có nguồn gốc dược liệu là hướng tiếp cận có tiềm năng và thu hút nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học trên thế giới Báo cáo về điều tra các thực vật có tác dụng bảo vệ gan của Adewusi và Afolayan năm

2010 cho thấy có hơn 100 loài thực vật với 58 hợp chất được chiết từ chúng có hiệu quả điều trị các bệnh lý về gan [27] Vì vậy, các nghiên cứu tương lai về những dược liệu có tác dụng bảo vệ gan và các hoạt chất chiết từ những dược liệu này là rất cần thiết

Cây Me rừng (tên khoa học Phyllanthus emblica L hay Emblica oficinalis

Gartn.) đã được nhiều nghiên cứu chứng minh có tác dụng chống oxy hóa, kháng khuẩn,

kháng viêm, bảo vệ tim mạch, chống ung thư, điều trị bệnh đái tháo đường, rối loạn lipid

và các chuyển hóa khác [30], [98], [96] Đặc biệt, đã có không ít các nghiên cứu chỉ ra

rằng các thành phần từ cây Me rừng có tác dụng bảo vệ gan in vitro và in vivo với nhiều

loại tác nhân như ethanol, carbon tetrachlorid (CCl4), arsenic, ochratoxin, paracetamol, thuốc kháng lao, N-nitrosodiethylamin…[9], [16], [22], [33], [47], [94] Cơ chế gây tổn thương gan do những tác nhân trên có liên quan đến nhiễm trùng và stress oxy hóa Các chất chống oxy hóa bao gồm acid ascorbic, acid gallic, các flavonoid, tannoid…trong cao chiết quả Me rừng đã được chứng minh có tác dụng bảo vệ gan thông qua cơ chế ngăn cản hình thành viêm và stress oxy hóa [16]

Hiện nay, ở Ấn Độ và Trung Quốc, Me rừng đã được thương mại hóa thành nhiều sản phẩm như bột pha uống bổ sung vitamin C, mỹ phẩm chống lão hóa cho da, viên nang hỗ trợ bệnh tim mạch Ở Việt Nam, cây Me rừng mọc hoang nhiều nơi, đặc biệt là ở khu vực Tây Bắc và đã được đưa vào trồng thử nghiệm Trong dân gian, quả

Me rừng được sử dụng làm thức uống giải khát, sắc uống, ngâm rượu để trị ho, cảm mạo, đau bụng, chữa đái tháo đường và cao huyết áp [2] Mặc dù Me rừng đã được biết đến rất rộng rãi song các nghiên cứu về tác dụng dược lý của cây Me rừng vẫn còn rất

hạn chế và đặc biệt ở trong nước hiện tại chưa có nghiên cứu nào liên quan tác dụng bảo

vệ gan Từ những thực trạng trên, với mong muốn tìm hiểu thêm về các tác dụng dược

lý của cây Me rừng, nhóm nghiên cứu tiến hành đề tài:

“Nghiên cứu tác dụng bảo vệ tế bào gan của Me rừng (Phyllanthus emblica L

Euphorbiaceae) trên thực nghiệm” với hai mục tiêu như sau:

1 Đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào gan của cao định chuẩn quả Me rừng in vivo trên

mô hình gây độc gan cấp tính bằng carbon tetrachlorid và mô hình gây độc gan

mạn tính bằng ethanol

2 Đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào gan của cao định chuẩn quả Me rừng in vitro

trên khả năng ức chế tích tụ lipid bằng thử nghiệm Oil Red O; khả năng ảnh hưởng lên AMPK và ACC bằng phương pháp Western Blot

PHẦN 1 TỔNG QUAN 1.1 Một số cơ chế liên quan đến tổn thương tế bào gan

Quá tải gốc tự do dẫn tới stress oxy hóa tế bào gan là một trong những cơ chế chính gây nên tổn thương tế bào gan với nhiều tác nhân khác nhau như ethanol, thuốc,

ô nhiễm môi trường hay tia xạ… Nghiên cứu in vivo và in vitro đều cho thấy các chất

chống oxy hóa có tiềm năng lớn đối với đa số bệnh lý liên quan đến gan [51] Mặt khác, tổng quan về các đích phân tử liên quan đến bệnh lý về gan cho thấy Adenosin monophosphat (AMP)-activated protein kinase (AMPK) là một đích phân tử gần đây được khá nhiều nhà nghiên cứu quan tâm khi đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào gan của các sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên [31] AMPK liên quan chặt chẽ với cơ chế phân tử của các bệnh lý tim mạch, thoái hóa thần kinh, viêm, cũng như trong các bệnh ung thư, rối loạn chuyển hóa và đặc biệt là bệnh lý về gan như bệnh gan nhiễm mỡ, bệnh gan do rượu hay xơ gan [52], [55], [106] Vì vậy, trong một khuôn khổ tương đối giới hạn, phần tổng quan này sẽ tập trung làm rõ hai cơ chế quan trọng liên quan đến bệnh lý về gan bao gồm vai trò của stress oxy hóa và vai trò của AMPK đối với tổn thương tế bào gan

1.1.1 Vai trò của stress oxy hóa và các gốc tự do đối với tổn thương tế bào gan

Gốc tự do (Reactive oxygen species – ROS) có thể được định nghĩa là bất kỳ

tiểu phân hóa học nào có khả năng tồn tại độc lập có chứa một electron chưa ghép cặp trong obitan nguyên tử Gốc tự do có xu hướng mất điện tử để trở thành chất khử hoặc nhận điện tử để trở thành chất oxy hóa [56] Vì đặc tính hóa học đó, ROS có thể gây ra peroxy hóa lipid, phá vỡ chuỗi ADN, tổn thương các phân tử trên màng và mô sinh học Tuy nhiên, cơ thể lại có khả năng đào thải các gốc oxy hóa ở một mức độ nào đó, nên với nồng độ thấp, gốc oxy hóa không có hại Sản sinh gốc tự do là một chức năng sinh

lý của cơ thể, đóng vai trò trong quá trình hình thành tế bào bao gồm dẫn truyền tín hiệu, hàng rào ngăn chặn các vi sinh vật, bộc lộ gen khởi động quá trình phát triển hay chết của tế bào [19] Stress oxy hóa là thuật ngữ dùng để mô tả tình trạng mất cân bằng nghiêm trọng giữa sự phát sinh gốc tự do và chất chống oxy hóa bảo vệ trong cơ thể, có thể gây ảnh hưởng các loại phân tử bao gồm cả lipid, protein và acid nucleic, dẫn đến

cơ chế tự chết hay hoại tử tế bào [23]

Gan là một cơ quan bị tổn thương nghiêm trọng bởi các ROS [81] Khi ROS

quá tải, hệ thống cân bằng bị phá vỡ, xảy ra stress oxy hóa gây nên tổn thương tế bào gan và những rối loạn mãn tính kèm theo Ty thể của các tế bào nhu mô gan tạo ra ROS, điều hòa yếu tố kiểm soát chuyển hóa lipid và đường (peroxisome proliferator-activated receptor-α – PPARα), có vai trò quan trọng đối với quá trình β-oxy hóa acid béo Hơn thế nữa, tế bào Kuffer, tế bào hình sao hay tế bào nội mô của gan được biết đến có vai trò trong việc nhạy cảm tiếp xúc với stress oxy hóa Stress oxy hóa kích thích tế bào Kuffer sản sinh chất gây viêm như TNF- α, IL-1β, Interleukin…những chất này gây khởi phát nhiễm trùng và quá trình tự chết của tế bào Đồng thời, stress oxy hóa cũng dẫn tới quá trình peroxy hóa lipid, gây kích hoạt tế bào hình sao tăng sinh tổng hợp collagen, khởi phát xơ hóa tế bào gan [18] Stress oxy hóa không chỉ gây kích hoạt tế bào Kuffer, tế bào hình sao, phá hủy không hồi phục các lipid, protein và DNA mà còn ảnh hưởng đến những chức năng khác bao gồm dẫn truyền gen, chu trình tự chết của tế bào, hệ thống miễn dịch Những cơ chế này liên quan đến các bệnh gan khác nhau như bệnh gan do rượu, viêm gan virus mạn tính, viêm gan nhiễm mỡ không do rượu…[87] Ngoài ra, cơ chế liên quan các bệnh lý về gan còn được cho rằng do sự kết hợp của các yếu tố nguy cơ gây bệnh, nhiễm trùng, hệ thống miễn dịch, quá tải các gốc tự do Cơ chế stress oxy hóa gây tổn thương tế bào gan được thể hiện trong hình 1.1 [51] (trang bên)

