Triển khai mô hình gây độc tế bào gan bằng ethanol trên động vật thực nghiệm và áp dụng đánh giá tác dụng của me rừng

Phương pháp đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào gan của cao định chuẩn quả Me rừng trên mô hình gây độc tế bào gan cấp bằng ethanol .... Kết quả đánh giá tác dụng bảo vệ gan của cao định chu

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN THẢO HƯƠNG

TRIỂN KHAI MÔ HÌNH GÂY ĐỘC

TẾ BÀO GAN BẰNG ETHANOL TRÊN ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM VÀ

ÁP DỤNG ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG

CỦA ME RỪNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2019

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN THẢO HƯƠNG

MÃ SINH VIÊN: 1401310

TRIỂN KHAI MÔ HÌNH GÂY ĐỘC

TẾ BÀO GAN BẰNG ETHANOL

1 PGS TS Nguyễn Thùy Dương

2 ThS Ngô Thanh Hoa

Nơi thực hiện:

Bộ môn Dược lực

HÀ NỘI - 2019

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành khóa luận, em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới thầy cô,

gia đình và bạn bè – những người đã quan quan tâm, giúp đỡ, ủng hộ em trong thời gian

qua

Đầu tiên, bằng tất cả lòng kính trọng, em xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới PGS TS

Nguyễn Thùy Dương và ThS Ngô Thanh Hoa, những người thầy đã trao cơ hội cho

em thực hiện đề tài và tận tình hướng dẫn chỉ bảo em Trong quá trình thực hiện, các cô

đã theo sát, chỉ cho em những thiếu sót, đưa ra thêm lời khuyên và truyền cho em động

lực để hoàn thành đề tài

Tiếp theo, em xin gửi lời cảm ơn đến chị Nguyễn Thị Uyên – một người cộng sự,

một người tiền bối đã luôn đồng hành, giúp đỡ, động viên em trong suốt quá trình thực

hiện đề tài Những ngày tháng làm việc cùng chị giúp em học hỏi thêm được nhiều kiến

thức và rút ra được những kinh nghiệm quý báu

Em xin chân thành cảm ơn đến toàn thể thầy cô, các anh chị kĩ thuật viên, các anh

chị, các bạn đã và đang nghiên cứu tại Bộ môn Dược lực đã giúp đỡ và tạo điều kiện

thuận lợi giúp em thực hiện đề tài

Em cũng xin cảm ơn những người thầy đã tận tâm dạy dỗ em trong những năm

tháng học tập dưới mái trường Đại học Dược Hà Nội thân thương Thầy cô sẽ luôn là

những tấm gương sáng về lối sống, học tập cho các thế hệ sinh viên chúng em

Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới bạn bè đã luôn bên cạnh, sẻ chia mọi niềm

vui, nỗi buồn và đặc biệt cảm ơn gia đình đã luôn ủng hộ, tin tưởng và là chỗ dựa tinh

thần cho con trong bất cứ hoàn cảnh nào

Hà Nội, tháng 5 năm 2019

Sinh viên

Trần Thảo Hương

MỤC LỤC DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

TỔNG QUAN 3

1.1 Bệnh gan do rượu 3

1.1.1 Định nghĩa 3

1.1.2 Dịch tễ 3

1.1.3 Cơ chế bệnh sinh của bệnh gan do rượu 3

1.1.4 Các giai đoạn của bệnh gan do rượu 6

1.1.5 Điều trị bệnh gan do rượu 7

1.2 Các mô hình gây độc tế bào gan bằng ethanol trên thực nghiệm 8

1.2.1 Mô hình gây độc tế bào gan cấp bằng ethanol 8

1.2.2 Mô hình gây độc tế bào gan mạn bằng ethanol 11

1.3 Thông tin về dược liệu Me rừng 14

1.3.1 Đặc điểm thực vật 14

1.3.2 Phân bố và bộ phận dùng 14

1.3.3 Thành phần hóa học của Me rừng 15

1.3.4 Tác dụng dược lý của Me rừng 15

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị nghiên cứu 18

2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu 18

2.1.2 Động vật thí nghiệm 19

2.1.3 Hóa chất, thuốc thử, thiết bị nghiên cứu 19

2.2 Nội dung và thiết kế nghiên cứu 19

2.3 Phương pháp nghiên cứu 20

2.3.1 Phương pháp triển khai mô hình gây độc tế bào gan cấp bằng ethanol 20

2.3.2 Phương pháp triển khai mô hình gây độc tế bào gan mạn bằng ethanol 21

2.3.3 Phương pháp đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào gan của cao định chuẩn quả Me rừng trên mô hình gây độc tế bào gan cấp bằng ethanol 22

2.3.4 Phương pháp xác định các thông số nghiên cứu 24

2.4 Phương pháp xử lý số liệu 28

KẾT QUẢ 29

3.1 Kết quả triển khai mô hình gây độc tế bào gan bằng ethanol 29

3.1.1 Kết quả triển khai mô hình gây độc tế bào gan cấp bằng ethanol 29

3.1.2 Kết quả triển khai mô hình gây độc tế bào gan mạn bằng ethanol 32

3.2 Kết quả đánh giá tác dụng bảo vệ gan của cao định chuẩn quả Me rừng trên mô hình gây độc tế bào gan cấp bằng ethanol 35

3.2.1 Ảnh hưởng của cao định chuẩn quả Me rừng đến hoạt độ ASAT và ALAT huyết thanh trên mô hình gây độc tế bào gan cấp bằng ethanol 35

3.2.2 Ảnh hưởng của cao định chuẩn quả Me rừng đến hàm lượng MDA trong gan trên mô hình gây độc tế bào gan cấp bằng ethanol 37

3.2.3 Ảnh hưởng của cao định chuẩn quả Me rừng đến hàm lượng GSH trong gan trên mô hình gây độc tế bào gan cấp bằng ethanol 38

3.2.4 Ảnh hưởng của cao định chuẩn quả Me rừng đến hàm lượng SOD trong gan trên mô hình gây độc tế bào gan cấp bằng ethanol 39

3.2.5 Ảnh hưởng của cao định chuẩn quả Me rừng đến hình ảnh vi thể gan trên mô hình gây độc tế bào gan cấp bằng ethanol 40

BÀN LUẬN 42

4.1 .Về triển khai mô hình gây độc tế bào gan cấp bằng ethanol 42

4.2 Về triển khai mô hình gây độc tế bào gan mạn bằng ethanol 45

4.3 Về đánh giá tác dụng bảo vệ gan của cao định chuẩn quả Me rừng trên mô hình gây độc tế bào gan cấp bằng ethanol 47

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

ALAT Alanin aminotransferase

ASAT Aspartat transaminase

TNF-α Tumor necrosis factor alpha

DANH MỤC CÁC BẢNG

1 Bảng 1.1 Một số điều kiện tiến hành mô hình gây độc tế

2 Bảng 3.1

Ảnh hưởng của ethanol đến hàm lượng MDA, GSH, SOD trong gan trên mô hình gây độc tế bào gan cấp

30

3 Bảng 3.2 Ảnh hưởng của ethanol đến hình ảnh vi thể gan

trên mô hình gây độc tế bào gan cấp 31

4 Bảng 3.3

Ảnh hưởng của ethanol đến hàm lượng MDA, GSH, SOD trong gan trên mô hình gây độc tế bào gan mạn

33

5 Bảng 3.4 Ảnh hưởng của ethanol đến hình ảnh vi thể gan

6 Bảng 3.5

Ảnh hưởng của cao định chuẩn quả me rừng đến hình ảnh vi thể gan trên mô hình gây độc tế bào gan cấp

