Đánh giá tác dụng hạ lipid máu, chống đống máu và độc tính của viên hoàn giọt chứa đan sâm, tam thất việt nam trên thực nghiệm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI HOÀNG THỊ KIM QUÝ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG HẠ LIPID MÁU, CHỐNG ĐÔNG MÁU VÀ ĐỘC TÍNH CỦA VIÊN HOÀN GIỌT CHỨA ĐAN SÂM, TAM THẤT VI

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

HOÀNG THỊ KIM QUÝ

ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG HẠ LIPID MÁU,

CHỐNG ĐÔNG MÁU VÀ ĐỘC TÍNH CỦA VIÊN HOÀN GIỌT CHỨA ĐAN SÂM, TAM THẤT

VIỆT NAM TRÊN THỰC NGHIỆM

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2021

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

HOÀNG THỊ KIM QUÝ

ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG HẠ LIPID MÁU, CHỐNG ĐÔNG MÁU VÀ ĐỘC TÍNH CỦA VIÊN HOÀN GIỌT CHỨA ĐAN SÂM, TAM THẤT

VIỆT NAM TRÊN THỰC NGHIỆM

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC LÝ- DƯỢC LÂM SÀNG

MÃ SỐ: 8720205

Người hướng dẫn khoa học: 1.TS.Chử Thị Thanh Huyền

2 PGS.TS.Nguyễn Thùy Dương

HÀ NỘI 2021

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thùy Dương, TS

Chử Thị Thanh Huyền đã rộng lòng trao cho tôi cơ hội làm nghiên cứu thực nghiệm,

đã động viên, đưa ra những nhận xét nghiêm khắc, quan trọng trong suốt quá trình nghiên cứu, đã hướng dẫn nhiệt thành giúp tôi hoàn thành luận văn này

Gửi lời cảm ơn tới TS Bùi Thị Thúy Luyện, ThS Trần Trọng Biên đã tạo

điều kiện cung cấp mẫu và ủng hộ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu thực nghiệm

Cảm ơn DS Đinh Thị Kiều Giang và các anh chị kĩ thuật viên, các em sinh

viên đang nghiên cứu khoa học tại bộ môn Dược lực- trường đại học dược Hà Nội đã luôn sát cánh, chia sẻ công việc giúp tôi hoàn thành luận văn này Những ngày tháng nghiên cứu tại bộ môn, những chia sẻ của mọi người là động lực lớn giúp tôi hoàn thành nghiên cứu

Và cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến các thầy giáo, cô giáo trường đại học Dược Hà Nội, những người thầy đã tận tụy truyền tải tri thức trên giảng đường trong gần bảy năm học tập dưới mái trường Dược mến yêu Cảm ơn gia đình, bạn bè luôn động viên tinh thần và ủng hộ hết mực để tôi hoàn thành luận văn này

Hà Nội, ngày 31 tháng 3 năm 2021

Hoàng Thị Kim Quý

MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Đại cương về rôi loạn lipid máu 3

1.1.1 Khái niệm về lipid và chuyển hóa lipid 3

1.1.2 Hội chứng rối loạn lipid máu 5

1.1.3 Các thuốc điều trị rối loạn lipid máu 7

1.1.4 Tình hình nghiên cứu thuốc có nguồn gốc dược liệu điều trị rối loạn lipid máu trên thế giới và Việt Nam 11

1.1.5 Một số mô hình dược lý thực nghiệm gây tăng lipid máu để nghiên cứu thuốc điều trị rối loạn lipid máu 13

1.2 Đại cương về đông máu 17

1.2.1 Sinh lý quá trình đông máu 17

1.2.2 Cơ chế đông máu 17

1.2.3 Các thuốc chống đông máu 18

1.3 Mối quan hệ giữa tác dụng chuyển hóa lipid và tác dụng chống đông máu 20

1.3.1 Tương quan về bệnh sinh 20

1.3.2 Tương quan về tác dụng của thuốc 20

1.3.3 Tương quan về điều trị 21

1.4 Tổng quan về viên hoàn giọt chứa đan sâm, tam thất Việt Nam 22

1.4.1 Đan sâm 22

1.4.2 Tam thất 24

1.4.3 Các sản phẩm chứa đan sâm, tam thất 26

1.4.4 Viên hoàn giọt chứa đan sâm, tam thất Việt Nam 27

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

2.1 Đối tượng nghiên cứu 28

2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu 28

2.1.2 Động vật thí nghiệm 30

2.1.3 Hóa chất, thuốc thử 31

2.1.4 Thiết bị, dụng cụ 31

2.2 Nội dung nghiên cứu 32

2.3 Phương pháp nghiên cứu 33

2.3.1 Phương pháp đánh giá tác dụng hạ lipid máu của viên hoàn giọt chứa đan sâm, tam thất Việt Nam 33

2.3.2 Phương pháp đánh giá tác dụng chống đông máu của viên hoàn giọt chứa đan sâm, tam thất Việt Nam 37

2.3.3 Phương pháp xác định độc tính cấp và bán trường diễn của viên hoàn giọt chứa đan sâm, tam thất Việt Nam 38

2.3.4 Phương pháp xử lý số liệu 42

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 43

3.1 Kết quả đánh giá tác dụng hạ lipid máu của viên hoàn giọt chứa đan sâm, tam thất Việt Nam 43

3.2 Kết quả đánh giá tác dụng chống đông máu của viên hoàn giọt chứa đan sâm, tam thất Việt Nam 54

3.3 Kết quả xác định độc tính tiền lâm sàng của viên hoàn giọt chứa đan sâm, tam thất Việt Nam 56

Chương 4 BÀN LUẬN 69

4.1 Về tác dụng hạ lipid máu của viên hoàn giọt chứa đan sâm, tam thất Việt Nam 69 4.2 Về tác dụng chống đông máu của viên hoàn giọt chứa đan sâm, tam thất Việt Nam 76

4.3 Về độc tính cấp của viên hoàn giọt chứa đan sâm, tam thất Việt Nam 78

4.4 Về độc tính bán trường diễn của viên hoàn giọt chứa đan sâm, tam thất Việt Nam 80

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 84 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DG Bài thuốc Danshen-Gegen

ESC Hội Tim mạch châu Âu

%LYM Tỷ lệ % bạch cầu lympho

PAI-1 Plasminogen activator inhibitor-1

PL Phospholipids

IDL Lipoprotein tỷ trọng trung bình

LCAT Enzym lecithin cholesterol acyltransferase

LD Liều dùng

LD50 Liều trung bình gây chết 50% số lượng động vật thí nghiệm

LDL Lipoprotein tỷ trọng thấp

LDLR Thụ thể lipoprotein tỷ trọng thấp

LRP1 Thụ thể lipoprotein tỷ trọng thấp liên quan đến protein 1

LMWH Heparin có phân tử lượng thấp (low molecular weight heparin)

MCV Thể tích trung bình hồng cầu

M Giá trị trung bình

Non- HDL-C Cholesterol không HDL-C

OECD

Tổ chức hợp tác và phát triển kinh tế (Organization for Economic

Cooperation and Development)

P-407 Poloxamer 407

PLT Số lượng tiểu cầu

PPAR- α Thụ thể peroxisome proliferator activated receptor- α

PT Thời gian prothrombin (prothrombin time)

DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU

1 Bảng 1.1 Phân loại rối loạn lipid máu theo Fredrickson

6

2 Bảng 1.2 Mục tiêu điều trị chính trong quản lý và điều trị RLLPM 7

3 Bảng 2.1 Thành phần hỗn hợp dầu cholesterol

36

4 Bảng 3.1 Tác dụng của VHG ĐS-TT lên thời gian đông máu in vivo 55

5 Bảng 3.2 Ảnh hưởng của VHG ĐS-TT đến thông số huyết học 60

6 Bảng 3.3 Ảnh hưởng của VHG ĐS-TT đến thông số sinh hóa 61

7 Bảng 3.4 Ảnh hưởng của VHG ĐS-TT đến khối lượng các cơ quan

8 Bảng 3.5 Hình ảnh vi thê gan của các lô chuột nhắt đực 65

9 Bảng 3.6 Hình ảnh vi thê thận của các lô chuột nhắt đực 66

10 Bảng 3.7 Hình ảnh vi thê gan của các lô chuột nhắt cái 67

11 Bảng 3.8 Hình ảnh vi thê thận của các lô chuột nhắt cái 68

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

1 Hình 1.1 Chuyển hóa lipoprotein nội sinh và ngoại sinh 4

2 Hình 1.2 Chuyển hóa HDL và vận chuyển cholesterol 5

3 Hình 2.1 Viên hoàn giọt chứa đan sâm, tam thất Việt Nam 29

4 Hình 2.2 Sơ đồ thiết kế nội dung nghiên cứu 33

5

Hình 2.3 Sơ đồ thí nghiệm đánh giá tác dụng hạ lipid máu VHG

ĐS-TT trên mô hình tăng lipid máu nội sinh bằng P-407 35

6

Hình 2.4 Sơ đồ thí nghiệm đánh giá tác dụng chống đông in vivo của

7

Hình 3.1 Tác dụng của VHG ĐS-TT lên nồng độ TC ở mô hình gây

tăng lipid máu nội sinh trên chuột nhắt trắng 44

8

Hình 3.2 Tác dụng của VHG ĐS-TT lên nồng độ TG ở mô hình gây

tăng lipid máu nội sinh trên chuột nhắt trắng 45

9

Hình 3.3 Tác dụng của VHG ĐS-TT lên nồng độ LDL-C ở mô hình

gây tăng lipid máu nội sinh trên chuột cống trắng 47

10

Hình 3.4 Tác dụng của VHG ĐS-TT lên nồng độ TC ở mô hình gây

tăng lipid máu ngoại sinh trên chuột nhắt trắng 49

11

Hình 3.5 Tác dụng của VHG ĐS-TT lên nồng độ TG ở mô hình gây

tăng lipid máu ngoại sinh trên chuột nhắt trắng 51

12

Hình 3.6 Tác dụng của VHG ĐS-TT lên nồng độ LDL-C ở mô hình

gây tăng lipid máu ngoại sinh trên chuột nhắt trắng 52

13

Hình 3.7 Tác dụng của VHG ĐS-TT lên nồng độ HDL-C ở mô hình

gây tăng lipid máu ngoại sinh trên chuột nhắt trắng 53

14

Hình 3.8 Ảnh hưởng viên hoàn giọt chứa đan sâm, tam thất Việt

Nam đến khối lượng chuột nhắt đực 58

15

Hình 3.9 Ảnh hưởng viên hoàn giọt chứa đan sâm, tam thất Việt

Nam đến khối lượng chuột nhắt cái 58

ĐẶT VẤN ĐỀ

Rối loạn lipid máu (RLLPM) là bệnh lý phổ biến, có xu hướng gia tăng đặc biệt

ở các nước đang phát triển và làm tăng nguy cơ xuất hiện các bệnh lý tim mạch nguy hiểm như tai biến mạch máu não, nhồi máu cơ tim cấp, biến cố mạch vành và dẫn đến tử vong nhanh.Tại Việt Nam, theo thống kê của Viện Dinh dưỡng Quốc gia cho thấy hơn 29% người Việt trưởng thành bị rối loạn lipid máu, trong

đó tỷ lệ này ở người thành thị lên tới 44,3% [129]

Statin hiện là thuốc hạ lipid máu tiềm năng nhất được lựa chọn trong phòng ngừa tiên phát và thứ phát bệnh tim mạch, thuốc được sử dụng để giảm nguy cơ biến

cố của bệnh tim mạch do xơ vữa Statin có hiệu quả trong giảm cholesterol trong tất cả các loại tăng lipid máu Các hiệu quả của statin bao gồm ổn định mảng xơ vữa động mạch, cải thiện chức năng nội mô mạch vành, ức chế huyết khối tiểu cầu hình thành và tác dụng chống viêm mạch máu [82], [107]

Bên cạnh đó, thuốc chống đông đường uống mới lần lượt ra đời như thuốc ức chế trực tiếp thrombin (dabigatran), thuốc ức chế trực tiếp yếu tố Xa (rivaroxaban, apixapan) [102]

Trong quá trình nghiên cứu và phát triển thuốc mới, ngoài việc sử dụng thuốc có nguồn gốc hóa dược thì việc nghiên cứu các bài thuốc, chế phẩm có nguồn gốc từ dược liệu bằng cách phối hợp các vị dược liệu với nhau đang được khai thác Tại Việt Nam

đã có nhiều công trình nghiên cứu thuốc có nguồn gốc từ thảo dược có tác dụng hạ lipid máu như viên Cholestan, chế phẩm GM, viên nang Vinatan,…đã đạt được một số kết quả trên lâm sàng [1], [2], [34] Gần đây quy trình bào chế viên hoàn giọt từ hai vị dược liệu là đan sâm và tam thất đã được xây dựng qua đề tài “Bước đầu nghiên cứu bào chế hoàn giọt chứa đan sâm, tam thất trồng ở Việt Nam” [38] Viên hoàn giọt chứa đan sâm, tam thất Việt Nam là dạng bào chế viên hoàn, được bào chế bằng phương pháp đun chảy nhỏ giọt cao khô của hai loại dược liệu là đan sâm và tam thất, với mục đích tạo ra chế phẩm kích thước nhỏ gọn thuận tiện, dễ sử dụng [61], [73], [89] Trên thế giới đã có những nghiên cứu khoa học chứng minh tác dụng hạ lipid máu và tác

dụng chống đông của hai vị dược liệu đan sâm và tam thất tuy nhiên còn mang tính riêng lẻ từng dược liệu Tại Việt Nam, chưa có nghiên cứu khoa học nào rõ ràng đánh giá tác dụng trên của chế phẩm dạng phối hợp này Từ thực tế trên, đề tài tiến hành nghiên cứu: “Đánh giá tác dụng hạ lipid máu, chống đông máu và độc tính của viên hoàn giọt chứa đan sâm, tam thất Việt Nam trên thực nghiệm” với ba mục tiêu chính:

1 Đánh giá tác dụng hạ lipid máu của viên hoàn giọt chứa đan sâm, tam thất Việt Nam trên mô hình gây tăng lipid máu trên thực nghiệm

2 Đánh giá tác dụng chống đông máu của viên hoàn giọt chứa đan sâm, tam thất Việt Nam trên thực nghiệm

3 Xác định độc tính cấp và độc tính bán trường diễn của viên hoàn giọt chứa đan sâm, tam thất Việt Nam

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Đại cương về rôi loạn lipid máu

1.1.1 Khái niệm về lipid và chuyển hóa lipid

1.1.1.1 Khái niệm về lipid và lipoprotein

Lipid là những este hoặc amid của acid béo với alcol hoặc aminoalcol Các lipid

có mặt trong máu là các acid béo tự do, triglycerid (TG), cholesterol toàn phần (TC) gồm cholesterol tự do (FC) và cholesterol este (CE), phospholipids (PL) [8], [9], [18]

Lipid không tan trong nước nên để tuần hoàn được trong huyết tương và hệ bạch huyết, chúng phải kết hợp với protein đặc hiệu tạo thành phức hợp lipoprotein (LP) LP

là những phần tử hình cầu, bao gồm phần nhân là các phân tử TG và CE, xung quanh bao bọc bởi các phân tử gồm phospholipid, cholesterol tự do và các protein được gọi là các apolipoprotein (apo) [8], [101]

Bằng phương pháp siêu ly tâm dựa vào tỷ trọng, lipoprotein được phân chia thành 5 dạng: chylomycron (CM), lipoprotein tỷ trọng rất thấp (VLDL), lipoprotein tỷ trọng trung bình (IDL), lipoprotein tỷ trọng thấp (LDL), lipoprotein tỷ trọng cao (HDL) với vai trò, chức năng khác nhau trong chuyển hóa lipoprotein [8], [101]

1.1.1.2 Chuyển hóa lipoprotein

Lipoprotein được chuyển hóa theo hai con đường ngoại sinh và nội sinh với sự tham gia của các enzym và protein vận chuyển Chuyển hóa lipoprotein theo con đường ngoại sinh và nội sinh được mô tả trong hình 1.1

 Con đường chuyển hóa ngoại sinh

TG, TC, PL từ lipid thức ăn được hấp thu vào tế bào ruột dưới dạng cholesterol

tự do và acid béo Tế bào niêm mạc ruột sẽ tái tổng hợp TG, các apolipoprotein để tạo chylomycron CM được hấp thu qua màng đáy vào mạch bạch huyết, qua ống ngực vào

hệ tuần hoàn đến các mô của cơ thể Tại đây, enzym lipoprotein lipase (LPL) sẽ thủy phân TG, giải phóng acid béo tự do cho các tổ chức này Acid béo được sử dụng để

sinh năng lượng hoặc este hóa thành TG dự trữ CM mất TG tạo thành CM tàn dư, nhận cholesterol từ HDL rồi vận chuyển về gan Tại gan, một phần cholesterol được chuyển thành acid mật đào thải xuống ruột non, một phần tham gia tạo VLDL VLDL rời gan vào hệ tuần hoàn bắt đầu con đường chuyển hóa nội sinh [53], [72], [93]

Hình 1.1 Chuyển hóa lipoprotein nội sinh và ngoại sinh [101]

Ghi chú: LPL: lipoprotein lipase, FFA: acid béo tự do, LDLR: thụ thể của LDL

 Con đường chuyển hóa nội sinh

VLDL giàu TG được tạo thành ở gan (90%) và một phần ở ruột (10%) vào máu đến các mô ngoại vi Tại các mô, TG trong VLDL được thủy phân bởi enzym LPL thành acid béo tự do cung cấp cho tổ chức, VLDL trở nên nhỏ hơn và tạo thành IDL IDL trở lại gan một phần được hấp thu vào tế bào và tiêu hủy bởi lysosom, phần còn lại dưới tác dụng của lipase gan bị lấy đi TG và tạo thành LDL LDL là chất vận chuyển

chính cholesterol trong máu, chủ yếu dạng cholesterol este LDL liên kết với thụ thể của nó tại tế bào gan, chuyển vào trong tế bào bị thoái hóa trong các lysosom và giải phóng cholesterol tự do Thông qua cơ chế này, gan điều hòa lượng LDL trong huyết tương [53], [72], [93]

HDL được tổng hợp ban đầu ở gan và một phần ở ruột dưới dạng tiền chất Cholesterol tự do từ đại thực bào và tế bào ngoại vi được este hóa bởi enzym lecithin cholesterol acyltransferase (LCAT) tạo thành cholesterol este di chuyển vào lõi HDL tạo thành các HDL trưởng thành HDL đóng vai trò loại trừ cholesterol thừa Cholesterol trong HDL có thể được chuyển trực tiếp đến gan hoặc gián tiếp qua protein cholesteryl ester transfer (CETP) sang VLDL và CM, các CE sau đó được đưa trở về gan [53], [72], [93] Sự chuyển hóa HDL và vận chuyển cholesterol được mô tả ở hình 1.2

Hình 1.2 Chuyển hóa HDL và vận chuyển cholesterol [101]

