BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHẠM THỊ VÂN ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI ACID SALVIANOLIC B, TANSHINON IIA BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO VÀ
TỔNG QUAN
Phương pháp định tính, định lượng bằng HPLC
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), hay còn gọi là sắc ký lỏng áp suất cao, là kỹ thuật phân tích dựa trên sự phân tách các chất trên pha tĩnh có trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng dưới áp suất cao Sắc ký lỏng HPLC hoạt động dựa trên các cơ chế phân tách như hấp phụ, phân bố và trao đổi ion, và cơ chế nào được tác động phụ thuộc vào loại pha tĩnh được sử dụng.
Trong phân tích sắc ký, các chất được hòa tan trong dung môi phù hợp và được đưa qua cột bằng một dòng chất lỏng liên tục gọi là pha động Tốc độ di chuyển của từng chất phụ thuộc vào hệ số phân bố giữa hai pha, tức là mức độ ái lực của chúng với pha tĩnh và pha động Việc điều chỉnh thành phần của pha động là cần thiết để rửa giải các chất phân tích qua cột với thời gian hợp lý [7].
Hình 1.1 Sơ đồ hệ thống HPLC
Trong đó: 1 - Bình chứa dung môi pha động
4 - Bộ phận tiêm mẫu (tiêm bằng syringe hay auto sampler)
5 - Cột sắc ký (pha tĩnh) để ngoài môi trường hay có thiết bị điều nhiệt
6 - Đầu dò detector (nhận tín hiệu)
7 - Hệ thống máy tính điện tử cài đặt phần mềm nhận tín hiệu, xử lý số liệu vàđiều khiển toàn bộ hệ thống
8 - Thiết bị in dữ liệu
1.1.2 Ứng dụng của phương pháp HPLC
Phương pháp HPLC có phạm vi ứng dụng rất rộng và đang là kỹ thuật phân tích phổ biến được ứng dụng trên nhiều lĩnh vực như thực phẩm, dược phẩm và môi trường Với độ nhạy cao, khả năng định lượng tốt và độ chính xác cao, HPLC đặc biệt phù hợp để tách các chất khó bay hơi và các chất dễ bị phân hủy nhiệt, nên được sử dụng nhiều cho mục đích sản xuất, nghiên cứu thí nghiệm và các ứng dụng pháp lý, y dược Đây là công cụ đắc lực nhất cho phép thực hiện phân tích định tính và định lượng các thành phần hóa học, hoạt chất trong dược liệu và các loại dược phẩm đa thành phần, đóng vai trò then chốt trong kiểm nghiệm thuốc và kiểm nghiệm dược liệu.
1.1.3 Định tính, định lượng đồng thời Sal-B và Tan-IIA bằng HPLC
Trong DĐVN V, hai thành phần hóa học Sal-B và Tan-IIA có trong vị dược liệu Đan sâm được định tính và định lượng độc lập bằng hai phương pháp sắc ký lớp mỏng và sắc ký lỏng Hiện chưa có phương pháp định tính và định lượng đồng thời cho hai hoạt chất Sal-B và Tan-IIA.
Hiện nay, trên thế giới đã đưa ra một số phương pháp định tính, định lượng đồng thời hai hoạt chất trên bằng HPLC, UPLC-MS [51], [69]
Bài báo “Xác định đồng thời 5 hoạt chất ưa nước và kỵ nước được chiết xuất từ rễ cây Đan sâm bằng HPLC” của Lu LL và cộng sự (2015) trình bày phương pháp định lượng năm hoạt chất gồm aldehyd protocatechuic, acid salvianolic B, tanshinon IIA, cryptotanshinone và danshensu trong rễ Đan sâm bằng HPLC ở bước sóng 281 nm; các chất được rửa giải bằng gradient nồng độ và thể hiện độ tuyến tính tốt với R^2 > 0.9990 trên một miền nồng độ tương đối rộng, cho phép phân tích định lượng nhanh, nhạy và đáng tin cậy.
Bài báo “Định lượng đồng thời các hợp chất đã chọn từ các loại thảo mộc Salvia bằng phương pháp HPLC và ứng dụng của chúng” (Hai-Ting Cheng et al., 2012) trình bày phương pháp định lượng đồng thời nhiều hợp chất hoạt tính từ Salvia bằng HPLC và ứng dụng của chúng Hàm lượng các hợp chất danshensu, aldehyd protocatechuic, acid rosemarinic, acid salvianolic B, dihydrotanshinon I, tanshinon I, cryptotanshinon và tanshinon IIA được định lượng ở các bước sóng 254 nm, 281 nm và 330 nm, với độ tuyến tính tốt R2 > 0.9994 trong một khoảng nồng độ tương đối rộng.
- Bài báo “Định lượng đồng thời 6 thành phần trong cốm “Jiang-Zhi” bằng phương pháp UPLC –MS” Hàm lượng các hoạt chất (acid salvianolic B, tanshinon
IIA, danshensu, emodin, acid chlorogenlc, nulferin) đã được xác định với độ tuyến tính tốt R 2 > 0.9992 trên các khoảng nồng độ khảo sát [68]
Đề tài “Xây dựng phương pháp định tính, định lượng cao đặc Đan sâm” của Nguyễn Lan Hương (2021) đã đồng thời định tính và định lượng hai hoạt chất acid Sal-B và Tan-IIA bằng phương pháp HPLC ở bước sóng 270 nm, với độ tuyến tính tốt R² > 0.9995 trên các khoảng nồng độ khảo sát [14].
Tổng quan về lipid máu
1.2.1 Khái niệm về lipid máu
Lipid máu là các phân tử kỵ nước, khó tan trong nước Lipid được tìm thấy trong màng tế bào, duy trì tính nguyên vẹn của tế bào và cho phép tế bào chất chia thành các ngăn tạo nên những cơ quan riêng biệt Lipid là tiền thân của một số hormone, và acid mật đóng vai trò là chất truyền tín hiệu ngoại bào và nội bào.
Lipid trong cơ thể gồm có: mô mỡ trung tính tức triglycerid, các phospholid, cholesterol và các acid bé tự do
- Cholesterol là một alcol vòng không no, là thành phần tham gia cấu tạo màng tế bào
Triglyceride là hợp chất gồm một phân tử glycerol và ba axit béo, tạo thành mỡ trung tính ở dạng dự trữ và cung cấp năng lượng cho cơ thể Ba chức năng chính của triglyceride là lưu trữ năng lượng dưới dạng mỡ trung tính và cung cấp năng lượng khi cần, cách nhiệt cho cơ thể và đóng vai trò là lớp đệm bảo vệ các cơ quan khỏi tổn thương.
Phospholipid là một phức hợp đa dạng có nhiều dạng và mang nhiều chức năng đặc thù trong sinh học tế bào, bao gồm truyền tín hiệu trong tế bào, tham gia làm giảm sức căng bề mặt và tham gia vào cấu tạo màng tế bào.
- Acid béo là những chuỗi cacbon có mạch thẳng được chia thành 2 nhóm chính: acid béo bão hòa và acid béo không bão hòa [2], [5]
Lipid không tan trong nước và máu, vì vậy chúng phải kết hợp với protein nhờ lực Van der Waals để hình thành lipoprotein Nhờ có lipoprotein, các lipid khó tan trong nước mới có thể hòa tan và được vận chuyển đến các mô trong cơ thể.
Các loại lipid máu theo kích thước:
- Chilomicron vi dưỡng chấp chứa triglycerid
- VLDL (very low density lipoprotein)
1.2.3 Con đường chuyển hóa và tác dụng của lipid trong cơ thể
Lipid là nguồn cung cấp năng lượng chính cho cơ thể, tham gia cung cấp 25%
Khoảng 30% tổng năng lượng của cơ thể đến từ lipid, và mỗi gram lipid cung cấp khoảng 9,1 kcal Lipid là nguồn dự trữ năng lượng lớn nhất của cơ thể, được lưu trữ ở dạng triglyceride trung tính trong mô mỡ Bình thường khối lượng mỡ thay đổi theo tuổi, giới và chủng tộc [5].
Quá trình chuyển hóa lipid được thực hiện qua hai chu trình chính là ngoại sinh và nội sinh Khi hai chu trình này diễn ra bình thường, cơ thể sẽ không phát sinh rối loạn lipid máu Tuy nhiên, khi các yếu tố tác động đến hai chu trình này gây dư thừa hoặc thiếu hụt, cân bằng lipid bị ảnh hưởng và dẫn đến rối loạn lipid máu [18].