40

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ

1 Hình 1.1 Ba con đường chuyển hóa ethanol trong gan 4

2 Hình 1.2 Cơ chế hình thành bệnh gan do rượu 6

4 Hình 2.2 Thiết kế nghiên cứu triển khai mô hình gây độc tế bào

23

7 Hình 2.5 Phản ứng tạo phức giữa MDA và TBA 24

8 Hình 2.6 Phản ứng tạo phức giữa GSH và DTNB 25

9 Hình 2.7 Sơ đồ phản ứng khử của anion superoxid và NBT 27

10 Hình 3.1 Ảnh hưởng của ethanol đến hoạt độ ASAT và ALAT

trong huyết thanh trên mô hình gây độc tế bào gan cấp 29

11 Hình 3.2 Ảnh hưởng của ethanol đến hoạt độ ASAT và ALAT

trong huyết thanh trên mô hình gây độc tế bào gan mạn 32

37

14 Hình 3.5

Ảnh hưởng của cao định chuẩn quả Me rừng đến hàm lượng GSH trong gan trên mô hình gây độc tế bào gan cấp bằng ethanol

38

15 Hình 3.6

Ảnh hưởng của cao định chuẩn quả Me rừng đến hàm lượng SOD trong gan trên mô hình gây độc tế bào gan cấp bằng ethanol

39

ĐẶT VẤN ĐỀ

Rượu là nguyên nhân phổ biến nhất gây ra bệnh gan mạn tính trên thế giới và dẫn đến hơn 50% ca tiến triển xơ gan tử vong, 4-25% ca tiến triển ung thư gan… [10] Đi cùng với sự phát trển của nền kinh tế, mức độ tiêu thụ rượu gia tăng ở các nước châu Á làm tăng tỷ lệ mắc bệnh gan do rượu Bệnh gan do rượu bao gồm các thay đổi bệnh lý

từ nhiễm mỡ đến viêm gan và xơ gan liên quan đến việc sử dụng rượu [44] Mặc dù bệnh gan do rượu gây ra những ảnh hưởng lớn đối với sức khỏe và gánh nặng bệnh tật cho toàn xã hội nhưng phương pháp điều trị vẫn còn hạn chế Do đó, trong những năm gần đây, các hướng nghiên cứu về các dược liệu có tác dụng điều trị bệnh gan do rượu ngày càng phát triển [24]

Dựa trên kinh nghiệm dân gian, nhiều dược liệu đã được đưa vào đánh giá tác dụng trong điều trị bệnh gan do rượu và thu được những kết quả khả quan như: sắn dây

(Pueraria lobate), nghệ (Curcuma longa), giần sàng (Cnidium monnieri), me rừng (Phyllanthus emblica)… [17], [24], [77] Đặc biệt, me rừng là nguồn dược liệu quan

trọng và đã có nhiều nghiên cứu đánh giá tác dụng bảo vệ gan trên các mô hình sử dụng các tác nhân khác nhau: ethanol, carbon tetrachlorid (CCl4), paracetamol, arsen, cadmium [17], [18], [33], [62], [77] Ở Việt Nam, me rừng là loài cây phân bố rộng khắp và sử dụng phổ biến trong dân gian để điều trị bệnh gan do rượu song chưa có nghiên cứu đầy đủ nhằm đánh giá tác dụng bảo vệ gan của me rừng đối với tổn thương

do rượu

Để bước đầu đánh giá hiệu quả của me rừng cũng như các dược liệu tiềm năng trong điều trị bệnh gan do rượu, trước tiên cần xây dựng được mô hình động vật thực nghiệm tin cậy, mô phỏng được bệnh gan do rượu ở người và phù hợp với điều kiện của Việt Nam Trên thế giới, mô hình gây độc tế bào gan bằng ethanol đã được triển khai khá phổ biến Tuy nhiên, giữa các nghiên cứu vẫn còn tồn tại một số điểm chưa thống nhất và các kết quả đã ghi nhận có sự khác biệt Liều và thời gian gây độc là 2 yếu tố chính ảnh hưởng đến các thông số phản ánh mức độ tổn thương gan [28], [51], [86] Bên cạnh đó, đường dùng ảnh hưởng đến khả năng hấp thu của ethanol cũng như thay đổi nồng độ ethanol trong máu làm ảnh hưởng đến mức độ tổn thương gan Trong các mô hình gây độc tế bào gan bằng ethanol, thời điểm lấy mẫu cũng ảnh hưởng đến các thông

số đánh giá mức độ tổn thương gan [15] Ở Việt Nam, các nghiên cứu liên quan đến mô hình gây tổn thương gan bằng ethanol còn tương đối ít Do đó, chúng tôi tiến hành

nghiên cứu “Triển khai mô hình gây độc tế bào gan bằng ethanol trên động vật thực nghiệm và áp dụng đánh giá tác dụng của me rừng” với 2 mục tiêu như sau:

1 Triển khai mô hình gây độc tế bào gan cấp và mạn bằng ethanol trên động vật thực nghiệm

2 Đánh giá tác dụng bảo vệ gan của cao định chuẩn quả Me rừng Phyllanthus emblica L trên mô hình gây độc tế bào gan cấp bằng ethanol

TỔNG QUAN 1.1 Bệnh gan do rượu

1.1.2 Dịch tễ

Rượu là nguyên nhân dẫn đến hơn 200 bệnh và các loại tổn thương Trong đó, bệnh gan do rượu chiếm tỷ lệ cao, đặc biệt là xơ gan [78] Nguy cơ mắc bệnh khác nhau phụ thuộc vào nhiều yếu tố như tuổi, giới tính, yếu tố di truyền, bệnh mắc kèm, lối sống

và mức độ tiêu thụ rượu [16], [47], [49] Bệnh gan do rượu thường gặp ở người từ 45-64 tuổi [49] Giới nữ dễ bị tổn thương gan do rượu và nguy cơ mắc bệnh gan do rượu gấp

2 lần ở nam giới Tuy nhiên, trên thực tế lượng rượu tiêu thụ ở nam giới nhiều hơn ở nữ nên tỷ lệ bệnh gan do rượu ở nam gấp 9 lần ở nữ [16], [47] Nguy cơ mắc bệnh gan do rượu tăng ở những người gốc Tây Ban Nha có kiểu gen PNPLA3 (patatin like phospholipase domain–containing protein 3) [16], [64], [71] Người béo phì và có chế

độ ăn giàu chất béo có nguy cơ cao mắc bệnh gan do rượu Ngoài ra, lượng rượu tiêu thụ là yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến sự phát triển bệnh gan do rượu Ở nam, tiêu thụ 40-60g ethanol/ngày gây ra gan nhiễm mỡ, tiêu thụ 160g ethanol/ngày trong 10-20 năm dẫn đến viêm gan và xơ gan do rượu [47] Các bệnh mắc kèm: viêm gan B, C; gan nhiễm mỡ không do rượu sẽ đẩy nhanh tiến triển của bệnh gan do rượu Ở người mắc viêm gan C, lạm dụng rượu làm tăng 30 lần nguy cơ tiến triển thành xơ gan [64]

Ở Việt Nam chưa có nghiên cứu về tỷ lệ mắc bệnh gan do rượu Tuy nhiên, theo báo cáo của WHO năm 2014, mức độ tiêu thụ rượu ở Việt Nam tương đối cao 7,2 lít/người/năm [83] Năm 2012, ước tính có khoảng 71,7% xơ gan ở nam và 33,7% xơ gan ở nữ liên quan đến rượu bia [2]

1.1.3 Cơ chế bệnh sinh của bệnh gan do rượu

Từ nhiều thập kỷ trước, cơ chế bệnh sinh của bệnh gan do rượu đã được nghiên cứu song quan điểm của các tác giả chưa có sự thống nhất với nhau Trong giai đoạn đầu, có quan điểm cho rằng ethanol không gây độc trực tiếp đối với tế bào gan mà

nguyên nhân chủ yếu là do rối loạn chế độ ăn uống và suy dinh dưỡng Năm 1973, lần đầu tiên Rubin và Lieber đã chứng minh ethanol gây tổn thương trực tiếp tế bào gan dựa trên mô hình gây độc gan bằng ethanol ở khỉ đầu chó với chế độ ăn uống dinh dưỡng đầy đủ Kể từ đó, nhiều nghiên cứu đã cho thấy quá trình chuyển hóa ethanol gây stress oxy hóa, thiếu oxy cho tế bào gan đồng thời kích hoạt tế bào Kupffer, đại thực bào sản xuất các cytokin gây viêm [73]

