Phương pháp điện di (Tải: https://link1s.com/yHqvN)

Khi hiểu rõ cấu trúc, đặc điểm của các đại phân tử này, chúng ta có thể kết hợp với sự phát triển các kỹ thuật, các công nghệ hiện đại để tiến hành lai tạo, chọn giống mới, sản xuất các

MỞ ĐẦU

Ở mọi cơ thể sinh vật, vật chất sống được cấu tạo từ các đại phân tử sinh học, trong đó quan trọng nhất là nucleic acid và protein Các nucleic acid đóng vai trò quan trọng trong sự lưu trữ và truyền đạt thông tin di truyền cho thế hệ sau Hơn nữa, các thông tin này sẽ được biểu hiện trên cơ thể thông qua sự tạo thành các phân tử protein Trong các quá trình sao chép cũng như tổng hợp protein luôn xuất hiện nhiều biến đổi, đây chính là nguồn gốc của sự tiến hóa và tính đa dạng của sinh giới

Vì vậy việc tìm hiểu, phân tích các phân tử DNA, RNA là rất cần thiết Khi hiểu rõ cấu trúc, đặc điểm của các đại phân tử này, chúng ta có thể kết hợp với sự phát triển các kỹ thuật, các công nghệ hiện đại để tiến hành lai tạo, chọn giống mới, sản xuất các hợp chất thứ cấp dùng trong y học, sản xuất các chất kháng sinh…

Có rất nhiều kỹ thuật được ứng dụng trong công nghệ sinh học để nghiên cứu vật chất sống, trong đó điện di là một kỹ thuật rất hữu ích sử dụng nhằm phân tích, xác định và tinh sạch các đoạn DNA bằng cách dựa vào sự dịch chuyển của chúng trong môi trường điện trường

NỘI DUNG

I NGUYÊN TẮC CHUNG

Điện di là hiện tượng dịch chuyển của các phân tử tích điện dưới tác động của điện trường, hay nói cách khác là kỹ thuật phân chia các phân tử DNA, RNA, protein dựa trên các đặc điểm vật lý như khối lượng hay điện tích thực của chúng

Khi các phân tử tích điện được đặt trong một điện trường, chúng sẽ dịch chuyển về các cực (+) hoặc (-) tùy theo điện tích của chúng Protein có điện tích thực hoặc dương hoặc âm, còn các nucleic acid có một điện tích âm không đổi nhờ khung phosphate của mình và vì thế chỉ dịch chuyển hướng đến cực dương

Các phân tử protein và nucleic acid có thể được chạy điện di trên một khuôn

đỡ (support matrix) như giấy, cellulose acetate, gel tinh bột, agarose hoặc polyacrylamide gel Tuy nhiên, kỹ thuật điện di trên giá rắn (agarose hoặc polyacrylamide) được sử dụng phổ biến nhất Kỹ thuật này sử dụng một dung dịch đệm để dẫn điện và tạo điện trường đều, một bản gel để phân tách các phân tử và các chất nhuộm khác nhau để phát hiện vị trí các phân tử trên gel sau khi điện di Trong đó, polyacrylamide gel được dùng để phân tách các phân tử protein và các phân tử DNA có chiều dài <1 kb, còn agarose gel phân tách hiệu quả các phân tử DNA hoặc RNA có kích thước từ 20 bp-20 kb

II ĐIỆN DI AGAROSE GEL

Agarose có khối lượng phân tử xấp xỉ 120.000 Da, là một trong hai thành phần chính của agar chiếm khoảng 70%, phần kia là agaropectin chiếm khoảng 30% Agarose là một polymer mạch thẳng không bị sulphate hóa chứa hai gốc xen kẽ nhau là D-galactose và 3,6-anhydro-L-galactose

Agarose gel là một chất trong suốt hoặc trong mờ, tạo thành khi hỗn hợp agarose và nước (hoặc đệm điện di) được đun nóng tới >100 o

C và sau đó được làm lạnh; dạng gel xuất hiện ở khoảng 40-45 oC Bản chất quá trình đông lại của agarose

là phản ứng trùng hợp gắn nhiều gốc monomer tạo thành polymer nhờ nhiệt độ Các

chuỗi polymer liên kết chéo với nhau tạo thành một hệ thống mạng lưới với kích thước các mắt lưới tùy thuộc vào nồng độ agarose và phản ứng polymer hoá