Hình 1.1 Vai trò của stress oxy hóa đối với tổn thương gan

Hệ thống chống oxy hóa trong cơ thể bao gồm những chất có bản chất là enzym

và cả những chất không có bản chất là enzym Cả hai loại enzym này đều cần thiết cho khả năng chống oxy hóa khi cơ thể gặp bệnh lý Do vậy, những enzym chống oxy hóa như catalase (CAT), superoxid dismutase (SOD), và glutathion peroxidase (GSH-Px) cũng như thụ thể không có bản chất là enzym như glutathion (GSH) thay đổi theo quá trình stress oxy hóa và được sử dụng làm chỉ số đánh giá mức độ stress oxy hóa của cơ thể [25] Đặc biệt, yếu tố nhân erythroid 2-related factor 2 (Nrf2) là một yếu tố phiên

mã trung tâm điều khiển các hệ thống bảo vệ chống oxy hóa và hệ thống chống viêm của cơ thể [114] Nrf2 hoạt động bằng cách gắn vào một đoạn trình tự nhất định có trong

hệ gen có tên gọi là yếu tố phản ứng chống oxy hóa (antioxidant response element – ARE) Khi có mặt một số dưỡng chất nhất định, Nrf2 sẽ đi đến nhân tế bào để điều khiển hoạt động tế bào sản xuất enzym chống oxy hóa như CAT, SOD, GSH-Px…[93] Tình trạng cân bằng hệ thống oxy hóa khử ở gan được thể hiện ở hình 1.2 [51] (trang bên)

Hình 1.2 Hệ thống cân bằng oxy hóa khử ở gan

Các gốc tự do là những phân tử chỉ tồn tại trong cơ thể một thời gian ngắn, gây ảnh hưởng tại chỗ ở cơ quan Tuy nhiên, các gốc tự do lại tấn công các acid béo đa không bão hòa (polyunsaturated fatty acids – PUFAs), dẫn đến khởi động quá trình

peroxy hóa lipid (lipid peroxidation – LPO) trong tế bào, tạo ra các chất chuyển hóa cuối

cùng như trans-4-hydroxy-2-nonenal và malondialdehyd (MDA) Những phân tử này có thời gian bán thải dài hơn so với các ROS và có khả năng khuếch tán ra khỏi vị trí ban đầu đến những cơ quan đích, làm trầm trọng hơn quá trình stress oxy hóa Đặc biệt, MDA không chỉ tăng đồng thời cùng với mức độ peroxy hóa lipid mà MDA còn dễ định lượng được trong máu thông qua phản ứng màu với acid thiobarbituric, vì vậy MDA là một dấu ấn sinh học đánh giá mức độ stress oxy hóa cũng như mức độ tổn thương gan Quá trình peroxyd hóa các thành phần trên màng ty thể tế bào gan góp phần làm giảm chức năng của ty thể đồng thời gây tăng cường stress oxy hóa tế bào gan [84] Một nghiên cứu của Pan M và cộng sự đã chứng minh rằng peroxyd hóa các PUFAs khiến mạng lưới nội chất tiết ra một số chất trung gian làm phân hủy ApoB dẫn đến giảm mức

độ Lipoprotein tỷ trọng rất thấp (very low density lipoprotein – VLDL) ở chuột [67]

Giảm VLDL có thể là một nguyên nhân làm tăng tích lũy triglycerid ở gan Không chỉ vậy, peroxyd hóa các PUFAs tạo nên các chất trung gian là các aldehyd làm rối loạn cân bằng nội mô của tế bào Các chất này ảnh hưởng đến sự tổng hợp nucleotid, protein, làm

thiếu hụt chất chống oxy hóa tự nhiên như glutathion và tiết các cytokin gây viêm như TNF-α (Tumor necrosis factor alpha), IL-1β (Interleukin-1-beta) dẫn đến nhiễm trùng

tế bào gan, khởi phát xơ hóa tế bào gan [63]

1.1.2 Vai trò của AMPK đối với tổn thương tế bào gan

Những năm gần đây, protein kinase được hoạt hóa bởi AMP (AMP activated protein kinase – AMPK) đang là một đích điều trị chiến lược trong các bệnh lý như đái tháo đường, nhiễm trùng, béo phì và đặc biệt là các bệnh về gan AMPK là một enzym

có vai trò quan trọng trong chuyển hóa năng lượng và cân bằng giữa nhu cầu năng lượng cần thiết với lượng thức ăn đưa vào cơ thể, enzym này liên quan trực tiếp đến các bệnh rối loạn chuyển hóa, có vai trò hoạt hóa enzym tham gia quá trình β-oxy hóa, làm tăng quá trình thoái hóa chất béo và tăng chuyển hóa glucose ở cơ, đồng thời ức chế quá trình tổng hợp cholesterol ở gan [100]

 Vai trò của AMPK trong bệnh gan nhiễm mỡ

Hoạt hóa AMPK gây phosphoryl hóa một số enzym trong bào tương trong đó

cơ chất chính của AMPK là acetyl coenzym A carboxylase (ACC) và methylglutaryl coenzym A reductase (HMG-CoA Reductase) AMPK được hoạt hóa dẫn đến làm giảm tích lũy mỡ tại gan liên quan đến cơ chế bất hoạt enzym ACC và HMG-CoA reductase thông qua gây phosphoryl hóa hai enzym này [99] HMG-CoA reductase chịu trách nhiệm chính trong quá trình tổng hợp acid béo và cholesterol ACC

3-hydroxy-3-là enzym xúc tác cho phản ứng tổng hợp malonyl-CoA từ acetyl-CoA, có vai trò chính tham gia tổng hợp acid béo tại tế bào gan Hoạt hóa AMPK (do phosphoryl hóa phân tử threonin 172 trên AMPK) gây ức chế ACC (do phosphoryl hóa phân tử serin 79 trên ACC) làm giảm nồng độ malonyl-CoA trong tế bào, giảm tổng hợp acid béo [12] Malonyl-CoA không chỉ là tiền chất cho quá trình sinh tổng hợp acid béo mà còn là chất

ức chế quá trình β-oxy hóa acid béo tại ty thể thông qua con đường ức chế enzym carnitine palmitoyl transferase I (CPT I) [76] Vai trò của CPT I là chất vận chuyển chất béo vào màng trong ty thể tế bào gan để vào chất khuôn (matrix) – nơi chúng bị oxy hóa [4] Vì vậy, giảm malonyl-CoA dẫn tới tăng hoạt hóa CPT I, tăng vận chuyển acid béo vào ty thể và tăng quá trình β-oxy hóa acid béo tại ty thể tế bào gan Bên cạnh đó, malonyl-CoA đồng thời bị phân hủy bởi enzym malonyl-CoA decarboxylase (MCD)

Khi MCD được kích hoạt, sẽ góp phần làm giảm malonyl-CoA [76] Một số nghiên cứu

đã chứng minh AMPK là protein kinase chính chịu trách nhiệm cho sự bất hoạt của ACC

và kích hoạt MCD, dẫn đến giảm nồng độ malonyl-CoA và tăng β-oxy hóa acid béo ở gan, tim và cơ xương…[79], [105]