1.1.3.1 Tăng sản xuất các gốc tự do và gây stress oxy hóa

Ethanol được hấp thu một phần bởi dạ dày và chủ yếu tại ruột non, sau đó được chuyển đến gan qua tĩnh mạch cửa [73] Tại gan, 70% lượng ethanol hấp thu được chuyển hóa thông qua 3 hệ thống enzym được mô tả trong hình 1.1 [55], [73]

Hình 1.1 Ba con đường chuyển hóa ethanol trong gan

- Alcohol dehydrogenase (ADH): ethanol được chuyển hóa bởi ADH và coenzym NAD+ trong bào tương thành acetaldehyd và NADH

- Cytocrom P450 2E1 (CYP2E1): CYP2E1 chuyển hóa ethanol thành acetaldehyd đồng thời tạo ra các gốc oxy tự do hoạt động (ROS) như gốc hydroxyethyl (gốc tự do của ethanol), superoxid anion (O2-), gốc hydroxyl (·OH)

- Catalase: chuyển hóa ethanol bằng cách sử dụng H2O2 để oxy hóa ethanol thành acetaldehyd

Trong đó, ADH và CYP2E1 là 2 enzym chính xúc tác cho quá trình chuyển hóa ethanol trong gan, chuyển hóa qua catalase là con đường nhỏ để chuyển hóa ethanol trong gan Hiệu quả xúc tác của CYP2E1 chậm hơn so với ADH Tuy nhiên, ở những người nghiện rượu, hoạt tính của enzym CYP2E1 tăng mạnh và trở thành con đường chuyển hóa ethanol chính [55] Dưới xúc tác của ADH, CYP2E1, catalase, ethanol chuyển thành acetaldehyd Acetaldehyd là chất có khả năng phản ứng và độc tính cao,

có thể liên kết cộng hóa trị với protein, lipid, acid nucleic sau đó phá vỡ cấu trúc và chức năng của các đại phân tử này Để giảm độc tính, tế bào gan oxy hóa acetaldehyd bằng enzym aldehyd dehydrogenase (ALDH) thành acetat và NADH [55], [73]

Kết quả của quá trình chuyển hóa ethanol làm giảm tỉ lệ NAD+/NADH trong bào tương và ty thể dẫn đến kích hoạt tế bào gan tăng sản xuất ROS [73] Đồng thời, quá trình chuyển hóa ethanol thành acetaldehyd qua CYP2E1 cũng tạo ra một lượng ROS làm trầm trọng hơn tình trạng quá tải ROS, hệ thống cân bằng giữa ROS/chất chống oxy hóa bị phá vỡ gây stress oxy hóa [84] ROS gây tổn thương tế bào gan bằng cách làm thay đổi trình tự ADN, gây peroxy hóa lipid dẫn đến phá hủy màng sinh học, rối loạn ty thể và ức chế quá trình β oxy hóa trong ty thể làm tích tụ acid béo trong tế bào gan, phát triển gan nhiễm mỡ [73]

1.1.3.3 Tăng sản xuất các cytokin

Việc sử dụng ethanol làm thay đổi hệ vi sinh đường ruột dẫn đến tăng sản xuất nội độc tố lypopolysaccarid Nội độc tố này được vận chuyển đến gan và kích hoạt tế bào Kupffer và đại thực bào tiết ra nhiều các cytokin gây viêm, như TNF-α, interleukin-

6 (IL-6) , thay đổi yếu tố tăng trưởng β, thúc đẩy hơn nữa viêm gan [48] TNF-α là chất cảm ứng tế bào chết theo chu trình (apotosis) đồng thời đóng vai trò quan trọng kích thích sự trưởng thành của yếu tố điều hòa sterol gắn protein-1 (SREBP1- sterol regulatory element binding protein-1) trong tế bào gan người, làm tăng tổng hợp lipid trong gan Vai trò của IL-6 chưa rõ ràng: có nghiên cứu cho rằng IL-6 thúc đẩy quá trình phát triển gan nhiễm mỡ nhưng cũng có nghiên cứu đưa ra IL-6 giúp tái tạo tế bào gan

và phục hồi tổn thương gan cấp tính và bệnh gan do rượu Ngoài ra, các cytokin và lypopolysaccarid cũng kích hoạt các tế bào hình sao ở gan sản suất collagen và sợi actin

cơ trơn làm phát triển xơ hóa [73]

Cơ chế hình thành bệnh gan do rượu được thể hiện hình 1.2 [73] (trang bên)

Hình 1.2 Cơ chế hình thành bệnh gan do rượu 1.1.4 Các giai đoạn của bệnh gan do rượu

Tổn thương gan do rượu thay đổi từ gan nhiễm mỡ đơn giản đến xơ gan và được phân thành ba giai đoạn: gan nhiễm mỡ, viêm gan và xơ gan Đây không nhất thiết là các giai đoạn phát triển khác nhau của bệnh, các giai đoạn có thể xuất hiện đồng thời [54]

 Gan nhiễm mỡ

Gan nhiễm mỡ là giai đoạn sớm nhất và phổ biến nhất của bệnh gan do rượu Gan nhiễm mỡ đặc trưng bởi sự lắng đọng chất béo (triglycerid, phospholipid, cholesterol ester) trong tế bào gan, chủ yếu là lắng đọng triglycerid [13], [76] Sự tích lũy chất béo tạo thành các hạt có kích thước khác nhau: từ hạt nhỏ đến u hạt mỡ Gan nhiễm mỡ thường không có triệu chứng và có thể hoàn toàn hồi phục sau khi kiêng rượu Tuy nhiên, trong một số trường hợp có thể xuất hiện các triệu chứng không đặc hiệu như đầy bụng, mệt mỏi, buồn nôn, chán ăn và nôn [50], [71] Ở bệnh nhân gan nhiễm mỡ, ASAT, ALAT và glutamyl transpeptidase thường tăng nhẹ, kèm theo tăng triglycerid và bilirubin [47]

 Viêm gan

Bệnh nhân mắc viêm gan thường có các triệu chứng sau: trướng bụng, sốt, vàng

da Trong trường hợp viêm gan do rượu ở mức độ nặng sẽ xuất hiện các triệu chứng: cổ

Bệnh gan do rượu (nhiễm mỡ, viêm gan, xơ hóa)

chướng, lách to, yếu cơ, bệnh não gan và xuất huyết tiêu hóa [50] Đặc điểm mô học đặc trưng của viêm gan do rượu bao gồm nhiễm mỡ, thâm nhiễm tiểu thùy của bạch cầu đa nhân trung tính trong tế bào gan bị phá hủy, ứ đọng bilirubin [71] Đối với bệnh nhân viêm gan, ASAT và ALAT thường tăng cao từ 2-7 lần [47] trong đó ASAT tăng cao hơn so với ALAT, tỷ lệ ASAT/ALAT thường lớn hơn 2 [50]

 Xơ gan

Sử dụng rượu mạn tính có thể tạo ra xơ hóa và có thể kèm theo hoại tử Xơ hóa có thể ở trung tâm tiểu thùy, quanh tế bào, hoặc quanh tĩnh mạch cửa Khi xơ hóa đến một mức độ nhất định sẽ phá vỡ cấu trúc gan bình thường và thay bằng nốt tái sinh [11] Khám thực thể phát hiện gan to và cứng, bề mặt có nốt Xơ gan có 2 giai đoạn: xơ gan còn bù và xơ gan mất bù Triệu chứng thường thấy ở xơ gan còn bù xuất hiện là chán

ăn, buồn nôn, sụt cân, mệt mỏi Giai đoạn xơ gan mất bù xuất hiện các triệu chứng: vàng

da, ngứa, phù, cổ chướng, dễ bầm tím, chảy máu, sao mạch, ban đỏ lòng bàn tay [50]

1.1.5 Điều trị bệnh gan do rượu

- Kiêng rượu hoàn toàn là nền tảng trong điều trị bệnh gan do rượu, giúp cải thiện

và có thể đảo ngược các tổn thương mô bệnh học [47] Suy dinh dưỡng thường phổ biến nên cần xem xét để bổ sung đủ lượng calo Vitamin B1 và các vitamin nhóm B khác cũng cần được chú ý bổ sung [71]

