Nghiên cứu tác dụng giảm đau, chống viêm, độc tính của chế phẩm naphtoquinon từ củ Sâm đại hành (Eleutherine bulbosa (Mill.), URB.) trên thực nghiệm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ KIM HUẾ NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG GIẢM ĐAU, CHỐNG VIÊM, ĐỘC TÍNH CỦA CHẾ PHẨM NAPHTOQUINON TỪ CỦ SÂM ĐẠI HÀNH ELEUTHE

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ KIM HUẾ

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG GIẢM ĐAU, CHỐNG VIÊM, ĐỘC TÍNH CỦA CHẾ PHẨM NAPHTOQUINON TỪ CỦ SÂM ĐẠI HÀNH

(ELEUTHERINE BULBOSA (MILL.), URB.)

TRÊN THỰC NGHIỆM

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI - 2019

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ KIM HUẾ

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG GIẢM ĐAU, CHỐNG VIÊM, ĐỘC TÍNH CỦA CHẾ PHẨM NAPHTOQUINON TỪ CỦ SÂM ĐẠI HÀNH

(ELEUTHERINE BULBOSA (MILL.), URB.)

TRÊN THỰC NGHIỆM

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC LÝ – DƯỢC LÂM SÀNG

MÃ SỐ: 8720205

Người hướng dẫn khoa học: 1 TS Đỗ Thị Nguyệt Quế

2 TS Bùi Kim Anh

HÀ NỘI - 2019

LỜI CẢM ƠN

Với tất cả lòng kính trọng và biết ơn tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới

TS Đỗ Thị Nguyệt Quế, bộ môn Dược lực, trường Đại học Dược Hà Nội, là

người thầy đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, động viên, khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu để tôi có thể hoàn thành luận văn này

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn TS Bùi Kim Anh và TS Phạm Thị Bích Hạnh, Viện hóa học – Viện Hàn lâm khoa học Việt Nam đã chỉ bảo và giúp đỡ

tôi rất nhiều trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thiện luận văn này

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới toàn thể thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên, các em sinh viên đang nghiên cứu khoa học tại bộ môn Dược lực, trường Đại học Dược Hà Nội đã luôn bên tôi, giúp đỡ tôi trong quá trình tôi thực hiện

và hoàn thiện luận văn này

Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu, phòng Đào tạo sau đại học và

các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo mọi điều kiện thuận lợi,

giúp đỡ tôi suốt quá trình học tập

Luận văn này được hỗ trợ kinh phí của Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam (VAST) trong đề tài mã số VAST.ƯDCN.01/16-18 Tôi chân thành cảm ơn các thành viên trong nhóm thực hiện đề tài đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực nghiệm và hoàn thiện luận văn này

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới gia đình, bạn bè đã đồng hành, động viên, chia sẻ với tôi trong gần hai năm học tập và nghiên cứu dưới mái trường Dược thân yêu!

Hà Nội, ngày 01 tháng 4 năm 2019

HỌC VIÊN

Nguyễn Thị Kim Huế

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ

DANH MỤC CÁC BẢNG

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Phần 1 TỔNG QUAN 3

1 Tổng quan về đau và các đích tác dụng của thuốc giảm đau 3

1.1 Định nghĩa, phân loại, đường dẫn truyền cảm giác đau 3

1.2 Một số đích tác dụng của thuốc giảm đau 4

1.2.1 Kích thích các receptor opioid (µ, k, δ): 4

1.2.2 Ức chế enzym cyclooxygenase (COX) 5 2 Tổng quan về viêm và một số đích tác dụng của thuốc chống viêm 6

2.1 Khái niệm, phân loại và sinh lý viêm 6

2.2 Một số đích tác dụng của thuốc chống viêm 8

2.2.1 Ức chế cyclooxygenase (COX) 8 2.2.2 Ức chế enzym lypoxygenase (LOX) 11 2.2.3 Ức chế phospholipase A2 12

2.2.4 Một số đích tác dụng khác 12 3 Một số mô hình thực nghiệm nghiên cứu về tác dụng giảm đau, chống viêm 14

3.1 Một số mô hình thực nghiệm nghiên cứu tác dụng giảm đau 14

3.1.1 Mô hình gây đau quặn trên chuột của Koster (Writhing test) 14

3.1.2 Mô hình gây đau bằng phiến nóng (hot plate method) 14

3.2 Một số mô hình thực nghiệm nghiên cứu tác dụng chống viêm 15

3.2.1 Mô hình nghiên cứu chống viêm cấp in vivo 15

3.2.2 Mô hình đánh giá tác dụng chống viêm mạn in vivo 16

3.2.3 Mô hình nghiên cứu chống viêm in vitro 17

4 Tổng quan về dược liệu nghiên cứu 19

4.1 Giới thiệu về Sâm đại hành 19

4.2 Một số nghiên cứu về thành phần hóa học của Sâm đại hành 20

4.3 Một số nghiên cứu về tác dụng sinh học của củ Sâm đại hành 22

Phần 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1 Nguyên vật liệu 25

2.1.1 Dược liệu nghiên cứu và mẫu nghiên cứu 25

2.1.2 Động vật và tế bào thí nghiệm 27

2.1.3 Hóa chất và thiết bị nghiên cứu 27

2.2 Thiết kế nghiên cứu 29

2.3 Phương pháp nghiên cứu 30

2.3.1 Đánh giá tác dụng giảm đau, chống viêm của NEB 30

2.3.1.1 Đánh giá tác dụng giảm đau bằng phương pháp gây đau quặn bằng acid acetic 30

2.3.1.2 Đánh giá tác dụng chống viêm cấp của NEB 32

2.3.1.3 Đánh giá tác dụng chống viêm mạn của NEB 33

2.3.1.4 Đánh giá tác dụng ức chế COX-2 trên tế bào RAW264.7 35

2.3.2 Phương pháp đánh giá độc tính của mẫu thử 37

2.3.2.1 Phương pháp đánh giá độc tính cấp tính 37

Sơ đồ 2.5 Đánh giá độc tính cấp tính 38

2.3.2.2 Phương pháp đánh giá độc tính bán trường diễn 38

2.4 Xử lý số liệu 40

Phần 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 41

3.1 Kết quả đánh giá tác dụng giảm đau của NEB 41

3.2 Tác dụng chống viêm của NEB 42

3.2.1 Tác dụng chống viêm cấp của NEB 42

3.2.2 Tác dụng chống viêm mạn của NEB 43

3.2.3 Tác dụng ức chế cyclooxygenase 2 (COX-2) trên tế bào RAW264.7 44

3.3 Kết quả đánh giá độc tính của NEB 45

3.3.1 Kết quả đánh giá độc tính cấp của NEB 45

Từ kết quả bảng 3.5 và bảng 3.6 ta thấy: 46

3.3.2 Kết quả đánh giá độc tính bán trường diễn của NEB 46

3.3.2.1 Tình trạng chung và sự thay đổi cân nặng của chuột 46

3.3.2.2 Kết quả ảnh hưởng của NEB trên các chỉ số huyết học 48

3.3.2.3 Kết quả ảnh hưởng của NEB đến chức năng gan của chuột cống trắng giống cái thực nghiệm 50

3.3.2.4 Kết quả ảnh hưởng của NEB đến chức năng gan của chuột cống trắng giống đực 53

3.3.2.6 Kết quả ảnh hưởng của NEB đến chức năng thận của chuột cống trắng giống cái 55

3.3.2.7 Kết quả ảnh hưởng của NEB đến chức năng thận của chuột cống trắng giống đực 57

Phần 4 BÀN LUẬN 59

4.1 Về tác dụng giảm đau của NEB trên mô hình gây đau quặn bằng aid acetic 59 4.2 Tác dụng chống viêm in vivo của NEB 60

4.2.1 Tác dụng chống viêm cấp trên mô hình gây phù chân chuột bằng carrageenin 60

4.2.2 Tác dụng chống viêm mạn trên mô hình gây u hạt thực nghiệm bằng bông 62

4.2.3 Về tác dụng trên COX-2 của NEB 63

4.3 Về độc tính cấp của NEB 65

4.4 Độc tính bán trường diễn 65

KẾT LUẬN 68

KIẾN NGHỊ 69

TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC CHỮ, KÍ HIỆU VIẾT TẮT

IASP International Association for the Study of Pain

VIẾT TẮT TÊN ĐẦY ĐỦ

TNF Tumor necrosis factor

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ

Hình

Hình 1.1 Con đường chuyển hóa acid arachidonic thông qua COX [63] 10

Hình 1.2 Con đường chuyển hóa acid arachidonic thông qua 5-LOX [31] 11

Hình 1.3 Cây Sâm đại hành (Eleutherine bulbosa) 20

Hình 2.1 Nguyên liệu nghiên cứu (thái lát: trái; bột: phải) 25

Hình 2.2 Quy trình chiết tách chế phẩm NEB quy mô 30 kg dược liệu khô/mẻ 27

Sơ đồ Sơ đồ 2.1 Thiết kế các nội dung nghiên cứu 30

Sơ đồ 2.2 Nghiên cứu tác dụng giảm đau quặn bằng acid acetic 31

Sơ đồ 2.3 Nghiên cứu tác dụng chống viêm cấp trên mô hình gây phù bàn chân chuột bằng carrageenin 32

Sơ đồ 2.4 Nghiên cứu tác dụng chống viêm mạn trên mô hình gây u hạt 34

Sơ đồ 2.5 Đánh giá độc tính cấp tính 38

Sơ đồ 2.6 Đánh giá độc tính bán trường diễn 39

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Công thức stacking gel và resolving gel 36

Bảng 3.1 Số cơn đau quặn của chuột tại các thời điểm thí nghiệm 41

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của NEB lên mức độ phù bàn chân chuột (%) 42