Hình 1.2 Chuyển hoá lipoprotein nội và ngoại sinh
LPL: lipoprotein lipase; FFA: free fatty acids; VLDL: very low density lipoproteins; IDL: intermediate density lipoproteins; LDL: low density lipoproteins; LDLR: low-density lipoprotein receptor (Nguồn: Harisson - 2005)
Chu trình ngoại sinh của lipid bắt đầu khi lipid được đưa vào cơ thể qua đường thức ăn; một phần lipid được tiêu hóa ngay từ tá tràng nhờ tác dụng của lipase, khiến các axit béo được giải phóng ở dạng tự do và sau đó được hấp thu vào cơ thể qua đường tĩnh mạch cửa lên gan, nơi chúng tham gia vào chu trình nội sinh [4], [23].
* Chu trình nội sinh: Lipid được hấp thu vào cơ thể qua đường thức ăn và lipid được hình thành từ con đường nội sinh tại gan đều được đưa vào tuần hoàn chung bằng cách gắn với các apoprotein để tạo thành lipoprotein tỷ trọng rất thấp (VLDL) VLDL theo đường tuần hoàn tới mô mỡ tỷ trọng tăng lên và lần lượt biến thành lipoprotein tỷ trọng trung gian (IDL) đến lipoprotein tỷ trọng thấp (LDL) Sau khi trao cholesterol cho các tế bào theo nhu cầu, LDL chuyển thành lipoprotein tỷ trọng cao (HDL) [4], [23] Ở người bình thường, quá trình tổng hợp và thoái hóa lipid - lipoprotein diễn ra cân bằng và theo nhu cầu của cơ thể Do vậy, hàm lượng và tỉ lệ thành phần các loại lipoprotein, lipid trong máu được ổn định Khi mất cân bằng giữa hai quá trình này, rối loạn chuyển hóa lipid sẽ xảy ra dân đến bệnh lý rối loạn lipid máu
1.2.4 Bệnh lý rối loạn lipid máu
Theo y học hiện đại, rối loạn lipid máu (RLLPM) là tình trạng có một hoặc nhiều thông số lipid bị rối loạn, như tăng cholesterol hoặc triglyceride, hoặc tăng LDL-C, hoặc giảm HDL-C RLLPM thường được phát hiện đồng thời với nhiều bệnh lý tim mạch - nội tiết - chuyển hóa và cũng là một yếu tố nguy cơ của những bệnh này Nguyên nhân của RLLPM có thể là nguyên phát do di truyền hoặc thứ phát do phong cách sống không hợp lý Điều trị RLLPM tập trung vào thay đổi lối sống (tăng cường vận động thể lực, chế độ ăn hạn chế bia rượu và mỡ động vật) hoặc dùng thuốc hạ lipid máu Việc điều trị RLLPM góp phần vào điều trị nguyên nhân của nhiều bệnh tim mạch, nội tiết và chuyển hóa [5].
Theo Y học cổ truyền, hội chứng rối loạn lipid máu thuộc phạm vi chứng
Đàm ẩm và đàm thấp là khái niệm quan trọng trong y học cổ truyền Nguyên nhân chính gây chứng bệnh này là sự hình thành thủy, thấp, đàm ẩm trong cơ thể Thủy, thấp, đàm và ẩm được hình thành do ngoại cảm lục dâm, nội thương thất tình và ăn uống thất thường, từ đó dẫn tới sự tích tụ đàm ẩm trong cơ thể.
Thông thường, lao lực quá độ hoặc sống quá nhàn rỗi làm rối loạn chức năng của các tạng phế, tỳ, can và thận, khiến sự vận hóa thủy dịch trong cơ thể bị trở ngại và thủy dịch bị đình trệ Theo Y học cổ truyền, RLLPM là tình trạng bản hư tiêu thực; bệnh thường khởi phát chủ yếu do tạng can, tỳ, thận hư (bản hư) dẫn đến đàm thấp trở trệ và huyết ứ (tiêu thực) Vì vậy, trong quá trình điều trị cần chú ý phân biệt các biểu hiện thực hư của bệnh.
1.2.5 Hiện trạng nghiên cứu thuốc YHCT điều trị RLLPM
1.2.5.1 Các vị thuốc có tác dụng điều trị RLLPM
* Tác dụng lên các thành phần lipid của máu [17], [45]:
- Vị thuốc có tác dụng giảm cholesterol: Hà thủ ô, Đỗ tro ̣ng, Cam thảo, Bạch quả, Mô ̣t dược, Cát căn, Tang ký sinh
- Vị thuốc có tác dụng giả m triglycerid: Kim ngân hoa, Đại hoàng, Sài hồ, Linh chi, rễ Đại mạch, Thổ miết trù ng
Vị thuốc cổ truyền giúp giảm cholesterol và triglyceride, được chế tác từ sự kết hợp của Thảo quyết minh, Ngũ linh chi, Đông trùng hạ thảo, Nhân sâm, Đan sâm, Hải tảo, Sơn tra, Trạch tả và Tam thất Sự pha trộn các thảo dược này có tác dụng điều hòa lipid máu, hỗ trợ chuyển hóa chất béo và tăng cường tuần hoàn, từ đó giúp hạ mức cholesterol và triglyceride trong máu Công thức thảo dược này thường được dùng ở dạng sắc uống hoặc ngâm để chăm sóc sức khỏe tim mạch và ngăn ngừa mỡ máu cao Tuy nhiên, người dùng nên tham khảo ý kiến bác sĩ hoặc thầy thuốc Đông y để xác định liều lượng, tránh tương tác thuốc và đảm bảo an toàn cho từng người.
- Nhóm có tác dụng tăng HDL-C: Hà thủ ô, Sài hồ, Thổ miết trùng
* Tác dụng theo cơ chế [17], [45]:
- Ức chế hấ p thu lipid từ ngoài vào:
+ Tăng cường nhu đô ̣ng ruô ̣t, thúc đẩy bài tiết lipid: Đại hoàng, Hà thủ ô, Thảo quyết minh, Cốt khí
+ Ức chế sự hấp thu lipid trong ruô ̣t: Đâ ̣u xanh, Rong biển, Bồ hoàng
- Ức chế sự tạo thành cholesterol và triglycerid:
+ Ức chế sự tạo thành cholesterol: Trạch tả, Nghê ̣, Hà thủ ô, Bồ hoàng + Ức chế sự tạo thành triglycerid: Trạch tả, Linh chi
1.2.5.2 Một số bài thuốc và chế phẩm có tác dụng điều trị RLLPM Đã có rất nhiều các bài thuốc, chế phẩm nghiên cứu về RLLPM ở Việt Nam và trên thế giới:
Bài thuốc Bán hạ bạch truật thiên ma thang của Hoàng Khánh Toàn và cộng sự (1999) sau hai tháng điều trị bằng thuốc sắc một thang mỗi ngày cho thấy giảm 16% tổng cholesterol (TC), 31,5% triglyceride (TG), tăng 19,8% HDL-C và giảm 20,2% LDL-C, được ghi nhận trong tham khảo [27].
Bài thuốc LP4 (Lê Văn Thành, 2003) gồm Hà thủ ô 20 g, Đan sâm 20 g, Thổ phục linh 20 g, nấm Linh chi 5 g, Thảo quyết minh 20 g, Sơn tra 20 g Nghiên cứu tiến hành trên 52 bệnh nhân rối loạn lipid máu (RLLPM) cho thấy thuốc đã làm giảm TC 8,8%, giảm TG 6,85%, giảm LDL-C 11,2% và đồng thời làm tăng HDL-C 11,2% [30].
Mô hình dược lý gây tăng lipid máu trên thực nghiệm
Để nghiên cứu thuốc điều trị RLLPM, trước hết phải gây được mô hình tăng lipid máu để đánh giá hiệu quả và cơ chế tác động Nhiều loài động vật đã được sử dụng và nhiều mô hình dược lý cũng đã được nghiên cứu và áp dụng thành công trên động vật thực nghiệm Các mô hình này có thể thuộc loại: tăng cholesterol hoặc lipid máu ngoại sinh (đưa cholesterol và mỡ theo đường thức ăn), tăng cholesterol máu nội sinh (tăng tổng hợp cholesterol) hoặc phối hợp cả hai cơ chế này [40].