1.1.2 Hội chứng rối loạn lipid máu

1.1.2.1 Định nghĩa và phân loại

 Định nghĩa

RLLPM là tình trạng bệnh lý khi có một hoặc nhiều thành phần lipid bị rối loạn

về nồng độ như tăng cholesterol, tăng triglycerid, tăng LDL-C, hoặc giảm HDL-C [6], [37], [72]

 Phân loại

Năm 1965, Fredrickson dựa vào kĩ thuật điện di và siêu ly tâm các thành phần lipoprotein đã chia RLLPM thành 5 tuýp Phân loại của Fredrickson có tính chất mô tả tình trạng RLLPM được sử dụng phổ biến trở thành phân loại quốc tế [45], [64], [107] Phân loại RLLPM của Fredrickson được trình bày trong bảng 1.1

Bảng 1.1 Phân loại rối loạn lipid máu theo Fredrickson

Bảng 1.2 Mục tiêu điều trị chính trong quản lý và điều trị RLLPM

LDL-C được khuyến cáo là mục tiêu chính của điều trị:

+ Ở những bệnh nhân có nguy cơ tim mạch rất cao (bệnh tim mạch, đái tháo đường tuýp 2, đái tháo đường tuýp 1 có tổn thương cơ quan đích, bệnh thận mạn trung bình đến nặng): mục tiêu LDL-C < 1,8 mmol/l (70 mg/dl) hoặc giảm ít nhất 50% nếu mức ban đầu 1,8 - 3,5 mmol/l (70 và 135 mg/dl)

+ Ở những bệnh nhân có nguy cơ tim mạch rất cao như bệnh nhân sau hội chứng vành cấp: mục tiêu LDL-C < 1,8 mmol/l (70 mg/dl) và tốt hơn nữa là đạt đến mức 1,3 mmol/l

+ Ở bệnh nhân có nguy cơ tim mạch cao (các yếu tố nguy cơ đơn độc tăng rõ rệt) nên xem xét mục tiêu LDL-C < 2,5 mmol/l (100 mg/dl)

+ Đối với những người có nguy cơ thấp hoặc trung bình: mục tiêu LDL-C < 3,0 mmol/l (115 mg/dl)

Các mục tiêu thứ cấp là non-HDL-C < 2,6 mmol/l, 3,4 mmol/l và 3,8 mmol/l (100, 130

và 145 mg/dl) theo thứ tự đối với những người nguy cơ rất cao, cao và trung bình HDL-C: không có mục tiêu, nhưng mức tăng > 1,0 mmol/l (40 mg/dl) ở nam giới và > 1,2 mmol/l (48 mg/dl) ở nữ giới cho thấy nguy cơ tim mạch thấp hơn

Triglycerid: không có mục tiêu, nhưng < 1,7 mmol/l (150 mg/dl) cho biết nguy cơ thấp hơn và mức độ cao hơn cho thấy cần phải tìm kiếm các yếu tố nguy cơ khác

Cholesterol nên được xem xét là mục tiêu điều trị nếu các xét nghiệm chỉ số lipid khác không sẵn có

1.1.3 Các thuốc điều trị rối loạn lipid máu

Dựa vào cơ chế tác dụng trên lipoprotein, thuốc điều trị rối loạn lipid máu được chia thành 2 nhóm chính: nhóm làm giảm tổng hợp lipid, nhóm làm giảm hấp thu và tăng thải trừ lipid và nhóm thuốc mới theo cơ chế khác [17], [37]

1.1.3.1 Nhóm làm giảm tổng hợp lipid

 Các statin

Các statin có cấu trúc tương tự với 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzym A (HMG-CoA) nên ức chế cạnh tranh với HMG-CoA reductase (HMGR), enzym xúc tác cho việc tổng hợp cholesterol từ acetyl CoA, làm giảm tổng hợp cholesterol, đồng thời làm tăng thụ thể LDL ở tế bào gan, giúp nhận LDL vào trong tế bào và bị thoái hóa trong các lysosome [37],[107] Statin cũng làm giảm mức LDL bằng cách tăng cường loại bỏ các tiền chất của LDL (VLDL và IDL) và giảm sản xuất VLDL

ở gan [82] Cơ chế này cũng giải thích cho tác dụng hạ triglycerid của statin Statin làm tăng HDL-C thông qua tăng ApoA-I, ApoA-I là protein thành phần chính của HDL được tổng hợp trong gan và ruột [124]

Như vậy, các thuốc thuộc nhóm statin làm tăng nồng độ HDL-C, giảm nồng độ

TC, TG, LDL-C và việc giảm nồng độ LDL-C phụ thuộc vào liều, tuy nhiên, nhóm statin không thể hiện hiệu quả đối với bệnh nhân mắc thể dị hợp FH (bệnh di truyền trội do đột biến gen chuyển hóa LDL-C) [82] Tác dụng tăng nồng độ HDL-C (5- 10%)

ở mức độ khiêm tốn còn tác dụng giảm rõ rệt nồng độ TC và LDL-C (18- 60%) thường thấy ở tất cả các statin trong vòng hai tuần và đáp ứng tối đa trong vòng 4 tuần và duy trì sau đó trong khoảng thời gian tiếp tục điều trị [102]

Tác dụng ức chế HMGR dẫn đến giảm tổng hợp cholesterol nội sinh Từ mevalonat sản phẩm chính của enzym này không chỉ là tiền chất của cholesterol

mà còn các isoprenoidic nonsteroid khác nên tác dụng ức chế HMGR sẽ dẫn đến những tác dụng khác Một số tác dụng không mong muốn phổ biến khi sử dụng statin là: các triệu chứng về tiêu hóa (nôn, buồn nôn, ), đau nhức cơ, thay đổi chức năng gan Tác dụng phụ ít gặp hơn là tăng men transaminase gấp ba lần giới hạn bình thường [82], [102]

Trong điều trị RLLPM, nhóm statin là lựa chọn đầu tay trong trường hợp tăng LDL-C, lựa chọn thuốc và mức liều dựa trên phân tầng nguy cơ tim mạch để đạt LDL-

C mục tiêu để giảm các biến cố và tỷ lệ tử vong do bệnh tim mạch do xơ vữa [23], [92]

 Nhóm fibrat

Các thuốc thuộc nhóm fibrat tác dụng lên thụ thể peroxisome proliferator activated receptor- α (PPAR- α), kích thích hoạt động enzyme lipoprotein lipase làm tăng thủy phân TG, tăng tổng hợp apo AI và apo AII làm tăng sản xuất HDL-C, thúc đẩy quá trình oxy hoá acid béo ở gan và các mô, làm giảm sản xuất VLDL [37], [107]

Do đó, các thuốc fibrat (fenofibrat, clofibrat,…) có tác dụng làm giảm nồng độ VLDL, LDL, TG, tăng nồng độ HDL-C

Nhóm fibrat sử dụng trong điều trị tăng triglycerid máu, làm giảm các biến cố tim mạch do xơ vữa trong điều trị RLLPM có triglycerid > 200 mg/dl (2,3 mmol/l) [23], [82]

 Acid nicotinic (niacin)

Acid nicotinic có tác dụng ức chế sự thủy phân TG từ tổ chức mỡ và giảm tổng hợp TG, ức chế tổng hợp VLDL dẫn đến giảm tạo thành LDL, ngoài ra còn giảm thanh thải apo AI dẫn đến tăng nồng độ HDL-C Do đó, acid nicotinic có tác dụng làm giảm nồng độ LDL-C, TG và tăng HDL-C

1.1.3.2 Nhóm làm giảm hấp thu và tăng thải trừ lipid

 Chất tạo phức với acid mật (resin)

Các resin gắn với acid mật tạo phức hợp resin-acid mật không được hấp thu và

bị đào thải qua phân, làm giảm nồng độ acid mật Tế bào gan tăng chuyển hóa cholesterol thành acid mật làm giảm nồng độ cholesterol ở gan, kích thích tăng thụ thể LDL ở gan [37] Do đó, các resin làm giảm nồng độ LDL-C và tăng nồng độ HDL-C

 Chất ức chế hấp thu cholesterol (ezetimib)

Ezetimib gắn trực tiếp vào protein vận chuyển sterol trên thành ruột non NPC1L1 ức chế quá trình hấp thu cholesterol tại ruột non, làm giảm lượng cholesterol

dự trữ trong gan, làm tăng số lượng thụ thể LDL tại gan, giúp nhận LDL vào trong tế

bào và bị thoái hóa trong các lysosome [31], [82] Do vậy, ezetimib có tác dụng làm giảm nồng độ LDL-C, TG, tăng nồng độ HDL-C

 Nhóm thuốc mới trong điều trị rối loạn lipid máu

Acid béo omega–3 là acid béo không bão hòa đa omega–3 (omega- 3 polyunsaturated fatty acids - PUFAs) có mặt nhiều trong dầu cá, bao gồm acid eicosapentaenoic và acid decohexanoic là hai phân tử được sử dụng phổ biến trong điều trị tăng lipid máu PUFAs làm giảm nồng độ TG huyết tương nhưng làm tăng nồng độ TC [82], [102]

Nhóm thuốc ức chế PCSK9 là những kháng thể đơn dòng nhân bản, có tác dụng

ức chế proprotein convertase subtilisin–kexin type 9 từ đó làm tăng số lượng receptor LDL ở bề mặt tế bào gan, kết quả là làm giảm nồng độ LDL- C trong máu Cơ chế này giống một phần với cơ chế tác dụng của nhóm statin tuy nhiên tác dụng phòng ngừa các biến cố tim mạch của các thuốc này chưa được chứng minh rõ ràng [102]