- Glucocorticoid: cơ chế bệnh gan do rượu liên quan đến việc giải phóng cytokin

và duy trì tổn thương bằng các quá trình miễn dịch, vì thế glucocorticoid thường được

sử dụng trong điều trị Có thể dùng prednison 40 mg/ngày hoặc prednisolon 32 mg/ngày trong 4 tuần [11], [47]

- Kháng TNF-α, pentoxifyllin đã được chứng minh có hiệu quả trong điều trị viêm gan do rượu nặng, chủ yếu làm giảm hội chứng gan thận [47], làm giảm TNF-α và các cytokin tiền viêm khác

- N-acetylcystein phục hồi glutathion do đó hạn chế stress oxy hóa [78]

- Ghép gan được chỉ định cho bệnh nhân xơ gan giai đoạn cuối [11]

- Sylimarin ức chế quá trình peroxy hóa lipid và dọn các gốc tự do làm giảm stress oxy hóa Trong một thử nghiệm, silymarin được sử dụng với liều 140mg, 3 lần/ngày ở bệnh nhân xơ gan làm giảm tỷ lệ tử vong so với nhóm giả dược [64]

1.2 Các mô hình gây độc tế bào gan bằng ethanol trên thực nghiệm

Trong nhiều thập kỷ qua, các mô hình gây độc tế bảo gan bằng ethanol trên động vật thực nghiệm đã được nghiên cứu để mô phỏng lại cơ chế bệnh sinh của bệnh gan do rượu ở người đồng thời phát triển các chiến lược mới trong điều trị bệnh gan do rượu [40] Ở các công bố trước đây, một số loài động vật đã được đưa vào nghiên cứu như: linh trưởng, heo đẹt (minipig), động vật gặm nhấm Trong đó, linh trưởng có các đặc điểm giống với người nhất nhưng do khối lượng cơ thể lớn, chi phí quá cao làm giảm tính khả thi của mô hình này Vấn đề chi phí cũng lặp lại tương tự đối với minipig Chính

vì vậy, động vật gặm nhấm thường được sử dụng trong hầu hết các mô hình Động vật

bị gây độc bằng ethanol có thể dùng các đường như: đường uống, hô hấp, tiêm tĩnh mạch, tiêm màng bụng Trong đó, đường uống thường được sử dụng trong các mô hình gây độc tế bào gan do ethanol [9]

1.2.1 Mô hình gây độc tế bào gan cấp bằng ethanol

Thời gian tiến hành đối với mô hình gây độc tế bào gan cấp, động vật thường được

cho dùng ethanol trong khoảng thời gian dưới 72 giờ

Đường dùng, liều dùng, thời điểm lấy mẫu có sự khác nhau giữa các nghiên cứu

Đường uống và đường tiêm tĩnh mạch đã được sử dụng trong các mô hình gây độc gan cấp bằng ethanol So với đường tiêm tĩnh mạch, đường uống dễ áp dụng và được sử dụng phổ biến hơn [28], [86] Liều ethanol thường từ 4-6g/kg cân nặng [51], có thể dùng đơn liều hoặc đa liều lặp lại cách nhau mỗi 12 giờ hoặc 24 giờ [28], [86] Mô hình sử dụng 3 liều ethanol cách nhau mỗi 12 giờ được lựa chọn nhiều nhất [5], [21], [28], [90] Tuy nhiên, trong một nghiên cứu, chuột được truyền ethanol với liều 250-300 mg/kg/giờ trong 12 giờ và sau đó là 1 liều 1.75g/kg tiêm tĩnh mạch Có nhiều thời điểm lấy mẫu

để định lượng các thông số là 2 giờ, 4 giờ, 6 giờ, 9 giờ, 12 giờ sau liều gây độc cuối cùng Đa số các nghiên cứu tiến hành lấy mấu để định lượng sau 4 giờ hoặc 6 giờ [37], [81], [87], [91], [92]

Carson and Pruett tiến hành thử nghiệm trên chuột nhắt với 1 liều 7g/kg ethanol 32%, hoạt độ ALAT trong huyết thanh thay đổi qua các thời điểm: sau 4 giờ là 116 U/L, sau 12 giờ là 74 U/L, sau 24 giờ là 31 U/L, sau 72 giờ là 32 U/L Như vậy, 4 giờ sau khi cho uống 1 liều ethanol, nồng độ ALAT huyết thanh đạt cao nhất [15]

Đặc điểm của mô hình này tạo được nồng độ ethanol trong máu cao, gây stress oxy

hóa, phản ứng viêm, làm suy giảm chức năng của ty thể Gan phải chuyển hóa nhiều

ethanol, gây tiêu thụ nhiều oxy dẫn đến thiếu oxy ở vùng trung tâm tiểu thùy, thay đổi quá trình chuyển hóa của glucose/lipid, kích hoạt tế bào Kupffer sản xuất cytokin, prostaglandin và gây tổn thương tế bào gan [51], [86]

Một số điều kiện tiến hành mô hình gây độc tế bào gan cấp bằng ethanol trong các

nghiên cứu trong và ngoài nước được trình bày trong bảng 1.1 dưới đây

Bảng 1.1 Một số điều kiện tiến hành mô hình gây độc gan cấp bằng ethanol

6 giờ - Nồng độ Ethanol trong máu,

ASAT, ALAT huyết thanh;

9 giờ - ASAT, ALAT, TG huyết thanh;

- MDA, GSH, SOD, GSH-Px, catalase trong gan;

- Tiêu bản mô bệnh học

2018, Rui

Liu, [46]

1 liều 7g/kg, Ethanol 50%;

chuột nhịn đói sau khi uống EtOH

16 giờ - ASAT, ALAT, cholesterol, TG,

HDL, LDL huyết thanh;

- MDA, GSH, GSH-Px, SOD, cytokin trong gan;

9 giờ - ALAT huyết thanh;

- MDA trong gan;

4 giờ - ALAT huyết thanh;

- MDA, GSH, TG, hoạt tính CYP2E1, TNF-α trong gan;

- Tiêu bản mô bệnh học

2007,

Sheng-Lei

Yan, [88]

3 liều 5g/kg, cách nhau mỗi 12 giờ, EtOH 25%

4 giờ - ASAT, ALAT, cytokin, CRP

huyết thanh;

- MDA, GSSH, GSH-Px, ROS, hoạt tính CYP2E1 trong gan

2012, Irina

Kirpich,

[35]

3 liều EtOH 4,5g/kg cách nhau mỗi 12 giờ

4 giờ - ALAT huyết thanh;

4giờ - ASAT, ALAT huyết thanh;

- MDA, GSH trong gan;

- Tiêu bản mô bệnh học

2014, Seval

Develi, [21]

3 liều 5g/kg, cách nhau mỗi 12 giờ, EtOH 40%

6giờ - ASAT, ALAT huyết thanh;

- MDA, SOD, GSH, GSH-Px trong gan;

Chưa rõ - ASAT, ALAT huyết thanh;

- MDA, GSH trong gan;

12giờ - ASAT, ALAT, TG huyết thanh;

- MDA, SOD, GSH, TG trong gan;

4giờ - Nồng độ EtOH, ASAT, ALAT,

CRP, BUN, creatinin huyết thanh;

- ROS, GSSH, GSH-Px, cytokin, hoạt tính CYP2E1 và ADH trong gan;

1.2.2 Mô hình gây độc tế bào gan mạn bằng ethanol

Song song với mô hình gây độc tế bào gan cấp bằng ethanol, nhiều tác giả đã tiến hành mô hình gây độc tế bào gan mạn bằng ethanol

1.2.2.1 Mô hình gây độc tế bào gan mạn bằng ethanol không kết hợp liều cao ethanol

 Uống ethanol tự do

Ở mô hình này, ethanol được đưa vào trong nước uống với các nồng độ khác nhau

từ 10% - 40% và động vật uống nước có chứa ethanol theo nhu cầu Thời gian gây độc

có thể kéo dài từ 8 tuần đến tối đa là 70 tuần [51]

