Kỹ thuật sắc ký cột hở

PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ CỘT Phương pháp sắc ký 2 3 4 1 Dụng cụ hóa chất Kỹ thuật tiến hành Ưu nhược điểm Phương Pháp Sắc Ký Nguyên tắc phương pháp sắc ký Sắc ký là một phương pháp tách trong đó các cấu tử được tách được phân bố giữa hai pha, một trong hai pha là pha tĩnh đứng yên còn pha kia chuyển động theo một hướng xác định Pha tĩnh đứng yên có khả năng hấp thụ chất phân tích Pha động di chuyển qua pha tĩnh bởi áp suất hoặc do trọng.

Trang 1

PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ CỘT

Trang 3

Phương Pháp Sắc Ký

Trang 4

Nguyên tắc phương pháp sắc ký

Sắc ký là một phương pháp tách trong đó các cấu tử được tách được phân bố giữa hai pha, một trong hai

pha là pha tĩnh đứng yên còn pha kia chuyển động theo một hướng xác định

- Pha tĩnh: đứng yên có khả năng hấp thụ chất phân tích

- Pha động di chuyển qua pha tĩnh bởi áp suất hoặc do trọng lực

Sắc ký hấp phụ được thực hiện trên một ống trơ về mặt hóa học đối với các chất trong quá trình sắc ký có thể là: thủy tinh, kim loại, nhựa thẳng

Trang 5

Việc tách hai hợp chất đạt kết quả tốt hay không là tùy thuộc vào hệ số phân chia Bất kỳ một hợp chất nào khi được đặt vào một hệ thống gồm có 2 pha, lúc đạt đến trạng thái cân bằng, hợp chất đó sẽ phân bố vào mỗi pha với một tỉ lệ nồng độ cố định, tỉ lệ này thay đổi tùy vào các tính chất động học của các hợp chất và của cả hai pha

Do các cấu tử có ái lực khác nhau với pha tĩnh nên chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau

2

Trang 6

Phân loại sắc ký

Theo pha động:

• Sắc ký khí: pha động là khí

• Sắc ký lỏng: pha động là lỏng

• Sắc ký chất lỏng siêu tới hạn: CO2 lỏng

Theo không gian:

• Sắc ký cột

• Sắc ký lớp mỏng

• Sắc ký giấy

Theo cơ chế:

• Sắc ký hấp phụ

• Sắc ký phân bố

• Sắc ký ion

• Sắc ký rây phân tử

Trang 7

Dụng cụ, hoá chất

Trang 8

1 Cột

Cột là những ống hình trụ bằng thủy tinh dài 30-70 cm, đường kính 1-5 cm, đầu dưới có một vòi thủy tinh và 1 khóa để điều chỉnh tốc độ chảy

Kích cỡ của cột tùy thuộc vào số lượng mẫu chất cần phân tách

- Trọng lượng chất hấp phụ phải lớn hơn 25- 50 lần trọng lượng mẫu cần sắc ký

- Tỉ lệ giữa chiều cao chất hấp phụ và đường kính trong của cột vào khoảng 10:1

Trang 9

2 Pha tĩnh

• Silica gel pha thường: đường kính trung bình 40 – 200µm, các lỗ rỗng có đường kính trung bình 40 – 300Å,

diện tích bề mặt khoảng 100 – 800 m2/g

• Vị trí hoạt động: nhóm silanol, hoạt động mạnh tạo nối hydrogen mạnh với những hợp chất được sắc ký,

những chất phân cực bị silica giữ chặt lại trong cột và giải ly chậm hơn và ngược lại

• Có thể điều chỉnh hoạt tính bề mặt của silica gel bằng cách:

- Thêm nước (giảm hoạt tính) hoặc loại bỏ nước (tăng hoạt tính)

- Kết hợp với những hợp chất khác (silica gel cơ chế hóa)

Silica gel

5

Trang 10

2 Pha tĩnh

Alumina

Alumina là oxid aluminium Al2O3, qui trình điều chế tương tự silica gel nhưng trên

nguyên liệu là hydroxid aluminium, hơn thế nữa có thể điều chỉnh độ pH của dung dịch phản ứng để sản xuất ra hạt alumina với bề mặt có tính acid, tính kiềm hay trung tính