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của NEB lên khối lượng u hạt trên chuột cống trắng 43

Bảng 3.5 Số chuột chết trong 72 giờ đầu thử độc tính cấp của NEB 45

Bảng 3.6 Mô tả tình trạng chuột ở các lô thử nghiệm trong vòng 7 ngày 45

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của NEB đến tỷ lệ tăng khối lượng chuột cống cái 474

Bảng 3.8 Ảnh hưởng của NEB đến tỷ lệ tăng khối lượng chuột cống đực 47

Bảng 3.9 Ảnh hưởng của NEB trên các chỉ số huyết học của chuột cống trắng cái 48

Bảng 3.10 Ảnh hưởng của NEB trên các chỉ số huyết học của chuột cống trắng đực 49

Bảng 3.11 Ảnh hưởng của NEB đến các chỉ số protein toàn phần, cholesterol toàn phần, AST, ALT của chuột cống trắng giống cái 50

Bảng 3.12 Hình ảnh vi thể gan lô chuột cái (Nhuộm HEx400 và PAS x400) 52

Bảng 3.13 Ảnh hưởng của NEB đến các thông số protein toàn phần, cholesterol toàn phần, AST, ALT của chuột cống trắng giống đực 53

Bảng 3.14 Hình ảnh vi thể gan ở các lô chuột đực (Nhuộm HEx400 và PAS x400) 54 Bảng 3.15 Ảnh hưởng của NEB đến chỉ số creatinin huyết thanh của chuột cống trắng giống cái 55

Bảng 3.16 Hình ảnh mô bệnh học thận ở các lô chuột cái (Nhuộm HEx400 và PAS x400) 56

Bảng 3.17 Ảnh hưởng của NEB đến chỉ số creatinin huyết thanh của chuột cống trắng giống đực 57

Bảng 3.18 Hình ảnh mô bệnh học thận ở các lô chuột đực (Nhuộm HEx400 và PAS x400) 58

ĐẶT VẤN ĐỀ

Việt Nam nằm trong khu vực khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng và ẩm, được thiên nhiên ưu đãi nên có thảm thực vật phong phú và đa dạng, với khoảng hơn 14.000 loài thực vật bậc cao Trong đó, có khoảng gần 4.000 loài được sử dụng làm thuốc trong y học cổ truyền [25] Nước ta có nền y học cổ truyền hết sức đa dạng và đặc sắc, với bề dày hàng nghìn năm lịch sử, nền y học dân tộc cũng không ngừng phát triển qua các thời kỳ đó Hiện nay việc sử dụng thuốc có nguồn gốc thực vật ở nước ta nói riêng và thế giới nói chung có chiều hướng gia tăng mạnh mẽ Nhiều người tin rằng các loại thuốc có nguồn gốc thực vật ít gây tác dụng không mong muốn hơn các loại thuốc có nguồn gốc hóa dược Tuy nhiên việc sử dụng các loại sản phẩm bảo vệ sức khỏe có nguồn gốc từ thực vật chủ yếu vẫn còn dựa trên kinh nghiệm dân gian, chưa có đầy đủ bằng chứng khoa học Nhiều cây thuốc, vị thuốc

có tác dụng tốt trên lâm sàng nhưng chưa được nghiên cứu sâu về tác dụng dược lý,

cơ chế tác dụng và độc tính Nghiên cứu để khai thác, kế thừa, ứng dụng và phát triển nguồn thực vật làm thuốc đã, đang và sẽ là vấn đề có ý nghĩa khoa học, kinh tế

và xã hội rất lớn ở nước ta

Cây Sâm đại hành Eleutherine bulbosa (Mill.) Urb thuộc họ La dơn

(Iridaceae), là một dược liệu phổ biến ở nước ta, mọc hoang ở nhiều nơi, thường được trồng lấy củ làm thuốc để chữa trị các chứng bệnh thiếu máu, vàng da, mệt mỏi, các chứng bệnh ho, viêm họng cấp và mạn, đinh nhọt, viêm da, lở ngứa, chốc đầu, tổ đỉa, vảy nến, tiêu viêm [7] Loài này cũng phổ biến ở vùng nam Mỹ và các nước ở khu vực Đông nam Á, thường được dùng trong y học dân gian để chữa trị các chứng bệnh về tim và phục hồi vết thương [8], [25] Các nghiên cứu trước đây cho thấy củ sâm đại hành có chứa các hợp chất naphtoquinon cùng một số dẫn xuất của anthraquinon và naphthalen [33], [80] Các hợp chất này thể hiện những hoạt tính sinh học đáng chú ý như kháng khuẩn, kháng nấm, kháng viêm giảm đau, gây độc tế bào [87]

Nhằm làm rõ tác dụng chữa bệnh của cây Sâm đại hành trong dân gian, góp phần xây dựng cơ sở dữ liệu, ứng dụng Sâm đại hành nhiều hơn trong y dược lâm sàng, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tác dụng giảm đau, chống viêm, độc

tính của chế phẩm naphtoquinon từ củ Sâm đại hành (Eleutherine bulbosa (Mill.)

Urb.) trên thực nghiệm” với hai mục tiêu:

1 Đánh giá tác dụng giảm đau, chống viêm và tác dụng trên COX-2 của chế phẩm naphtoquinon từ củ Sâm đại hành

2 Đánh giá độc tính cấp và độc tính bán trường diễn của chế phẩm

naphtoquinon từ củ Sâm đại hành trên thực nghiệm

Phần 1 TỔNG QUAN

1 Tổng quan về đau và các đích tác dụng của thuốc giảm đau

1.1 Định nghĩa, phân loại, đường dẫn truyền cảm giác đau

Định nghĩa đau

Hiệp hội quốc tế nghiên cứu về đau (ISAP) định nghĩa: Đau là một cảm giác

khó chịu và trải nghiệm cảm xúc xuất hiện cùng lúc với sự tổn thương thực sự hay

tiềm tàng của các mô hoặc được mô tả theo kiểu giống như thế [51]

Theo Geissner và Wurtele, đau theo sinh lý học thần kinh là một khái niệm

trừu tượng phụ thuộc những yếu tố như: cơ địa, cảm xúc và sự chịu đựng khác nhau

của từng người bệnh [41]

Như vậy đau là một cảm giác báo hiệu một tổn thương thực thể nhưng cũng

mang tính chủ quan tâm lý, bao gồm cả những chứng đau tưởng tượng, đau không

có căn nguyên hay gặp trên lâm sàng [51]

Phân loại đau

Có nhiều cách phân loại đau, trong đó có 3 cách phân loại chính hiện áp

dụng [51] gồm:

Phân loại đau theo cơ chế gây đau

1 Đau cảm thụ (nociceptive pain): là đau do tổn thương tổ chức (cơ, da, nội

tạng…) gây kích thích vượt ngưỡng đau

Đau cảm thụ có 2 loại: đau thực thể (somatic pain) là đau do tổn thương mô

da, cơ, khớp… và đau nội tạng (visceral pain) là đau do tổn thương nội tạng

2 Đau thần kinh (neuropathic pain): Là chứng đau do những thương tổn

nguyên phát hoặc những rối loạn chức trong hệ thần kinh gây nên

3 Đau hỗn hợp (mixed pain): gồm cả 2 cơ chế đau cảm thụ và đau thần kinh

Ví dụ: đau thắt lưng với bệnh lý rễ thần kinh, bệnh lý rễ thần kinh cổ, đau do ung

thư, hội chứng ống cổ tay…

4 Đau do căn nguyên tâm lý (psychogenic pain)

Comment [LTD1]: Sửa lại cách viết tài liệu

tham khảo

Comment [LTD2]: -Cách viết

-Trích dẫn ở đâu để tài liệu ở đó không vo thành cục ở đầu cả đoạn thế này nhé

Phân loại đau theo thời gian

1 Đau cấp tính (acute pain): là đau mới xuất hiện, có cường độ mạnh mẽ, có thể được coi là một dấu hiệu báo động hữu ích Thời gian đau dưới 3 tháng

2 Đau mạn tính (chronic pain) là chứng đau dai dẳng tái đi tái lại nhiều lần

Ngoài ra, đau còn được phân loại theo khu trú đau (gồm: đau cụ bộ, đau xuất

chiếu và đau lan xiên)

Đường dẫn truyền cảm giác đau

 Tín hiệu đau từ ngoại biên được truyền về tủy sống nhờ hai sợi thần kinh

là sợi Aδ (có myelin, truyền cảm giác đau cấp: đau nhói, đau tại chỗ với tốc dộ nhanh) và sợi C ( không có myelin, truyền cảm giác đau mạn: đau âm ỉ, đau lan tỏa, đau do bỏng với tốc độ chậm) Nếu chỉ ức chế sợi Aδ thì mất cảm giác đau cấp, nếu

ức chế sơi C bằng thuốc gây tê tại chỗ thì mất cảm giác đau chậm [23]

 Dẫn truyền cảm giác từ tủy lên não (nơron thứ hai): cảm giác đau được dẫn truyền theo nhiều hướng: bó gai – thị nằm ở cột trắng trước – bên; bó gai – lưới tận cùng các vùng khác nhau của hành não, cầu não, não giữa ở cả hai bên Từ cấu tạo lưới nằm ở các vùng này, nhiều nơron đi tới các nhân của đồi thị và một số vùng

ở nền não, có những sợi đi lên hoạt hóa vỏ não Tại các synap với nơron thứ hai ở sau cùng tủy, các sợi C tiết ra chất truyền đạt là chất P Chất P là chất trung gian hóa học chủ yếu trong đường dẫn truyền cảm giác đau [23]