Cho đến nay, mô hình này đã được triển khai và ghi nhận các kết quả khác nhau tùy thuộc vào nồng độ ethanol và thời gian gây độc Theo nghiên cứu của Bradon và cộng sự, ethanol có nồng độ từ 5-20% được cho uống trong 8 tuần và đạt được nồng độ ethanol trong máu từ 50-70 mg/dL, gan nhiễm mỡ nhẹ [14] Trong một nghiên cứu khác, chuột uống ethanol 40% trong 29 tuần cho nồng độ ethanol trong máu đạt 90 mg/dL, phát triển nhẹ gan nhiễm mỡ và xơ hóa [32]

Mô hình này đơn giản và dễ thực hiện Tuy nhiên, động vật thường có ác cảm tự nhiên với đồ uống chứa cồn dẫn đến hạn chế uống nước, gây mất nước; nồng độ ethanol đạt được trong máu thấp khó gây ra tổn thương gan đáng kể, dinh dưỡng không đầy đủ [51]

 Chế độ ăn uống lỏng có chứa ethanol

Mô hình được đưa ra lần đầu tiên vào năm 1963 do Lieber và cộng sự thực hiện Theo đó, chuột được nuôi bằng chế độ ăn lỏng tiêu chuẩn có lượng calo từ 0,6 -1 calo/ml Lượng calo do các thành phần trong thức ăn cung cấp gồm: casein (methionin, cystin) cung cấp 18% tổng lượng calo, chất béo cung cấp 35% tổng lượng calo, ngoài ra còn có các vitamin tan trong dầu (A, D, K, E), vitamin B12, khoáng chất và chất xơ Lượng ethanol thay đổi từ 0-50 g/L Thời gian gây độc khác nhau tùy loài, với chuột nhắt khoảng 4-12 tuần, chuột cống từ 1-9 tháng [40]

Năm 1975, nghiên cứu của Lieber và cộng sự tiến hành trên khỉ đầu chó với chế

độ ăn uống lỏng có chứa ethanol cho thấy tổn thương gan nghiêm trọng: viêm, xơ hóa

và xơ gan [45] Tuy nhiên, một số nghiên cứu khác tiến hành với một số loài động vật gặm nhấm trong thời gian 10 tuần hay 9 tháng chỉ xuất hiện gan nhiễm mỡ nhẹ [86]

Mô hình này khắc phục được nhược điểm về sự ác cảm tự nhiên của động vật với ethanol, lượng ethanol tiêu thụ hàng ngày khá cao từ 12-18 g/kg, nồng độ ethanol trong

máu dễ đạt được ở mức độ cao dao động từ 100-150 mg/dL Vì vậy, hoạt độ ASAT và ALAT thường tăng rõ rệt khoảng 6 lần so với bình thường Tuy nhiên, mô hình chỉ tạo

ra được tổn thương gan nhiễm mỡ nhẹ trong gan, không gây được các tổn thương nghiêm trọng khác [40], cần phải kiểm soát thành phần của chế độ ăn uống [95] Đặc biệt, chi phí nghiên cứu cao và khó áp dụng đối với các thực nghiệm trong nước do chế độ ăn này được bán dưới dạng sản phẩm thương mại có giá thành cao

 Truyền chế độ ăn uống lỏng có chứa ethanol vào dạ dày

Năm 1984, lần đầu tiên Tsukamoto đưa ra mô hình gây độc gan mạn tính bằng ethanol gây viêm và hoại tử nghiêm trọng Chuột được thực hiện thủ thuật để luồn một ống trực tiếp vào dạ dày và được truyền chế độ ăn uống lỏng có chứa ethanol với liều 16,5 g/kg/ngày [70] Mô hình này thường kết hợp với điều kiện khác: chế độ ăn giàu chất béo, cholesterol, gây độc cấp để tạo tổn thương gan nghiêm trọng [51]

Một nhóm nghiên cứu đã tiến hành truyền chế độ ăn uống uống lỏng có chứa

ethanol vào dạ dày chuột trong 30 ngày làm phát triển nặng gan nhiễm mỡ và hoại tử khu trú, tạo được nồng độ ethanol trong máu rất cao (216 mg/dL), hoạt độ ASAT, ALAT huyết thanh cũng tăng cao [79] Một nghiên cứu khác truyền chế độ ăn uống chứa ethanol và giàu chất béo vào dạ dày tạo ra xơ hóa phát triển sau 30 ngày [80]

Mô hình khắc phục nhược điểm động vật ác cảm tự nhiên với uống rượu, đạt được nồng độ cồn trong máu rất cao, gây tổn thương gan nghiêm trọng Song mô hình đòi hỏi

kĩ thuật cao, dễ gây stress cho động vật do cách đưa ethanol không sinh lý, động vật bị nhiễm trùng sau khi thực hiện thủ thuật, đường ống cần phải duy trì trong thời gian dài, chi phí tốn kém [40], [51], [86]

1.2.2.2 Mô hình gây độc tế bào gan mạn bằng ethanol kết hợp liều cao ethanol

 Uống ethanol dài ngày kết hợp liều cao ethanol

Ở mô hình này, động vật được cho uống ethanol trong nhiều ngày kèm theo liều cao ethanol cuối cùng làm tăng mức độ tổn thương tế bào gan

Trong các công bố trước đây, động vật được cho uống ethanol trong khoảng thời gian dài 4 tuần hay 6 tuần nhưng khó gây được tổn thương gan nghiêm trọng [17], [85], [96] Một nhóm nghiên cứu đã thay đổi mô hình bằng cách kết hợp giữa cho uống ethanol trong nhiều ngày với liều cao ethanol Cụ thể, chuột được cho uống ethanol 35% với liều 3g/kg/ngày trong 7 ngày đầu, ethanol 40% với liều 4g/kg/ngày trong 7 ngày tiếp theo, ethanol 52% với liều 5g/kg/ngày trong ngày cuối cùng Kết quả nghiên cứu cho

thấy hoạt độ ASAT, ALAT huyết thanh, hàm lượng TG, MDA trong gan tăng cao, hàm lượng SOD, catalase giảm nhẹ Kết quả mô bệnh học xuất hiện nhiễm mỡ trong gan [95], [98]

Mô hình tương đối đơn giản và dễ thực hiện [86], không cần điều chỉnh thành phần của chế độ ăn uống cho chuột, đặc biệt mô phỏng tốt hơn việc uống rượu ở người Do ở người, việc uống rượu thường diễn ra cấp tính trong vòng vài giờ hay vài ngày; hoặc mạn tính trong nhiều năm Song việc uống rượu của người không diễn ra một cách liên lục như mô hình sử dụng chế độ ăn uống lỏng có chứa ethanol, mô hình truyền chế độ

ăn uống lỏng chứa ethanol vào dạ dày[95]

 Chế độ ăn uống lỏng kết hợp với liều cao ethanol

Ở mô hình này chuột được nuôi bằng chế độ ăn uống lỏng trong một thời gian dài sau đó sẽ được cho uống đơn liều hoặc đa liều cao ethanol Thời gian gây độc có thể kéo dài từ 8-12 tuần [51]

Nhiều nhóm tác giả thực hiện thay đổi liều và thời gian gây độc gây ra những mức

độ tổn thương khác nhau Năm 2010, một nhóm nhiên cứu đã sử dụng chế độ ăn liquid diet có chứa 5% ethanol trong 10 ngày Ngày thứ 11, chuột được cho uống thêm 1 liều ethanol 5g/kg Nghiên cứu cho thấy nồng độ ethanol trong máu cao, tổn thương gan ở mức độ nhiễm mỡ và viêm [34] Một nghiên cứu khác tiến hành với chế độ ăn uống lỏng

có chứa nồng độ ethanol thay đổi từ 1,25-5% trong 4 tuần kết hợp với 3 liều ethanol 5g/kg mỗi 12 giờ Mô hình tạo hoạt độ ALAT tăng cao, gan nhễm mỡ nhiều, viêm và thâm nhiễm bạch cầu đa nhân trung tính [8]