1.3.1 Mô hình dược lý thực nghiệm gây rối loạn lipid máu nội sinh
Để tạo mô hình tăng lipid máu nội sinh, người ta thường dùng các chất như Tween 80 (Polysorbate 80) (Cheymol và cộng sự, 1965), Triton WR-1339 (Tyloxapol) được cải tiến bởi Frans và đồng sự, và Poloxamer 407 (P-407) (Thomas P Johnston, 2004); các chất này có cơ chế làm tăng tổng hợp cholesterol tại gan, từ đó gây ra tăng lipid máu nội sinh ở động vật thí nghiệm và được ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu đánh giá tác dụng của thuốc lên lipid huyết.
Tween 80 hay Polysorbate 80 là một chất hoạt động bề mặt không ion hóa, là dẫn xuất của sorbitol và acid oleic Tác dụng gây tăng lipid máu của tween 80 được quan sát thấy lần đầu tiên ở trên thỏ bởi Kellner, Correll và Ladd [81], [90], và sau đó là ở trên chuột nhắt bởi Cornforth, Hart, Rees và Stock [91] Nguyễn Tiến Chung sử dụng tween 80 trên thỏ theo mô hình của Kell, Correll và Ladd bằng cách tiêm tĩnh mạch vành tai dung dịch tween 80 20% với liều 2,5 mL/kg cân nặng trong NaCl 0,9%, kết quả cho thấy nồng độ TC tăng 78,41% và TG là 622,64% [45] Triton WR-1339 (isooctyl-polyoxy-ethylene phenol) là chất diện hoạt, dùng đường toàn thân trên chuột nhắt hoặc chuột cống nhịn đói hoặc không nhịn đói sẽ gây tăng TC và TG huyết thanh [38] Theo một nghiên cứu của Nandakumar và cộng sự, sử dụng mô hình của Moreover Paoletti gây tăng cholesterol bằng triton WR-1339 đường tiêm tĩnh mạch liều 200mg/kg trên chuột nhắt, nồng độ TC tăng
Chứng tăng cholesterol gồm 2 giai đoạn [61] :
+ Giai đoạn I: sau 24 giờ, nồng độ cholesterol huyết tăng lên đột ngột gấp khoảng 3 lần so với nhóm đối chứng
+ Giai đoạn II: nồng độ cholesterol huyết giảm dần và sau 72 giờ nồng độ Cholesterol gần như bằng với nồng độ nhóm đối chứng
Cơ chế tăng cholesterol máu do Triton được giải thích qua tác động lên sự tiếp nhận lipid huyết tương ở các mô, cụ thể là Triton ức chế hoạt động của enzym lipoprotein lipase (LPL) và làm tăng nồng độ VLDL trong huyết thanh Sự ức chế LPL làm giảm khả năng thu nhận và phân giải triglyceride từ VLDL, dẫn tới tích tụ lipid trong huyết thanh và làm tăng cholesterol máu Các tham khảo [53], [57] đã mô tả rõ cơ chế này và ý nghĩa của nó đối với mô hình tăng lipid huyết thanh được dùng trong nghiên cứu.
1.3.2 Mô hình dược lý thực nghiệm gây rối loạn lipid máu ngoại sinh
Nhiều nhà nghiên cứu trên thế giới sử dụng chuột cống trắng trưởng thành với mô hình tăng cholesterol bằng chế độ ăn có 1% cholesterol, 1% acid cholic và 0,5% kháng giáp trạng propylthiouracil (PTU) trong vòng 4 tuần; bổ sung acid cholic và PTU làm tăng hấp thu cholesterol và làm giảm chuyển hóa cholesterol thành acid mật, vì vậy nồng độ cholesterol huyết thanh tăng nhanh và mạnh hơn Nassiri và cộng sự đã cải tiến mô hình này bằng cách cho chuột uống 10 mL/kg cân nặng hỗn hợp dầu cholesterol gồm: 10 mg cholesterol, 3 g propylthiouracil và 10 g acid cholic, dầu lạc vừa đủ 100 mL; kết quả cho thấy ở nhóm sử dụng 10 mL hỗn hợp dầu cholesterol/kg/ngày, cholesterol tăng lên 9,65 ± 0,1 mmol/L trong khi ở nhóm chứng là 3,7 ± 0,1 mmol/L [41].
Ở Việt Nam, Đoàn Thị Nhu và cộng sự đã thiết lập một mô hình tăng cholesterol máu bằng cách cho thỏ đực uống cholesterol hòa tan trong dầu lạc với liều 0,5 g/kg/ngày kéo dài 2 tuần [22], [35] Trong khuôn khổ mô hình này, Nguyễn Phương Thanh đã sử dụng hỗn hợp gồm cholesterol 0,1 g/mL, acid cholic 0,01 g/mL, PTU 0,05 g/mL và dầu lạc 1 mL Kết quả cho thấy nồng độ tổng cholesterol (TC) tăng đáng kể ở nhóm uống hỗn hợp dầu-cholesterol với liều 1 mL/100 g chuột/ngày, tăng 2,04 lần so với nhóm chứng sinh học [29].
Phương thuốc Giáng chỉ ẩm
- Đan sâm (Radix et Rhizoma Salviae miltiorrhizae) 5,0 g
- Câu kỷ tử (Fructus Lycii) 3,5 g
- Hà thủ ô đỏ (Radix Fallopiae multiflorae) 3,5 g
- Thảo quyết minh (Semen Cassiae torae) 5,0 g
1.4.2 Nguồn gốc và xuất xứ của phương thuốc
Phương thuốc “Giáng chỉ ẩm” có xuất xứ trong “Thiên gia diệu phương” (Những bài thuốc đông y hay của muôn nhà) với liều lượng như sau:
- Đan sâm (Radix et Rhizoma Salviae miltiorrhizae) 20,0 g
- Câu kỷ tử (Fructus Lycii) 10,0 g
- Hà thủ ô đỏ (Radix Fallopiae multiflorae) 15,0 g
- Thảo quyết minh (Semen Cassiae torae) 15,0 g
Cách dùng và đường dùng: Sắc nhỏ lửa với khoảng 1500 ml nước, chứa vào nước phích nước nóng làm trà uống dần nhiều lần
Hiệu quả lâm sàng của phương thuốc: Theo dõi 31 ca, sau hai tháng thì giảm thể trọng, lipid huyết giảm rõ rệt [1]
1.4.3 Công năng, chủ trị của phương thuốc
- Công năng: Ích âm, hóa ứ, giáng chỉ [1], [26]
Chủ trị tập trung vào trị can thận âm hư, khắc phục khí trệ và huyết ứ, đồng thời điều hòa lipid máu tăng để cải thiện sức khỏe toàn diện Các triệu chứng đi kèm gồm đau lưng và đau gối, ngũ tâm phiền nhiệt, mệt mỏi, đầu choáng tai ù, tự hãn, miệng khô và họng ráo.
Trong phương thuốc Đan sâm bổ huyết, hoạt huyết hóa ứ được xem là chủ dược, giúp thông huyết và giải ứ trệ huyết mạch Hà thủ ô và Câu kỷ tử bổ can thận âm và bổ huyết, được coi là thần dược trị can thận âm hư và huyết hư.
+ Sơn tra, Thảo quyết minh thư can, tán ứ, thanh hóa nhiệt đàm là tá giúp tiêu tích dầu mỡ
+ Câu kỷ tử là sứ giúp bổ can thận ích khí huyết dẫn thuốc tới nơi bị bệnh.
Thông tin cơ bản các vị thuốc
1.4.1.1 Tên khoa học: Radix et Rhizoma Salviae miltiorrhizae [8], [20]
1.4.1.2 Bộ phận dùng: Rễ và thân rễ phơi hoặc sấy khô của cây Đan sâm - Salviae miltiorrhiza Bunge [8], [20], [33]
- Các diterpenoid quinon: Tanshinon I, II, III, tanshindiol A, B, C…[20] Có khoảng 49 diterpenoid quinon được tìm thấy trong Đan sâm [77]
- 36 acid phenolic thân nước: Acid salvianolic A, B, C, D, G, F, acid caffeic, acid rosmarinic … [54], [77]
- Một số các chất khác: Salvianonol, salvianon, 2α-acetoxysugio, palmitoyl arucadiol, neotanshinlacton [77]
Sal-B, hoạt chất có trong Đan sâm, có tác dụng hạ lipid máu bằng cách làm giảm nồng độ TC trong huyết tương và đồng thời làm giảm đáng kể TG và LDL-C, kèm theo tăng HDL-C, mang lại lợi ích cho sức khỏe tim mạch [44], [58], [62], [77].