 Trung tâm nhận thức cảm giác đau: đường dẫn truyền cảm giác đau tận cùng ở cấu trúc lưới của thân não, trung ttâm dưới vỏ như nhân lá trong của đồi thị

và vùng S-I, S-II, vùng đỉnh, vùng chán của vỏ não Cấu trúc lưới và trung tâm dưới

vỏ có chức năng nhận thức đau vừa, tạo ra đáp ứng về tâm lý khi đau Vỏ não phân tích cảm giác đau tinh vi, phân biệt vị trí, đánh giá mức độ đau [23]

1.2 Một số đích tác dụng của thuốc giảm đau

1.2.1 Kích thích các receptor opioid (µ, k, δ):

Cơ chế giảm đau khi kích thích các receptor opioid (µ, k, δ), tất cả các receptor (µ, k, δ) của opioid đều cặp đôi với protein Gi Khi kích thích các receptor này, gây ức chế adenylcyclase, ức chế mở kênh Ca2+ và hoạt hóa kênh K+ (tăng ưu cực) Vì vậy, ức chế giải phóng các chất dẫn truyền thần kinh (chất P, acid glutamic)

và ngăn cản dẫn truyền xung động thần kinh Các tác động cụ thể [4]:

 Receptor muy (µ): khi kích thích gây tác dụng giảm đau, ức chế hô hấp,

co đồng tử, giảm co bóp cơ trơn dạ dày, ruột và gây sảng khoái

 Receptor kappa (k): khi kích thích gây tác dụng giảm đau, suy hô hấp, co đồng tử và an thần

 Receptor delta (δ): chưa được nghiên cứu đầy đủ trên người, nhưng trên động vật khi kích thích cũng gây tác dụng giảm đau

Các thuốc kích thích lên receptor opioid hiện có gồm:

+ Thuốc chủ vận trên receptor opioid:

 Các opioid tự nhiên: morphin, codein,…

 Các opioid tổng hợp: pethidin, methadon,…

+ Thuốc chủ vận – đối kháng hỗn hợp và chủ vận từng phần trên receptor opioid: pentazocin, nalorphin, nalbuphil, butorphanol,…

+ Thuốc đối kháng đơn thuần trên receptor opioid: naloxon, naltrexon [4]

Chỉ định trong điều trị đau: Các trường hợp đau nặng như gẫy xương đùi,

đau sau mổ, cơn nhồi máu cơ tim, ung thư giai đoạn cuối… [4]

Tác dụng không mong muốn: Gây táo bón, buồn nôn và nôn, ức chế hô hấp, gây nghiện, hội chứng kích thích, tụt huyết áp… [4]

1.2.2 Ức chế enzym cyclooxygenase (COX)

Cơ chế giảm đau khi ức chế enzym cyclooxygenase (COX) sẽ ức chế sự tổng hợp prostaglandin, chất trung gian hóa học khởi phát nhiều quá trình sinh lý và bệnh

lý của cơ thể Prostaglandin sẽ khơi mào cho việc tạo ra các chất trung gian hóa học khác như serotonin, bradikinin, histamin… ở ngọn sợi cảm giác (ngoại vi) nên các thuốc nhóm này được xếp vào nhóm giảm đau ngoại vi [5], [6]

Thuốc giảm đau ngoại vi bao gồm: thuốc giảm đau - hạ sốt - chống viêm (như: Aspirin, diclofenac, indomethacin, ibuprofen, naproxen,…) và paracetamol Chỉ định trong điều trị đau: Đau ở mức độ nhẹ và vừa: đau đầu, đau bụng kinh, đau khớp… [5], [6]

Tác dụng không mong muốn: loét dạ dày, suy thận, chảy máu…một số thuốc như aspirin gây mẫn cảm (phù Quinck, ban da) [5], [6]

2 Tổng quan về viêm và một số đích tác dụng của thuốc chống viêm

2.1 Khái niệm, phân loại và sinh lý viêm

Khái niệm

Viêm là một đáp ứng bảo vệ cơ thể của hệ miễn dịch trước sự tấn công của tác nhân bên ngoài (vi sinh vật, tác nhân hóa, lý, cơ) hoặc của tác nhân bên trong (hoại tử do thiếu máu cục bộ, bệnh tự miễn) Đây là một đáp ứng miễn dịch tự nhiên Quá trình viêm thường kèm theo các triệu chứng sưng, nóng, đỏ và đau, do các mạch máu giãn nở, đưa nhiều máu đến nơi tổn thương Các bạch cầu cũng theo mạch máu xâm nhập vào mô, tiết các chất prostaglandin, cytokine nhằm tiêu diệt hoặc trung hòa các tác nhân gây tổn thương Khi viêm không lành sẽ có thể trở thành viêm mãn tính [23], [42]

Phản ứng viêm hình thành do nhiều nguyên nhân khác nhau, có thể chia thành hai nhóm là nguyên nhân bên ngoài và nguyên nhân bên trong Tuy nhiên, rất khó phân biệt rõ ràng hai loại nguyên nhân này vì thực tế, nguyên nhân bên ngoài thường dẫn đến những biến đổi thành nguyên nhân bên trong [23] Nguyên nhân bên ngoài: nhiễm khuẩn là nguyên nhân phổ biến nhất Vi khuẩn, virus, nấm mốc và các kí sinh trùng tác động thông qua các độc tố, các sản phẩm chuyển hóa Tác nhân vật lí như chấn thương do va đập, vết thương kể cả vết thương vô khuẩn, bỏng nóng hoặc bỏng lạnh, tia xạ, dị vật Tác nhân hóa học là chất hòa tan gây hoại tử tế bào và tổn thương chất gian bào (dung dịch acid, kiềm, muối,…), chất gây thực bào của bạch cầu đa nhân Nguyên nhân bên trong: hoại tử tổ chức, nghẽn mạch, xuất huyết, viêm tắc động mạch, thay đổi nội sinh của các chất gian bào (như hình thành các

phức hợp miễn dịch kháng nguyên-kháng thể, sinh sản ung thư, một số chất dạng

bột), phản ứng miễn dịch (quá mẫn, tự miễn) [23]

Phân loại viêm

Tùy theo đặc điểm lâm sàng và mô học, viêm có thể phân thành 3 loại: viêm cấp tính, viêm mạn tính và viêm hạt [1]

Viêm cấp tính: viêm cấp có đặc điểm lâm sàng là khởi phát đột ngột, diễn

biến nhanh từ vài giờ đến vài ngày, vùng mô bị tổn thương (còn gọi là ổ viêm cấp tính) có dấu hiệu sưng, nóng, đỏ, đau; trường hợp viêm nặng có thêm tình trạng mất

chức năng riêng biệt của mô và cơ quan tương ứng [1] Ba đặc điểm mô học chính của viêm cấp là sung huyết động, phù viêm và thâm nhập tế bào mà chủ yếu là các bạch cầu đa nhân trung tính

Viêm mạn tính: viêm mạn tính là phản ứng viêm diễn ra trong thời gian dài

(hàng tuần, hàng tháng, hàng năm) Viêm mạn có thể phát triển tiếp sau một viêm cấp, khi mà tác nhân gây tổn thương vẫn còn tồn tại chưa bị tiêu diệt Viêm mạn cũng có thể xuất hiện ngay từ đầu trong những trường hợp này nó thường có khởi đầu ngấm ngầm, âm ỉ, không có triệu chứng lâm sàng rõ rệt [1] Các đặc điểm mô học chính của viêm mạn gồm có thâm nhập tế bào đơn nhân, tăng sinh mô liên kết - mạch máu

Viêm hạt: viêm hạt là một dạng đặc biệt của viêm mạn tính, xảy ra khi các

tác nhân gây viêm thuộc loại khó tiêu hủy Các tác nhân đó có thể là vi khuẩn (Mycobaterium tuberculosis,M leprae, Treponema pallidum), ký sinh trùng (Schistosoma mansoni, S japonicum), nấm (Cryptococcus neoformans), chất hóa học (silic, bột talc, tinh thể urat), chỉ phẫu thuật hoặc chưa rõ tác nhân gây tổn thương [1] Đặc điểm mô học của viêm hạt là sự hình thành các u hạt có đường kính nhỏ hơn 2 mm Cấu tạo của u hạt gồm tập hợp các tế bào tế bào biểu mô bị biến đổi

và một viền tế bào bao quanh (chủ yếu là lympho bào và một ít tương bào) [1]

Sinh lý quá trình viêm

Giai đoạn viêm cấp tính [23], [42]

Viêm cấp: Khi thời gian diễn biến viêm ngắn (vài phút – vài ngày) và có các đặc điểm như tiết dịch, dịch tiết chứa nhiều protein huyết tương và nhiều bạch cầu

đa nhân trung tính Trong giai đoạn cấp tính của viêm, có ba biến đổi chủ yếu là: Rối loạn tuần hoàn, rối loạn chuyển hóa, tổn thương mô và tăng sinh tế bào Trên thực tế bốn quá trình này đan xen và liên quan chặt chẽ đến nhau

* Sự rối loạn tuần hoàn tại ổ viêm:

Rối loạn tuần hoàn tại ổ viêm thường xảy ra sớm, ngay khi yếu tố gây viêm tác động lên cơ thể Có thể quan sát thấy 4 hiện tượng của rối loạn tuần hoàn gồm: rối loạn vận mạch, tạo dịch rỉ viêm, bạch cầu xuyên mạch và hiện

tượng thực bào

* Rối loạn chuyển hóa trong ổ viêm

Viêm gây rối loạn chuyển hóa glucid, tạo ra nhiều acid lactic Acid lactic tích lại trong ổ viêm, làm pH giảm dần từ rìa vào trong trung tâm ổ viêm Viêm nặng có thể gây nhiễm toan toàn cơ thể Rối loạn glucid muộn gây tăng chuyển hóa yếm khí rối loạn chuyển hóa lipid và protid