Ngoài ra, hoạt hóa AMPK còn ảnh hưởng tới khả năng tổng hợp acid béo tế bào gan thông qua yếu tố phiên mã nhạy cảm với AMPK là sterol regulatory element-binding protein 1 (SREBP-1) SREBP-1 là một yếu tố phiên mã thúc đẩy sự tổng hợp acid béo thông qua tăng bộc lộ gen sinh tổng hợp lipid, có vai trò quan trọng trong bệnh lý rối loạn chuyển hóa gan [59]

Bệnh gan nhiễm mỡ có thể đơn thuần hoặc kết hợp viêm, có thể xảy ra ở những người có sử dụng rượu hoặc không (bệnh gan nhiễm mỡ không do rượu) Đây là bệnh

lý có thể diễn tiến từ không triệu chứng đến có biểu hiện viêm gan (viêm gan nhiễm mỡ

không do rượu) và cuối cùng là xơ gan Metformin và Thiazolidinedion làm giảm rõ rệt

tình trạng bệnh gan nhiễm mỡ trên mô hình in vivo và trên cả lâm sàng, cơ chế được cho

rằng thông qua kích hoạt AMPK ở gan [54], [5] Bên cạnh đó, một số nghiên cứu đã đánh giá vai trò của AMPK trên mô hình chuột được gây kích hoạt AMPK thông qua các đột biến gen như thiếu hụt enzym Stearoyl CoA desaturase – enzym có vai trò tổng hợp acid béo đơn bão hòa hay đột biến gen γ1 subunit (γ1D316A) Kết quả cho thấy rằng kích hoạt AMPK làm tăng quá trình β-oxy hóa acid béo, dẫn tới giảm nhiễm mỡ ở

gan chuột trong các nghiên cứu này [26], [106]

Hình 1.3 thể hiện vai trò của AMPK trong bệnh gan nhiễm mỡ [99] (trang bên)

Hình 1.3 Vai trò của AMPK trong bệnh gan nhiễm mỡ

 Vai trò của AMPK trong xơ hóa tế bào gan

Xơ hóa gan là sự tích tụ quá nhiều chất cơ bản ngoại bào (extracellular matrix – ECM), hình thành mô sẹo, kết quả của tình trạng viêm và các tế bào chết của gan, xảy

ra ở hầu hết các bệnh gan mạn tính Nguyên nhân có thể từ tế bào gan bị tổn thương bởi virus, rượu, gan nhiễm mỡ, các chất độc, chấn thương hoặc các yếu tố khác, hệ thống miễn dịch bắt đầu sửa chữa thiệt hại Theo Hiệp hội chuyên khoa bệnh gan Friedman của Mỹ, xơ hóa tế bào gan là con đường duy nhất tiến triển từ bệnh gan mạn tính thành bệnh xơ gan không hồi phục [34] Xơ hóa tế bào gan trải qua ba giai đoạn bao gồm tổn thương nhiễm trùng, hoạt hóa tế bào hình sao – một nguồn mạnh của các peroxid lipid gây xơ hóa; tăng tiết và tích tụ ECM [52] Trước tiên, tổn thương nhiễm trùng kích hoạt chuyển đổi yếu tố tăng trưởng chuyển dạng TGF-β từ dạng tiềm ẩn đến dạng tiền gây

xơ hóa hoạt động, tuy nhiên may mắn là TGF-β được cho rằng bị ức chế bởi AMPK, từ

đó dẫn tới làm giảm khởi phát xơ hóa tế bào gan Một số nghiên cứu trên mô hình chuột

bị gây xơ gan bằng CCl4 hay tế bào gan nhiễm virus viêm gan C cho thấy kích hoạt AMPK làm giảm tín hiệu yếu tố chuyển đổi TGF-β trong gan, từ đó giảm đáng kể xơ hóa tế bào gan [40], [45]

Bên cạnh làm giảm yếu tố chuyển đổi TGF-β, hoạt hóa AMPK còn có khả năng làm ngăn cản quá trình tăng sinh, giảm tính hóa ứng động – di chuyển theo hướng sức

hút hóa học đối với cytokin, giảm hình thành xơ hóa đồng thời khởi phát tự chết theo chu trình của tế bào hình sao trong quá trình xơ hóa tế bào gan [101] AICAR (aminoimidazol-4-carboxamid ribonucleotid) – một yếu tố kích hoạt biểu hiện của AMPK được chứng minh có tác dụng ức chế sự tăng sinh nguyên bào cơ xơ có nguồn gốc từ tế bào hình sao trên mô hình chuột bị gây độc gan bằng CCl4, đồng thời làm giảm mức độ collagen I và xơ hóa Li và cộng sự đã sử dụng mô hình tương tự để chứng minh berberin ức chế sự tăng sinh của tế bào hình sao cũng như giảm biểu hiện của yếu tố nguyên bào sợi cơ, thông qua cơ chế kích hoạt AMPK Đáng chú ý là nghiên cứu đã phát hiện ra rằng tác dụng chống tăng sinh của chất kích hoạt AMPK phụ thuộc vào mức nồng độ chất kích hoạt AMPK và thời gian sử dụng [50] Adiponectin – một chất gây tăng biểu hiện của AMPK cũng được chứng minh có khả năng ngăn cản quá trình tăng sinh của tế bào hình sao trên chuột bị gây độc gan bằng CCl4 dẫn tới làm giảm sự xơ hóa tế bào gan [73] Không chỉ vậy, AMPK cũng đóng vai trò quan trọng đối với giai đoạn tăng tiết ECM, hoạt hoá AMPK còn có tác dụng ngăn cản quá trình xơ hóa tế bào gan thông qua làm giảm ECM, do đó giảm hình thành sẹo và mô xơ [58]

 Vai trò của AMPK trong bệnh gan do rượu

Tổn thương gan do rượu được chia thành ba giai đoạn kế tiếp nhau là gan nhiễm

mỡ (steatosis hepatis), viêm gan do rượu (alcoholic steatohepatitis – ASH) và xơ gan do rượu, các giai đoạn này thường chồng chéo lên nhau, trong đó gan nhiễm mỡ hay gặp nhất, chiếm > 90% các bệnh gan do rượu Cơ chế phân tử của bệnh gan nhiễm mỡ do sử dụng ethanol dài ngày liên quan đến các đích phân tử bao gồm yếu tố phiên mã kiểm soát chuyển hóa chất béo và đường (PPARα), protein điều hòa chuyển hóa lipid (SREBP-1), và AMP-dependent protein kinase (AMPK) Các đích phân tử này liên quan trực tiếp đến một số yếu tố ảnh hưởng lên sự tổng hợp lipid và quá trình β-oxy hóa acid béo tại ty thể tế bào gan như ACC, CPT I, MCD, TNF-α, adiponectin receptor 2…[110]

Sử dụng ethanol dài ngày gây kích hoạt ACC và bất hoạt CPT I trong tế bào gan, từ đó làm giảm quá trình β-oxy hóa acid béo tại tế bào gan dẫn đến bệnh gan nhiễm mỡ do rượu [32] Bên cạnh đó, các nghiên cứu cũng ủng hộ bằng chứng ethanol gây tăng biểu

hiện yếu tố SREBP-1 trên cả mô hình in vivo và in vitro Đã có một số mô hình nghiên cứu in vivo gây bệnh gan nhiễm mỡ do ethanol cho thấy chuột bị gây độc gan bởi chế

độ ăn chứa ethanol trong thời gian từ 4-6 tuần có tăng biểu hiện yếu tố SREBP-1 trong

tế bào gan [111] Kết quả nghiên cứu của Min You và cộng sự đã cho thấy ethanol gây tăng biểu hiện yếu tố điều hòa sinh acid béo SREBP-1 trên tế bào gan H4IIEC3; McA-