- Alumina trung tính: pH từ 6,5-7

Trang 11

Là đất sét diatomit, có các lỗ rỗng lớn, diện tích bề

mặt lớn, tính hấp phụ rất yếu; giảm khả năng hấp

phụ bằng cách thêm HCl 3%, rửa sạch clor và sấy

khố ở 80 sử dụng làm pha tĩnh trong sắc ký phân

Trang 12

3 Dung môi:

Đây là lựa chọn khó nhất và cũng quan trọng nhất

Sắc ký cột, thường tiến hành với một hỗn hợp 2 dung môi được dùng làm pha động: một dung môi phân cực và

một dung môi không phân cực Đôi khi có thể dùng một dung môi duy nhất hoặc hỗn hợp 3 dung môi khác nhau

Muốn phân tách sản phẩm và tạp chất tốt nhất và dùng tiết kiệm dung môi phải chạy mẫu trên sắc ký bản mỏng (TLC) – bản nhôm hoặc kính phủ silica (thường là bản nhôm vì rẻ hơn)

Trang 13

3 Dung môi:

Bước 1: Mẫu cần sắc kí được hòa tan hoàn toàn trong dung

môi phù hợp, với nồng độ 10mg/ml gọi là dung dịch mẫu (A)

Bước 2: Chuẩn bị 4-6 tấm bản mỏng 2,5 x 10 cm Chấm lên

những tấm bản này mỗi tấm 1 chấm khoảng 2-5μl dung dịch (A)

Bước 3: Mỗi bản mỏng được triển khai với 1 loại dung môi giải

ly khác nhau, kế đó hiện hình các vết trên bản bằng đèn UV hoặc bằng các thuốc thử Với đơn dung môi sẽ dễ dàng thấy được dung môi nào là phù hợp Tìm một hỗn hợp dung môi, trong đó một dung môi kém phân cực và một dung môi phân cực

9

Trang 14

• Với hỗn hợp mẫu chất là kết quả của phản ứng tổng hợp hữu cơ, ta chọn hệ dung môi có thể đẩy hợp chất cần quan tâm lên ở vị trí trên bản với Rf = 0,2-0,3

• Với mẫu cao thô chiết xuất từ cây cỏ, chọn dung môi giải ly đầu tiên là dung môi có thể đẩy vết ít phân cực nhất của cao chiết lên vị trí ở bản với Rf = 0,5 và chọn dung môi chấm dứt sắc ký cột là dung môi có thể đẩy vết phân cực nhất của cao chiết lên vị trí ở bản với Rf = 0,2

Bước 4:

Trang 15

11

Trang 16

4 Mẫu sắc ký

Mẫu thử trước khi phân tích phải được loại tạp chất bằng phương pháp thích hợp

Mẫu thử có thể ở 2 dạng:

- Dạng dung dịch khá đậm đặc: hòa tan mẫu trong dung môi không quá phân cực so với

hệ dung môi pha động

- Dạng bột khô: hòa tan mẫu trong dung môi như etyl axetat hoặc methanol, thêm vào

silica gel hạt lớn vừa đủ, cô quay hỗn hợp để đuổi hết dung môi thu được mẫu ở dạng bột mịn tơi xốp

Dạng dung dịch

đậm đặc

Dạng bột khô

Trang 17

1. Kỹ Thuật Tiến Hành

Trang 18

3.Để pha tĩnh lắng xuống và nhẹ nhàng đóng van cột lại để silica/alumina được nhồi chặt trong cột (Hình 4, bước D)

4.Tháo dung môi đến mức chạm vào bề mặt pha rắn (hình 4, bước E)

Trang 19

1.Nhồi cột

Cách 2:

1 Thêm silica gel khô vào cột và nối chân không bằng cách nối ống chân không vào đầu ra của cột (hình 5, bước B) Chân không giúp quá trình nén silica gel và giữ nó ổn định cho bước tiếp theo

2 Khi tạo độ chân không rồi, rót từ từ dung môi vào (Hình 5, bước D)

3 Để dung môi chảy qua cột tới khi chảy đến đáy cột Tại điểm này, đóng van và tắt chân không (Hình 5, bước E)

4 Để dung môi qua cột với lượng khoảng 5 – 6 lần lượng dung môi đầy cột để đảm bảo hoàn thành quá trình nhồi cột

5 Tháo dung môi cho tới khi mức dung môi trong cột chạm vào bề mặt pha tĩnh (hình 5, bước F)

14

Trang 20

4 Tiếp tục đổ hỗn hợp vào cột đến khi tất cả lượng silica/alumina hết.Rửa thành cột bằng cách rót dung môi lên thành trong của cột.