Nhóm thuốc ức chế enzym adenosine triphosphate-citrate lyase làm giảm tổng hợp cholesterol ở gan Hoạt chất là acid bempedoic (Nexletol, Esperion) Thuốc được chỉ định trong điều trị tăng cholesterol máu gia đình dị hợp tử hoặc bệnh tim mạch do

xơ vữa ở người trưởng thành cần giảm thêm LDL-C, phối hợp cùng chế độ ăn và statin [128]

1.1.3.3 Điều trị phối hợp thuốc

Những bệnh nhân không đạt mục tiêu LDL-C và non- HDL –C với statin đơn trị liệu sau khi dung nạp mức liều tối đa có thể phổi hợp chất ức chế hấp thu cholesterol (ezetimib) hoặc chất tạo phức với acid mật (resin) Những bệnh nhân đang dùng statin

có nồng độ TG cao có thể phối hợp thêm fibrat hoặc acid béo omega-3 Những bệnh nhân tăng TG máu nặng không đạt mục tiêu non-HDL-C với fibrat thì có thể cân nhắc

bổ sung thêm statin [23], [92]

1.1.4 Tình hình nghiên cứu thuốc có nguồn gốc dược liệu điều trị rối loạn lipid máu trên thế giới và Việt Nam

1.1.4.1 Tình hình nghiên cứu thuốc có nguồn gốc dược liệu điều trị rối loạn lipid máu trên thế giới

Các quốc gia cùng nguồn dược liệu phong phú có rất nhiều bài thuốc có nguồn gốc từ dược liệu được sử dụng khá phổ biến như Trung Quốc, Hàn Quốc,

Thuốc sắc Danggui-Buxue (DGBX) là bài thuốc gồm hoàng kỳ (Radix Astragali)

và đương quy (Radix Angelicae sinensis) liều theo tỷ lệ 1:5 Một nghiên cứu trên

DGBX với liều 3 hoặc 6g/kg/ngày trong 4 tuần trên chuột gây rối loạn lipid máu và bị tiểu đường do ức chế NO và chế độ ăn giàu cholesterol Kết quả cho thấy mặc dù không có thay đổi đáng kể nồng độ TG nhưng TC, LDL-C giảm đáng kể, trong đó HDL-C của nhóm có sử dụng DGBX tăng hơn so với nhóm chứng [69] Một nghiên cứu khác tương tự trên DGBX với 3 mức liều 1,68 g/kg, 8,4 g/kg, 16,8 g/kg cho kết quả TG giảm đáng kể ở tất cả các liều [126]

Bài thuốc Danshen-Gegen (DG) gồm 2 thành phần đan sâm (Radix Salviae

miltiorrhizae) và sắn dây (Radix Puerariae lobatae) Trong một thử nghiệm lâm sàng,

DG được nghiên cứu với liều 3 g/ngày, trong suốt 24 tuần trên bệnh nhân mắc bệnh động mạch vành cho thấy có sự giảm nhẹ TC và LDL-C [59] Một nghiên cứu khác với phụ nữ mãn kinh được điều trị DG có sự giảm đáng kể TC và LDL-C so với nhóm điều trị với giả dược trong 12 tháng [51]

Thuốc sắc Erxian được nghiên cứu đầu tiên bởi Zhang-bo-na năm 1950 Thành

phần thuốc bao gồm sâm cau (Curculiginis rhizoma), dâm dương hoắc (Folium

Epimedii), đương quy (Radix Angelicae sinensis), ba kích (Radix Morindae officinalis), tri mẫu (Anemarrhenae rhizoma) và hoàng bá (Cortex Phellodendri chinensis) Bài thuốc được sử dụng từ lâu để điều trị thận yếu, loãng xương và phụ nữ

mãn kinh Một nghiên cứu trên Erxian cho kết quả với liều 4,1 g/kg /ngày trong 8 tuần

trên chuột cống trắng có tác dụng làm hạ đáng kể TC, LDL-C trong khi đó TG và HDL-C thay đổi không đáng kể [104]

1.1.4.2 Tình hình nghiên cứu thuốc có nguồn gốc dược liệu điều trị rối loạn lipid máu tại Việt Nam

Trong những năm gần đây, có nhiều nghiên cứu về các bài thuốc, sản phẩm có nguồn gốc dược liệu để điều trị RLLPM tại Việt Nam

Năm 2012, Vũ Việt Hằng đã nghiên cứu tác dụng điều trị rối loạn lipid máu của bài “Giáng chỉ tiêu khát linh” bào chế dưới dạng cốm đóng viên nang cứng trên mô hình thực nghiệm chuột cống gây rối loạn lipid máu và đái tháo đường tuýp 2 Kết quả cho thấy Giáng chỉ tiêu khát linh có tác dụng dự phòng và điều trị rối loạn lipid máu ở chuột cống trắng sau 60 ngày giảm 40,1% TG, 50,1% TC, 16,3% LDL-C, tăng 182,9% HDL-C Giáng chỉ tiêu khát linh còn có tác dụng giảm glucose máu sau 30 ngày và hiệu quả rõ rệt sau 60 ngày điều trị ở chuột cống trắng gây ĐTĐ tuýp 2 giảm 79,8% và 67,8% glucose [19]

Năm 2012, Vũ Thị Thuận đã nghiên cứu tác dụng điều chỉnh rối loạn lipid máu và giảm xơ vữa mạch máu của bài thuốc BBT trên thực nghiệm Kết quả cho thấy với liều 3 g/kg/ngày có tác dụng giảm 10,06% TC, giảm 36,47% LDL-C trên thỏ và với liều 6 g/kg/ngày có tác dụng giảm sự hình thành mảng bám VXĐM trên động mạch chủ thỏ [28]

Năm 2014, Trương Quốc Chính đã đánh giá tác dụng của bài thuốc “Hạ mỡ

NK” trên bệnh nhân rối loạn lipid máu nguyên phát Kết quả trên lâm sàng cho thấy

cholesterol giảm 16,55%, triglycerid giảm 32,17% và chỉ số HDL-C tăng 9,09%, chỉ

số LDL-C giảm 15,26% so với nhóm chứng [12]

Năm 2016, Tạ Thu Thủy đã đánh giá tác dụng điều chỉnh rối loạn lipid máu của

cao lỏng Đại an trên động vật thực nghiệm Kết quả ở mô hình gây tăng lipid máu nội

sinh cho thấy cao lỏng Đại an ở các liều 9,6 g dược liệu/kg và 19,2 g dược liệu/kg đều làm giảm có ý nghĩa thống kê các chỉ số TC, non-HDL-C so với lô mô hình Ở mô hình

liệu/kg/ngày và atorvastatin liều 10 mg/kg/ngày đều làm giảm nồng độ TC, LDL-C có

ý nghĩa thống kê [30]

Năm 2019, Phạm Thanh Tùng đã nghiên cứu tính an toàn và tác dụng của viên nang cứng Vinatan trong điều trị hội chứng rối loạn lipid máu trên thực nghiệm và lâm sang Kết quả cho thấy Vinatan lô mô hình sau 4 tuần uống hỗn hợp dầu cholesterol, đã gây được tình trạng RLLPM trên chuột cống trắng, thể hiện ở mức tăng rõ rệt nồng độ

TC, TG, HDL-C, LDL-C bắt đầu xuất hiện sau 2 tuần nghiên cứu Ngoài ra cho thấy Vinatan 0,12 g/kg/ngày và 0,36 g/kg/ngày sau 2 tuần uống thuốc làm giảm nồng độ LDL-C (↓ 14,7%), và tăng nồng độ HDL-C so với lô mô hình Sau 4 tuần uống thuốc nồng độ LDL-C giảm theo thứ tự 30,3% và 32,51% Có xu hướng giảm nồng độ TG,

TC so với lô mô hình nhưng sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê [34]

Năm 2019, Trần Thị Hồng Ngãi đã nghiên cứu tính an toàn, kết quả điều trị rối loạn chuyển hóa lipid máu của bài thuốc HSN trên thực nghiệm

và lâm sàng Kết quả thực nghiệm cho thấy lô uống HSN liều thấp 24 g dược liệu/kg/ngày làm giảm các chỉ số TC (↓17,95%), non-HDL-C (↓ 24,26%) so với lô mô hình Lô uống HSN liều cao 72 g dược liệu/kg/ngày làm giảm rõ rệt các chỉ số TC (18,46%) và non-HDL-C (24,26%) so với lô mô hình Tác dụng làm giảm nồng độ TC,

TG, non-HDL-C liều cao tương đương liều thấp [24]

Nhìn chung, các đề tài đa phần mang tính tổng quát, các sản phẩm có giá trị sử dụng chưa phổ biến, số liệu nghiên cứu còn ít và kết luận đánh giá chưa có tính đại diện

1.1.5 Một số mô hình dược lý thực nghiệm gây tăng lipid máu để nghiên cứu thuốc điều trị rối loạn lipid máu

1.1.5.1 Mô hình dược lý thực nghiệm gây rối loạn lipid máu nội sinh

Các chất được biết đến trong mô hình gây rối loạn lipid máu nội sinh đã được các nghiên cứu trước đây thực hiện như estrogen, tween 80, triton WR-1339 hoặc

poloxamer 407 (P-407) là các chất hoạt động bề mặt dùng liều đơn tiêm tĩnh mạch hoặc màng bụng

Dùng estrogen liều cao cho động vật làm tăng sinh tổng hợp VLDL trong gan dẫn đến tăng nồng độ VLDL trong huyết tương đã được nghiên cứu Kết quả nghiên cứu của Fukushima và cộng sự cho thấy cholesterol máu tăng gấp 10 lần so với nhóm chứng (908 mg% so với 133 mg%) trong vòng một tuần, sau một liều duy nhất β- estradiol tác dụng chậm cho gà con [65] Năm 1962, Steinberg đã xây dựng mô hình tương tự và kết luận sự tăng lipid này có tính nội sinh và không phụ thuộc vào sự có mặt của mỡ trong chế độ ăn [94] Mô hình gây bởi estrogen dùng để phát hiện các thuốc ức chế sinh tổng hợp cholesterol máu