Mô hình khắc phục được nhược điểm về sự ác cảm tự nhiên của động vật với rượu, tổn thương nhiều hơn so với mô hình sử dụng chế độ ăn uống lỏng có chứa ethanol Tuy nhiên, tổn thương chỉ xảy ra trong một thời gian ngắn và vẫn cần phải dùng chế độ ăn uống lỏng thương mại Chi phí nghiên cứu cao tương tự như mô hình sử dụng chế độ ăn uống lỏng chứa ethanol

 Truyền chế độ ăn uống lỏng chứa ethanol vào dạ dày kết hợp với liều cao ethanol Nhóm nghiên cứu của Tsukamoto đã thay đổi mô hình bằng cách kết hợp giữa truyền trực tiếp chế độ ăn uống lỏng có chứa ethanol vào dạ dày và liều cao ethanol Trong các nghiên cứu này, mức độ tổn thương gan thường nghiêm trọng hơn Nhóm nghiên cứu thực hiện với chế độ ăn uống lỏng có chứa ethanol (liều 27 g/kg/ngày) trong 8 tuần và từ tuần thứ 2 chuột được nhận thêm 1 liều ethanol từ 4-5 g/kg mỗi tuần

Kết quả cho thấy xuất hiện viêm gan với sự thâm nhễm của bạch cầu đa nhân trung tính kèm theo xơ hóa [42]

Mô hình này gây được mức nồng độ ethanol trong máu tương đối cao khoảng 263 mg/dL, ALT tăng cao 270 U/L, gây viêm gan có thâm nhiễm bạch cầu đa nhân trung tính [86] Tuy nhiên, mô hình vẫn có nhược điểm như đã mô tả ở mô hình truyền chế độ

ăn uống lỏng chứa ethanol vào dạ dày

1.3 Thông tin về dược liệu Me rừng

1.3.1 Đặc điểm thực vật

Me rừng còn có tên gọi khác như: dư cam tử, du cam tử, ngưu cam tử, chùm ruột

Tên khoa học là Phyllanthus emblica L (hay Embllica officinalis) thuộc họ thầu dầu

ta, có khía rất mờ, vị chua chát, ăn được, màu nâu đỏ Khi chín, quả chuyển từ màu vàng nhạt sang màu đỏ cam [1], [25]

1.3.2 Phân bố và bộ phận dùng

Cây Me rừng có nguồn gốc từ Ấn Độ - Malaysia, nhưng vùng phân bố hiện nay gồm hầu hết các nước có khí hậu nhiệt đới ở Nam Á và Đông Nam Á như: Ấn Độ, Malaysia, Lào, Campuchia, Thái Lan, Việt Nam và ở vùng Nam Trung Quốc [1], [25]

Ở Việt Nam, cây mọc phổ biến trên các đồi trọc, các bãi hoang, trong các rừng thưa, khắp các vùng núi (dưới 1000 m) và trung du thuộc nhiều tỉnh từ Bắc vào Nam, nhất là các tỉnh miền núi trung du phía Bắc Cây ưa ánh sáng, chịu được khô hạn và có thể sống trên nhiều loại đất, kể cả vùng đất đồi khô cằn, đất nhiều sỏi đá và nghèo dinh dưỡng Cây rụng lá vào mùa đông Sau mùa ra lá non mới đến mùa hoa, số lượng quả trên một cây khá nhiều, tái sinh tự nhiên bằng hạt [1]

Nhiều bộ phận của cây Me rừng như: quả, rễ, lá và vỏ cây đều được sử dụng trong dân gian để chữa bệnh Trong đó, quả là bộ phận hay được sử dụng nhất [1]

1.3.3 Thành phần hóa học của Me rừng

Me rừng đã được nghiên cứu rộng rãi trên thế giới về thành phần hóa học Trong

số các hợp chất đã được phân lập có thể chia thành các nhóm hợp chất chính sau: + Hợp chất tannin: 1,6-di-O-galloyl-β-D-glucose, 1,2,4,6-tetra-O-galloyl-β-D-glucose, acid gallic, acid chebulinic, methyl gallat, phyllacmnlicin B, phyllacmblicin C, chebulanin, corilagin, emblicanin A…[93], [94]

+ Hợp chất flavonoid: kaempferol, kaempferol3-O-β-D-glucopyranosid, dihydro- kaempferol, mericetin 3-O-α-D-rhamnosid, naringenin, lupeol…[94]

+ Các acid hữu cơ: acid aspartic, acid ellagic, acid ascorbic, acid mucic [89]

Ở Việt Nam, Me rừng đã được phân lập các thành phần hóa học gồm: quercetin, acid gallic và methyl gallat [6]

 Tác dụng bảo vệ gan

Trên thế giới, Me rừng đã được chứng minh có tác dụng bảo vệ gan trên các mô hình sử dụng tác nhân gây độc gan như ethanol [17], [18], [60], paracetamol [62], CCl4[31], [43], kim loại nặng [33], [68], ochratoxin, hexachlorocyclohexan và thuốc điều trị lao [77]

Me rừng với liều 250 mg/kg cải thiện độc tính của CCl4 trên cả mô hình gây độc cấp và mạn thông qua làm giảm hoạt độ ASAT, ALAT, ALP và hàm lượng phosphoryl acetyl-coA carboxylase trong gan [31] Với tác nhân CCl4,Chao-Ying Lee và cộng sự cũng thực hiện đánh giá tác dụng bảo vệ gan của Me rừng liều 1000 mg/kg và thu được các kết quả khả quan [43] Với tác nhân paracetamol, arsen, cadmium, Me rừng cũng thể hiện tác dụng bảo vệ gan tương tự [33], [62], [68]

Đối với tác nhân ethanol, Me rừng cũng được đánh giá tác dụng bảo vệ gan trên

cả mô hình cấp và mạn Nghiên cứu của Reddy và cộng sự đã tiến hành đánh giá tác dụng bảo vệ gan của Me rừng liều 250 mg/kg trên chuột bị gây độc bằng ethanol 20% với liều 5g/kg trong 60 ngày Kết quả cho thấy, cao chiết Me rừng làm giảm hoạt độ

ASAT, ALAT huyết thanh đồng thời tăng rõ rệt hàm lượng các chất chống oxy hóa: CAT, SOD, GSH, GSH-Px [18] Trong một nghiên cứu khác, Me rừng cũng thể hiện tác dụng bảo vệ gan rõ rệt trên mô hình tổn thương gan bằng ethanol mạn tính trong 21 ngày [60] Trên mô hình gây độc tế bào gan cấp bằng một liều 5g/kg, Me rừng cải thiện các thông số ASAT, ALAT, TG, TNF-α và IL-1β, giảm tổn thương hoại tử trên hình ảnh vi thể tế bào gan [60]

Hiện nay, Me rừng không chỉ được sử dụng trong y học cổ truyền mà các sản phẩm của me rừng còn được sử dụng phổ biến trong điều trị bổ trợ các bệnh về gan ở nhiều nước Đặc biệt, rượu là nguyên nhân chủ yếu gây ra bệnh về gan trên toàn thế giới [10]

Do vậy, Me rừng cần được đánh giá tác dụng bảo vệ gan đối trên các mô hình gây độc

tế bào gan bằng ethanol để có thể đưa Me rừng trở thành sản phẩm hỗ trợ điều trị các bệnh về gan đặc biệt bệnh gan do rượu

 Tác dụng chống oxy hóa và thu dọn gốc tự do

Trong nhiều nghiên cứu, Me rừng đã được chứng minh có tác dụng thu dọn các gốc tự do của như: DPPH, O2-, OH-, NO, ABTS, H2O2 [17], [38], [53], [57], ức chế quá trình oxy hóa LDL [38] và DNA [39] Me rừng cũng được chứng minh làm tăng các chất chống oxy hóa nội sinh: SOD, catalase, GSH-Px [61] Một số hoạt chất: acid gallic, furosin, acid ellagic, emblicanin A, emblicanin B, methyl gallat, corilagin và geraniin cũng có tác dụng thu gọn gốc tự do rất tốt [77] Ở Việt Nam, cao định chuẩn quả Me rừng đã được chứng minh hiệu quả trong việc thu dọn gốc tự do: DPPH, superoxid trên

mô hình in vitro và in vivo [4] Bên cạnh đó, nhiều nghiên cứu cũng chỉ ra quercetin,

acid gallic, corilagin và acid ellagic là các thành phần chính trong Me rừng có tác dụng bảo vệ gan dựa vào cơ chế thu dọn gốc tự do và chống oxy hóa [77]