* Tổn thương mô

Thường có hai loại tổn thương: Tổn thương tiên phát do nguyên nhân gây viêm tạo ra và tổn thương thứ phát do các rối loạn tại ổ viêm tạo nên

* Tăng sinh tế bào và quá trình làm lành vết thương

Viêm bắt đầu bằng tổn thương và kết thúc bằng quá trình tái tạo Mô xơ

và các mạch máu mới là cơ sở hình thành sẹo thay thế cho mô tổn thương, làm lành vết thương

Giai đoạn viêm mạn tính

Viêm mạn diễn biến từ vài ngày đến hàng tháng thậm chí đến hàng năm Về

mô học có sự xâm nhập của lympho bào và đại thực bào, mức tổn thương ngang bằng với mức độ sửa chữa tổn thương

Giai đoạn mạn tính của phản ứng viêm gồm phản ứng tế bào phát triển chậm

và sự hình thành mô tạo keo Sự di cư tế bào nguồn gốc từ máu hoặc từ trung mô vẫn tiếp diễn ở ổ viêm rất lâu sau sự can thiệp của yếu tố tấn công Ổ viêm có thể diễn tiến tới chỗ làm mủ hoặc hoại tử Sự tăng sinh nguyên bào sợi và tân tạo mao mạch tạo thành u hạt U hạt khi tiến triển, mất các thành phần tế bào và các mao mạch đồng thời mô tạo keo xuất hiện dần dần [23], [42]

2.2 Một số đích tác dụng của thuốc chống viêm

2.2.1 Ức chế cyclooxygenase (COX)

Enzym cyclooxygenase (COX) còn được gọi là prostaglandin H/G synthase

có vai trò quan trọng trong quá trình tổng hợp các prostanoid Các phospholipid ở màng tế bào bị thủy phân bởi phospholipase A2 tạo ra acid arachidonic Enzym COX sẽ xúc tác cho quá trình tạo ra các prostanoid từ acid arachidonic Prostanoid

là thuật ngữ chung dùng để chỉ các phân tử bao gồm: prostaglandin (PG), các prostacyclin (PGI) và thromboxan (Tx) [42], [78]

Hai đồng phân của COX đã được xác định là COX-1 và COX-2 COX-1 hay PGG/H synthetase-1 có tác dụng duy trì các hoạt động sinh lý bình thường

của tế bào, là một "enzym cấu tạo" Enzym có mặt ở hầu hết các mô: thận, dạ dày, nội mạc mạch, tiểu cầu, tử cung, tinh hoàn Tham gia trong quá trình sản xuất các PG có tác dụng điều hoà các chức phận sinh lý, ổn định nội môi, bảo vệ tế bào, do đó còn gọi là "enzym giữ nhà'' ("house keeping enzyme"): Thromboxan A2 của tiểu cầu, prostacyclin (PGI2) trong nội mạc mạch, niêm mạc dạ dày, prostaglandin E2 tại dạ dày bảo vệ niêm mạc, prostaglandin E2 tại thận đảm bảo chức năng sinh lý [42], [78]

COX-2 hay PGG/H synthetase-2 có chức năng thúc đẩy quá trình viêm COX-2

có ở các tế bào tham gia vào phản ứng viêm như bạch cầu đơn nhân, đại thực bào, bao hoạt dịch khớp, tế bào sụn, và ở hầu hết các mô với nồng độ rất thấp trong trạng thái bình thường Trong các mô viêm, nồng độ COX-2 có thể tăng cao tới 80 lần so với nồng độ COX-2 ở trạng thái không viêm Các kích thích viêm gây cảm ứng và hoạt hóa mạnh COX-2, vì vậy COX-2 còn được gọi là "enzym cảm ứng” [42], [78]

Các prostanoid thường có dạng “số 2” (ví dụ PGE2) và được hình thành từ acid arachidonic, “số 2” này ngầm chỉ số liên kết đôi trong cấu trúc phân tử Các cyclooxygenase (COX) xúc tác cho phản ứng bis-oxy hóa, trong đó hai phân tử O2 được đưa vào khung carbon của acid arachidonic để tạo thành PGG2 Peroxidase (POX) xúc tác cho phản ứng khử nhóm 15- hydroperoxyl của PGG2 để cho sản phẩm là PGH2 và nước Phản ứng của POX đóng vai trò quan trọng trong cơ chế enzym, các peroxidase khác như glutathione peroxidase cũng đóng vai trò quan trọng trong phản ứng khử PGG2 thành PGH2 trong cơ thể PGH2 không được tích

tụ trong tế bào mà được biến đổi nhanh chóng thành những chất khác gây đáp ứng sinh học: PGD2, PGE2, PGF2α, PGI2 và TxA2 Ngoại trừ PGF2α được tạo ra sau phản ứng khử hai electron của PGH2, còn các chất khác được tạo ra dưới xúc tác của các enzym không oxy hóa để sắp xếp lại cấu trúc phân tử Các prostanoid cuối cùng gắn đặc hiệu với một hoặc một số receptor liên kết với protein G, một số prostanoid khác lại thể hiện tác dụng qua receptor ở nhân [89]

Prostaglandin PG): Trong viêm cấp, các mô và mạch máu sản xuất ra PGE2

và PGI2, các tế bào mast giải phóng ra PGD2 Trong viêm mạn các bạch cầu đơn nhân và đại thực bào giải phóng ra PGE2 và thromboxan A2 Các chất PGE2, PGI2, PGD2 là các chất giãn mạch, đồng thời cũng hiệp đồng tác dụng với các chất giãn mạch khác như histamin và bradykinin Chúng không trực tiếp làm tăng tính thấm

thành mạch mà gián tiếp qua histamin và bradykinin Tuy nhiên, bên cạnh chức năng trung gian trong viêm, một số PG còn đóng vai trò chống viêm đáng kể do làm giảm hoạt tính của các tế bào viêm Ví dụ, PGE2 làm giảm giải phóng các enzym của lysosom và các chất chuyển hóa gây độc từ bạch cầu trung tính, làm giảm giải phóng histamin từ tế bào mast [76]

Cơ chế chống viêm khi ức chế enzym cyclooxygenase -2 (COX-2): ức chế

COX-2, ngăn cản tổng hợp prostaglandin là chất trung gian hóa học gây viêm, do

đó làm giảm quá trình viêm Các thuốc chống viêm không steroid (NSAIDs) như: aspirin, indomethacin, meloxicam, peroxicam, diclofenac, celecoxib, ibuprofen, nimesulid…có tác dụng chống viêm là do ức chế enzym cyclooxygenase -2 [4], [44]

Hình 1.1 Con đường chuyển hóa acid arachidonic thông qua COX [63]

Ngoài ra NSAIDs còn đối kháng với hệ enzym phân hủy protein, ngăn cản quá trình biến đổi làm bền vững màng lysosom và đối kháng tác dụng của các chất trung gian hóa học như bradykinin, histamin, serotonin, ức chế hóa ứng động bạch cầu, ức chế sự di chuyển của bạch cầu tới ổ viêm [4], [44]

2.2.2 Ức chế enzym lypoxygenase (LOX)

Enzym lypoxygenase (LOX) xúc tác cho quá trình chuyển hóa acid arachidonic thành các leucotrien, là một nhóm các chất trung gian gây viêm Leucotrien hoạt động như một chất hóa ứng động, lôi kéo các tế bào của hệ thống miễn dịch đến ổ viêm [75]

Các enzym LOX phổ biến nhất là 5, 12 và 15- LOX [82] Khi acid arachidonic đƣợc chuyển hóa bởi 12-LOX và 15-LOX cho các lipoxin là những chất có tác dụng chống viêm bằng cách: tổng hợp các chalon (là phân tử tín hiệu dừng quá trình viêm),

ức chế các receptor của leucotrien, giảm hoạt hóa tế bào bạch cầu đơn nhân [20] Ở người, 5-LOX đƣợc có mặt trong các tế bào có nguồn gốc dòng tủy và đặc biệt là bạch cầu [75] 5-LOX xúc tác sự chuyển đổi của AA thành acid 5S-

hydroperoxyeicosatetraenoic (5- HpETE) (hình 1.2) và tiếp tục chuyển hóa 5- HpETE

thành LTA4 LTA4 có thể chuyển hóa thành LTB4 và sau đó thành các cysteinyl leucotrien dưới xúc tác của LTA4 hydrolase và LTC4 synthase tương ứng [41]

Hình 1.2 Con đường chuyển hóa acid arachidonic thông qua 5-LOX [31]

Các sản phẩm được chuyển hóa bởi 5-LOX gây hóa ứng động bạch cầu, kích hoạt bạch cầu hạt, tế bào T, tăng tổng hợp IgG, gây co thắt phế quản, co thắt tế bào

cơ trơn và có liên quan đến quá trình viêm nhiều bệnh lý như ung thư, đái tháo đường, béo phì [31], [41], [69]

2.2.3 Ức chế phospholipase A2

Glucocorticoid bao gồm glucocorticoid tự nhiên do vùng bó vỏ thượng thận sản xuất ra (hydrocortison và cortison) và glucocorticoid tổng hợp như predinisolon, methyprednisolon, triamcinolon, dexamethason có tác dụng chống viêm do ức chế phospholipase A2 thông qua kích thích tổng hợp lipocortin, làm giảm tổng hợp cả leucotrien và prostaglandin Ngoài ra nó còn có tác dụng ức chế dòng bạch cầu đơn nhân, đa nhân, lympho bào đi vào mô để gây khởi phát phản ứng viêm Vì vậy thuốc ức chế phospholipase A2 sẽ có tác dụng chống viêm do mọi nguyên nhân [4]