Mô hình sử dụng tween 80 để gây rối loạn lipid máu được mô tả bởi Kell A và cộng sự [83] cho thấy tween có khả năng gây tăng lipid nhanh, tuy nhiên chỉ gây tăng trong thời gian ngắn đạt đỉnh 6-12 giờ và trở lại bình thường sau 24 giờ

Các nghiên cứu đầu tiên của Frantz ID và Hinkelman BT năm 1955 [63], Garattini S năm 1958 và 1961 [67], [66], Holmes WL năm 1964 [117], Tamasi G năm 1968 [110] cho kết quả triton WR- 1339 làm tăng cả cholesterol và triglycerid trên chuột nhắt và chuột cống trắng Mô hình được xây dựng cho chuột cống đực cho nhịn đói 18 giờ trước khi tiến hành, sau đó tiêm triton WR-1339 với liều 200 mg/kg cân nặng chuột Kết quả là nồng độ cholesterol tăng mạnh gấp 2- 3 lần sau 24 giờ tại giai đoạn 1, nồng độ cholesterol tăng giảm dần sau đó về mức kiểm soát trong 24 giờ tiếp theo tại giai đoạn 2 Cơ chế làm tăng cholesterol máu của triton WR-1339 trong giai đoạn 1 được cho là do sự gia tăng tổng hợp cholesterol ở gan do tác động đến sự tiếp nhận lipid huyết tương ở các mô, trong khi sự thải trừ và chuyển hóa cholesterol xảy ra trong giai đoạn 2

Poloxamer-407 là chất điện hoạt không ion hóa được rât nhiều các tác giả sử dụng trong mô hình gây tăng lipid máu Năm 1993, Johnston T.P và cộng sự đã gây được mô hình tăng lipid máu trên chuột nhắt trắng với TG tăng từ 84 ± 10 lên 3175 ±

mg/dl/ phút trong huyết tương của chuột tiêm P-407 xảy ra trong khoảng từ 2 đến 4 giờ sau tiêm [79] Kết quả này sau đó được các nhà nghiên cứu sau đó sử dụng P-407 để gây mô hình tăng lipid trên các loài chuột khác nhau Năm 2005, Millar J.S và cộng sự

đã tiến hành so sánh tác dụng tăng lipid máu của P-407 liều 1000 mg/kg và triton

WR-1339 liều 500 mg/kg trên các loài chuột nhắt trắng khác nhau Dữ liệu kết quả cho thấy

TG khi sử dụng P-407 tăng lên ổn định với tốc độ 200 mol/h/kg sau 6 giờ gây mô hình, còn TG khi sử dụng triton WR-1339 tăng giống P-407 ở 2 giờ đầu tiên, còn lại giảm mạnh trong 24 giờ tiếp theo [95]

Ở Việt Nam, Tạ Thị Thu Thủy đã sử dụng P-407 đường tiêm màng bụng với liều 200 mg/kg có tác dụng gây tăng lipid máu rõ rệt, kết quả cho thấy TG tăng 912,5%, TC tăng 203,3%, HDL-C tăng 13,5% và LDL-C tăng 247,3% so với lô chứng [30] Kết quả cũng tương tự với nghiên cứu của Nguyễn Phương Thanh sử dụng P-407 đường tiêm màng bụng với liều 500 mg/kg, kết quả cho thấy tất cả các thông số lipid máu (TC, TG, HDL-C, LDL-C) đều tăng, trong đó TC tăng gấp 10 lần so với nhóm chứng [27]

1.1.5.2 Mô hình dược lý thực nghiệm gây rối loạn lipid máu ngoại sinh

Một số loài động vật đã được đưa vào nghiên cứu trong xây dựng mô hình tăng lipid máu như thỏ, chuột nhắt trắng, chuột cống trắng, chuột hamster, Ngoài ra một số tác giả sử dụng trên khỉ, lợn, bồ câu,

Mô hình gây RLLPM ngoại sinh trên thỏ đã được các nhà nghiên cứu thực hiện Thường sử dụng thỏ đực, thuần chủng, độ tuổi từ 8-10 tuần, chế độ ăn có bổ sung từ 0,3- 2% cholesterol và duy trì chế độ ăn trong 10- 12 tuần Mô hình Buja L Maximilian được coi là mô hình kinh điển được tiến hành bằng cách cho thỏ ăn cholesterol 0,3- 0,5 g/kg/ngày trong một năm [50] Năm 2016, Baumgartner Christine

và cộng sự nghiên cứu mô hình trên thỏ cho thấy có sự tăng xơ vữa động mạch nhiều hơn khi ăn chế độ ăn dầu cholesterol có bổ sung thêm dầu thực vật (1% cholesterol và 5% dầu ngô) trong 8 tuần [43] Năm 2017, tác giả Nguyễn Thùy Dương và Nguyễn Văn Đồng đã triển khai thành công mô hình gây xơ xữa động mạch trên thỏ thực

nghiệm trong 3 tháng bằng chế độ ăn cholesterol dược dụng trong dầu dừa (200mg/kg/ngày) kết hợp với chế độ ăn giàu chất béo (óc lợn 7g/kg/ngày và mỡ lợn 2g/kg/ngày) [16]

Tăng cholesterol cũng dễ dàng được tạo ra bằng cách thêm một lượng nhỏ cholesterol 0,01- 0,05% theo cân nặng trên mô hình chuột hamster Năm 1991, Kowala

MC và cộng sự đã thành công trong gây mô hình tăng lipid trên chuột hamster với chế

độ ăn có bổ sung chất béo là dầu dừa 5-10% tính theo cân nặng chuột [85]

Paigen B và cộng sự đã mô tả đánh giá định lượng các tổn thương xơ vữa động mạch trên chuột nhắt trắng sau 14 tuần với chế độ ăn giàu cholesterol gồm 1,25% cholesterol, 15% chất béo và 0,5% axit cholic Kết quả của nghiên cứu cho thấy việc

bổ sung cholesterol vào chế độ ăn làm tăng cường lắng đọng các mảng xơ vữa trên động mạch [99] Kết quả nghiên cứu của Yamaguchi Y cũng tương tự trên mô hình gây tăng lipid máu khi bổ sung thêm vào chế độ ăn 10% acid linoleic [123]

Một trong những mô hình gây tăng lipid máu trên chuột cống đầu tiên được nghiên cứu bởi Andrus S.B và cộng sự năm 1956, Lustalot P và cộng sự năm 1961 Tác giả đã sử dụng 1 lít dầu đậu gồm: 100 g cholesterol, 30 g propylthio-uracil, and

100 g cholic cho chuột cống trắng uống hàng ngày với liều 1ml/100g [42], [91] Năm

2009, Nassiri và cộng sự đã sử dụng mô hình với chế độ ăn như trên nhưng cải biến thời gian kéo dài 28 ngày Kết quả cho thấy mô hình với chế độ ăn giàu cholesterol gây tăng cholesterol tăng 9,65 ± 0,10 mmol/l gấp 2,6 lần so với nhóm chứng 3,70 ± 0,10 mmol/l, LDL-C tăng 3,26 ± 0,10 mmol/l so với nhóm chứng 1,96 ± 0,10 mmol/l [97]

Tại Việt Nam, nhiều tác giả đã sử dụng mô hình tăng lipid máu ngoại sinh theo

mô hình của Nassiri có cải biến trên chuột cống Chế độ ăn điều chỉnh lại với liều 1ml/100g chuột, trong 1 ml gồm: 0,1 g cholesterol, 0,01 g acid cholic, 0,005 g propylthio-uracil Như vậy liều của acid cholic đã giảm đi 10 lần, liều của propylthio-uracil đã giảm đi 6 lần, chi phí giảm đi nhưng vẫn đảm bảo kết quả gây được mô hình tăng lipid máu Tác giả Tạ Thu Thủy đã cho kết quả tăng cholesterol 5,69 ± 1,36 so với

với cholesterol tăng 5,08 ±1,35 mmol/l so với lô chứng 2,08 ± 0,20 mmol/l sau 4 tuần [24]

1.2 Đại cương về đông máu

1.2.1 Sinh lý quá trình đông máu

Đông máu là trạng thái tự bảo vệ của cơ thể khi có chảy máu Sau khi ra khỏi lòng mạch 2 - 4 phút, máu sẽ đông lại Đông máu nghĩa là máu chuyển từ thể lỏng sang thể đặc nhờ chuyển fibrinogen hòa tan trong huyết tương thành fibrin không hòa tan dưới xúc tác của thrombin, nhằm hạn chế mất máu ở nơi có tổn thương thành mạch, giữ sự toàn vẹn của mạch máu [48], [70]

1.2.2 Cơ chế đông máu

Quá trình đông máu trải qua 3 giai đoạn

 Giai đoạn I: Hình thành phức hợp prothrombinase

Đông máu được chia thành 2 con đường: nội sinh và ngoại sinh, chỉ khác nhau ở giai đoạn I của quá trình đông máu

+ Con đường đông máu ngoại sinh

Khi các mô, thành mạch tổn thương tiếp xúc với máu sẽ giải phóng thromboplastin mô, một phức hợp đặc biệt bao gồm phospholid màng và lipoprotein

Dưới tác dụng của thromboplastin yếu tố VII được hoạt hóa thành VIIh VIIh

cùng ion Ca2+ kích hoạt yếu tố X thành yếu tố X hoạt hóa (Xh) [33], [100]