Tan-IIA và Sal-B trong Đan sâm có tác dụng chống xơ vữa bằng cách ức chế tăng sinh tế bào cơ trơn mạch máu và làm giảm tăng sản nội bào Qua đó, chúng làm chậm sự phát triển của chứng xơ vữa động mạch và có ý nghĩa trong liệu pháp bảo vệ thành mạch [65], [77].
- Chống tăng huyết áp: Tan-IIA làm giảm áp lực động mạch phổi trung bình ở chuột bị tăng huyết áp do thiếu oxy [59], [77]
- Chống thiếu máu cơ tim: Acid salvianolic trong Đan sâm có khả năng điều trị bệnh thiếu máu cục bộ ở bệnh nhân mắc bệnh mạch vành [66], [77] Tanshinon
II có tác dụng bảo vệ cơ tim chống lại những rối loạn về chức năng và chuyển hóa gây ra bởi thiếu hụt oxy [33]
Các nghiên cứu lâm sàng cho thấy Đan sâm có tác dụng tăng cường tuần hoàn máu trong YHCT, phù hợp với chẩn đoán của y học hiện đại về tác dụng điều trị bệnh tim mạch, viêm mạch tạo huyết khối nghẽn và huyết khối tắc mạch não Ở Trung Quốc, Nhật Bản, Hoa Kỳ và Châu Âu, Đan sâm được sử dụng rộng rãi để điều trị các bệnh mạch máu như xơ vữa động mạch, tăng huyết áp, tăng lipid máu và đột quỵ.
1.4.1.5 Tác dụng, công dụng theo y học cổ truyền
- Tính vị: Vị đắng, tính hơi hàn [20], [24], [33]
Công năng của bài thuốc là hoạt huyết, thông kinh, giảm đau, thanh tâm lương huyết, nhằm điều hòa dòng chảy huyết mạch và an thần; chủ trị kinh nguyệt không đều, kinh nguyệt bế tắc, hành kinh đau bụng, huyết tích hòn cục, đồng thời giảm đau thắt ngực, cải thiện mất ngủ và tâm phiền Các công dụng và chỉ định trên được ghi nhận trong các nguồn tham khảo [8], [20], [24], [33].
- Kiêng kỵ: Không dùng chung với vị thuốc Lê lô [8], người không có chứng ứ huyết [20]
- Phương pháp sắc ký lớp mỏng (Phụ lục 5.4)
Trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải xuất hiện các vết có cùng giá trị Rf và cùng màu sắc với các vết thu được trên sắc ký đồ của dung dịch dược liệu đối chiếu; đồng thời phải có một vết màu đỏ đậm có cùng màu sắc và giá trị Rf với vết của Tan-IIA trên sắc ký đồ của dung dịch chất đối chiếu.
- Phương pháp sắc ký lớp mỏng (Phụ lục 5.4 - DĐVN V)
Để xác nhận kết quả phân tích bằng sắc ký, trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải xuất hiện các vết có cùng giá trị Rf và cùng màu sắc với vết Sal-B trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu Sự trùng khớp về Rf và màu sắc giữa vết Sal-B trên hai sắc ký đồ cho thấy Sal-B có mặt trong dung dịch thử và đảm bảo tính chính xác của phương pháp sắc ký lớp mỏng TLC.
- Phương pháp sắc ký lỏng (Phụ lục 5.3 – DĐVN V)
- Dược liệu phải chứa không ít hơn 0,2% Tan-IIA (C19H18O3) tính theo dược liệu khô kiệt
- Phương pháp sắc ký lỏng (Phụ lục 5.3)
- Dược liệu phải chứa không ít hơn 3,0% Sal-B (C36H30O16) tính theo dược liệu khô kiệt
1.4.2.1 Tên khoa học: Fructus Lycii [8], [20]
1.4.2.2 Bộ phận dùng: là quả chín phơi hay sấy khô của cây Khởi tử (Khủ khởi) -
- Betain, caroten, acid nicotinic, các nguyên tố vi lượng như canxi, sắt [20]
- Scopoletin, beta-sitosterol, axit p-coumaric, glucose, daucosterol [83]
- Acid amin, acid béo và các polysacarid [86]
Nước sắc Câu kỷ tử tăng cường miễn dịch bằng cách tăng hoạt động của men lysozym trong huyết thanh, nâng cao hiệu quả kháng thể kháng hồng cầu của huyết thanh và tăng số lượng tế bào có kháng thể hình thành trong tổ chức lách [33].
- Hạ cholesterol huyết, đường huyết: Các polysacarid có trong dịch chiết Câu kỷ tử làm giảm đáng kể nồng độ LDL, TC, triacylglycerol (TAG) và glucose huyết
Betaine trong dịch chiết Câu kỷ tử có tác dụng bảo vệ gan, đặc biệt đối với các bệnh gan nhiễm mỡ, và làm giảm nhẹ tổn thương gan do CCl4 bằng cách tăng cường hoạt động chống oxy hóa và giảm chất trung gian gây viêm [70], [39].
Tác dụng đối với hệ thống máu: Câu kỷ tử được chứng minh có khả năng ngăn ngừa hiện tượng giảm bạch cầu do cyclophosphamide gây ra trong các nghiên cứu điều trị ung thư thực nghiệm trên chuột cống trắng.
- Tác dụng chống oxy hóa: chủ yếu là do carotenoid, flavonoid, acid ascobic và các dẫn xuất của nó và polyphenol [86]
- Tác dụng chống ung thư: Các polysaccharid chiết xuất từ Câu kỷ tử có tác dụng chống ung thư và cải thiện miễn dịch [86]
1.4.2.5 Tác dụng, công dụng theo y học cổ truyền:
- Tính vị: Vị ngọt, tính bình [20], [24], [33]
- Qui kinh: Qui vào kinh phế, can và thận [20], [24], [33]
Bài thuốc có công năng tư bổ can thận, ích tinh, sáng mắt và được chỉ định để điều trị hư lao tinh suy Các biểu hiện mắc phải gồm đau thắt lưng, đau đầu gối, chóng mặt, ù tai, đồng thời bài thuốc điều trị nội nhiệt gây tiểu đường, huyết hư và mờ mắt [8], [24].
- Liều dùng: 9 - 15 g, sắc uống hoặc dùng dạng hoàn tán [33]
- Kiêng kỵ: Tỳ vị hư yếu, đại tiện sống phân không nên dùng [8]
- Phương pháp sắc ký lớp mỏng (Phụ lục 5.4)
- Trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải có các vết có cùng màu sắc và giá trị
Rf với các vết trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu
- Phương pháp sắc ký lỏng [45]
- Dược liệu phải chứa không ít hơn 0,3% - betain (C5H11NO2) tính theo dược liệu khô kiệt
1.4.3.1 Tên khoa học: Radix Fallopiae multiflorae [8], [31]
1.4.3.2 Bộ phận dùng: là rễ củ phơi khô của cây Hà thủ ô đỏ - Fallopia multiflora
(Thunb) Haraldson Syn/Polygonum multiflorum (Thunb.) [8], [20], [31]
Stilben là thành phần hóa học đặc trưng của Hà thủ ô đỏ Đã có khoảng 21 stilben được phân lập và chiết xuất, bao gồm stilben glucopyranosid, resveratrol, polydatin và polygonumosid A, B, C, D cùng nhiều hợp chất khác [67].
Quinon là thành phần đặc trưng của Hà thủ ô đỏ, và các quinon cùng các dẫn xuất của chúng đã được phân lập và xác định, hầu hết thuộc nhóm anthraquinone với các hợp chất điển hình như Emodin, Rhein, Chrysophanol, Physcion và Fallacinol, được ghi nhận trong các nghiên cứu tham khảo [67].
- Các flavonoid trong Hà thủ ô đỏ bao gồm tricin, rutin, luteolin, quercetin, kaempferol, isoorientin, apigenin, hyperosid, vitexin và quercetin-3-O-arabinosid
[49], [50], [85] Flavonostilben glycosid được phân lập từ Hà thủ ô đỏ và được xác định là polygonflavanol [47], [67]
The red Hà Thủ Ô (a traditional medicinal herb) is rich in phospholipids, including phosphatidylethanolamine, and comprises a broad lipid profile such as copaene, eicosane, hexanoic acid, methyl hexadecanoate, ethyl hexadecanoate, methyl octadecanoate, ethyl oleate, methyl docosanoate (docosanoic acid methyl ester), ethyl tetradecanoate, and squalene, as cited in references [49], [50].