RH 7777 đồng thời nghiên cứu chứng minh hai yếu tố kích hoạt AMPK là metformin

và AICAR có khả năng làm giảm biểu hiện yếu tố điều hòa sinh acid béo SREBP-1 trên dòng tế bào gan được ủ với ethanol [112] Rõ ràng, ACC, CPT I hay yếu tố SREBP-1 đều có mối quan hệ chặt chẽ với AMPK, cụ thể là hoạt hóa AMPK làm tăng hoạt hóa CPT I đồng thời làm bất hoạt ACC dẫn tới tăng quá trình β-oxy hóa acid béo tại tế bào gan [99], [79] Ngoài ra, hoạt hóa AMPK sẽ điều hòa làm giảm yếu tố SREBP-1, từ đó giảm tổng hợp acid béo tại tế bào gan [29] Như vậy, hoạt hóa AMPK có vai trò quan trọng trong các giai đoạn của bệnh gan do rượu thông qua việc làm tăng quá trình β-oxy hóa và giảm tổng hợp acid béo tại gan đồng thời làm giảm quá trình hình thành xơ hóa

tế bào gan Hình 1.4 thể hiện vai trò của AMPK trong bệnh gan nhiễm mỡ do rượu [112]

Hình 1.4 Vai trò của AMPK trong bệnh gan do rượu

1.2 Thông tin về dược liệu Me rừng

1.2.1 Đặc điểm thực vật

Phyllanthus emblica (hay Embellica officinallis), tiếng Việt gọi là Me rừng, me

mận, du cam tử, chùm ruột núi hoặc là mắc kham [1] Ngoài ra, tên gọi phổ biến của Me

rừng ở Trung Quốc là Ganlanshu, Youganzi, hay ở Ấn Độ là Amla Đây là một loài thực

vật có hoa với quả ăn được, trong họ Thầu dầu Euphorbiaceae [30]

Me rừng là dạng cây nhỡ, phân cành nhiều, cao 5-6 cm, vỏ cây màu xanh xám Cành cây mọc lộn xộn, dài khoảng 40 cm, có khoảng 100 lá cây mỗi nhánh Lá nhỏ thuôn hẹp, dài 9-10 mm, rộng 2-3 mm, xếp sít thành 2 dãy, như lá kép lông chim, mặt trên màu lục xám, mặt dưới nhạt hơi hồng, lá kèm rất nhỏ Cụm hoa mọc ở kẽ lá ở cuối cành thành xim hoặc tản, hoa đơn tính cùng gốc màu vàng gồm nhiều hoa đực và ít hoa cái, hoa cái có cuống ngắn hơn hoa đực nhiều, có 6 đài dày hơn, bầu 3 ô, mỗi ô chứa 2 noãn Quả thịt hình cầu có kích thước 1,8-2,5 cm, to bằng quả táo ta, có khía rất mờ, vị chua chát, chuyển từ màu vàng nhạt sang màu đỏ cam khi chín [1], [30] Hình 1.5 minh họa hình ảnh lá và quả của cây Me rừng (nguồn ảnh: caythuoc.org)

Hình 1.5 Quả và lá cây Me rừng 1.2.2 Phân bố, thu hái và chế biến

Me rừng mọc nhiều ở nhiều nước vùng nhiệt đới châu Á như Trung Quốc (Quảng Đông, Quảng Tây, Vân Nam), Ấn Độ, Việt Nam, Indonesia [30] Ở Việt Nam, cây mọc phổ biến trên các đồi trọc, các bãi hoang, trong các rừng thưa và trung du thuộc nhiều tỉnh từ Bắc vào Nam, đặc biệt ở các tỉnh miền núi trung du phía Bắc Cây ưa ánh sáng, chịu được khô hạn Quả, rễ, lá và vỏ cây được sử dụng để làm thuốc Trong công nghiệp người ta còn dùng vỏ thân, làm nguồn nguyên liệu chế tannin Rễ thu hái quanh năm, đào vể rửa sạch đất cát, phơi hay sấy khô Quả thu hái vào mùa thu, đồ hơi nước rồi phơi hay sấy khô [1]

1.2.3 Thành phần hóa học

Các thành phần của cây Me rừng chứa nhiều chất dinh dưỡng với thành phần hóa học đa dạng bao gồm các annin, acid mucic, amino acid, alkaloid, flavon glycosid, phenolic glycosid, flavonol glycosid, acid phenolic, sesquiterpenoid, norsesquiterpenoid

và carbohydrat [49] Quả Me rừng chứa hàm lượng đáng kể các muối khoáng, protein

và các amino acid như acid glutamic, prolin, acid aspartic, alanin, cystin, lysin Bên cạnh

đó, các nghiên cứu về thành phần hóa học trong quả Me rừng cũng tìm thấy các chất như acid gallic, acid ellagic, acid chebulinic, acid chebulagic, emblicanin A, emblicanin

B, punigluconin, pedunculagin, acid citric, ellagotannin, trigallayl glucose, isostrictiniin, corilagin, pectin, 1-O-galloyl-β-D-glucose, 1,6-di-O-galloyl-β-D-glucose, acid 3-ethylgallic (acid 3-ethoxy-4,5-dihydroxy benzoic), 3,6-di-O-galloyl-D-glucose [104] Ngoài ra, nghiên cứu đã xác định flavonoid trong quả Me rừng bao gồm quercetin, kaempferol [30], [49] Thành phần hóa học của quả Me rừng được liệt kê trong Bảng 1.1 [78]

Bảng 1.1 Thành phần hóa học trong quả Me rừng

ellagotannin Các alkaloids Phyllantin, phyllembein, phyllantidin

Chất phenolic Acid gallic, methyl gallate, acid ellagic, trigallayl glucose Amino acids Acid glutamic, prolin, acid aspartic, alanin, cystin, lysin

Flavonoid Quercetin, kaempferol

1.2.4 Tác dụng dược lý của Me rừng

Theo y học cổ truyền, quả Me rừng có vị chua ngọt, hơi chát, tính mát có công năng sinh tân, chỉ khát, lợi tiểu, hạ nhiệt, tiêu viêm, nhuận phế hóa đờm Quả Me rừng được sử dụng rộng rãi trong hệ thống y học Ấn Độ như thuốc lợi tiểu, nhuận tràng, thuốc

bổ gan, làm lạnh, dạ dày, phục hồi, chống viêm, thuốc bổ tóc, chống loét và trị cảm lạnh, sốt thông thường [98] Các nghiên cứu về thành phần hóa học của quả Me rừng cho thấy quả Me rừng giàu tannin, alkaloid, polyphenol, vitamin và khoáng chất Acid gallic, acid ellagic, emblicanin A & B, phyllembein, quercetin và acid ascorbic trong quả Me rừng

đã được chứng minh có hoạt tính sinh học [30] Đã có nhiều nghiên cứu nước ngoài đánh giá tác dụng dược lý của cao chiết quả Me rừng trên khả năng chống oxy hóa và bảo vệ tế bào gan, khả năng bảo vệ tim mạch, mỡ máu, hạ đường huyết, giảm nhiễm trùng…

 Khả năng chống oxy hóa

Các phản ứng oxy hóa trong cơ thể rất quan trọng, tuy nhiên chúng có thể gây

ra các tổn hại cho tế bào Sử dụng các sản phẩm từ thiên nhiên có khả năng chống oxy hóa giúp giảm nguy cơ mắc bệnh và tỷ lệ tử vong Hoạt tính chống oxy hóa của quả Me rừng không chỉ nhờ thành phần vitamin C mà còn từ các tannin như emblicanin A, emblicanin B, punigluconin, pedunculagin và acid gallic [98] Poltanov và cộng sự đã nghiên cứu dịch chiết khác nhau giàu các thành phần chống oxy hóa trên từ cao chiết nước quả Me rừng và khẳng định các dịch chiết này đều có khả năng thu dọn gốc 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), superoxid anion (O2∙-) [70] Hoạt tính thu dọn gốc DPPH của emblicanin A và B cao hơn gần 7,86 và 11,2 lần so với vitamin C, trong khi