2.2.4 Một số đích tác dụng khác

Việc sản xuất quá mức và không kiểm soát của ROS (kết quả của stress oxi hóa), đặc biệt ROS có nguồn gốc ti thể kích thích trực tiếp lên điều chỉnh của các cytokin viêm liên quan với các tình trạng bệnh lý khác nhau trong các bệnh liên quan đến viêm ở người [66] Viêm xảy ra như là kết quả của stress oxy hóa Đáp ứng với tình trạng giải phóng quá nhiều gốc tự do (thường có nguồn gốc từ ti thể) sẽ dẫn đến một loạt của các bệnh lý của viêm, khởi động một chu trình đáp ứng tế bào phức tạp bắt đầu và kích hoạt một vài phân tử tín hiệu [73] Một trong những phân

tử trung gian truyền tín hiệu quan trọng là yếu tố sao chép nhân (NF-κB), yếu tố này điều chỉnh quá trình sản xuất các chất trung gian gây viêm hạ nguồn như: NO synthase cảm ứng (iNOS), interleukin-1β (IL-1β), yếu tố hoại tử khối u α (TNF-α)

và cyclooxygenase-2 (COX-2) NF-κB đóng vai trò quan trọng trong phản ứng viêm và chết tế bào, miễn dịch và đáp ứng stress cũng như điều hòa biểu hiện của các gen khác nhau [73]

Vì vậy việc ức chế các chất được tạo ra do quá trình viêm như interleukin (IL),

NO, prostaglandin E2 (PGE2), TNF-α [53], [67], [72], [92], nuclear factor – κB

(NF-κB) và các enzym iNOS (inducible nitric oxide synthase), NOS (nitric oxide synthase), COX (cyclooxygese)…[54] sẽ ức chế quá trình viêm

Histamin: Histamin được hình thành và dự trữ sẵn trong các hạt và được giải phóng do sự vỡ hạt của các dưỡng bào khi đáp ứng với các kích thích như: tổn thương vật lý, phản ứng miễn dịch làm gắn các kháng thể với dưỡng bào Histamin gây giãn các tiểu động mạch và tăng tính thấm thành mạch với tiểu tĩnh mạch [23] Leucotrien: Leucotrien B4 đã được báo cáo có vai trò trong việc lôi kéo bạch cầu tới lớp nội mạc của các mạch máu bị tổn thương và nó cũng cũng hoạt động như một chất hóa ứng động thực bào LTC4 và LTD4 gây co thắt phế quản mạnh và đã được tìm thấy trong các trường hợp dị ứng LTC4, LTD4 và LTE4 là những chất gây phản ứng chậm của phản ứng sốc phản vệ được tiết ra trong trường hợp dị ứng như hen suyễn hay sốc phản vệ [39]

Serotonin: serotonin có tác dụng tương tự như histamin

Các cytokin: TNF, IL-1, IL-6 tham gia phát triển phản ứng viêm tại chỗ hoặc

hệ thống Tại chỗ chúng làm hoạt hóa nội mô, ngoài ra còn gây sốt, làm tăng lượng bạch cầu đa nhân trung tính, tăng nguyên bào sợi và kích thích tổng hợp collagen Còn IL-8 là một tác nhân gây hóa ứng động và hoạt hóa mạnh đối với bạch cầu đa nhân trung tính Nó là chất cảm ứng mạnh của các cytokin khác, chủ yếu là TNF và IL-1 [23]

Yếu tố hoạt hóa tiểu cầu (PAF): PAF hoạt động trên các receptor đặc hiệu của nó và có khả năng gây ra nhiều hiện tượng trong viêm PAF hoạt hóa bạch cầu

đa nhân trung tính, kích thích sự xuyên mạch của bạch cầu, giải phóng các men của tiêu thể, gây hoạt hóa và kết dính tiểu cầu [23]

Hệ thống bổ thể: Hệ thống bổ thể có các thành phần C3a và C5a làm tăng tính thấm thành mạch C5a hoạt hóa con đường chuyển hóa LOX của acid arachidonic ở các bạch cầu đa nhân trung tính và bạch cầu đơn nhân, gây giải phóng các chất trung gian hóa học của quá trình viêm, C5a còn là tác nhân gây hóa ứng động mạnh bạch cầu [23]

Bradykinin: Bradikinin gây giãn mạch và tăng tính thấm thành mạch

Oxyd nitơ (NO) do đại thực bào sản xuất, có tác dụng làm giãn mạch, tăng tính thấm thành mạch, tăng sản xuất các PG gây viêm Tuy nhiên nếu đại thực bào

bị hoạt hóa sản xuất quá nhiều NO sẽ gây giãn mạch quá mức, gây sốc [76]

Hệ thống đông máu và tiểu tơ huyết: Hệ thống đông máu là một loạt những protein huyết tương có thể bị hoạt hóa bởi yếu tố Hageman Bước cuối cùng là sự chuyển fibrinogen thành fibrin Trong quá trình biến đổi này, các fibrinopeptid được hình thành, nó gây tăng tính thấm mao mạch và nó có hoạt tính hóa ứng động đối với bạch cầu [23]

Vì vậy ức chế tổng hợp histamin, leucotrien, serotonin, yếu tố hoạt hóa tiểu cầu (PAF), các cytokin, hệ thống bổ thể, bradykinin, hệ thống đông máu và tiêu tơ huyết, oxyd nitơ sẽ ức chế quá trình viêm

3 Một số mô hình thực nghiệm nghiên cứu về tác dụng giảm đau, chống viêm 3.1 Một số mô hình thực nghiệm nghiên cứu tác dụng giảm đau

Hiện nay, một số mô hình được dùng để nghiên cứu tác dụng giảm đau trên thực nghiệm như:

3.1.1 Mô hình gây đau quặn trên chuột của Koster (Writhing test)

Koster và cộng sự (1959) đã sử dụng tác nhân gây đau là acid acetic 1% Acid acetic kích thích giải phóng các chất trung gian như bradykinin, prostaglandin

và các cytokin như IL, TNF… gây cơn đau do viêm Chuột nhắt được tiêm màng bụng 0,1 ml dung dịch acid acetic 1% trong nước Đặt chuột trong hộp thí nghiệm

và quan sát số cơn đau quặn trong vòng 30 phút Biểu hiện cơn đau quặn là bụng kéo căng và ít nhất một chân duỗi ra Nếu thuốc có tác dụng giảm đau thì số lượng cơn đau quặn sẽ giảm [28], [59]

Thử nghiệm gây đau quặn là thử nghiệm thường dùng nhất để khảo sát tác

dụng của các thuốc giảm đau không gây ngủ (các thuốc giảm đau ngoại vi)

Ưu điểm: Đơn giản, dễ áp dụng

Nhược điểm: Việc đếm số cơn đau quặn phụ thuộc vào người quan sát

3.1.2 Mô hình gây đau bằng phiến nóng (hot plate method)

Bàn chân chuột rất nhạy cảm với nhiệt độ, tiến hành đặt chuột lên máy đo phản xạ bằng bản nhiệt có nhiệt độ ổn định là 55±1 độ C Dùng đồng hồ bấm giây xác định thời gian phản ứng đau của từng con (là khoảng thời gian tính từ lúc đặt chuột lên máy đến khi chuột có phản ứng liếm chân sau hoặc nhảy lên cao để tìm cách trốn khỏi phiến nóng) [24], [68] Nếu thuốc thử nghiệm có tác dụng giảm đau thì chuột sẽ không có hoặc chậm xuất hiện các phản xạ trên

Thực hiện 3 lần sau các khoảng thời gian là 20, 60, 90 phút kể từ khi cho

chuột dùng thuốc Xác định thời gian phản ứng đau trung bình của động thí nghiệm

So sánh kết quả giữa lô thử và lô chứng

Thử nghiệm này đánh giá tác dụng của thuốc giảm đau trung ương

Ưu điểm: tiến hành và quan sát dễ dàng Sơ bộ sàng lọc được tác dụng giảm

đau trung ương của thuốc

Nhược điểm: Không xác định được mức liều tối ưu Với thuốc giảm đau có

kèm theo tác dụng giãn cơ hoặc gây loạn thần thì mô hình này có thể cho phản ứng dương tính giả [68]

3.2 Một số mô hình thực nghiệm nghiên cứu tác dụng chống viêm

3.2.1 Mô hình nghiên cứu chống viêm cấp in vivo

a Mô hình gây phù chân chuột bằng carrageenin

Sau khi tiêm dưới da ở bề mặt gan bàn chân sau của chuột 0,05 ml dung dịch carrageenin 1% Tác nhân gây viêm carrageenin là một polysaccharid gần giống với cấu trúc của vỏ vi khuẩn sẽ khởi động các quá trình viêm cấp, kích thích giải phóng histamin, serotonin, prostaglandin … kích hoạt phản ứng viêm, gây giãn mạch và tăng tính thấm thành mạch biểu hiện quan sát thấy chủ yếu là triệu chứng phù Kết quả của quá trình viêm này là hiện tượng phù bàn chân chuột Các thuốc

có tác dụng chống viêm sẽ có khả năng ức chế hiện tượng phù [24], [42], [70] Trong quá trình viêm gây bởi carrageenin, mức độ viêm tối đa ở trong khoảng thời gian 3 – 4 giờ

Để đánh giá mức độ viêm, đo thể tích bàn chân tới khớp cổ chân, trước và sau khi tiêm carrageenin giữa các lô So sánh mức độ phù ở các lô để đánh giá tác dụng ức chế viêm của mẫu thử

Mô hình gây phù chân chuột bằng carragenin được sử dụng bởi nhiều nhà nghiên cứu và được chứng minh phù hợp với mục đích sàng lọc đánh giá tác dụng chống viêm của thuốc chống viêm không steroid, steroid, thuốc kháng histamin, kháng serotonin [24], [42], [70]