- Ngoài ra còn có tinh bột, các chất vô cơ K, Ca, Mn, Ni, Cr… [33]
2,3,5,4’-tetrahydroxystilben-2-O-β-D-glucosid, một hoạt chất có trong Hà thủ ô đỏ, có tác dụng chống lão hóa và tiềm năng điều trị Alzheimer và Parkinson thông qua cơ chế ức chế acetylcholinesterase, bảo vệ thần kinh, chống oxy hóa và tăng cường nhận thức [66], [67], [78].
- Ức chế acetylcholinesterase (AchE): Emodin-8-O-β-D-glucopyranosid (EG), có tác dụng ức chế AchE hoạt động điều trị chứng mất ngủ và rối loạn chức năng não [67]
- Tác dụng chống oxy hóa: Dịch chiết của Hà thủ ô đỏ có khả năng chống oxy hóa trong mô hình chuột do D-galactose gây ra sự lão hóa [67], [75]
Tác dụng điều hòa miễn dịch của polysaccharide và anthraquinone glycoside là làm tăng mức IL-2 huyết thanh và các thông số huyết học, đồng thời tăng cường hệ chống oxy hóa và thúc đẩy quá trình tạo máu ở tế bào lách [48], [67].
- Tác dụng giảm lipid máu: chủ yếu là của một số các thành phần, chẳng hạn như: 2,3,5,4'-tetrahydroxystilben-2-O-β-D-glucopyranosid (TSG), polysacarid và anthraquinon [55], [79], [80]
Các nghiên cứu về phương thuốc Giáng chỉ ẩm
Có rất ít nghiên cứu về phương thuốc Giáng chỉ ẩm ở Việt Nam Các công trình hiện có chủ yếu tập trung phân tích các vị thuốc như Đan sâm và Hà thủ ô Hiện nay có hai đề tài nghiên cứu về phương thuốc này tại Việt Nam, một tập trung vào phương pháp chiết xuất và một tập trung vào đánh giá tác dụng của thuốc thang trên lâm sàng, nhưng chưa có nghiên cứu nào về cao đặc phương thuốc với tác dụng hạ lipid máu trên thực nghiệm.
Bài thuốc Giáng chỉ ẩm, gồm Đan sâm 20 g, Hà thủ ô 20 g, Sơn tra 20 g, Kỷ tử 15 g, Thảo quyết minh 20 g (Phan Việt Hà, 1998) Nghiên cứu trên 30 bệnh nhân bị rối loạn lipid máu cho thấy thuốc làm giảm TC 13,54%, LDL-C 15,23%, TG 32,67% và tăng HDL-C 17,07% sau 40 ngày điều trị [10].
- Bài thuốc “Giáng chỉ ẩm”, gồm Đan sâm 20 g, Câu kỷ tử 10 g, Hà thủ ô đỏ
Trong nghiên cứu của Hoàng Mạnh Tuấn (2020), cao đặc giàu acid salvianolic B được điều chế từ phương thuốc Giáng chỉ với liều lượng 15 g cho các thành phần, đặc biệt có sự tham gia của Sơn tra và Thảo quyết minh; đồng thời tác giả xây dựng một số tiêu chuẩn và chỉ tiêu chất lượng để đảm bảo hiệu quả và an toàn của sản phẩm.
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
- Các vị thuốc Đan sâm, Câu kỷ tử, Hà thủ ô đạt tiêu chuẩn Dược điển Trung Quốc 2015 [45]; Sơn tra, Thảo quyết minh đạt tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam V
Trong Phụ lục 2, các vị thuốc của phương thuốc được cung cấp bởi Công ty TNHH Đông dược Dân Lợi và được trình bày tại Hình 2.1 Các dược liệu được chế biến theo phương pháp cổ truyền [8], [45].
+ Đan sâm: Rửa sạch để ráo nước, ủ mềm, thái lát mỏng 2 - 4 mm, sấy khô + Câu kỷ tử: Loại tạp, sấy khô
Để chế biến Hà thủ ô đỏ, bạn rửa sạch củ rồi ngâm trong nước vo gạo suốt một ngày đêm Sau đó rửa lại và đổ nước đậu đen vào cho ngập củ, nấu cho đến khi củ mềm Lấy củ ra bỏ lõi (nếu có), thái thành lát dày 2–4 mm và sấy khô để bảo quản.
+ Sơn tra: Rửa sạch, ủ mềm, thái phiến dày 2 - 4 mm, sấy khô
+ Thảo quyết minh: Loại bỏ tạp chất, rửa sạch, sấy khô
- Cao đặc phương thuốc Giáng chỉ ẩm chiết nước: Cao đặc được bào chế qua 2 giai đoạn:
Chiết xuất được thực hiện bằng cách cân các vị thuốc đã chế biến theo công thức: Đan sâm 200 g, Câu kỷ tử 154 g, Hà thủ ô đỏ (chế) 154 g, Sơn tra 200 g và Thảo quyết minh 200 g, cho tổng khối lượng dược liệu là 908 g Chiết bằng nước được thực hiện hai lần ở 80°C, mỗi lần 2 giờ, với tỉ lệ DM/DL = 8 lần Quá trình chiết được thực hiện bằng bếp hồng ngoại Kangaroo và nồi inox Gala Plus để thu dịch chiết.
+ Cô cao: Sau khi thu dịch chiết, tiến hành lọc và cô dịch chiết dưới áp suất giảm bằng máy cô quay chân không với tốc độ 50 vòng/phút, nhiệt độ < 60℃ đến thể chất lỏng sánh, loại tạp bằng ethanol 70%, thu dịch lọc, tiếp tục chuyển sang cô cách thủy ở 80˚C đến thể chất cao đặc (độ ẩm < 20%) [28]
Tiến hành chiết 3 mẻ cao Tỷ lệ cao/dược liệu (tính theo cao khô, dược liệu khô kiệt) trung bình là 22,83% (Phụ lục 1)
- Cao đặc phương thuốc Giáng chỉ ẩm chiết ethanol 70%: Cao đặc được bào chế qua 2 giai đoạn:
Chiết xuất được thực hiện bằng cách cân các vị thuốc đã chế biến theo công thức: Đan sâm 200 g, Câu kỷ tử 154 g, Hà thủ ô đỏ (chế) 154 g, Sơn tra 200 g, Thảo quyết minh 200 g, cho tổng khối lượng dược liệu cho 1 mẻ chiết là 908 g Thêm dung môi chiết lần 1 với tỷ lệ DM/DL = 8 lần, ngâm 72 giờ ở nhiệt độ phòng rồi rút dịch chiết Tiếp tục thêm dung môi lần 2 với tỷ lệ DM/DL = 7 lần, ngâm 72 giờ ở nhiệt độ phòng rồi rút dịch chiết Gộp dịch chiết thu được của 2 lần chiết.
Cô đặc cao: Sau khi thu dịch chiết, tiến hành lọc và cô đặc dưới áp suất giảm bằng máy cô quay chân không với tốc độ 50 vòng/phút và nhiệt độ dưới 60°C cho tới khi dung dịch trở thành thể chất lỏng sánh; sau đó tiếp tục cô đặc bằng cách thủy ở 80°C để thu được sản phẩm cao đặc với độ ẩm dưới 20% [28].
Tiến hành chiết 3 mẻ cao Tỷ lệ cao/dược liệu (tính theo cao khô, dược liệu khô kiệt) trung bình là 27,97% (Phụ lục 1)
- Cao đặc placebo: Chuẩn bị như cao đặc phương thuốc Giáng chỉ ẩm nhưng bỏ Đan sâm
Hình 2.1 Các dược liệu trong phương thuốc Giáng chỉ ẩm
Động vật thí nghiệm là chuột nhắt trắng chủng Swiss albino, 5–6 tuần tuổi, trọng lượng 24 ± 2 g, khỏe mạnh và được cung cấp bởi Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương Chuột được nuôi 7 ngày trong phòng chăn nuôi với điều kiện nhiệt độ duy trì ở 25 ± 1°C, độ ẩm và ánh sáng phù hợp Chuột ăn thức ăn tiêu chuẩn do Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp và uống nước tự do theo nhu cầu.