đó acid gallic và acid ellagic có hoạt tính lần lượt gấp 6,25 và 3 lần so với vitamin C [71] Tác dụng thu dọn các gốc tự do như DPPH; 2,2'-azino-bis(acid 3-ethylbenzothiazolin-6-sulphonic) (ABTS) hay hydrogen peroxyd của cao chiết ethanol

từ quả Me rừng cũng đã được báo cáo [69]

 Tác dụng bảo vệ tế bào gan

Hiện nay trên thị trường, sản phẩm nguồn gốc từ thảo dược điều trị các bệnh về gan khá phổ biến bởi thảo dược rất lành tính và rất ít tác dụng phụ Đã có nhiều nghiên

cứu đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào gan in vivo với các tác nhân gây độc gan khác nhau cũng như các nghiên cứu in vitro về cơ chế bảo vệ tế bào gan liên quan đến khả năng

ngăn chặn các gốc chống oxy hóa, kích hoạt các đích phân tử điều hòa chuyển hóa lipid trên tế bào gan Đặc biệt, quả Me rừng có nhiều thành phần hóa học như tannin, vitamin

C, acid gallic hay các flavonoid… đây là những hoạt chất có khả năng chống stress oxy hóa và ngăn ngừa viêm ở tế bào gan [98] Bảng 1.2 trình bày các nghiên cứu đánh giá khả năng bảo vệ tế bào gan của Me rừng (trang bên)

Bảng 1.2 Tác dụng bảo vệ tế bào gan của Me rừng

Tác giả,

năm,

[TLTK]

Mô hình nghiên cứu

Mẫu nghiên cứu

Cao chiết từ nước quả Me rừng ở Liều 250 mg/kg hay 500 mg/kg

Giảm ASAT, ALAT, TG; tăng GSH, GSH-Px, CAT, GST trong gan; tăng biểu hiện PPARα, giảm SREBP-1

trên tế bào gan

Cao chiết nước từ quả Me rừng nồng độ 50 - 200

µM

Tăng mức AMPK, PPARα và CPT I; giảm tích tụ acid béo, ROS trên tế bào HepG2, giảm mức collagen I và nguyên bào sợi cơ

Cao chiết nước và dạng nano tiểu phân bạc của cao chiết quả Me rừng

ở liều 300 mg/kg

Giảm ASAT, ALAT, ALP, LDH và Bilirubin trong đó dạng nano tiểu phân bạc hiệu quả hơn cao chiết nước quả

Me rừng Manish K

2014 [88]

Chuột bị gây độc gan bằng asenic 3 mg/kg/ngày trong

30 ngày

Cao chiết ethanol 50% từ quả Me rừng ở mức liều

500 mg/kg

Giảm ASAT, ALAT; tăng GSH, SOD, CAT, GSH-Px, GST, giảm hàm lượng kẽm, đồng và arsen trong gan Vaddi

Damodara

Reddy

2010 [22]

Chuột bị gây độc gan mạn bằng ethanol 20% liều 5g/kg trong 60 ngày

Cao chiết nước từ quả Me rừng chứa 49.5% các tannin liều 250 mg/kg

Tăng các chất chống oxy hóa GSH, SOD, CAT, GPx và giảm enzym làm mất ổn định màng tế bào gan Na⁺/K⁺-ATPase; Mg2+-ATPase Kuo-Hsin

Chen 2010

[16]

Chuột bị gây độc gan bằng N-Nitrosodiethyl Amin

Cao chiết quả Me rừng mức liều

100 mg/kg

Giảm mức ASAT, ALAT, LPO và tăng hoạt độ enzym

chống oxy hóa

Bảng 1.2 Tác dụng bảo vệ tế bào gan của Me rừng (tiếp theo)

Tác giả,

năm,

[TLTK]

Mô hình nghiên cứu

Mẫu nghiên cứu

ngày

Cao chiết nước từ quả Me rừng ở 100 mg/kg hoặc 200 mg/kg

Giảm tỷ lệ chuột bị chết trong thử nghiệm, cải thiện hình ảnh vi thể tế

Cao chiết ethanol 50% từ quả Me rừng liều 75 mg/kg

Giảm ASAT, ALAT, TNF-α, IL-1β; cải thiện hình ảnh vi thể tế bào gan

mức liều 1,5ml/kg

Cao chiết methanol

từ quả Me rừng ở mức liều 500 và

1000 mg/kg

Mức liều 1000 mg/kg làm giảm ASAT và ALAT rõ rệt; làm tăng SOD, GSH, GSH-Px nhưng không có ý nghĩa

ngày

Cao chiết ethanol 50% từ quả Me rừng mức liều 100 mg/kg

Giảm ALAT, ASAT, LPO, ALAT; tăng hàm lượng GSH, GSH-Px

Cao chiết ethanol 50% từ quả Me rừng mức liều 100 mg/kg

Giảm mức ASAT, ALAT, LPO, ALP, tăng GSH, hoạt độ của GSH-

Px, Na⁺/K⁺-ATPase Jeena K

Jose 2000

[39]

Chuột bị gây độc gan cấp bằng CCl4

Cao chiết nước từ quả Me rừng mức liều 500 mg/kg

Làm giảm có ý nghĩa mức LPO, GPT, ALP

 Tác dụng bảo vệ tim mạch

Me rừng là một trong 50 cây có hiệu quả bảo vệ tim mạch được đề cập trong

“Chuyên luận về thuốc trợ tim” của cuốn sách Aviccena Quả Me rừng bảo vệ tim mạch thông qua cơ chế tăng cường sức mạnh và độ bền của cơ tim, giảm mỡ máu, điều hòa nhịp tim, chống oxy hóa tế bào cơ tim, bên cạnh đó, quả Me rừng còn có hiệu quả trên một số bệnh gián tiếp ảnh hưởng đến tim mạch như trào ngược dạ dày thực quản [89] Bảng 1.3 trình bày một số nghiên cứu về ảnh hưởng của Me rừng lên bệnh tim mạch

Bảng 1.3 Tác dụng bảo vệ tim mạch của Me rừng

Tác giả,

năm,

[TLTK]

Mô hình nghiên cứu

Mẫu nghiên cứu

Cao chiết nước từ quả Me rừng liều

100 mg/kg

Tăng bộc lộ GSK3-β, nitrotyrosin, tín hiệu phosphatidylinositol - 3 kinase bảo vệ tế bào tim Santosh

kumar J

2013 [82]

Chuột bị gây tăng cholesterol bằng chế độ ăn giàu chất béo

Cao chiết nước từ quả Me rừng liều

540 mg/kg

Giảm cholesterol toàn phần,

TG, LDL-Cholesterol, tăng HDL-cholesterol

Ojha S

2012

[66]

Chuột bị gây độc cơ tim bằng isoproterenol

Cao chiết ethanol 50% từ quả Me rừng: 100, 250, 500

mg/kg

Tăng chất chống oxy hóa, tái tạo mạch máu, chức năng thất trái, giảm LPO

Cao chiết ethanol 50% từ quả

Me rừng: 75, 150 và

300 mg/kg

Giảm huyết áp và nhịp tim, giảm stress oxy hóa ở tim, tăng mức nitric oxid, nitric

oxid synthase Bhattacha

rya SK

2002 [8]

Chuột bị gây thiếu máu

cơ tim cục bộ

Cao chiết nước từ quả Me rừng chứa emblicanin-A (37%)

và -B (33%)

Giảm mức LPO, tăng hoạt độ SOD, GSH-Px, CAT tế bào cơ tim

 Tác dụng liên quan đến hạ đường huyết

Me rừng có thành phần hóa học đa dạng, giàu các hoạt chất chống oxy hóa như tannin, vitamin C, flavonoid, và đặc biệt chứa chrom - một tố chất có vai trò quan trọng

trong hỗ trợ điều trị bệnh đái tháo đường Nghiên cứu in vivo cho thấy Me rừng có hiệu

quả hỗ trợ điều trị đái tháo đường thông qua tái tạo tế bào β đảo tụy, kích thích tế bào β đảo tụy tiết insulin, làm giảm đường huyết ở chuột bị gây đái tháo đường bằng streptozotocin [21] Không chỉ vậy, đã có nghiên cứu ảnh hưởng của cao chiết quả Me rừng trên bệnh nhân đái tháo đường trong vòng 6 tháng, kết quả cho thấy quả Me rừng không gây tác dụng phụ cho bệnh nhân đồng thời làm giảm đường huyết, mức HbA1c, các chỉ số lipid trong máu [41] Bảng 1.4 trình bày một số nghiên cứu ảnh hưởng của