 Tác dụng ức chế tế bào ung thư

Me rừng có tác dụng chống ung thư mạnh chủ yếu liên quan đến tanin và flavonoid [97] Cơ chế chống ung thư của Me rừng bao gồm: thu dọn các gốc tự do, giảm nồng độ omithin dercarboxylase, tăng nồng độ enzym chống oxy hóa, điều hòa miễn dịch, điều chỉnh mức protein tế bào, gây ra chết tế bào theo chu trình của các tế bào ung thư, ngăn ngừa di căn [22], [23], [58], [59] Me rừng có tác dụng ức chế giữa các dòng ung thư khác nhau như ung thư dòng tế bào biểu mô gan người HepG2, tế bào ung thư phổi

A549 trên in vitro [58], tế bào buồng trứng chuột lang [74]

 Tác dụng kháng khuẩn

Saeed và Tariq đã đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các chất chiết xuất từ quả

me rừng đối với 345 chủng vi khuẩn thuộc 6 chi khác nhau của vi khuẩn Gram âm được phân lập từ nước tiểu Kết quả cho thấy, me rừng có hoạt tính kháng khuẩn mạnh chống

lại E coli, Salmonella typhi, Salmonela paratyphi A, Salmonella B, Klebsiella pneumonia, Pseudomonas aeruginosa [65]

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị nghiên cứu

2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu

2.1.1.1 Dược liệu nghiên cứu

Dược liệu dùng trong nghiên cứu là quả của cây Me rừng được thu hái tại Ba Vì,

Hà Nội Mẫu được giám định tên khoa học bởi Khoa Tài nguyên – Viện Dược liệu và được lưu trữ tại Khoa Hóa Thực vật – Viện Dược liệu

2.1.1.2 Cao định chuẩn quả Me rừng

Sau khi thu hái, quả Me rừng được rửa sạch, sấy khô đến khối lượng không đổi và xay thô Mẫu nghiên cứu là cao khô định chuẩn quả Me rừng được chiết hồi lưu bằng dung môi ethanol 50% Sau khi chiết 3 lần với dung môi ethanol, dịch chiết được gộp lại, lọc và cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được cao thô Cao thô sau đó được loại tạp bằng than hoạt tính, dịch sau loại tạp được cất thu hồi dung môi và sấy trong tủ sấy chân không ở nhiệt độ 55-60oC trong 24 giờ thu được cao định chuẩn quả Me rừng Chi tiết quy trình điều chế cao khô định chuẩn được mô tả trong “Quy trình chiết suất cao định chuẩn giàu hoạt chất có tác dụng bảo vệ gan từ quả Me rừng quy mô 20-50 kg nguyên liệu khô/mẻ” được ban hành theo quyết định số 126/QĐ-VDL ngày 15/02/2019 Cao định chuẩn quả Me rừng đạt độ ẩm 4,7% và hiệu suất chiết cao 32,43% Mẫu cao định chuẩn quả Me rừng được cung cấp bởi nhóm nghiên cứu của PGS.TS

Đỗ Thị Hà, Khoa Hóa Thực vật – Viện Dược liệu

2.1.1.3 Mẫu thử từ cao định chuẩn quả Me rừng

Phân tán cao khô định chuẩn quả Me rừng trong nước cất đến những nồng độ thích hợp để sử dụng cho động vật uống Liều dùng được biểu diễn theo khối lượng cao khô tuyệt đối

Nhóm nghiên cứu đã thực hiện một thử nghiệm khác đánh giá tác dụng bảo vệ gan của cao khô định chuẩn Me rừng trên mô hình gây độc tế bào gan cấp bằng CCl4 Cao khô định chuẩn quả Me rừng được sàng lọc tác dụng ở 3 mức liều 500 mg/kg, 1000 mg/kg, 2000 mg/kg Kết quả cho thấy: ở cả 3 mức liều Me rừng đều có tác dụng bảo vệ gan rõ rệt song tác dụng bảo vệ gan giữa các mức liều tương tự nhau và tỏ ra không có

sự khác biệt [3] Vì vậy, trong thử nghiệm này, nhóm nghiên cứu lựa chọn hai mức liều thử là 500 mg/kg cân nặng chuột và 1000 mg/kg cân nặng chuột

2.1.3 Hóa chất, thuốc thử, thiết bị nghiên cứu

2.1.3.1 Hóa chất

- Ethanol absolute (Merk, Đức);

- Tetramethoxypropan, acid thiobarbituric, 5,5'-Dithiobis (2-nitrobenzoic acid),

xanh nitrotetrazolium chlorid, xanthin oxidase (Sigma-Aldrich, Mỹ);

- Kali chlorid, acid hydrochlorid, acid acetic, n-butanol, acid sulfosalicylic, dinatri hydrophosphat, kali dihydrophosphat (tiêu chuẩn phân tích – Trung Quốc);

- Kit định lượng ASAT (aspartate aminotransferase), ALAT (alanin aminotransferase) (Biosystems, Tây Ban Nha);

- Silymarin - Viên Legalon 70mg (Meda Pharma, Bỉ, số lô B1700172, hạn dùng 12/2021)

2.1.3.2 Thiết bị nghiên cứu

- Máy xét nghiệm sinh hóa tự động TC – 3300 Plus (Teco diagnostics, Mỹ);

- Máy nghiền dịch đồng thể (Wisestir HS-30E, Mỹ);

- Máy ly tâm lạnh (Centrifuge 5702R, Mỹ);

- Hệ thống máy ELISA bao gồm máy đọc khay vi tinh thể (Biotek, Hoa Kì) và máy

ủ lắc khay (Awareness, Hoa Kì);

- Cân phân tích (AND-GR200, Nhật);

- Cân kỹ thuật (Precisa-BJ610C, TE 412, Sartorius);

- Đĩa Costar 3596 (Corning, Mỹ)

2.2 Nội dung và thiết kế nghiên cứu

Sơ đồ thiết kế nghiên cứu được thể hiện ở hình 2.1 (trang bên)

Hình 2.1 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu tiến hành thành 2 đợt với các nội dung sau:

- Đợt 1: Triển khai mô hình gây độc tế bào gan cấp và mạn bằng ethanol

- Đợt 2: Đánh giá tác dụng bảo vệ gan của cao định chuẩn quả Me rừng trên mô hình gây độc tế bào gan cấp bằng ethanol

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp triển khai mô hình gây độc tế bào gan cấp bằng ethanol

 Thiết kế thí nghiệm

Chuột nhắt trắng được chia ngẫu nhiên vào các lô:

- Lô 1 (chứng sinh lý): uống nước hàng ngày với liều 0,1ml/10g cân nặng

- Lô 2 (chứng bệnh): uống nước với liều hàng ngày 0,1ml/10g cân nặng

- Lô 3 (chứng dương): uống silymarin hàng ngày với liều 100 mg/kg cân nặng

 Tiến hành

Vào 8 giờ sáng hàng ngày chuột được cho uống silymarin hoặc nước tương ứng với mỗi lô trong thời gian 7 ngày Vào ngày thứ 6, lô chứng bệnh và lô chứng dương uống ethanol 50% với 3 liều 5g/kg cách nhau mỗi 12 giờ Song song với quá quá trình gây độc ethanol cấp, lô chứng sinh lý uống nước với liều 0,1ml/10g cân nặng Sau 4 giờ

Triển khai mô hình gây độc tế bào gan bằng ethanol

Triển khai mô hình gây độc

tế bào gan mạn bằng ethanol

Triển khai mô hình gây độc tế bào gan cấp bằng ethanol

Đánh giá tác dụng bảo vệ gan của cao định chuẩn quả Me rừng trên mô hình gây độc tế bào gan cấp bằng ethanol