Hình 1 Cấu trúc hoá học của agarose và cấu trúc agarose gel

1 Nguyên tắc

Các phân t ử nucleic acid có khối lượng và điê ̣n tích khác nhau được tách ra khi di chuyển từ cực âm sang cực dươn g của hê ̣ điê ̣n di trong mô ̣t điê ̣n trường có điê ̣n thế và cường đô ̣ thích hợp Tốc độ dịch chuyển của các phân tử trong gel phụ thuộc vào kích thước, cấu hình phân tử, nồng độ gel, lực điện trường Điện di agarose gel được xem là phương pháp tối ưu nhất dùng để phân tích, xác định và tinh sạch các đoạn DNA

Vị trí của DNA trong gel được xác định trực tiếp : các băng DNA trong gel đươ ̣c nhuô ̣m ở nồng đô ̣ thấp của thuốc nhuô ̣m huỳnh quang ethidium bromide (EtBr)

và có thể phát hiện dưới ánh sáng tử ngoại

2 Các yếu tố ảnh hưởng

2.1 Kích thước của phân tử

Các phân tử DNA có kích thước càng lớn (khối lượng phân tử lớn) thì tốc độ dịch chuyển càng chậm.Các phân tử DNA mạch thẳng sợi đôi đi qua bản gel ở các tốc đô ̣ tỷ lệ nghịch với hàm log10 của khối lượng phân tử của chúng

Hình 2 Mối quan hê ̣ giữa kích thước DNA và độ linh đô ̣ng điê ̣n di của nó

2.2 Nồng đô ̣ agarose

Đoạn DNA mang kích thước khác nhau di ̣ch chuyển ở các tốc đô ̣ khác nhau qua các bản gel chứa các nồng đô ̣ agarose khác nhau

Bảng 1 Các thông số điện di DNA bằng agarose gel

Hàm lượng agarose (%) trong gel

Kích thước DNA mạch thẳng (kb) sử dụng có

hiê ̣u quả

1 2 3 4 5 6

Hình 3 Điện di các mẫu DNA giống nhau ở các nồng độ agarose khác nhau A: 1%, B: 1,5%

và C: 2%

Theo hình trên, sự dịch chuyển của tập hợp các đoạn DNA trong hai mẫu ở ba nồng độ khác nhau của agarose, tất cả chúng ở trong một khay gel và được điện di ở cùng một điện áp trong một thời gian xác định Kết quả cho thấy, các đoạn lớn được phân tách tốt hơn ở gel 1%, trong khi các đoạn nhỏ thích hợp với gel 2%

2.3 Cấu hi ̀nh của DNA

phân tử sẽ di ̣ch chuyển trên agarose gel ở các tốc đô ̣ khác nhau

DNA của các plasmid mạch vòng dịch chuyển nhanh hơn DNA của plasmid

2.4 Thành phần base và nhiệt độ

Điê ̣n di của DNA trong agarose gel không bi ̣ ảnh hưởng rõ bởi thành phần base của DNA hoă ̣c nhiê ̣t đô ̣ Trong agarose gel , tính linh động điện di tương đối của các đoạn DNA có kích thước khác nhau không thay đổi trong kho ảng từ 4 o

C đến 30 o

C Nói chung, agarose gel thườ ng đươ ̣c cha ̣y ở nhiê ̣t đô ̣ phòng

3 Phương pháp điện di

3.1 Thiết bị điện di

Hình 5 Cấu trúc thiết bị điện di agarose gel

Thiết bị điện di agarose gel gồm 3 bộ phận cơ bản: nắp, khay vận hành và buồng điện di

+ Nắp: trên nắp có đầu ra của dây cáp điện nối điện cực trên buồng điện di với nguồn điện

+ Khay vận hành bao gồm: khay đổ gel, khuôn đổ gel, lược

+ Buồng điện di: là nơi đặt gel trong quá trình điện di Buồng có rãnh để cài lược, hai điện cực tạo ra điện trường trong dung dịch