Ưu điểm: mô hình gây phù bàn chân chuột là mô hình đơn giản, dễ tiến hành viêm cấp đáp ứng trong vài giờ, thời gian tiến hành ngắn Carrageenin là

chất tan trong nước tạo thành dung dịch do đó sẽ tiêm được liều chính xác, tạo

độ phù ổn định

Nhược điểm: Kết quả có độ chính xác chưa cao do kết quả đo thể tích bàn chân chuột phụ thuộc vào yếu tố chủ quan là người tiến hành thí nghiệm Mô hình thường được dùng để sàng lọc thuốc mới

b Mô hình gây phù tai chuột nhắt bằng oxazol

Mô hình gây phù tai chuột bằng oxazol được mô tả đầu tiên bởi Evans và cộng sự (1971) là mô hình dựa trên phản ứng quá mẫn muộn của cơ thể gây ra bởi oxazol Kết quả của sự phơi nhiễm với oxazol là làm vỡ màng tế bào mast, giải phóng ra các chất trung gian gây phù Sử dụng dung dịch oxazol 2% nhỏ vào tai chuột nhắt để gây viêm Sau 24 giờ gây viêm, tính tỉ lệ % tặng khối lượng của tai phải so với tai trái rồi tính giá trị trung bình tỉ lệ % tăng khối lượng tai chuột trong mỗi lô Sau đó tính tỉ lệ phần trăm ức chế phù của lô thử so với lô chứng

Mô hình này cho phép đánh giá khả năng chống viêm tại chỗ của thuốc Đây cũng là phương pháp phù hợp để đánh giá tác dụng chống viêm của thuốc chống viêm steroid và không steroid [24], [42]

Ưu điểm: Áp dụng cho cả thuốc chống viêm không steroid và steroid Nhược điểm: Quá trình tiến hành kéo dài, tốn nhiều thời gian

3.2.2 Mô hình đánh giá tác dụng chống viêm mạn in vivo

a Mô hình gây u hạt thực nghiệm bằng bông ( Meier và cộng sự (1950))

Cấy vật lạ (bông cotton) không hấp thu vào cơ thể, cơ thể sẽ phản ứng bằng cách tập trung nhiều loại tế bào tạo mô bào lưới và nguyên bào sợi bao quanh vật lạ, tạo thành một khối u hạt thực nghiệm tương tự với tiến triển của viêm mạn tính Quá trình tăng sinh tế bào tạo u hạt bang mô hình này gồm 3 giai đoạn: giai đoạn 1

là giai đoạn thấm dịch, xuất hiện trong 3 giờ đầu tiên, viên bông sẽ ngấm dịch và đạt bão hòa; giai đoạn 2 là giai đoạn rỉ dịch, xuất hiện sau 3 – 72 giờ cấy bông; giai đoạn 3 là pha tăng sinh với sự xuất hiện của collagen trong u hạt Do đó có thể nghiên cứu cơ chế tác dụng của các thuốc thông qua các giai đoạn này Mô hình này rất nhạy với các thuốc chống viêm steroid Thí nghiệm được tiến hành trên chuột cống trắng Bông cotton được vê tròn, cân và sấy tiệt khuẩn Cấy miếng bông đó

vào dưới da lưng của chuột theo chiều hướng lên đầu Cho chuột dùng thuốc liên tục trong một thời gian từ 5 – 7 ngày Mổ chuột bóc tách u hạt đem cân tươi ngay từng u hạt, sau đó sấy khô tới khối lượng không đổi và cân khối lượng khô

Đánh giá tác dụng chống viêm (ức chế sự tạo u hạt) bằng cách so sánh tỷ lệ

% giảm trọng lượng trung bình các u hạt ở lô mẫu thử so với lô đối chứng [42]

Ưu điểm: cách tiến hành đơn giản, nguyên liệu rẻ tiền, dễ kiếm, không độc, cho kết quả tương đối tin cậy

Nhược điểm: sự tạo thành u hạt yếu

Theo kinh nghiệm của các nhà nghiên cứu, sự tạo thành u hạt sẽ mạnh hơn khi bông được tẩm carrageenin

b Mô hình gây u hạt thực nghiệm bằng amian (Ducrot, Julou và cộng sự, 1963)

Cấy vật lạ (sợi amian) không hấp thu vào cơ thể, cơ thể sẽ phản ứng bằng cách tập trung nhiều loại tế bào tạo mô bào lưới và nguyên bào sợi bao quanh vật lạ, tạo thành một khối u hạt thực nghiệm tương tự với tiến triển của viêm mạn tính Thí nghiệm được tiến hành trên chuột cống trắng Một sợi amian đường kính mặt cắt khoảng 2 mm, có trọng lượng 30 ± 1 mg được vê tròn và sấy tiệt khuẩn trong 2 giờ, ở nhiệt độ 160ºC trong tủ sấy Cấy viên amian vào dưới da lưng của chuột theo chiều hướng lên đầu Cho chuột dùng thuốc trong 5 ngày liên tục Mổ chuột bóc tách u hạt và cân tươi ngây từng u hạt Tính trọng lượng thực sự của u hạt bằng cách trừ trọng lượng viên sợi amian

Đánh giá tác dụng chống viêm (ức chế sự tạo u hạt) bằng cách so sánh tỷ lệ

% giảm trọng lượng trung bình các u hạt ở lô mẫu thử so với lô đối chứng [42]

Ưu điểm: amian là vật liệu trơ khi đưa vào cơ thể dễ tạo hình dáng, kích thước đồng đều, dễ bóc tách và rẻ tiền, sẵn có, nên đây là nguyên liệu gây u hạt thực nghiệm hay được sử dụng Mô hình này được sử dụng phổ biến ở Việt Nam Nhược điểm: amian có tính độc hại với cơ thể và môi trường; là một trong những yếu tố gây nên ung thư phổi và màng phổi, màng bụng

3.2.3 Mô hình nghiên cứu chống viêm in vitro

Nghiên cứu tác dụng chống viêm invitro, các mô hình nghiên cứu được xây dựng dựa trên định lượng nồng độ các chất được tạo ra do quá trình viêm như

interleukin (IL), NO, prostaglandin E2 (PGE2), TNF-α [53], [67], [72], [92], nuclear

factor – κB (NF-κB) và các enzym iNOS (inducible nitric oxide synthase), NOS (nitric oxide synthase), COX (cyclooxygese)…[54]

Dòng tế bào thường được sử dụng trong nghiên cứu tác dụng chống viêm in

vitro: RAW264.7 (dòng tế bào đại thực bào của chuột) [34], [92], U937 (dòng bạch

cầu đơn nhân của người) [92], J774A.1 (dòng tế bào đại thực bào của chuột) [72], THP-1 (dòng tế bào bạch cầu đơn nhân) được duy trì trong môi trường Rothwell Park Memorial Institue 1640 (RPMI 1640) có bổ sung thêm 100 U/ml penicillin,

100 µg/ml streptomycin và 10% huyết thanh phôi bò Dòng tế bào được phát triển trong điều kiện 37ºC, không khí ẩm có chứa 5% CO2

 Mô hình gây ức chế tạo thành NO [34], [53], [67], [72], [92]

Các tế bào được xử lý với mẫu thử trong 2 giờ rồi sau đó ủ với LPS (1 μg/mL) Sau quá trình ủ, các dịch môi trường trên được trộn lẫn với thuốc thử Griess (gồm 1% sulfanilamid, 0,1% N-1-naphthylenediamin dihydrochlorid và 2,5% acid phosphoric) Độ hấp thụ của hỗn hợp được đo ở 540 nm với một đầu đọc microplate Nồng độ nitrit được tính theo đường chuẩn của dung dịch nitrit

 Mô hình ức chế TNF-α và kích thích IL10 [34], [53]

Tế bào được xử lý trước với mẫu thử trong 2 h và ủ với LPS (1 μg/ml)

trong 24 h Nồng độ TNF-γ và IL 10 trong dịch tế bào được phân tích bằng kit

ELISA theo hướng dẫn của nhà sản xuất

Hiện nay, để định lượng các chất trung gian gây viêm như PGE2 và các cytokin, người ta sử dụng bộ kit ELISA theo hướng dẫn của nhà sản xuất Các bộ kit này dựa trên nguyên tắc ELISA cạnh trạnh

Tiến hành đánh giá tác dụng chống viêm in vitro của mẫu thử trên sự biểu

hiện gen của COX-2 và sự sản sinh PGE2 với chất kích thích viêm LPS và dòng

tế bào đại thực bào RAW264.7 với kỹ thuật đo lường là Western blot, ELISA và định lượng RT-PCR [43], [61], [66] Đây là các phương pháp phổ biến và có độ nhạy cao

4 Tổng quan về dược liệu nghiên cứu

4.1 Giới thiệu về Sâm đại hành

Dược liệu nghiên cứu được phân loại khoa học như sau:

Loài: Eleutherine subaphylla Gagnep

Trên thế giới, họ La dơn (Iridaceae) có khoảng 80-92 chi và bao gồm hơn

2000 loài, phân bố ở vùng nhiệt đới và ôn đới, chủ yếu ở Đông Phi và Châu Mỹ nhiệt đới

Ở Việt Nam có 8 chi là: Belamcanda, Crocosmia, Eleutherine, Freesia,

Gladiolus, Iris, Trimezia, Tritonia

Các cây thuộc họ La dơn là các cây có hoạt tính sinh học phong phú như: kháng viêm, độc tế bào… và cũng được sử dụng rất nhiều trong các bài thuốc dân gian ở Trung Quốc, Nhật Bản… để điều trị viêm họng, ho, ung thư [8], [13]…

Loài sâm đại hành (Eleutherine bulbosa)