Me rừng trên mô hình chuột bị bệnh đái tháo đường bằng streptozotocin

Bảng 1.4 Tác dụng trên bệnh đái tháo đường của Me rừng

Tác giả,

năm,

[TLTK]

Mô hình nghiên cứu

Mẫu nghiên cứu

Quercetin mức liều 75 mg/kg được chiết từ cao chiết methanol của quả Me rừng

Đường huyết giảm 14,78% sau 7 ngày điều trị, tăng đáng

kể insulin và hemoglobin toàn phần, giảm tổn thương tụy trên hình ảnh vi thể Fatima N

2017 [28]

Chuột bị gây bệnh đái tháo đường bằng streptozotocin

Cao chiết methanol từ quả

2013 [68]

Chuột bị gây bệnh đái tháo đường bằng streptozotocin

Cao chiết ethanol 50% từ quả Me rừng 100 mg/kg trong 4 tuần

Giảm mức glucose, Cholesterol toàn phần, LDL-Cholesterol, tăng các ezym chống oxy hóa P.Suryanar

ayana

2007 [91]

Chuột bị gây đục thủy tinh thể bằng streptozotocin

Cao chiết nước từ quả Me rừng chứa 10-12% tannin

Giảm tỷ lệ đục thủy tinh thể, trì hoãn tiến triển đục thủy

tinh thể

 Tác dụng bảo vệ đường tiêu hóa

Đã có các nghiên cứu lâm sàng và tiền lâm sàng điều tra về khả năng bảo vệ đường tiêu hóa của Me rừng Tiềm năng bảo vệ đường tiêu hóa của Me rừng được cho rằng có liên quan đến khả năng chống viêm, chống oxy hóa và làm tăng chất nhầy bảo màng của các thành phần hóa học như acid gallic, các flavonoid, tannin trong quả Me rừng [98] Trên lâm sàng, cao chiết ethanol 50% từ quả Me rừng đã được đánh giá hiệu quả đối với bệnh nhân có rối loạn đường tiêu hóa, kết quả nghiên cứu cho thấy nhóm bệnh nhân được sử dụng cao quả Me rừng giảm các triệu chứng đau bụng, nôn và buồn nôn đồng thời giảm thời gian lành vết loét tiêu hóa [113] Bên cạnh đó, nghiên cứu của

Shubhi Mehrotra và cộng sự đã điều tra khả năng kháng vi khuẩn Helicobacteria pylori

và chống oxy hóa in vitro của cao chiết ethanol từ quả Me rừng cho thấy cao chiết ethanol từ quả Me rừng có khả năng kháng lại Helicobacteria pylori với nồng độ ức chế

tối thiểu là 0,91 – 1,87 µg/µl đồng thời có khả năng ngăn ngừa gốc tự do gây stress oxy hóa, do đó cao chiết quả Me rừng có thể cân nhắc dùng phối hợp với thuốc ức chế bơm proton và kháng sinh để điều trị loét dạ dày [86] Cao chiết ethanol từ quả Me rừng ở mức liều 120 mg/kg đã được báo cáo có khả năng chữa lành vết loét đồng thời làm tăng chất nhầy Prostaglandin E2 (PGE2), giảm các cytokin gây viêm như TNF-α và IL-1β trên chuột bị gây loét đường tiêu hóa bằng indomethacin [15] Tương tự, N.V Rajeshkumar và cộng sự đã điều tra ảnh hưởng của cao chiết methanol từ quả Me rừng

ở mức liều 100 mg/kg trên mô hình chuột bị gây loét đường tiêu hóa với các tác nhân khác nhau bao gồm indomethacin, ethanol hoặc histamin, kết quả cho thấy lô chuột được

sử dụng cao Me rừng giảm tỷ lệ xuất huyết, giảm chỉ số loét và tăng GSH bảo vệ đường tiêu hóa [61] Dịch chiết giàu acid gallic từ cao chiết ethanol 50% của quả Me rừng giàu được chứng minh có hiệu quả trên mô hình chuột bị gây loét tiêu hóa bằng indomethacin thông qua việc làm tăng chất nhầy PGE2, tăng yếu tố tăng sinh nội mô mạch máu, tăng mức NO – có ý nghĩa trong việc chữa lành vết loét [14]

1.3 Các nghiên cứu đánh giá tác dụng bảo vệ gan của Me rừng

Các nghiên cứu về tác dụng dược lý của Me rừng gần đây cho thấy tác dụng bảo

vệ tế bào gan là một trong những tác dụng được nhiều nhà nghiên cứu trên thế giới rất quan tâm, tiến hành đa dạng và phong phú với các mô hình thử nghiệm khác nhau Dưới

đây là mô tả chi tiết những nghiên cứu về tác dụng bảo vệ tế bào gan của cao chiết quả

Me rừng trên các mô hình khác nhau, đặc biệt là trên mô hình gây độc gan cấp bằng CCl4 hay mô hình gây độc gan mạn bằng ethanol cũng như phương pháp Western Blot

để đánh giá mức độ biểu hiện AMPK trên tế bào HepG2

1.3.1 Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của Me rừng in vivo

1.3.1.1 Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của Me rừng trên mô gây độc gan bằng

Me rừng ở mức liều 250 mg/kg cân nặng có tác dụng bảo vệ tế bào gan trên cả hai mô hình gây độc gan cấp và mạn tính bằng CCl4 thông qua làm giảm hoạt độ enzym ALAT, ASAT, glutamat-pyruvate transaminase, alkalin phosphatase và hàm lượng LPO trong gan [39] Sultana S và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu tương tự đánh giá ảnh hưởng của cao chiết quả Me rừng ở mức liều 100-200 mg/kg cân nặng trên chuột bị gây độc gan bằng CCl4 với nhiều thông số đánh giá hơn Cao chiết quả Me rừng trong nghiên cứu này được chiết với hỗn hợp dung môi ether, benzen, ethyl acetat, aceton, methanol Kết quả cho thấy dịch chiết quả Me rừng có tác dụng làm giảm đáng kể hoạt độ enzym ALAT, ASAT, lactate dehydrogenase, GSH-S-transferase, hàm lượng LPO, khả năng tổng hợp DNA đồng thời làm tăng các tác nhân chống oxy hóa như GSH, GSH-Px và GSH reductase so với nhóm chứng bệnh [83] Tương tự, những thông số trên cũng được đánh giá trong nghiên cứu của Sheikh Abdulla và cộng sự về tác dụng chống các yếu tố hình thành xơ gan của cao chiết quả Me rừng với dung môi ethanol 50% ở mức liều là

100 mg/kg Mức liều này có hiệu quả làm giảm 3-4 lần hoạt độ các enzym ASAT, ALAT, mức độ LPO đồng thời làm tăng 3-4 lần hàm lượng GSH, hoạt độ enzym CAT

so với lô chứng bệnh [95] Bên cạnh đó, nghiên cứu của R.Bhuvaneswari và cộng sự tiến hành tương tự để đánh giá tác dụng của cao chiết quả Me rừng trên mô hình gây độc gan bằng CCl4 cho thấy mức liều của dịch chiết là 300 mg/kg cân nặng có hiệu quả

cải thiện ASAT, ALAT so với mức liều của chứng dương silymarin là 100 mg/kg cân nặng [9] Ngoài ra, cũng có nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng của cao chiết nước từ quả