Các đoạn DNA sẽ dịch chuyển với các tốc độ hơi khác nhau trong ba loại đệm trên

Đệm giúp thiết lập một giá trị pH, cung cấp các ion để hỗ trợ cho độ dẫn

Bảng 2 Các loại đệm sử dụng phổ biến trong điện di

Đệm Nồng độ dung dịch sử dụng Dung dịch stock (1 lít)

40 mL EDTA

3.3 Quy tri ̀nh điê ̣n di

3.3.1 Chuẩn bị agarose gel

Có nhiều loại agarose khác nhau thích hợp để chạy điện di , loại agarose dùng

tốt nhất trong thí nghiê ̣m là type -II-agarose có nô ̣i thẩm thấu thấp osmotic) Nó dễ dàng chảy ra và ta ̣o thành mô ̣t dung di ̣ch trong suốt , kết quả là gel đàn hồi thâ ̣m chí ở các nồng đô ̣ thấp Tuy nhiên , type-II-agarose dễ bi ̣ bẩn b ởi sulphate polysaccharides (SP), hơn nữa SP còn ức chế các enzyme như ligase , polymerase và RE Vì thế, các đoạn DNA dung ly từ những gel như thế phải được làm sạch cẩn thận trước khi chúng được dùng như là các khuôn mẫu hoặc cơ chất cho các enzyme này

(low-endo-Cách tiến hành: Cho 1% type-II-agarose vào 100 mL đê ̣m 0,5 TAE Đun trong nồi khử trùng hoặc lò vi sóng cho đến khi agarose tan hoàn toàn Nếu quá trình đun mất nước quá nhiều thì phải thêm nước cho đủ 100 mL Để nguô ̣i khoảng

60oC và đổ vào bu ồng điê ̣n di có cài s ẵn lược Chiều dày gel khoảng 5 mm là thích

hơ ̣p Sau 30-40 phút, khi gel đã đông cứng, gỡ lược ra

3.3.2 Đặt mẫu DNA vào giếng

Tùy thuộc vào từng mục đích điện di khác nhau có thể sử dụng nồng độ DNA cao hoă ̣c thấp Chẳng ha ̣n theo tỷ lê ̣ sau:

DNA (1 g/1 µL ) : 1 L

Đê ̣m màu bromophenol (10 loading dye):1 L

Nước cất 2 lần: 9 L

Tổng số : 11 L

Dùng micropipette hút 11 L dung di ̣ch trên cho vào giếng

Thường đă ̣t mẫu sau khi đã đổ di ̣ch đê ̣m 0,5 TAE vào buồng điê ̣n di cho ngâ ̣p gel, ít khi đặt mẫu trước rồi đổ đệm sau Thường dùng micropipette loại 20-200 L

và đặt bu ồng điê ̣n di trên bàn có nền đen Khi tăng điện thế của quá trình điện di, các đoạn DNA lớn thường dịch chuyển nhanh hơn so với các đoạn nhỏ DNA dịch chuyển từ cực âm đến cực dương Quan sát sự d ịch chuyển bằng màu bromophenol

để biết lúc nào cần ngừng điê ̣n di

3.3.3 Nhuộm DNA bằng EtBr

Phương pháp quan sát DNA trong agarose gel thuâ ̣n lợi nhất là dùng thuốc nhuô ̣m huỳnh quang EtBr Sau khi cha ̣y điê ̣n di xong lấy nhe ̣ bản gel ra khỏi khuôn

và ngâm vào dung dịch EtBr nồng đô ̣ 0,5 g/mL, trong thờ i gian 30-45 phút, tốt nhất trên một máy lắc nhe ̣ (đô ̣ 10 vòng/phút ) Đổ dịch nhuộm EtBr vào một bình riêng để xử lý và rửa bản gel bằng cách ngâm trong nước cất hai lần, mỗi lần 15-20 phút EtBr thường pha sẵn ở da ̣ng đâ ̣m đă ̣c 5 mg/mL và giữ ở 4o