- Định lượng ASAT, ALAT trong huyết thanh

- Định lượng MDA, GSH, SOD trong gan

- Đánh giá mô bệnh học

kể từ liều ethanol cuối cùng, chuột được lấy mẫu máu từ xoang hốc mắt để xác định

ASAT, ALAT huyết thanh, mổ lấy gan để định lượng MDA, GSH, SOD và đánh giá

mô bệnh học

Sơ đồ thiết kế thí nghiệm được thể hiện trong hình 2.2

Hình 2.2 Thiết kế thí nghiệm triển khai mô hình gây độc tế bào gan cấp bằng

ethanol

 Thông số đánh giá

- Hoạt độ ASAT, ALAT huyết thanh

- Hàm lượng MDA, GSH, SOD trong gan

- Đánh giá mô bệnh học

2.3.2 Phương pháp triển khai mô hình gây độc tế bào gan mạn bằng ethanol

 Thiết kế thí nghiệm

Chuột nhắt trắng được chia ngẫu nhiên vào các lô như sau:

- Lô 1 (chứng sinh lý): uống nước hàng ngày với liều 0,1ml/10g cân nặng

- Lô 2 (chứng bệnh): uống nước hàng ngày với liều 0,1 ml/10g nặng

- Lô 3 (chứng dương): uống silymarin hàng ngày với liều 100 mg/kg cân nặng

4 giờ sau liều EtOH cuối:

- Định lượng ASAT, ALAT huyết thanh

- Định lượng MDA, GSH, SOD trong gan

 Tiến hành

Vào 8 giờ sáng hàng ngày chuột được cho uống silymarin hoặc nước tương ứng với mỗi lô trong thời gian 15 ngày Một giờ sau khi uống silymarin/nước, lô chứng bệnh

và lô chứng dương uống ethanol như sau:

- 7 ngày đầu: ethanol 35% liều 3 g/kg/ngày

- 7 ngày tiếp: ethanol 40% liều 4 g/kg/ngày

- Ngày thứ 15: ethanol 50% liều 5 g/kg/ngày

Song song với quá trình gây độc ethanol, lô chứng sinh lý uống nước với liều 0,1ml/10g cân nặng Sau 9 giờ kể từ liều ethanol cuối cùng, chuột được lấy mẫu máu từ xoang hốc mắt để xác định ASAT, ALAT huyết thanh, mổ lấy gan để định lượng MDA, GSH, SOD và đánh giá mô bệnh học

Sơ đồ thiết kế thí nghiệm được thể hiện trong hình 2.3

Hình 2.3 Thiết kế thí nghiệm triển khai mô hình gây độc tế bào gan mạn bằng

ethanol

 Thông số đánh giá: tương tự mục 2.3.1

2.3.3 Phương pháp đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào gan của cao định chuẩn quả Me rừng trên mô hình gây độc tế bào gan cấp bằng ethanol

9 giờ sau liều EtOH cuối xác định:

- Định lượng ASAT, ALAT huyết thanh

- Định lượng MDA, GSH, SOD trog gan

- Đánh giá mô bệnh học

14

7 -5

Cho uống silymarin/nước hàng ngày Nuôi thích nghi

- Lô 1 (chứng sinh lý): uống nước hàng ngày với liều 0,1 ml/10g cân nặng

- Lô 2 (chứng bệnh): uống nước hàng ngày với liều 0,1ml/10g cân nặng

- Lô 3 (chứng dương): uống silymarin với liều hàng ngày 100mg/kg cân nặng

- Lô 4 (MR500): uống cao định chuẩn quả me rừng hàng ngày với liều 500 mg/kg cân nặng

- Lô 5 (MR1000): uống cao định chuẩn quả me rừng hàng ngày với liều 1000 mg/kg cân nặng

 Tiến hành

Vào 8 giờ sáng hàng ngày chuột được cho uống thuốc hoặc nước tương ứng với mỗi lô trong thời gian 7 ngày Vào ngày thứ 6, lô chứng bệnh, lô chứng dương, lô thử uống ethanol 50% với 3 liều 5g/kg cách nhau mỗi 12 giờ, lô chứng sinh lý uống nước với liều 0,1ml/10g Sau 4 giờ kể từ liều ethanol cuối cùng, chuột được lấy mẫu máu từ xoang hốc mắt để xác định ASAT, ALAT huyết thanh, mổ lấy gan để định lượng MDA, GSH, SOD và đánh giá mô bệnh học

Sơ đồ thiết kế nghiên cứu được thể hiện trong hình 2.4

Hình 2.4 Thiết kế thí nghiệm đánh giá tác dụng bảo vệ gan của cao định chuẩn

quả Me rừng trên mô hình gây độc tế bào gan cấp bằng ethanol

 Thông số đánh giá: tương tự mục 2.3.1

4 giờ sau liều EtOH cuối:

- Định lượng ASAT, ALAT huyết thanh

- Định lượng MDA, GSH, SOD trong gan

EtOH 50% liều 5g/kg

12h 12h

2.3.4 Phương pháp xác định các thông số nghiên cứu

2.3.4.1 Xác định hoạt độ ASAT, ALAT huyết thanh

 Nguyên tắc

Hoạt độ của enzym ASAT, ALAT trong huyết thanh chuột được xác định theo

phương pháp động học enzym dựa trên phản ứng:

L-aspartat + α-cetoglutarat < -> Glutamat + Oxaloacetat

Oxaloacetat + NADH + H+ < -> L-malat + NAD+

L- alanin + α-cetoglutarat < -> Glutamat + Pyruvat

Pyruvat + NADH + H+ < -> L- lactat + NAD+

Hoạt độ ASAT, ALAT được đo bằng sự giảm nồng độ NADH ở bước sóng 340nm

theo thời gian

 Tiến hành

Hoạt độ ASAT, ALAT huyết thanh được định lượng trên máy sinh hóa bán tự động

TC 3300 Plus, sử dụng bộ kit và quy trình định lượng tương ứng từ Biosystems

 Thông số đánh giá

Hàm lượng ASAT, ALAT được tính theo đơn vị U/L

2.3.4.2 Xác định hàm lượng MDA trong gan

Hàm lượng MDA trong dịch nghiền đồng thể gan được xác định theo phương pháp

của Wojciech [82]

Nguyên tắc

Tại điều kiện nhiệt độ cao và pH thấp, malondialdehyd (MDA) phản ứng với acid

thiobarbituric (TBA) tạo thành phức màu hồng đỏ có cực đại hấp thụ tại bước sóng

532nm

Hình 2.5 thể hiện phản ứng tạo phức giữa MDA và TBA

Hình 2.5 Phản ứng tạo phức giữa MDA và TBA

ASAT MDH ALAT LDH

 Tiến hành

Mẫu gan được nghiền đồng thể trong dung dịch KCl 0,15 M theo tỷ lệ 1:10 (w/v)

ở nhiệt độ 0-4oC Sau khi ly tâm lạnh (10000 vòng/phút trong 15 phút, 0oC), lấy 150µl dịch cho vào ống thủy tinh có nắp có chứa sẵn 1ml nước và 1ml acid thiobarbituric 0,5% (pha trong dung dịch acid acetic 50%) Đun cách thủy hỗn hợp này ở nhiệt dộ 990C trong 1 giờ Sau khi để nguội về nhiệt độ phòng, thêm vào hỗn hợp phản ứng 25µl HCl 5M và chiết phức hợp màu tạo thành bằng n-butanol Tách lớp n-butanol và đo độ hấp thụ tại bước sóng 532nm

Song song với mẫu thử, tiến hành phản ứng với các mẫu chuẩn Trong đó, 150µl mẫu thử được thay thế bằng 150µl dung dịch chuẩn có chứa từ 2-8 nmol tetramethoxypropan

Trong đó: a – hàm lượng MDA có trong 150µl dịch nghiền đồng thể gan (nmol)

2.3.4.3 Xác định hàm lượng GSH trong gan

Hàm lượng GSH trong gan được xác định bằng thuốc thử Ellman [36]