- Cân phân tích AND GR200 (A&D, Nhật Bản) độ chính xác 0,1 mg
- Cân phân tích Mettler Toledo XPE105 (Mettler Toledo, Thụy Sĩ) độ chính xác 0,01 mg
- Máy đo độ ẩm Precisa XM60 (Precisa, Thụy Sĩ)
- Máy cô quay chân không IKA ® RV 8 (IKA, Đức)
- Bể siêu âm WUC-D22H (Daihan Scientific, Hàn Quốc)
An HPLC system from Shimadzu, Japan, includes the LC-30AD pump, the SPD-M20A diode array detector (DAD), the SIL-20A autosampler, the CTO-10AS temperature control module, and the Shim-pack GIST C18 chromatography column.
- Hệ thống lọc chõn khụng, màng lọc 0,45 àm x 47 mm Supelco (Mỹ), màng lọc syringe 0,45 àm Shimadzu (Shimadzu, Nhật Bản), lọ đựng mẫu (vial) 1,5 ml Shimadzu (Shimadzu, Nhật Bản).
- Máy định lượng sinh hóa bán tự động Humanlyzer H2000 (Đức)
- Bếp hồng ngoại Kangaroo điều chỉnh được nhiệt độ
- Tủ sấy Memmert (Memmert, Đức)
- Bình định mức, bình nón, pipet chính xác các loại, micro pipet và các dụng cụ thủy tinh cần thiết khác cần cho phân tích
2.1.4 Thuốc, hóa chất, chất chuẩn
Bảng 2.1 Thuốc và hóa chất sử dụng
STT Thuốc, hóa chất Độ tinh khiết/Tiêu chuẩn Nguồn gốc
Xinyang Zhongjian Metrology Biological Technology Co., Ltd
Xinyang Zhongjian Metrology Biological Technology Co., Ltd
10 Dung dịch NaCl 0.9% PA Viện Dược liệu
(Nước cất siêu sạch) HPLC Trường ĐH Dược Hà Nội
12 Nước cất 1 lần PA Trường ĐH Dược Hà Nội
Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Định tính, định lượng đồng thời Sal-B và Tan-IIA trong cao đặc phương thuốc bằng HPLC
- Cao đặc Giáng chỉ ẩm chiết nước
- Cao đặc Giáng chỉ ẩm chiết ethanol 70%
- Cao đặc placebo Đan sâm
2.2.1.2 Chuẩn bị dung dịch thử và dung dịch mẫu
Tham khảo tài liệu [8], [69] để khảo sát quy trình xử lý mẫu cao định lượng
Cân chính xác khoảng 15,02 mg chất chuẩn Sal-B (hàm lượng 99,34%), cho vào bình định mức 5 mL; thêm khoảng 4 mL methanol 70%, lắc cho tan hết Sau đó bổ sung vừa đủ methanol 70% đến vạch 5 mL và lắc đều để dung dịch chuẩn Sal-B được hòa tan hoàn toàn.
Để chuẩn bị dung dịch chuẩn Tan-IIA, tiếp tục cân chính xác khoảng 5,76 mg chất chuẩn Tan-IIA (hàm lượng 98,09%) và cho vào bình định mức 10 mL Thêm vào bình khoảng 8 mL methanol 70% và lắc để tan hết chất chuẩn Sau đó bổ sung methanol 70% vừa đủ đến vạch 10 mL và lắc đều cho dung dịch đồng nhất.
Để định mức, hút chính xác 0,275 mL dung dịch chất chuẩn Tan-IIA cho bình định mức 5 mL chứa dung dịch chất chuẩn Sal-B đã pha Sau khi lắc đều, thu được dung dịch chuẩn gốc với nồng độ Sal-B 2828,60 µg/mL và Tan-IIA 29,46 µg/mL.
Từ dung dịch chuẩn gốc này pha dãy chuẩn có nồng độ của Sal-B trong khoảng: 88,39 - 2828,60 g/mL và nồng độ của Tan-IIA trong khoảng: 0,92 - 29,46 g/mL
Quy trình thử nghiệm: Cân chính xác khoảng 0,2 g mẫu cao vào bình nón 50 ml có nút mài, thêm đúng 25 ml dung môi; cân lại và tiến hành chiết siêu âm Để nguội, cân lại và bổ sung phần thiếu bằng dung môi để khôi phục khối lượng ban đầu Lắc đều hỗn hợp, lọc qua màng lọc syringe 0,45 µm để thu được dung dịch tiêm sắc ký Khảo sát ảnh hưởng của dung môi chiết, thời gian chiết và nhiệt độ chiết để chọn phương pháp chiết tối ưu.
Chương trình sắc ký lỏng được khảo sát ban đầu dựa trên các điều kiện sắc ký được tham khảo trong tài liệu [45], [69]
- Pha tĩnh: cột sắc ký C18 (250 x 4,6mm, 5àm)
- Pha động: acetonitril (dung môi A) và acid phosphoric 0,1% (dung môi B) theo chương trình rửa giải gradient, khảo sát 3 hệ pha động:
Hệ I: 0 - 20 phút, 26,5% A; 20 - 21 phút, 26,5% - 86,5% A; 21 - 35 phút, 86,5% A; 35 - 36 phút, 86,5% - 26,5% A; 36 - 40 phút, 26,5% A
Hệ II: 0 - 20 phút, 26% A; 20 - 21 phút, 26% - 90% phút; 21 - 35 phút, 90% A; 35 - 36 phút, 90% - 26% A; 36 - 40 phút, 26% A
Hệ III: 0 - 24,5 phút, 25% A; 24,5 - 25 phút, 25% - 61% A; 25 - 31 phút, 61% A; 31 - 45 phút, 61% - 90% A; 45 - 45.5 phút, 90% - 61% A; 45.5 - 50 phút, 61% A; 50 - 50.5 phút, 61% - 25% A; 50.5 - 55 phút, 25% A
- Tốc độ dòng: 1 ml/phút
- Nhiệt độ cột: Khảo sát nhiệt độ 20 o C, 30 o C, 40 o C để chọn nhiệt độ cột cho pic Sal-B và Tan-IIA tách rõ so với các pic khác
- Thể tớch tiờm mẫu: 10 àL
- Bước sóng phát hiện: quét phổ chất chuẩn để chọn bước sóng phát hiện phù hợp
Định tính Sal-B và Tan-IIA
Tiờm 10 àl lần lượt dung dịch thử và dung dịch chuẩn vào hệ thống HPLC và ghi nhận sắc ký đồ Ghi nhận thời gian lưu của pic Sal-B và Tan-IIA trong sắc ký đồ của Sal-B và Tan-IIA chuẩn và thời gian lưu của pic đặc trưng trên sắc ký đồ của dung dịch thử Nhận dạng pic Sal-B và Tan-IIA trên sắc ký đồ của dung dịch thử bằng cách so sánh thời gian lưu với pic trên sắc ký đồ dung dịch chuẩn Thời gian lưu của pic Sal-B và Tan-IIA từ hai sắc ký đồ không khác biệt quá 2,0%
Định lượng Sal-B và Tan-IIA
Trong nghiên cứu này, 10 loại dung dịch chuẩn được tiêm vào máy sắc ký để ghi nhận sắc ký đồ và đo diện tích của các pic, đặc biệt cho hai chất Sal-B và Tan-IIA Dữ liệu diện tích pic sau đó được sử dụng để xây dựng đường hồi quy tuyến tính, biểu diễn mối quan hệ giữa diện tích pic và nồng độ dung dịch chuẩn (µg/mL) Phương trình hồi quy được thể hiện dưới dạng y = a x + b, nhằm ước lượng nồng độ từ diện tích pic và ngược lại, phục vụ cho việc thiết lập đường chuẩn và phân tích định lượng Kết quả từ sắc ký đồ của Sal-B và Tan-IIA cung cấp cơ sở tin cậy cho quá trình định lượng và đánh giá độ lặp lại của phép đo.
Tiêm 10 l dung dịch thử, ghi nhận sắc ký đồ, diện tích của pic Sal-B, Tan- IIA Nồng độ Sal-B, Tan-IIA trong dung dịch thử (àg/ml) được tớnh theo cụng thức: a b
Hàm lượng Sal-B, Tan-IIA trong cao khô tuyệt đối được tính theo công thức:
S t : Diện tích pic Sal-B, Tan-IIA trên sắc ký đồ của dung dịch thử
Trong nghiên cứu này, Ct biểu thị nồng độ của Sal-B và Tan-IIA trong dung dịch thử (mg/ml) a là giá trị hệ số góc của đường hồi quy tuyến tính, phản ánh mức thay đổi của nồng độ Sal-B và Tan-IIA theo biến độc lập b là giá trị hệ số chắn của đường hồi quy tuyến tính, cho biết giá trị cơ sở khi biến độc lập bằng 0 mcd là khối lượng cao đặc (g), được sử dụng như tham số liên quan trong phân tích hồi quy.