C trong tối

EtBr đươ ̣c dùng để phát hi ện DNA sợi đôi và RNA sợi đơn Tuy nhiên, ái lực (affinity) của thuốc nhuộm đối với nucleic acid sợi đơn là tương đối thấp và có hiê ̣u

suất huỳnh quang không cao Sau khi nhuộm, EtBr sẽ xen vào giữa các base của nucleic acid và cho phép phát hiện dễ dàng chúng ở trong gel

Thường EtBr (0,5 g/mL) được đưa vào trong agarose gel đ ể phản ứng nhuộm xảy ra trong suốt quá trình điện di Mặc dù tính linh đô ̣ng điê ̣n di của DNA sợi đôi mạch thẳng giảm khi có mặt thuốc nhuộm (khoảng 15%), nhưng khả năng xác đi ̣nh gel trực tiếp dưới ánh sáng UV trong suốt quá trình điện di hoă ̣c ở giai đoa ̣n cuối có

ưu thế rõ rê ̣t Tuy nhiên , nếu cần có thể ch ạy điện di gel không có EtBr và chỉ nhuô ̣m DNA ho ặc RNA sau khi điê ̣n di xong Gel đươ ̣c ngâm trong đê ̣m điê ̣n di hoă ̣c H2O chứa EtBr (0,5 g/mL)/45 phút ở nhiệt độ phòng

Hình 6 Sơ đồ minh họa các bước trong quá trình điện di agarose gel

3.3.4 Quan sa ́ t và chụp ảnh

Bản gel sau khi nhuộm EtBr được quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ( = 302 nm) Dùng thiế t bị chuyên du ̣ng đ ể phân tích và lưu trữ hình ảnh DNA (Gel Documentation System)

(a) (b)

Hình 7: Quan sát DNA dưới ánh sáng tử ngoại (a) và hình ảnh điện di DNA trên agarose gel (b)

3.4 Một số phương pháp thu hồi DNA tư ̀ agarose gel

a) Dùng agarose có nhiệt độ nóng chảy thấp

Mẫu agarose gel có nhiệt độ nóng chảy thấp chứa đoạn DNA quan tâm được cắt

ra khỏi bản gel và cho vào trong đệm với tỷ lệ 1:1, bổ sung muối đến nồng độ 0,5 M, sau đó được nóng chảy ở 70oC để hòa tan hoàn toàn trong đệm Dung dịch gel có DNA được chiết bằng phenol/chloroform và kết tủa Lưu ý DNA được tách chiết bằng phương pháp này không thích hợp cho mọi phương thức thao tác tiếp theo, do sự hiện diện của các nhân tố ức chế trong agarose

và kết tủa

Bổ sung muối đến nồng độ 0,5M

Dung dịch gel có DNA

70oC

Hình 8 Sơ đồ tóm tắt quá trình thu hồi DNA quan tâm bằng cách dùng agarose có nhiệt độ nóng chảy thấp

b) Ly tâm

Mẫu agarose gel có chứa băng DNA quan tâm được cắt ra và cho vào đệm chiết, làm nóng để hòa tan hoàn toàn, sau đó cho dung dịch gel lên trên một lớp bông thủy tinh đã silicon hóa đặt trong một cột lọc nhỏ loại 0,5 ml Cột này được cho vào một tube vi ly tâm loại 1,5 mL và được ly tâm ở tốc độ cao 10.000-15.000 rpm trong 10-15 phút DNA sẽ liên kết với màng còn dung dịch đệm sẽ đi qua lớp bông thủy tinh vào tube vi ly tâm Cho đệm rửa vào cột và rửa cột vài lần bằng cách

ly tâm nhanh Thay tube vi ly tâm mới, cho đệm hòa tan DNA vào cột và ly tâm để dung ly (elution) DNA ra khỏi màng vào tube Dung dịch DNA thu được có thể được tinh sạch thêm nếu cần Cũng có thể đông lạnh mẫu gel trước khi dùng phương pháp ly tâm để cải thiện hiệu suất thu hồi DNA

c) Điện di vào bẫy

* Cách 1: Một cái rãnh nhỏ được cắt trong agarose gel ngay phía trước của băng DNA quan tâm Rãnh này được làm đầy bằng glycerol và gel được điện di nhanh trở lại để chuyển DNA từ gel vào trong dung dịch glycerol (quá trình điện di