Sâm đại hành là một loại cỏ sống lâu năm, cao từ 30-60 cm, dò (củ) hình trứng dài 4-5 cm, đường kính 2-3 cm giống như củ hành nhưng dài hơn, ngoài phủ vảy màu đỏ nâu, phía trong màu nâu hồng đến đỏ nâu Lá hình mác, gân lá song song, chạy dọc, trông giống như lá cau non, củ lại có tác dụng bổ cho nên gọi là 5 Sâm cau (lá như lá cau, bổ như sâm); lá có thể dài 40-50 cm, rộng 3-5 cm Từ củ mọc lên một cán mang hoa dài 30-40 cm, trên cán có một lá đài 15-25 cm, hoa mọc thành chùm 3 lá đài, 3 cánh tràng màu trắng hay vàng nhạt, 3 nhị màu vàng Bầu hình trứng, 3 cạnh 3 ngăn dài 1 mm, vòi dài 2,5 mm trên xẻ thành 3 trông như 3 mũi dùi Mùa hoa: tháng 4-6 Quả ít gặp

Hình 1.3 Cây Sâm đại hành (Eleutherine bulbosa)

Ở Việt Nam, Sâm đại hành mọc hoang và được trồng lấy củ làm thuốc tại nhiều nơi như Hà Tây cũ, Hòa Bình, Nghĩa Lộ, Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Nam, Đà Nẵng, Hà Nội Trồng sâm đại hành rất đơn giản: chỉ việc dùng củ vùi xuống đất như trồng hành, tỏi Khi thu hoạch, đào lấy củ về, rửa sạch, bóc lớp vỏ bên ngoài, thái mỏng, dùng tươi hoặc phơi hay sấy khô, rồi để nguyên hay tán bột mà dùng [8] Bên cạnh đó sâm đại hành cũng được sử dụng trong dân gian để trị thiếu máu, vàng

da, hoa mắt, choáng váng, nhức đầu, mệt mỏi, băng huyết, ho ra máu Nấu thành cao rồi luyện viên uống sát trùng, chữa chàm, chốc và bệnh ngoài da Sâm đại hành

đã phơi khô, sao qua, hãm uống làm thuốc an thần gây ngủ, bột dùng để cầm máu, uống trị ho, ho lao, thường phối hợp với Rẻ quạt làm thuốc trị ho, viêm họng [7]

4.2 Một số nghiên cứu về thành phần hóa học của Sâm đại hành

Năm 1951, lần đầu tiên cây Sâm đại hành được nghiên cứu bởi Schmid và cộng sự, hai hợp chất là eleutherine và isoeleutherine đã được phân lập [79]

Năm 1975, C Bianchi và cộng sự đã phân lập từ củ của cây Sâm đại hành hai hợp chất là eleutherine và eleutherol [33]

Năm 1978, Nguyễn Văn Đàn, Lê Văn Hồng, Lê Hùng Châu, Đào Hồng Vân

đã công bố phân lập được 4 hợp chất là eleutherine, isoeleutherine, eleutherol và một chất tại thời điểm phân lập được vẫn chưa xác định được cấu trúc Sắc ký lớp mỏng của dịch chiết còn cho biết có 16 vết trong đó có 9 vết màu vàng đậm nhạt khác nha8, 6 vết phát quang lơ và một vết màu hồng nhạt Cả 3 hoạt chất đều có tác

dụng kháng sinh đối với chủng Staphyllococcus aureus [17]

Năm 2006, Trương Minh Lương, Tô Trà Mi, Ngô Thị Minh Hiền đã tách được eleutherine tinh khiết từ sâm đại hành Việt Nam và xác nhận cấu trúc bằng các phương pháp phổ IR, 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT-135, DEPT90 và phổ khối Tổng hợp được hai hợp chất 6-nitroeleutherine và 6,8- đinitroeleutherine có hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm Hợp chất 6-nitroeleutherine có hoạt tính với vi khuẩn Gr (+) chủng S aureus còn hợp chất 6, 8-đinitroeleutherine kháng vi khuẩn Gr (+) chủng S aureus và kháng nấm mốc chủng F oxysporum [21]

Nguyễn Thị Hồng Vân và cộng sự (2012) đã công bố việc phân lập 2 hợp chất Eleutherine, Isoeleutherine từ Sâm đại hành [16]

Theo công bố mới và đầy đủ nhất năm 2016 về thành phần hóa học của cây Sâm đại hành, Đỗ Thị Thanh Huyền, Lê Minh Hà đã công bố phân lập và xác định được cấu trúc của 14 hợp chất là: (2S) dihydroeleutherineol-8-O-A-D-

glucopyranoside (NEB-1), eleutherineol (NEB-2), eleutherineoside A(NEB-3), hongconin (NEB-4), eleutherine (NEB-5), isoeleutherine (NEB- 6), eleuthoside C (NEB-7), Eleutherineoside C (NEB-8), eleutherineoside B (NEB-9), (R)-7-acetyl- 3,6-dihydroxy-8-methyltetralone (NEB-10), eleuthoside A (NEB-11), eleuthoside B (NEB-12), eleutherineoside D (NEB-13), 3,6,8-trihydroxy-1- ethylanthraquinone (NEB-14) Trong số đó, (2S) dihydroeleutherineol-8-O-A-Dglucopyranoside (NEB-

1) là hợp chất mới và hợp chất 3,6,8-trihydroxy-1- methylanthraquinone (NEB-14)

lần đầu tiên được phân lập từ loài sâm đại hành này [9]

3,6,8-trihydroxy-1- methylanthraquinone (NEB-14)

Như vậy ở Việt Nam và trên thế giới đã có các nghiên cứu về cây Sâm đại

hành từ rất sớm Các nghiên cứu cho thấy thành phần hoá học chủ yếu của sâm đại

hành là các hợp chất quinone và dẫn xuất

4.3 Một số nghiên cứu về tác dụng sinh học của củ Sâm đại hành

Năm 2003, Tânia Maria Almeida Alves và cộng sự đã nghiên cứu hoạt tính

của eleutherine, eleutherineone, isoeleutherine và isoeleutherol Eleutherine thể hiện

hoạt tính ức chế khối u thông qua cơ chế liên quan đến ức chế topoisomerase II

Isoeleutherine và isoeleutherol thể hiện hoạt tính ức chế sự phân chia của virus HIV

trong tế bào lympho H9 Eleutherineone, eleutherine, isoeleutherine thể hiện hoạt

tính kháng lại chủng nấm hại cây C sphaerospermum [27]

Năm 2006, Betriz Goncalves và cộng sự cũng đã chứng minh eleutherine có

tác dụng kháng lại các chủng vi khuẩn pycoccus aureus và streptococcus

haemolyticus A [30]

Năm 2010 nghiên cứu của Irawan Wijaya Kusuma và cộng sự về hoạt tính

kháng lại chủng nấm da T mentagrophytes của eleutherine cho thấy eleutherine tuy

thể hiện tác dụng kháng nấm thấp hơn so với chất chống nấm da miconazole đã

được thương mại hóa nhưng lại có ưu điểm là ít tác dụng phụ hơn Eleutherine cũng

thể hiện hoạt tính ức chế sự hình thành sắc tố đen melanin ở 5 ppm với độc tính

thấp hơn so với arbutin, một chất làm trắng da thương mại Như vậy, eleutherine

được coi như một chất bảo vệ da: chống nấm da và chống lại sự hình thành sắc tố

đen cho da [52]

Sujogya Kumar Panda và cộng sự (2010) đã nghiên cứu hoạt tính kháng nấm

candidall của các dịch chiết ethyl acetate, chloroform, buthanol, ethanol và nước

Comment [LTD3]: Xếp theo thứ tự năm phát

hiện hay gì đây em??

của sâm đại hành Trong số các dịch chiết này, dịch chiết buthanol có hoạt tính kháng nấm candidall cao hơn hẳn Nồng độ ức chế tối thiểu của các dịch chiết trong khoảng 0,046-1,5 mg/ml [83]

Năm 2015, Laxmipriya Padhi, Sujogya Kumar Panda đã nghiên cứu hoạt

tính kháng khuẩn của dịch chiết Eleutherine bulbosa chống lại một loạt vi khuẩn

kháng đa kháng thuốc bằng cách tính toán các vùng ức chế, nồng độ ức chế tối thiểu (MIC), nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBCs) và thời gian dược động học Bột khô

củ sâm đại hành (Eleutherine bulbosa) được chiết xuất bằng dung môi (ethyl

axetat, chloroform, buthanol, ethanol và nước) để chọn ra chất chiết tốt nhất, sau đó

cô lập các hợp chất hoạt tính sinh học tiếp theo để sử dụng với pin của vi khuẩn MDR (các chủng vi khuẩn đa kháng thuốc ) Kết quả thu được: buthanol là chất chiết xuất tốt nhất có MIC từ 46 mg / mL đến 187 mg / mL Dịch chiết buthanol và nước cho thấy các khu vực ức chế cao hơn so với các thuốc kháng sinh tiêu chuẩn gentamicin và ciprofloxacin [64] Dịch chiết sâm đại hành tẩm giấy có đường kính

10 mm đặt trên thạch có tác dụng ức chế sinh sản của Diplococcus pneumoniae,

Strepcoccus hemolyticus, S taphyllococcus Tác dụng này yếu hơn đối với Shigella flexneri, Shiga, Bacillus mycoides, B Anthraci, và không có tác dụng ức chế sinh

sản đối với Escherichia coli, Bacillus pyocyaneus, B diphteriae [64]

Ở Việt Nam, nghiên cứu của Ngô Thị Minh Hiền và cộng sự (2006) cũng đã chứng minh eleutherol ở nồng độ 30 ppm thể hiện hoạt tính kháng khuẩn mạnh đối

với vi khuẩn gây bệnh cho tôm là Vibro parahaemoliticus [22]