Me rừng ở mức liều cao như 1000 mg/kg cân nặng trên mô hình gây độc tính gan bằng CCl4, rõ ràng mức liều này đã được chứng minh có ý nghĩa trong việc cải thiện lượng enzym ALAT, ASAT và tổn thương trên mô bệnh học của gan [47]

1.3.1.2 Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của Me rừng trên mô hình gây độc gan bằng

ethanol

Stress oxy hóa dẫn đến viêm tế bào gan là cơ chế quan trọng gây tổn thương gan do rượu và rối loạn chức năng ty thể của tế bào gan Quá trình chuyển hóa ethanol làm thay đổi trạng thái oxy hóa khử, tăng hình thành acetaldehyd, tổn thương DNA, kích hoạt quá trình tự chết của tế bào, gây thiếu oxy, ảnh hưởng đến hệ thống miễn dịch và kích hoạt tế bào Kuffer ở gan Ethanol kích hoạt tế bào Kuffer nhờ nội độc tố do vi khuẩn gram âm ở ruột tiết ra Tế bào Kuffer được kích hoạt dẫn đến sản sinh ra các gốc

tự do và các chất gây viêm (TNF-α, IL-1β) Sử dụng ethanol trên chuột được chứng minh làm tăng các enzym ALAT, ASAT, TG huyết thanh cũng như làm tăng TNF-α,

IL-1β [35], [115] Hiện nay, đã có nhiều nghiên cứu đánh giá tác dụng bảo vệ gan in

vivo trên mô hình gây độc gan do sử dụng ethanol hoặc chế độ ăn chứa ethanol Nghiên

cứu của Pornpen Pramyothin và cộng sự đã tiến hành đánh giá tác dụng bảo vệ gan của

Me rừng in vivo trên cả mô hình chuột bị gây độc gan cấp tính bằng 1 liều ethanol 5 g/kg

cân nặng và trên mô hình mạn tính bằng ethanol 4 g/kg liên tục trong 21 ngày Kết quả cho thấy sử dụng cao chiết ethanol 50% từ quả Me rừng làm cải thiện các thông số ASAT, ALAT, TG, TNF-α và IL-1β, giảm tổn thương hoại tử trên hình ảnh vi thể tế bào gan ở trên cả mô hình gây độc ethanol cấp tính và mạn tính bằng ethanol [72] Cơ chế bảo vệ gan của dịch chiết quả Me rừng có thể liên quan đến khả năng chống oxy hóa, ngăn cản hình thành gốc tự do của các hoạt chất như flavonoid, tannin chứa trong cao chiết quả Me rừng Các nghiên cứu khác nhau về tác dụng bảo vệ gan trên mô hình chuột

bị gây độc gan bằng ethanol cũng cho thấy Me rừng làm cải thiện các thông số như ASAT, ALAT huyết thanh đồng thời làm tăng hoạt độ enzym bảo vệ gan như GSH, SOD, GPx và CAT [13], [22], [75]

1.3.1.3 Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của Me rừng trên một số mô hình gây độc

gan bằng các tác nhân khác

Nghiên cứu của S A Tasduq và cộng sự tiến hành đánh giá tác dụng bảo vệ gan của cao chiết quả Me rừng với 50% hydroalcoholic trên mô hình thực nghiệm gây độc gan bằng thuốc kháng lao, cao chiết quả Me rừng được thử với một nồng độ 100 mg/kg

và dùng hàng ngày với thuốc kháng lao trong thời gian 30 ngày Kết quả cho thấy rằng cao chiết quả Me rừng với 50% hydroalcoholic có tác dụng chống lại độc tính do thuốc kháng lao gây ra [94] Các hoạt tính bảo vệ gan của cao chiết quả Me rừng có thể do khả năng chống oxy hóa, ổn định màng và khả năng ức chế Cytochrom P450 Bên cạnh đó, nghiên cứu của H.L Vidhya Malar và cộng sự về tác dụng bảo vệ gan của cao chiết nước từ quả Me rừng trên mô hình gây độc gan bằng paracetamol cũng cho kết quả tương tự [33] Với liều thử cao chiết quả Me rừng là 100-200 mg/kg hàng ngày được sử trước 4 giờ sử dụng paracetamol 2 g/kg đường uống trong thời gian 14 ngày liên tục, kết quả cho thấy với mức liều cao chiết quả Me rừng là 200 mg/kg làm cải thiện mô bệnh học của tế bào gan bị tổn thương hơn so với mức liều cao chiết quả Me rừng 100 mg/kg Ngoài ra, dịch chiết quả Me rừng cũng có tác dụng làm giảm tổn thương gan do N -nitrosodiethylamin, asernic gây ra thông qua tăng cường các chất chống oxy hóa, chống viêm, ngăn chu trình tự chết của tế bào, và ngăn quá trình tự thực bào [16] Gần đây, Cheng-Ze Huang và cộng sự cũng đã tiến hành đánh giá tác dụng của cao chiết quả Me

rừng trên mô hình in vivo ở chuột bị gây độc gan bằng chế độ ăn giàu chất béo Kết quả

cho thấy cao chiết quả Me rừng có tác dụng làm giảm cân nặng, giảm mỡ máu đồng thời tăng cường hoạt động chống oxy hóa, cải thiện bệnh gan nhiễm mỡ thông qua adiponectin ở tế bào mô mỡ và PPAR-α trong gan cũng như làm giảm yếu tố biểu hiện SREBP-1 ở tế bào gan của chuột được ăn chế độ giàu chất béo [37]

1.3.2 Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của Me rừng in vitro

Stress oxy hóa đóng vai trò quan trọng trong cơ chế hình thành bệnh lý về gan Stress oxy hóa tạo nên các gốc oxy phản ứng như anion superoxid (O2∙-), gốc perhydroxy (HOO-) và gốc hydroxyl (OH·) Các gốc này được hình thành bởi một quá trình khử một electron của oxy phân tử ROS có thể dễ dàng bắt đầu quá trình peroxy hóa lipid của màng tế bào gan, gây tổn thương màng phospholipids của tế bào, tạo nên

một chu kỳ phản ứng dây chuyền, dẫn đến gây tổn thương tế bào gan [51] Đã có một

số nghiên cứu in vitro đánh giá khả năng bảo vệ tế bào gan của cao chiết quả Me rừng

thông qua tăng cường hệ thống ngăn chặn stress oxy hóa, giảm hình thành gốc tự do Kết quả nghiên cứu của Kumaran A và cộng sự cho thấy dịch chiết methanol của quả

Me rừng có hoạt tính thu dọn gốc tự do DPPH, O2∙-; OH∙; NO [46] Đặc biệt, với cao định chuẩn quả Me rừng được sử dụng trong nghiên cứu đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào gan hiện tại, đã được chứng minh có hiệu quả thu dọn gốc tự do DPPH, O2∙- trước khi tiến đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào gan Khả năng thu dọn gốc tự do DPPH và O2∙- của cao định chuẩn quả Me rừng có IC50 lần lượt là 4,929 µM (khoảng tin cậy 95% (2,376 – 10,220)); 0,909 µM (khoảng tin cậy 95% (0,651 – 1,270)) [3] Thêm vào đó, Mahesh Mysore và cộng sự cũng đã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của cao chiết quả Me rừng lên hệ thống oxy hóa trên tế bào HepG2 Kết quả nghiên cứu cho thấy mức nồng độ cao chiết của quả Me rừng với nước là 100 μM không gây độc tính trên tế bào HepG2 và mức nồng độ này khi ủ với tế bào HepG2 trong 24 giờ làm giảm đáng kể hàm lượng LPO (18-42%), ROS (11-29%) đồng thời làm tăng hàm lượng GSH (18-32%), hoạt độ các enzym CAT (39-50%), SOD (25-40%), GSH-Px (20-35%), GSH reductase (26-35%) trong gan so với mẫu chứng không ủ với cao chiết quả Me rừng [85]