agarose gel chứa băng DNA Cắt

Đoạn DNA quan tâm

cho vào đệm chiết, làm nóng hòa tan hoàn toàn

ly tâm ở 15.000 rpm trong 10-15 phút

10.000-thủy tinh đặt trong một cột lọc

cho vào tube ly tâm

rửa cột vài lần

DNA liên kết với màng

dung ly DNA ra khỏi màng

Hình 9 Sơ đồ tóm tắt quá trình thu hồi DNA quan tâm

bằng cách dùng ly tâm

có thể được kiểm soát bằng UV) Dung dịch glycerol-DNA sau đó được chiết bằng pipette

* Cách 2: sau khi điện di, một khe nhỏ được cắt trong gel ngay phía trước băng DNA quan tâm và đặt trong khe một mẫu giấy loại NA-45 Gel sau đó được điện di trở lại và băng DNA quan tâm sẽ dịch chuyển vào trong mẫu giấy Mẫu giấy sau đó được rửa và DNA được dung ly trong đệm bằng cách đun nóng mẫu giấy tới 70o

C DNA sau đó có thể được tách chiết bằng phenol và kết tủa

d) Dùng hạt thủy tinh

Mẫu gel quan tâm được hòa tan trong dung dịch muối NaI ở nồng độ khoảng 4

M Sau đó, các hạt thủy tinh được bổ sung vào dung dịch để liên kết hiệu quả với các đoạn DNA được phóng thích ở nồng độ đã cho của NaI RNA, protein và các tạp chất khác không liên kết với các hạt thủy tinh Tiếp theo, tiến hành rửa và kết tủa tiểu thể, DNA tinh sạch được dung ly khỏi hạt thủy tinh trong đệm muối thấp Tuy nhiên, phương pháp này mặc dù nhanh và hiệu quả nhưng lại có phạm vi tối ưu hẹp Thu hồi các đoạn DNA nhỏ (500-800 bp) là không hiệu quả lắm và các đoạn lớn

Cắt một rãnh nhỏ phía trước

băng DNA quan tâm

Làm đầy bằng glycerol

Điện di nhanh trở lại để chuyển DNA

từ gel vào trong dung dịch glycerol

Chiết dung dịch glycerol-DNA

bằng pipette

Cắt một rãnh nhỏ trước băng DNA quan tâm

Đặt trong khe một mẫu giấy loại NA-45

Điện di nhanh trở lại để chuyển DNA từ gel vào

Hình 10 Sơ đồ tóm tắt quá trình thu hồi DNA quan tâm bằng cách dùng

điện di vào bẫy (a): cách 1, (b): cách 2

(>15 kb) có thể liên kết với các hạt thủy tinh khác nhau và các sợi DNA có thể bị phá vỡ trong suốt các chu kỳ rửa

4 Ứng dụng của điện di agarose gel

Ước lượng kích thước của các phân tử DNA sau khi thực hiện phản ứng cắt

hạn chế (ví dụ: lập bản đồ hạn chế của DNA được tạo dòng…)

Phân tích các sản phẩm PCR (ví dụ: trong chẩn đoán di truyền phân tử hoặc

in dấu di truyền…)

Phân tách DNA hệ gen đã được cắt hạn chế trước khi thẩm tích Southern, hoặc RNA trước khi thẩm tích Northern

5 Ưu điểm và nhược điểm

* Ưu điểm của phương pháp này là gel được rót dễ dàng, không gây biến tính

mẫu và bền vững vật lý hơn polyacrylamide Mẫu cũng dễ thu hồi

* Nhược điểm là agarose gel có thể bị nóng chảy trong quá trình điện di, đệm

có thể bị tiêu hao, và các dạng khác nhau của nucleic acid có thể chạy không ổn định

II ĐIỆN DI POLYACRYLAMIDE GEL

Acrylamide là một monomer có cấu trúc như sau:

Khi có mặt các gốc tự do, được cung cấp bởi ammonium persulphate và ổn

Rửa và kết tủa tiểu thể

Tách chiết DNA bằng phenol

O