+ Con đường đông máu nội sinh

Khi máu bị tổn thương hoặc tiếp xúc với bề mặt lạ làm hoạt hóa tiểu cầu và yếu

tố XII thành XIIh Yếu tố XIIh cùng ion Ca2+ hoạt hóa yếu tố XI, IX thành XIh và IXh Tiểu cầu giải phóng phospholipid tiểu cầu cùng với IXh, ion Ca2+, VIIIh (hoạt hóa bởi thrombin) tham gia hoạt hóa yếu tố X thành Xh [25], [33]

Sau khi yếu tố X được hoạt hóa qua con đường đông máu nội sinh hoặc ngoại sinh sẽ cùng ion Ca2+, phospholipid tiểu cầu, Vh (hoạt hóa bởi thrombin) tạo thành phức hợp prothrombinase

 Giai đoạn II: hình thành thrombin

Prothrombin là một protein huyết tương được hình thành bởi gan ở dạng zymogen không hoạt động Phức hệ prothrombinase cùng ion Ca2+ chuyển prothrombin thành thrombin là một enzym có hoạt tính Thrombin được tạo ra hoạt hóa yếu tố V và VIII tạo ra Vh và VIIIh là đồng yếu tố tham gia hình thành prothrombinase [58], [100]

 Giai đoạn III: hình thành fibrin

Thrombin thủy phân fibrinogen thành các fibrin đơn phân Các fibrin đơn phân liên kết với nhau tạo thành fibrin trùng hợp Thrombin cùng ion Ca2+ hoạt hóa yếu tố XIII thành XIIIh, XIIIh có vai trò giữ sự ổn định của fibrin trùng hợp Mạng lưới fibrin sau khi được hình thành và ổn định bao bọc lấy các tế bào máu tạo nên cục máu đông, bịt các vết thương thành mạch làm ngưng chảy máu [58], [70]

1.2.3 Các thuốc chống đông máu

Dựa theo đường dùng có thể phân loại thuốc chống đông thành thuốc chống đông đường tiêm và thuốc chống đông đường uống [102], [107]

1.2.3.1 Thuốc chống đông đường tiêm

 Heparin

Heparin không phân đoạn (unfractionated heparin, UFH) được chiết xuất từ phổi bò hoặc niêm mạc ruột lợn Các UFH trải qua thủy phân hóa học, giải trùng hợp để có những đoạn heparin chuyên biệt gọi là heparin có phân tử lượng thấp (low molecular weight heparin, LMWH) [82]

Heparin có tác dụng chống đông máu cả in vivo và in vitro Bình thường, trong máu

antithrombin III có tác dụng chống đông do làm mất hiệu lực của thrombin và các yếu

tố IX, X, XI, XII đã hoạt hóa Các UFH, LMWH chống đông máu thông qua tạo phức

với antithrombin III, làm tăng cường tác dụng của chất này lên 1000 lần Trong đó, UFH có tác dụng tương đương trên thrombin và yếu tố X hoạt hóa (Xh) còn LMWH tác động chủ yếu lên Xh ít ảnh hưởng trên thrombin [82], [107]

Fondaparinux là một pentasaccharid tổng hợp, có tác dụng ức chế chọn lọc yếu tố X hoạt hóa (Xh) thông qua liên kết với antithrombin III Do đó, fondaparinux chỉ có tác dụng ức chế Xh không ức chế thrombin [102]

 Nhóm ức chế trực tiếp thrombin

Lepivudin, bivalirudin, argatropan là các chất chống đông máu dùng đường tiêm có tác dụng ức chế thrombin Không giống với cơ chế của heparin (gắn với chất trung gian là antithrombin III), các chất này gắn trực tiếp lên thrombin và bất hoạt thrombin dẫn đến ức chế quá trình đông máu [102], [107]

1.2.3.2 Thuốc chống đông đường uống

 Thuốc chống đông kháng vitamin K

Các dẫn xuất coumarin và indandion có cấu trúc gần giống vitamin K, ức chế cạnh tranh enzym epoxid-reductase, làm cản trở việc khử vitamin K-epoxid thành vitamin K cần cho sự carboxyl hóa các tiền yếu tố đông máu II, VII, IX, X thành yếu tố có hoạt tính tham gia vào quá trình đông máu Vì thuốc kháng lại tác dụng của vitamin K, tác

động trên các yếu tố đông máu ở gan nên thuốc chỉ có tác dụng in vivo [82], [102]

 Nhóm ức chế yếu tố X hoạt hóa (-xaban)

Rivaroxaban, apixaban và edoxaban chống đông đường uống thế hệ mới, thông qua

cơ chế ức chế trực tiếp yếu tố X hoạt hóa làm giảm hình thành thrombin nên ngăn cản quá trình đông máu [107]

 Dabigatran

Dabigatran là chất có tác dụng ức chế trực tiếp thrombin thông qua liên kết thuận nghịch, từ đó ngăn cản quá trình đông máu Dabigatran được dùng đường uống dưới dạng tiền thuốc là dabigatran etexilat [81], [102]

1.3 Mối quan hệ giữa tác dụng chuyển hóa lipid và tác dụng chống đông máu

1.3.1 Tương quan về bệnh sinh

Theo thuyết đáp ứng với chấn thương của Ross và Glomset (1973) có sửa đổi và

bổ sung, hai nguyên nhân chính liên quan đến cơ chế bệnh sinh XVĐM là do tăng lipid máu và vai trò huyết động liên quan đến sự rối loạn cân bằng của hai hệ thống đông máu và chống đông [103] Trong cơ thể thành động mạch có nhiều lớp, trong đó lớp nội mạc trơn nhẵn có vai trò bảo vệ và chống đông máu tự phát XVĐM là sự tích đọng cholesterol dưới lớp áo trong của động mạch (intima) làm thành mạch dày lên, tiếp đó

là sự lắng đọng canxi đưa đến thoái hóa, loét, sùi, dẫn đến lớp nội mạc mất sự trơn nhẵn, tạo điều kiện cho tiểu cầu bám vào và khởi động quá trình đông máu [3], [8] Quá trình này được thúc đẩy bởi sự oxy hóa lipoprotein, dẫn đến tạo thành tế bào bọt Như vậy những biến đổi đột ngột ở mạch thường liên quan đến vỡ các mảng giàu lipid, gây hoạt hóa tiểu cầu và đọng fibrin gây tắc lòng mạch

1.3.2 Tương quan về tác dụng của thuốc

Hiện nay, mối liên quan giữa hai tác dụng trên chưa được hệ thống hóa rõ ràng nhưng được thể hiện qua một số báo cáo riêng lẻ trong đó có các báo cáo liên quan đến nhóm thuốc statin lên quá trình đông máu

Năm 2013, nghiên cứu MESA trên 6814 bệnh nhân khỏe mạnh, đánh giá tác dụng của statin lên yếu tố đông máu Kết quả cho thấy statin làm giảm nồng độ các yếu

tố đông máu D- dimer (9%), protein phản ứng C (21%), yếu tố VIII (3%) so với nhóm người không sử dụng statin [40]

Năm 2016, kết quả của Amirhossein Sahebkar và cộng sự trong phân tích gộp ngẫu nhiên trên 21 nhóm điều trị cho thấy statin làm giảm đáng kể nồng độ yếu tố von Willebrand, hiệu quả rõ rệt hơn khi điều trị kéo dài 12 tuần [105]

Năm 2018, Joseph S Biedermann và cộng sự đã tiến hành thử nghiệm lâm sàng ngẫu nhiên về khả năng cải thiện của statin lên tình trạng đông máu ở 247 bệnh nhân bị huyết khối tĩnh mạch sau khi dùng rosuvastatin 20 mg/ngày kéo dài trong 4 tuần Kết quả cho thấy rosuvastatin làm giảm rõ rệt nồng độ 5 yếu tố đông máu vào cuối thời điểm nghiên cứu: VIII, VII, XI, D-dimer, yếu tố von Willebrand [46]

Nghiên cứu của Moon JH và cộng sự đã ghi nhận statin ức chế HMGR làm tăng LDLR, trong đó có LRP1 (thụ thể lipoprotein tỷ trọng thấp liên quan protein 1 thuộc

trong họ LDL) cả in vivo và in vitro [96] Mặt khác yếu tố VIII được thanh thải bởi

LRP1 nên tác dụng lên yếu tố đông máu của statin có thể được giải thích do sự điều hòa của hai thụ thể này nên làm giảm yếu tố VIII [49] Hầu hết các tác dụng liên quan đến chống đông của statin do ức chế quá trình isoprenyl hóa của protein và có thể hoạt động như một thuốc chống đông nhẹ [111]

Tác giả Nguyễn Văn Đồng và cộng sự trường đại học dược Hà Nội đã tiến hành nhiều công trình nghiên cứu về khảo sát tác dụng hạ lipid của nhiều vị thuốc và bài thuốc Các vị thuốc đơn lẻ đào nhân, hồng hoa, đương quy, đan sâm, tam thất, bạch thược, xuyên khung, đã được chứng minh là có tác dụng giảm ngưng tập tiểu cầu, chống hình thành huyết khối, tiêu fibrin [15]

1.3.3 Tương quan về điều trị

Trong y học cổ truyền, phần lớn các vị thuốc có tác dụng hạ lipid máu cũng có công năng hoạt huyết Một số bài thuốc như “đào hồng tứ vật thang”, BBT có công năng hoạt huyết hóa ứ, dùng trong điều trị huyết ứ lâu ngày, hạ lipid máu [20], [28]