Những năm gần đây, nghiên cứu về các hoạt chất chiết từ dược liệu có khả năng điều hòa con đường dẫn truyền tín hiệu AMPK có ý nghĩa quan trọng trong điều trị các bệnh lý về gan, bệnh béo phì, đái tháo đường, nhiễm trùng và rối loạn chuyển hóa… [31] Đã có một số nghiên cứu đánh giá tác dụng bảo vệ gan của cao chiết quả Me rừng trên các tế bào khác nhau thông qua kích hoạt AMPK Nghiên cứu của Cheng-Ze Huang

và cộng sự tiến hành các thử nghiệm nhuộm Oil Red O để đánh giá khả năng ức chế tích

tụ lipid của các mức nồng độ Me rừng khác nhau so với acid egallic đồng thời đánh giá khả năng kích hoạt AMPK và ức chế ACC của các mức nồng độ Me rừng khác nhau trên dòng tế bào ung thư gan (liver hepatocellular cells – HepG2) Kết quả cho thấy cao chiết nước từ quả Me rừng có tác dụng làm tăng biểu hiện của p-AMPK, p-ACC đồng thời làm giảm tích lũy chất béo và sản sinh gốc tự do trên dòng tế bào HepG2 bằng việc thay đổi bộc lộ gen liên quan đến quá trình tạo mỡ [17] Sau đó, nhóm nghiên cứu này cũng đã công bố một nghiên cứu mới có kết quả tương tự với nghiên cứu trước đó về

tác dụng kích hoạt AMPK trên tế bào HepG2 của cao chiết nước từ quả Me rừng [37] Bên cạnh đó, nghiên cứu của Ngamkitidechakul C và cộng sự chỉ ra rằng cao chiết quả

Me rừng kích hoạt tự chết tế bào theo chu trình trên 6 dòng tế bào ung thư, trong đó, bao gồm dòng tế bào ung thư gan HepG2 [64]

PHẦN 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu thí nghiệm

2.1.1 Hóa chất, thuốc thử

- Viên silymarin 70 mg – biệt dược Legalon® (Meda Pharma, Bỉ, số lô B1700172, hạn dùng 12/2021);

- Dung dịch ethanol (nồng độ 99,99%, Sigma, Mỹ);

- Carbon tetraclorid đạt tiêu chuẩn phân tích (Trung Quốc);

- Kit định lượng ASAT (aspartat aminotransferase), ALAT (alanin aminotransferase)

(Biosystems, Tây Ban Nha);

- Tetramethoxypropan, acid thiobarbituric, 5,5′-Dithiobis (2-nitrobenzoic acid, xanh

nitrotetrazolium clorid, xanthin oxidase (Sigma-Aldrich, Mỹ);

- Kali clorid, acid hydroclorid, acid acetic, acid sulfosalicylic, dinatri hydrophotsphat,

kali dihydrophosphat đạt tiêu chuẩn phân tích (Trung Quốc);

- Tế bào ung thư gan (liver hepatocellular cells – HepG2) (Rockwill, MD, Mỹ);

- Môi trường DMEM, trypsin (Gibco, Mỹ), FBS (Biochrom, mã hiệu S0115),

penicillin/streptomycin (Biochrom, mã hiệu A2212);

- Kháng thể p-AMPK, p-ACC, kháng thể thứ cấp chuột, kháng thể thứ cấp thỏ và

β-actin (Cell signaling, Mỹ);

- Các nguyên vật liệu và hoá chất khác: isopropanol, Oil Red O, oleic acid, 3-(4,

5-dimethyl-2-thiazolyl)-2, 5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT)… (Sigma, Mỹ);

- Các dung môi, hệ đệm dùng cho phản ứng in vitro đạt tiêu chuẩn phân tích

2.1.2 Thiết bị thí nghiệm

- Máy xét nghiệm sinh hóa bán tự động TC – 3300 Plus (Teco diagnostics, Mỹ);

- Máy nghiền dịch đồng thể (Wisestir HS-30E, Mỹ);

- Máy li tâm (Hermle Z300, Đức);

- Máy ly tâm lạnh (Centrifuge 5702R, Mỹ);

- Hệ thống máy ELISA bao gồm máy đọc khay vi tinh thể (Biotek, Hoa Kì) và máy ủ

lắc khay (Awareness, Hoa Kì);

- Cân phân tích (Shimadzu AY 220, Nhật);

- Cân kĩ thuật (Precisa-BJ610C, TE 412, Sartorius);

- Đĩa Costar 3596 (Corning, Mỹ);

- Kính hiển vi soi ngược (Canzese, Đức);

- Một số thiết bị khác sử dụng trong nghiên cứu in vitro

2.2 Đối tượng nghiên cứu

2.2.1 Dược liệu và mẫu nghiên cứu

- Dược liệu dùng trong nghiên cứu là bộ phận quả của cây Me rừng được thu hái tại

Ba Vì, Hà Nội Mẫu được giám định tên khoa học bởi Khoa Tài nguyên –Viện Dược liệu và được lưu tại khoa Hóa Thực vật –Viện Dược liệu

- Mẫu nghiên cứu là cao định chuẩn quả Me rừng được chiết hồi lưu bằng dung môi

ethanol 50%, lọc, gộp dung môi và cất thu hồi dưới áp suất giảm thu được cao thô Cao thô sau đó được loại tạp bằng than hoạt tính, dịch sau loại tạp được cất thu hồi dung môi và sấy trong tủ sấy chân không ở nhiệt độ 55-60oC trong 24 giờ, chi tiết quy trình điều chế cao khô định chuẩn đã được mô tả trong “Quy trình chiết xuất cao định chuẩn giàu hoạt chất có tác dụng bảo vệ gan từ quả Me rừng quy mô 20-50 kg nguyên liệu khô/mẻ” được ban hành hành theo quyết định số 126/QĐ-VDL ngày 15/02/2019 Cao khô định chuẩn đạt độ ẩm 4,7% và hiệu suất chiết cao 32,43%

2.2.2 Động vật thí nghiệm

Động vật thí nghiệm là chuột nhắt trắng chủng Swiss, trưởng thành, giống đực, khỏe mạnh, khối lượng 25 ± 5 g do Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương cung cấp Chuột được nuôi ổn định 5 ngày trước khi tiến hành nghiên cứu bằng thức ăn chuẩn do Viện

Vệ sinh Dịch tễ Trung ương cung cấp, uống nước tự do

2.3 Nội dung nghiên cứu

2.3.1 Đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào gan của cao định chuẩn quả Me rừng trên

mô hình in vivo

Để nghiên cứu tác dụng bảo vệ tế bào gan in vivo của Me rừng, nhóm nghiên

cứu tiến hành đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào gan của cao định chuẩn quả Me rừng với các mức liều khác nhau trên hai mô hình gây độc gan bao gồm:

- Đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào gan của cao định chuẩn quả Me rừng trên mô hình

gây độc gan cấp tính bằng CCl4.

- Đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào gan của cao định chuẩn quả Me rừng trên mô hình

gây độc gan mạn tính bằng ethanol

2.3.2 Đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào gan của cao định chuẩn quả Me rừng in vitro

Trước khi đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào gan của cao định chuẩn quả Me rừng, nhóm nghiên cứu tiến hành xác định nồng độ cao định chuẩn quả Me rừng không gây độc trên tế bào HepG2 thông qua phương pháp MTT để tiến hành các thử nghiệm sau

đó.

Đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào gan của cao định chuẩn quả Me rừng in vitro thông qua hai thử nghiệm sau:

- Đánh giá khả năng ức chế tích tụ lipid của cao định chuẩn quả Me rừng trên tế bào

HepG2 bằng thử nghiệm Oil Red O

- Đánh giá khả năng hoạt hóa AMPK và ức chế ACC trên tế bào HepG2 của cao định

chuẩn quả Me rừng bằng phương pháp Western Blot

Nội dung nghiên cứu được thể hiện trong hình 2.1