H: Hàm ẩm của cao đặc (%)
2.2.1.4 Thẩm định phương pháp định lượng
Quy trình định lượng được thẩm định theo hướng dẫn của AOAC [42] và ICH
Các đặc trưng quan trọng để đánh giá một phương pháp phân tích bao gồm tính đặc hiệu, tính tương thích hệ thống, khoảng tuyến tính, độ chính xác (gồm độ lặp lại và độ chính xác trung gian), độ đúng và hai giới hạn quan trọng là giới hạn phát hiện (LOD) cùng giới hạn định lượng (LOQ) Những yếu tố này xác định mức độ nhạy, tính tin cậy và khả năng đo lường chính xác của tín hiệu trong phạm vi làm việc, đảm bảo phương pháp chỉ đo đúng chất phân tích mục tiêu, có thể áp dụng trên các hệ thống khác nhau, duy trì mảng tuyến tính theo khoảng nồng độ xác định và đưa ra ngưỡng tối thiểu để phát hiện và để định lượng một chất được phân tích.
* Tiến hành sắc ký các loại mẫu sau đây theo quy trình phân tích:
Dung dịch mẫu trắng (dung môi)
Dung dịch chuẩn hỗn hợp Sal-B, Tan-IIA
Dung dịch mẫu thử thêm chuẩn
Trên sắc kí đồ của dung dịch thử, pic chính phải có thời gian lưu trùng với pic Sal-B và Tan-IIA trên sắc kí đồ dung dịch chuẩn; nếu có pic phụ thì pic của chất cần phân tích cần được tách hoàn toàn ra khỏi các chất phụ này để đảm bảo độ phân giải và kết quả phân tích chính xác.
+ Trên sắc kí đồ của mẫu dung môi và mẫu placebo không xuất hiện pic có thời gian lưu tương ứng với pic Sal-B, Tan-IIA
Độ phù hợp của hệ thống là phép thử nhằm đánh giá độ ổn định và tin cậy của toàn bộ hệ thống phân tích, bao gồm các yếu tố như máy móc thiết bị, hệ thống điện và cách tiến hành phân tích Việc đánh giá này đảm bảo các thành phần và quy trình làm việc tương thích với nhau, giúp kết quả phân tích chính xác, lặp lại và tuân thủ các tiêu chuẩn vận hành của phòng thí nghiệm, từ đó tăng độ tin cậy và hiệu quả của quá trình phân tích.
Tiến hành: Sắc ký 6 lần liên tiếp dung dịch chuẩn Sal-B, Tan-IIA
- Pha một dãy dung dịch chuẩn Sal-B, Tan-IIA ở các nồng độ thích hợp Tiến hành sắc ký như điều kiện đã lựa chọn
- Xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ Sal-
B, Tan-IIA trong các dung dịch chuẩn
Yêu cầu: Hệ số tương quan R ≥ 0,99
Chuẩn bị dung dịch chuẩn: Dùng dãy dung dịch chuẩn trong phần độ tuyến tính
Chuẩn bị dung dịch thử được thực hiện trên 6 mẫu thử độc lập và tiến hành theo quy trình phân tích đã được quy định Định lượng được thực hiện trên 6 mẫu thử độc lập nhằm đảm bảo tính khách quan của kết quả Độ lặp lại của phương pháp được xác định bằng giá trị RSD (%) của kết quả định lượng hàm lượng Sal-B và Tan-IIA có trong mẫu.
* Độ chính xác trung gian:
Thực hiện như phần độ lặp lại nhưng vào ngày khác
Xác định giá trị trung bình và giá trị RSD (%) hàm lượng hoạt chất có trong các mẫu ở mỗi ngày và giữa hai ngày
Để đảm bảo tính lặp lại và độ tin cậy của phương pháp định lượng Sal-B và Tan-IIA, yêu cầu đặt ra là giá trị RSD (%) của kết quả định lượng mỗi ngày (n = 6) và của cả hai ngày (n) phải ≤ 2,7% đối với Sal-B và ≤ 5,3% đối với Tan-IIA; mức khuyến cáo của AOAC áp dụng tương ứng với hàm lượng từ 1% đến dưới 10% (Sal-B) và từ 0,01% đến dưới 0,1% (Tan-IIA) [42].
Độ đúng được đánh giá bằng cách bổ sung một lượng chất chuẩn đã biết (dung dịch chuẩn gốc) vào mẫu ở mức nồng độ Sal-B và Tan-IIA khoảng 50% so với mẫu thử, nhằm tạo ra ba mức nồng độ khác nhau là 75%, 100% và 125% so với mẫu thử Quá trình chuẩn bị mẫu được thực hiện theo đúng quy trình và điều kiện sắc ký đã chọn, và mỗi nồng độ được lặp lại ba lần để bảo đảm tính lặp lại và độ tin cậy của kết quả.
- Xác định tỷ lệ (%) tìm lại được so với nồng độ ban đầu
Yêu cầu xác định tỷ lệ thu hồi ở mỗi mức nồng độ phải nằm trong phạm vi 97,0–103,0% đối với Sal-B và 90–107% đối với Tan-IIA Đây là mức khuyến cáo của AOAC, áp dụng cho hàm lượng từ 1% đến dưới 10% với Sal-B và từ 0,01% đến dưới 0,1% với Tan-IIA, tương ứng [42].
Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)
Xử lí số liệu
Các số liệu nghiên cứu được tính toán dựa trên các công thức đã xác định hoặc thông qua công cụ Data Analysis của Microsoft Excel, trong khi phân tích thống kê được thực hiện bằng phần mềm SigmaPlot 12.0 của SYSTAT Software Inc, Richmond, CA, USA.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Định tính, định lượng đồng thời Sal-B, Tan-IIA trong cao đặc phương thuốc Giáng chỉ ẩm bằng HPLC
3.1.1 Khảo sát điều kiện sắc ký và phương pháp chiết mẫu
Phõn tớch mẫu chuẩn hỗn hợp Sal-B 353,58 àg/ml và Tan-IIA 3,68 àg/ml và ghi phổ trong khoảng 230 - 350 nm Kết quả được trình bày ở Hình 3.1
Hình 3.1 Hình ảnh phổ của Sal-B và Tan-IIA trong khoảng 230 - 350 nm
Nhận xét: Phổ hấp thụ của Tan-IIA đạt cực đại còn Sal-B lại có hấp thụ cực tiểu tại cùng bước sóng 270 nm Dù ở vị trí hấp thụ thấp, Sal-B vẫn cho cường độ hấp thụ cao và diện tích pic lớn Với nồng độ Sal-B cao hơn hẳn Tan-IIA, bước sóng 270 nm được chọn để định lượng đồng thời cả hai chất này.
Phõn tớch mẫu thử và mẫu chuẩn hỗn hợp Sal-B 353,58 àg/ml và Tan-IIA 3,68 àg/ml với 3 hệ dung mụi trờn Kết quả được trỡnh bày ở Hỡnh 3.2
Hình 3.2 Sắc ký đồ của Sal-B và Tan-IIA với hệ pha động I (a), II (b), III (c)
Nhận xét: Thời gian lưu của hệ I và hệ II được rút ngắn, nhưng hệ pha động I chân pic Sal-B vẫn còn dính với pic khác, trong khi pic Tan-IIA tách tốt (Hình 3.2a) Hệ pha động II lại không tách được chất; chân pic Sal-B và Tan-IIA vẫn còn dính với pic khác (Hình 3.2b).
Hệ pha động III cho thấy pic của Sal-B và Tan-IIA tách rõ so với các pic khác và có chân pic gọn (Hình 3.2c), vì vậy hệ pha động III được chọn làm cơ sở cho các phân tích tiếp theo.
3.1.1.3 Khảo sát nhiệt độ cột
Phân tích mẫu thử và mẫu chuẩn hỗn hợp Sal-B 353,58 µg/mL và Tan-IIA 3,68 µg/mL được thực hiện ở ba nhiệt độ cột khác nhau Kết quả về thời gian lưu của các chất được trình bày trong Bảng 3.1 và minh họa bằng Hình 3.3, cho phép đánh giá sự ảnh hưởng của nhiệt độ cột đến thời gian lưu và hiệu suất phân tích.