Nghiên cứu của Huỳnh Kim Diệu (2012) chứng minh sâm đại hành tác động

rất tốt trên vi khuẩn gram dương Staphylococcus aureus (MIC=256 - 512µg/ml) và

Streptococcus faecalis (MIC=512- 1024 µg/ml) Khả năng kháng các vi khuẩn gram

âm gây bệnh trên gia súc yếu hơn: Pseudomonas aeruginosa (MIC=2048-4096 µg/ml) yếu nhất đối với E.coli và Salmonella (MIC= 4096µg/ml) Bên cạnh đó, kết

quả có được cũng cho thấy khả năng kháng mạnh vi khuẩn gây bệnh quan trọng và

gây tử vong cao trên động vật thủy sinh của các dòng sâm đại hành: Edwardsiella

ictaluri gây bệnh gan thận mủ (MIC= 16-32µg/ml), và Edwardsiella tarda gây

nhiễm khuẩn máu, gây áp xe gan thận, gây bệnh trên tôm càng xanh (MIC=

64-128µg/ml), tỉ lệ tử vong 30-70% (có thể lên đến 100%), kế đến yếu hơn trên

Aeromonas hydrophila gây bệnh đốm đỏ (MIC=2048-4096 µg/ml) [12] Kết quả có

được phù hợp với Đỗ Tất Lợi (2003), cho sâm đại hành có tác dụng ức chế rõ rệt in vitro đối với phế cầu khuẩn, liên cầu tan máu, tụ cầu vàng, không có tác động đối

với Escherichia coli [7] và cũng lý giải được trên lâm sàng sâm đại hành có tác

dụng tốt đối với chốc đầu trẻ em, nhọt đinh, viêm da có mủ, viêm họng cấp và mạn tính, chàm nhiễm trùng,…[7]

Năm 2016, Đỗ Thị Thanh Huyền, Lê Minh Hà đã chứng minh cắn dịch chiết ethyl acetat của củ sâm đại hành có hoạt tính kháng viêm theo đường uống với mức

độ ức chế khối viêm là 52,12 %, và không thể hiện hoạt tính khi thử theo đường bôi Hợp chất mới EB-1 và các hợp chất EB-4, EB-5 và EB-6 phân lập từ củ Sâm đại hành ức chế tiềm năng sự sản sinh các cytokine IL-12 p40 (với giá trị IC 50 từ 0,1±0,08 5 ±0,4 µM) và IL-6 (với giá trị IC 50 từ 1,7±0,1 8,7 ±0,3 µM) từ tế bào tua Dendritic Cell sinh ra từ tủy xương Kết quả này cho thấy có thể sử dụng các hợp chất này như là các chất kháng viêm tiềm năng trong tương lai [9]

Phần 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu

2.1.1 Dược liệu nghiên cứu và mẫu nghiên cứu

Củ sâm đại hành được thu hoạch tại Lâm Đồng vào tháng 10 năm 2016, rửa sạch để loại bỏ tạp chất, thái lát, phơi, sấy ở 40-50C, đạt độ ẩm dưới 10%, xay nhỏ

và bảo quản trong túi nilon kín làm nguyên liệu nghiên cứu xây dựng quy trình chiết tách

Mẫu dược liệu được KS Nguyễn Kim Đào, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật giám định tên khoa học và tiêu bản lưu giữ tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam (Địa chỉ: số 18 Hoàng Quốc Việt – Cầu Giấy –

Hà Nội)

Hình 2.1 Nguyên liệu nghiên cứu (thái lát: trái; bột: phải)

Chế phẩm napthoquinon (đạt 42% tính theo tổng hàm lượng eleutherin và

isoeleutherin, ký hiệu: NEB) chiết tách từ củ Sâm đại hành (Eleutherine bulbosa)),

được bào chế theo Tiêu chuẩn cơ sở của Viện Hóa học trong phạm vi đề tài cấp Viện Hàn lâm KHCNVN, mã số: VAST.ƯDCN.01/16-18, sản xuất và lưu mẫu tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm KHCNVN Chế phẩm naphtoquinon từ củ Sâm đại hành được ký hiệu là NEB dùng trong nghiên cứu này do Viện Hóa học (TS Phạm Thị Bích Hạnh) cung cấp

Ngâm chiết với EtOH 90% trên thiết bị chưng cất Apeks kết nối bơm chân không bằng phương pháp 1, 55-60 o

C, 2 giờ, (lặp lại chiết 3 lần), gộp dịch chiết và lọc, cô đặc dịch chiết trên thiết bị chưng cất APESK kết nối bơm chân không, ~60 o

Dịch nước còn lại (Chiết

với BuOH để xử lý sau)

- Tủa được rửa lại trên phễu lọc sứ, sử dụng hỗn hợp

rửa là axeton/n- hexan: (1:3, v/v ) lạnh và hút kiệt

Hình 2.2 Quy trình chiết tách chế phẩm NEB quy mô 30 kg dược liệu khô/mẻ

2.1.2 Động vật và tế bào thí nghiệm

- Chuột cống trắng chủng Wistar khỏe mạnh, cân nặng 130 - 150g do Học

viện Quân Y cung cấp

- Chuột nhắt trắng , chủng Swiss albino khỏe mạnh, cân nặng 18-22g do

Viện vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp

- Động vật được nuôi trong điều kiện nhiệt độ phòng, ánh sáng tự nhiên, cho

ăn bằng thức ăn chuẩn do viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cấp, uống nước tự do Chuột được nuôi ổn định trong điều kiện thí nghiệm tối thiểu 5 ngày trước khi bắt đầu nghiên cứu

- Tế bào sử dụng trong nghiên cứu: Tế bào RAW264.7 (là đại thực bào có nguồn gốc từ chuột nhắt) được cung cấp bởi American Type Culture Collection (ATCC® TIB-71™), được lưu giữ trong nitơ lỏng

2.1.3 Hóa chất và thiết bị nghiên cứu

- Ống nghiệm chống đông EDTA K2 của hãng HTM Việt Nam

- Acid acetic (Merk)

- Carrageenin (Sigma Aldrich)

- NaCMC 0,1% (Sigma Aldrich)

- Ethanol 96%, nước cất hai lần, n-hexan, ethyl acetat, methanol, cloroform,

aceton, dicloromethan, DMSO

- Chất gây viêm: lipopolysaccharid (Sigma, St Louis, MO)

Môi trường nuôi cấy tế bào Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), huyết thanh bào thai bê (fetal bovine serum: FBS), HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethane sulfonic acid) của hãng Invitrogen-Đức, Kháng sinh penicillin, streptomycin (100 µg/ml), NaCl, Tris, NP40 - hãng Sigma (St Louis, MO) Kháng thể kháng IgG thỏ có gắn HRP (anti-rabbit IgG HRP-linked antibody), kháng thể kháng IgG chuột nhắt có gắn HRP (anti-mouse IgG HRP-linked antibody), kháng thể kháng COX-2 của Viện công nghệ sinh học Invitrogen, CA, kháng thể kháng -Actin (sc-47778) của hãng Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, Califonia, USA)

Bộ dung dịch ECL Prime gồm dung dịch luminol và dung dịch peroxid do hãng GE Heathcare UK Limited cung cấp

Các dụng cụ và hóa chất khác đạt tiêu chuẩn thí nghiệm

Máy móc, thiết bị

- Máy đo độ phù chân chuột Plethysmometer LE 7500 (Letica Scientific Instruments)

- Tủ sấy Memmert, Binder-FD115

- Cân kĩ thuật Precisa BJ 610C, cân phân tích Precisa 262SMA-FR, cân xác định độ ẩm Precisa HA 60

- Micropipet một đầu kênh và đa kênh với các loại thể tích: 2-10 µl, 10-100

2.2 Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu gồm hai nội dung chính để giải quyết hai mục tiêu

Nội dung 1: Các thử nghiệm in vivo đánh giá tác dụng giảm đau, chống viêm

thực nghiệm và thử nghiệm invitro để đánh giá tác dụng ức chế enzym COX-2

 Thử nghiệm tác dụng giảm đau ngoại vi trên mô hình gây đau quặn bằng acid acetic

 Thử nghiệm tác dụng chống viêm cấp trên mô hình gây phù chân chuột bằng carrageenin

 Thử nghiệm tác dụng chống viêm mạn trên mô hình gây u hạt bằng bông

 Thử nghiệm tác dụng ức chế enzym COX-2 trên tế bào RAW264.7

Nội dung 2: các thử nghiệm in vivo đánh giá độc tính cấp và độc tính bán

trường diễn thực nghiệm

 Thử nghiệm độc tính cấp trên chuột nhắt trắng

 Thử nghiệm độc tính bán trường diễn trên chuột cống trắng

Sơ đồ 2.1 Thiết kế các nội dung nghiên cứu 2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Đánh giá tác dụng giảm đau, chống viêm của NEB

2.3.1.1 Đánh giá tác dụng giảm đau bằng phương pháp gây đau quặn bằng acid acetic

Tiến hành đánh giá tác dụng giảm đau theo mô hình gây đau quặn cho chuột nhắt trắng khi tiêm dung dịch acid acetic [28], [59] Chuột được chia ngẫu nhiên thành các lô gồm lô chứng, lô đối chiếu và các lô thử thuốc

- Lô chứng (n=11): uống dung môi NaCMC 0.1% với liều 0,1ml/ 10g cân nặng

- Lô đối chiếu (n=10): uống diclofenac với liều 20 mg/kg cân nặng pha trong NaCMC 0.1%

- Lô NEB liều 1(n=11): uống NEB pha trong NaCMC 0,1% với liều 36