Trong y học hiện đại, điều trị các bệnh lý hội chứng mạch vành cấp (HCMVC)

có liên quan đến sử dụng hai nhóm thuốc Cơ chế của HCMVC là sự mất ổn định của mảng xơ vữa và mảng này bị nứt ra hình thành máu đông ồ ạt lấp toàn bộ thành mạch dẫn đến nhồi máu cơ tim có ST chênh lên, nếu sự nứt vỡ nhỏ hơn, cục máu đông chưa dẫn đến tắc hoàn toàn đông mạch vành là HCMVC không có đoạn ST chênh lên [5] Vì

cơ chế hình thành cục máu đông nên việc dùng các thuốc chống đông trong HCMVC không có ST chênh lên là bắt buộc Theo khuyến cáo về điều trị HCMVC của bộ y tế (2019) và ESC (2020), nên bắt đầu hoặc tiếp tục sử dụng liệu pháp điều trị statin tích cực cường độ cao ở những bệnh nhân không có chống chỉ định bất kể nồng độ LDL-C trước đó như thế nào Statin nên sử dụng là atorvastatin (40- 80 mg) hoặc rosuvastatin (20- 40 mg) [5], [57]

1.4 Tổng quan về viên hoàn giọt chứa đan sâm, tam thất Việt Nam

Trong quá trình nghiên cứu và phát triển thuốc mới từ dược liệu, RLLPM và rối loạn đông máu liên quan đến những bệnh lý phổ biến và đang được khai thác Việt Nam là vùng đất của nhiều loại thảo dược, trong đó đan sâm và tâm thất từ lâu đã là hai

vị dược liệu quý hiếm có nhiều công dụng trong điều chỉnh RLLPM và lưu thông huyết mạch

1.4.1 Đan sâm

 Tên khoa học, bộ phận dùng

Cây đan sâm có tên khoa học là Salvia miltiorrhiza Bunge, thuộc Chi Salvia,

Họ bạc hà (Lamiaceae), Bộ Labiatae còn có tên gọi khác là huyết sâm, xích sâm hoặc

rosmarinic, các thành phần khác là các hợp chất khó phân loại như β-sitosterol, balcalin, acid ursolic, daucosterol, vitamin E và tannin [10], [11]

 Công dụng và tác dụng sinh học

Theo y học cổ truyền, dược liệu đan sâm có vị đắng, tính hơi hàn, quy kinh tâm, can, có tác dụng bổ gan, bổ máu, hoạt huyết, điều kinh, bài nùng, chữa bụng dưới kết hòn cục, giảm đau, thanh tâm, trừ phiền Đan sâm có mặt trong các bài thuốc cổ truyền chữa suy nhược cơ thể, thiếu máu, bế kinh, rong kinh, phong nhiệt ghẻ lở Liều dùng theo y học cổ truyền là 9-15 g/ngày dược liệu dưới dạng thuốc sắc [4], [11]

Hiện nay, nhiều tác dụng sinh học của đan sâm đã được chứng minh qua các nghiên cứu như: thúc đẩy lưu thông máu, cải thiện tình trạng thiếu máu cơ tim cấp [114], tác dụng chống huyết khối [125], cải thiện tình trạng suy giảm trí nhớ [74], thành phần tanshinon của đan sâm có tác dụng chống ung thư [55]

Các nghiên cứu chứng minh tác dụng hạ lipid máu và chống đông của đan sâm

đã được nhiều tác giả thực hiện

Năm 2008, Ji W và Gong B.Q đã nghiên cứu tác dụng dịch chiết nước đan sâm trên chuột cống trắng được tăng lipid máu bằng chế độ ăn Kết quả cho thấy dịch chiết nước của đan sâm liều 150 mg/kg làm giảm nồng độ TC, LDL-C, TG huyết tương và giảm nồng độ TC trong gan trên chuột thực nghiệm so với nhóm chứng bệnh [76]

Năm 2017, Cheung David Wing-Shing và cộng sự đã đánh giá tác dụng hạ lipid

máu của một công thức thảo dược là DG gồm 2 thành phần Salvia miltiorrhiza và

Pueraria lobata với tỉ lệ 7:3 Nghiên cứu được thực hiện trên mô hình gây tăng lipid

máu ngoại sinh bằng chế độ ăn giàu cholesterol trên chuột nhắt trắng trong 8 tuần Kết quả cho thấy DG ở mức liều 600 mg/kg đã làm giảm nồng độ TC, LDL-C và TG huyết tương so với lô chứng bệnh [56]

Năm 2018, Hongjing Fan và cộng sự đã đánh giá tác dụng hạ lipid máu của

thuốc tiêm Danhong được chiết xuất từ 2 thành phần Salvia miltiorrhiza Bunge và Flos

Carthami tinctorii với tỉ lệ 750 mg : 250 mg Nghiên cứu được thưc hiện trên chuột

cống trắng và gây tăng lipid ngoại sinh bằng chế độ ăn giàu cholesterol trong 6 tuần

Kết quả cho thấy chế phẩm làm giảm nồng độ TC, TG, LDL-C huyết tương, tăng HDL-C so với nhóm chứng tại các mức liều 1 ml/kg, 2 ml/kg, 4 ml/kg [62]

Năm 2019, Wang Ja Li và cộng sự đã nghiên cứu về tác dụng chống đông máu của cặp dược liệu đan sâm và hồng hoa và các hoạt chất của chúng Nghiên cứu đã chỉ

ra tác dụng chống đông máu in vitro của acid salvianolic B có trong đan sâm, acid

salvianolic B nồng độ 0,3 mM và 0,6 mM có tác dụng kéo dài thời gian đông máu APTT, PT, TT, đồng thời giảm nồng độ fibrinogen so với nhóm chứng [115]

1.4.2 Tam thất

 Tên khoa học, bộ phận dùng

Cây tam thất có tên khoa học là Panax notoginseng (Burk.) F H Chen, thuộc Chi Panax, họ nhân sâm (Araliaceae), bộ Apiales, còn có tên khác là điền thất, sâm tam thất hay nhân sâm tam thất [10]

Dược liệu tam thất là rễ củ đã phơi hay sấy khô của cây tam thất (Panax

notoginseng (Burk.) F H Chen [10]

 Thành phần hóa học

Tam thất chứa nhiều nhóm thành phần hóa học chủ yếu là saponin (4,42- 12,00%) Các saponin trong tam thất gồm nhiều loại ginsenosid và notogingsengosid khác nhau như ginsenosid: Rb1, Rb2, Rc, Rd, Re, Rg, Rh, Rf…, các notoginsenosid như: R1, R2, R3, R4, R6… Ngoài ra, trong tam thất còn chứa các hợp chất khác như acid amin, hợp chất có nhân sterol, đường, flavonoid, polysaccharids, acid béo [10], [11]

 Công dụng và tác dụng sinh học

Theo y học cổ truyền, tam thất có vị đắng, ngọt, tính ấm, quy vào các kinh can, thận, có tác dụng hoạt huyết, bổ huyết, cầm máu, tiêu ứ huyết, tiêu sưng, giảm đau Tam thất được dùng chữa thổ huyết, ho ra máu, rong kinh, băng huyết, kiết lỵ, thiếu máu, mệt mỏi, hoa mắt, ít ngủ, có mặt trong các bài thuốc chữa thiếu máu, huyết hư, hoặc chảy máu nhiều sau đẻ, suy nhược cơ thể, chảy máu khi bị thương, đái ra máu,

viêm gan, rong kinh Liều dùng theo y học cổ truyền là 3-8 g dược liệu/ngày dưới dạng thuốc sắc [4], [11]

Hiện nay, nhiều tác dụng sinh học của tam thất đã được chứng minh qua các nghiên cứu như hỗ trợ điều trị bệnh mạch vành [61], bảo vệ tế bào, chống lão hóa [127], tác dụng chống huyết khối [125], bảo vệ gan khỏi các tổn thương [87], phòng và

hỗ trợ điều trị ung thư đại trực tràng [113]

Các nghiên cứu chứng minh hạ lipid máu và chống đông của tam thất đã được nhiều tác giả thực hiện

Năm 2007, Ji W và Gong B Q đã tiến hành đánh giá tác dụng hạ lipid máu cho thấy dịch chiết n-Butanol của tam thất ở mức liều 30 mg/kg làm giảm nồng độ TG, LDL-C huyết tương so với lô chứng bệnh, liều 60 mg/kg và 90 mg/kg giảm nồng độ

so với nhóm chứng uống natri carboxymethyl cellulose 0,5% [86]

Năm 2010, Joo Il Woo và cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của rễ cây Panax

notoginseng đối với tác dụng hạ lipid máu trên mô hình nội sinh gây tăng lipid máu bởi

poloxamer-407 trên chuột cống trắng Kết quả sau 3 tuần cho thấy Panax notoginseng

ở mức liều 40 mg/kg làm giảm nồng độ TC, mức liều 100 mg/kg giảm nồng độ TC,

TG, LDL-C so với lô chứng bệnh [80]

Năm 2011, Xia W và cộng sự đã nghiên cứu tác dụng hạ lipid máu của rễ cây

tam thất Panax notoginseng (Sanchi) bằng cách bổ sung chế độ ăn giàu cholesterol trên

chuột cống trắng với các hàm lượng Sanchi 0,25%, 0,5% và 1% trong 4 tuần Kết quả chỉ ra Sanchi làm giảm đáng kể nồng độ TC, TG, LDL-C và làm tăng nồng độ HDL-C trong huyết thanh, đồng thời giảm giảm hoạt động của enzym HMG-CoA so với lô chứng bệnh [121]