Bảng 3.1 Thời gian lưu pic Sal-B và Tan-IIA ở các nhiệt độ cột khác nhau
Hình 3.3 Sắc ký đồ của Sal-B và Tan-IIA ở nhiệt độ cột 20℃ (a), 30℃ (b),
Quan sát cho thấy ở nhiệt độ cột 30°C và 40°C, thời gian lưu của Sal-B và Tan-IIA bị rút ngắn nhưng peak Sal-B không tách rõ khỏi các peak khác Với nhiệt độ cột 20°C, thời gian lưu của Sal-B và Tan-IIA lần lượt là 19,947 phút và 45,323 phút, cả hai peak đều riêng biệt và tách rõ so với các peak còn lại Vì vậy, nhiệt độ cột 20°C được chọn làm điều kiện phân tích tối ưu cho việc phân tích Sal-B và Tan-IIA.
3.1.1.4 Khảo sát dung môi chiết
Chiết siêu âm với mẫu 0,2 g được thực hiện bằng các dung môi methanol ở các nồng độ 30%, 50%, 70% và 100% trong thời gian 30 phút Sau đó, mẫu được phân tích theo điều kiện sắc ký đã chọn và kết quả được trình bày ở Bảng 3.2.
Bảng 3.2 Diện tích pic Sal-B và Tan-IIA chiết ở các dung môi khác nhau
Nhận xét cho thấy khi chiết bằng methanol 50% và 70%, diện tích pic Sal-B cao nhất và sự khác biệt giữa hai dung môi không đáng kể Tuy nhiên, diện tích pic Tan-IIA lại cao hơn đáng kể khi chiết bằng methanol 70% Từ kết quả này, methanol 70% được chọn làm dung môi chiết cao đặc.
3.1.1.5 Khảo sát nhiệt độ chiết
Trong nghiên cứu này, mẫu 0,2 g ở trạng thái cao đặc được chiết siêu âm với dung môi methanol 70% trong thời gian 30 phút ở các nhiệt độ khác nhau để tối ưu hóa hiệu suất chiết Sau đó, phần chiết được phân tích theo điều kiện sắc ký đã được chọn nhằm xác định các thành phần mục tiêu Kết quả của quá trình phân tích được trình bày trong Bảng 3.3.
Bảng 3.3 Diện tích pic Sal-B và Tan-IIA khi chiết với nhiệt độ chiết khác nhau
Nhận xét cho thấy diện tích pic của Sal-B và Tan-IIA không chênh lệch nhiều khi chiết ở các nhiệt độ khác nhau Từ quan sát này, nhiệt độ 30°C, gần với nhiệt độ phòng, được chọn làm điều kiện chiết để thu được chiết cao đặc Việc lựa chọn nhiệt độ phòng gần 30°C giúp ổn định hiệu suất chiết và tối ưu hóa giá trị diện tích peak của Sal-B và Tan-IIA trong quá trình chiết.
3.1.1.6 Khảo sát thời gian chiết
Chiết siêu âm 0,2 g mẫu với dung môi methanol 70% được thực hiện ở ba thời gian 15 phút, 30 phút và 45 phút để đánh giá hiệu quả chiết các hợp chất mục tiêu Mẫu sau đó được phân tích dưới điều kiện sắc ký đã chọn nhằm xác định đặc tính của mẫu theo phương pháp phân tích được sử dụng Kết quả của quá trình này được trình bày ở Bảng 3.4.
Bảng 3.4 Diện tích pic Sal-B và Tan-IIA khi chiết với thời gian khác nhau
Nhận xét cho quá trình chiết Sal-B và Tan-IIA cho thấy diện tích các pic Sal-B và Tan-IIA thấp nhất khi chiết ở thời gian 15 phút, và sự khác biệt giữa 30 phút và 45 phút không đáng kể Từ đó, thời gian chiết 30 phút được chọn làm điều kiện tối ưu để chiết cao đặc, nâng cao hiệu suất phân tích.
3.1.2 Chuẩn bị dung dịch thử
- Dung dịch thử: Dung dịch thử được chuẩn bị theo mục 2.2.1.2 với dung môi chiết là methanol 70%, thời gian chiết là 30 phút
- Điều kiện sắc ký: Theo mục 2.2.1.3 với hệ pha động là hệ III, nhiệt độ cột 20℃, bước sóng phát hiện là 270 nm
3.1.3 Chuẩn bị dung dịch chuẩn
- Dung dịch chuẩn: Dung dịch chuẩn được chuẩn bị theo mục 2.2.1.2
- Điều kiện sắc ký: Theo mục 2.2.1.3 với hệ pha động là hệ III, nhiệt độ cột 20℃, bước sóng phát hiện là 270 nm
3.1.4 Thẩm định quy trình định lượng
3.1.4.1 Tính đặc hiệu của phương pháp
Chúng tôi tiến hành phân tích các mẫu gồm dung môi, mẫu placebo Đan Sâm, dung dịch chuẩn Sal-B và Tan-IIA, cùng với dung dịch mẫu thử và dung dịch thử thêm chuẩn, theo các điều kiện sắc ký và xử lý mẫu như đã mô tả Kết quả phân tích được trình bày chi tiết tại Hình 3.4, Hình 3.5 và Hình 3.6.
Hình 3.4 Sắc ký đồ các mẫu nghiên cứu
1 Dung môi; 2 Placebo Đan sâm; 3 Hỗn hợp chất chuẩn Sal-B và Tan-IIA,
4 Mẫu thử, 5 Mẫu thử thêm chuẩn
Hình 3.5 Phổ của mẫu thử và mẫu chuẩn Sal-B
Trong Hình 3.6, phổ của mẫu thử và mẫu chuẩn Tan-IIA cho thấy hai pic Sal-B và Tan-IIA có thời gian lưu lần lượt khoảng 20 và 45 phút, và các pic này tách hoàn toàn khỏi các pic khác; Sal-B được phát hiện ở thời gian lưu khoảng 20 phút, Tan-IIA ở khoảng 45 phút, với cạnh pic cân đối và độ rộng chân pic nhỏ Nhận xét cho thấy trên sắc ký đồ của dung dịch mẫu thử và mẫu thử thêm chuẩn cho pic có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của pic trên sắc ký đồ dung dịch chuẩn Sal-B và Tan-IIA Trong khi đó, trên sắc ký đồ của mẫu dung môi
Mẫu 43 và mẫu placebo không cho thấy đỉnh có thời gian lưu trùng với thời gian lưu của đỉnh trên sắc ký đồ dung dịch chuẩn Sal-B và Tan-IIA Ngược lại, phổ của đỉnh mẫu thử và đỉnh chuẩn cho thấy hệ số chồng phổ Sal-B đạt 1,0000 và Tan-IIA đạt 0,9961 (>0,99) Do đó phương pháp này đảm bảo độ chọn lọc và đặc hiệu.
3.1.4.2 Tính tương thích của hệ thống
Tiến hành lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn Sal-B ở nồng độ 353,58 µg/mL và dung dịch chuẩn Tan-IIA ở nồng độ 3,68 µg/mL, ghi nhận các giá trị thời gian lưu và diện tích pic nhằm đánh giá độ lặp lại của hệ thống phân tích Độ lặp lại của hệ thống được biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối (RSD) Kết quả được trình bày ở Bảng 3.5 và Bảng 3.6.
Bảng 3.5 Kết quả độ thích hợp hệ thống của Sal-B
Nhận xét: Độ lê ̣ch chuẩn tương đối của diê ̣n tích pic (0,05%) và thời gian lưu
Đánh giá tác dụng hạ lipid máu trên thực nghiệm của cao đặc phương thuốc Giáng chỉ ẩm
3.2.1 Ảnh hưởng của cao chiết đến hàm lượng cholesterol toàn phần và triglycerid toàn phần
Kết quả ở Bảng 3.15 và Hình 3.13 biểu thị tác dụng của cao chiết nước và cao chiết ethanol 70% đến hàm lượng TC và TG
Bảng 3.15 Ảnh hưởng của các cao chiết đến nồng độ của TC và TG
TC TG mg/dl % ức chế mg/dl % ức chế
Chú thích: Số liệu được biểu thị dưới dạng trung bình ± S.E.M; *p