Năm 2020, Long Linzi và cộng sự đã đánh giá tác dụng hạ lipid máu của rễ cây

tam thất Panax notoginseng bằng mô hình gây tăng lipid ngoại sinh với chế độ ăn giàu cholesterol gồm 0,5% cholesterol, 10% lòng đỏ và mỡ lợn 5% thêm vào chế độ ăn chuẩn trong 8 tuần trên chuột nhắt trắng Kết quả cho thấy Panax notoginseng ở mức

liều 60 mg/kg làm cải thiện đáng kể những thay đổi do chê độ ăn giàu cholesterol gây

ra về các chỉ số TC, TG, HDL-C, LDL-C so với lô chứng bệnh [90]

1.4.3 Các sản phẩm chứa đan sâm, tam thất

Trên thế giới, chế phẩm từ đan sâm và tam thất đã được quan tâm nghiên cứu và phát triển từ sớm Đáng chú ý có thể kể đến sản phẩm Thiên sứ hộ tâm đan (CP- Cardiotonic Pill) của Công ty dược phẩm Tasly, Trung Quốc (Tianjin Tasly Pharmaceutical Co, Ltd) Thiên sứ hộ tâm đan với thành phần bao gồm: cao đan sâm, cao tam thất, borneol, PEG 6000, bào chế dưới dạng viên hoàn giọt, dùng đường uống hoặc ngậm dưới lưỡi Sản phẩm được sử dụng rộng rãi với tác dụng làm tăng lưu thông máu, giảm các mảng xơ vữa, cải thiện vi tuần hoàn, giảm tắc nghẽn mạch máu, ngăn ngừa hiệu quả đau thắt ngực do bệnh mạch vành và các biến chứng tiểu đường [119], [122]

Ở Việt Nam hiện nay có một số chế phẩm đã được sản xuất và lưu hành như: Đan sâm Tam thất của công ty TNHH dược phẩm Fito Pharma, dạng bào chế viên nang , Viên hộ tâm của công ty cổ phần dược phẩm OPC dạng bào chế viên nang cứng, Đan sâm Tam thất của công ty cổ phần công nghệ cao Traphaco, dạng bào chế viên nén bao phim, các chế phẩm này có chỉ định phòng và điều trị chứng đau thắt ngực, đau nhói vùng tim do huyết ứ, thiểu năng mạch vành, đau đầu do huyết ứ, thiểu năng tuần hoàn não, sa sút trí nhớ do lưu thông máu não kém [130]

1.4.4 Viên hoàn giọt chứa đan sâm, tam thất Việt Nam

Theo y học cổ truyền, đan sâm có tác dụng hoạt huyết, chống đông, giãn mạch, tam thất có tác dụng cầm máu, giãn mạch, bảo vệ tim Bài thuốc đan sâm, tam thất đã được sử dụng hơn 1000 năm qua, có tác dụng thông thoáng huyết quản động mạch, giảm cholesterol, chống tích tụ chất thải trong máu, làm chậm sự tiến triển của quá trình xơ vữa động mạch vành, điều trị đau thắt ngực, loạn nhịp tim, thiếu máu cơ tim, sau nong vành hoặc phẫu thuật bắc cầu động mạch Viên hoàn giọt là một dạng bào chế

đã được đưa vào Dược điển Trung Quốc

Viên hoàn giọt chứa đan sâm, tam thất Việt Nam (VHG ĐS-TT) là chế phẩm kết hợp giữa hai loại dược liệu đã được sử dụng phổ biến với mục đích chống đông và hạ lipid máu Đan sâm và tam thất được bào chế dưới dạng dùng đặc biệt là viên hoàn giọt, với đường dùng dự kiến là uống hoặc ngậm dưới lưỡi Viên hoàn giọt là dạng bào chế thuốc dược liệu dưới dạng hệ phân tán rắn bằng phương pháp đun chảy nhỏ giọt cao khô của hai loại dược liệu [89] Trong khi các hệ phân tán rắn khác chỉ tạo ra dạng sản phẩm trung gian, cần được máy dập viên hay đóng nang thì viên hoàn giọt bào chế được trực tiếp dạng bán thành phẩm nên viên hoàn giọt là dạng bào chế thích hợp với cao dược liệu Vài năm gần đây, dạng bào chế hoàn giọt nói chung và viên hoàn giọt chứa đan sâm - tam thất nói riêng rất được các doanh nghiệp quan tâm, nhưng chưa có nghiên cứu nào được thực hiện một cách đầy đủ Nhóm nghiên cứu tiến hành đánh giá tác dụng hạ lipid máu, chống đông máu và xác định độc tính của VHG ĐS-TT với mong muốn tạo ra sản phẩm kích thước nhỏ gọn dễ sử dụng, hiệu quả và an toàn

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu

 Đặc điểm mẫu nghiên cứu

Chế phẩm viên hoàn giọt chứa đan sâm, tam thất Việt Nam (VHG ĐS-TT) được bào chế tại Bộ môn Công Nghiệp Dược- Trường Đại học Dược Hà Nội, là sản phẩm của đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ y tế “Xây dựng quy trình bào chế viên hoàn giọt

có chứa đan sâm, tam thất Việt Nam”, được cung cấp bởi TS Bùi Thị Thúy Luyện (bộ môn Công Nghiệp Dược- Trường Đại học Dược Hà Nội)

- Tiêu chuẩn cơ sở của VHG ĐS-TT được trình bày ở phần phụ lục

- Thành phần công thức viên bao gồm:

Cao khô rễ đan sâm (Radix Salviae miltiorrhiza): 5,23 mg

(tương đương 43,56 mg rễ đan sâm)

Cao khô rễ tam thất (Radix Panax notoginseng): 0,77 mg

(tương đương 8,52 mg rễ tam thất)

- Dạng bào chế: viên hoàn nhỏ giọt

- Quy trình bào chế :

 Đun chảy: chất mang PEG 6000 được đun chảy hoàn toàn bằng bếp cách thủy ở nhiệt độ 70°C Cao dược liệu, borneol (đã nghiền nhỏ) được thêm vào hỗn hợp chảy lỏng, khuấy trộn trong 5 phút thu được hỗn hợp đồng nhất

 Nhỏ giọt: hỗn hợp đồng nhất này được nhỏ giọt qua đầu nhỏ giọt (đường kính trong 2,0 mm, đường kính ngoài 3,0 mm) xuống dầu parafin lạnh (làm lạnh bằng nước đá) và hóa rắn dần tạo thành viên hoàn giọt

 Làm khô: viên được thấm dầu và để khô tự nhiên Viên được bảo quản trong bình hút ẩm, tránh ánh sáng

- Đặc tính lý hóa của viên

VHG ĐS-TT có dạng hình cầu, đều, bề mặt nhẵn, khô, màu nâu sẫm, mùi thơm đặc trưng của borneol, đường kính trung bình 3,69 ± 0,10 mm, độ ẩm 6,1%, độ cầu 1,03, khối lượng viên trung bình 26 ± 1,5 mg, đồng đều khối lượng ± 5,5%, độ rã 13-

15 phút (hình 2.1)

Hình 2.1 Viên hoàn giọt chứa đan sâm, tam thất Việt Nam

 Xử lý mẫu nghiên cứu

Đối với thí nghiệm in vivo, thử độc tính cấp, độc tính bán trường diễn VHG ĐS-TT

được nghiền nhỏ hòa tan trong nước cất, siêu âm để tăng phân tán tạo hỗn dịch đồng nhất thành các nồng độ tương ứng với các liều thử đã được thiết kế

 Thiết kế liều thử cho mẫu nghiên cứu

Liều lượng VHG ĐS-TT dự kiến sử dụng trên người: 30 viên/ngày, chia 3 lần, mỗi viên 26 mg

Sử dụng phương pháp ngoại suy liều có hiệu quả tương đương giữa người và động vật thí nghiệm [13] Từ mức liều dự kiến sử dụng trên người quy đổi thành các liều thử tương ứng trên động vật thí nghiệm như sau:

+ Mô hình đánh giá tác dụng hạ lipid máu nội sinh:

- Liều thử 1: chuột nhắt trắng được uống liều 200 mg/kg/ngày (liều tương đương với liều dùng dự kiến trên người)

- Liều thử 2: chuột nhắt trắng được uống liều 400 mg/kg/ngày (liều gấp đôi liều

dùng dự kiến trên người)

+ Mô hình đánh giá tác dụng hạ lipid máu ngoại sinh:

- Liều thử 1: chuột cống trắng được uống liều 100 mg/kg/ngày (liều tương đương với liều dùng dự kiến trên người)

- Liều thử 2: chuột cống trắng được uống liều 200 mg/kg/ngày (liều gấp đôi liều

dùng dự kiến trên người)

+ Mô hình đánh giá tác dụng chống đông máu in vivo:

- Liều thử 1: chuột nhắt trắng được uống liều 200 mg/kg/ngày (liều tương đương với liều dùng dự kiến trên người)

- Liều thử 2: chuột nhắt trắng được uống liều 400 mg/kg/ngày (liều gấp đôi liều

dùng dự kiến trên người)

+ Thử độc tính cấp thử trên chuột nhắt trắng với mức liều cao nhất không gây chết

chuột, liều thấp nhất gây chết chuột hoàn toàn và các mức liều trung gian

+ Thử độc tính bán trường diễn trên chuột nhắt trắng theo mô hình liều lặp lại 28 ngày với hai mức liều: mức liều thấp thử với liều gấp 3 lần liều có tác dụng dược lý và mức

liều cao liều gấp 9 lần liều có tác dụng dược lý (liều gấp 3 lần mức liều thấp)

2.1.2 Động vật thí nghiệm

Chuột nhắt trắng chủng Swiss hai giống, cân nặng từ 18 - 22 g khỏe mạnh do

Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp

Chuột cống Wistar hai giống, cân nặng 180 - 200 g, khỏe mạnh do Học viện

Quân Y cung cấp