5 Mở van tháo dung môi đến khi mức dung môi trong cột chạm đến bề mặt của pha tĩnh (Hình 6, bước E)

Trang 21

Nạp mẫu

Nạp mẫu dạng dung dịch

• Mở khóa cho dung môi chảy ra khỏi cột để hạ mức dung môi trong cột xuống sao cho vừa sát với mặt thoáng của chất hấp phụ trong cột

Tách chiết và phân lập hợp chất thiên nhiên Phương pháp sắc ký cột

• Đóng khóa lại, dùng pipette hút dung dịch mẫu chất và nạp vào đầu cột Đặt đầu của pipette gần sát với mặt thoáng của chất hấp phụ trong cột, vừa bóp vừa rây pipette dọc quanh thành trong của cột, cho dung dịch chất chảy ra dọc theo thành trong của cột chạm xuống bề mặt của chất hấp phụ

• Mở khóa bên dưới cho dung môi chảy ra khỏi cột, làm cho dung dịch mẫu được thấm hết vào chất hấp phụ trên đầu cột

• Dùng pipette cho một lượng nhỏ dung môi mới lên đầu cột, dùng dung môi này để rửa sạch dung dịch mẫu chất đã dính trên thành cột Tiếp tục mở khóa cho dung môi chảy qua Lặp lại vài lần như thế để dung dịch mẫu thấm sâu vào phần chất hấp phụ ở phần đầu cột và phần dung môi trên đầu cột trở nên trong suốt

• Cho một lớp cát (hoặc bông gòn) dầy khoảng 3-6 mm đặt nhẹ lên trên mặt thoáng của chất hấp phụ để bảo vệ mặt cột

• Sau khi nạp mẫu xong cho dung môi vào đầy cột để bắt đầu quá trình giải ly

16

Trang 22

Nạp mẫu

Nạp mẫu dạng bột khô:

• Đặt mẫu khô lên đầu cột, dùng dung môi bắt đầu sắc ký cột thấm ướt toàn bộ silica gel

• Cho một lớp bông gòn trên bề mặt thoáng của chất hấp phụ để bảo vệ

• Cho dung môi vào đầy cột để bắt đầu quá trình giải ly

Trang 23

Giải ly chất ra khỏi cột

Các phương pháp giải ly

• Giải ly nhờ trọng lực: các hạt gel nạp vào cột có kích thước lớn hơn 60µm

• Giải ly sử dụng lực đẩy: dùng máy bơm tạo áp lực để đẩy dung môi qua pha tĩnh, kích thước hạt gel 40-63 µm, cột sắc ký có thành dày với lớp bao lưới che chắn bên ngoài để tránh vỡ cột khi có áp suất cao

• Giải ly sử dụng lực hút: dùng máy bơm hút chân không ở đầu ra của cột

18

Trang 24

Dung môi giải ly và kỹ thuật tăng dần tính phân cực cho dung môi giải ly

• Giải ly sử dụng dung môi đơn nồng độ: chỉ sử dụng đơn dung môi hoặc hỗn hợp dung

môi nhưng trong hỗn hợp tỉ lệ giữa các thành phần không thay đổi để giải ly cho đến khi việc tách chất hoàn tất

• Giải ly sử dụng dung môi có nồng độ tăng theo kiểu bậc thang: Việc sử dụng một loại

dung môi sẽ chỉ giải ly ra khỏi cột một số cấu tử nhất định và một số cấu tử khác có tính phân cực hơn vẫn còn nằm ở đầu cột Vì thế muốn đuổi chúng ra khỏi cột, phải dùng một dung môi có ái lực mạnh hơn

• Giải ly sử dụng dung môi với nồng độ tăng dần tuyến tính: Dung môi giải ly có độ phân cực tăng dần đều

Trang 25

Vận tốc giải ly

• Vận tốc chảy của dung môi giải ly không được quá nhanh (sẽ không kịp cân bằng với chất hấp phụ) cũng không được quá chậm hoặc bị cho ngừng lại một thời gian vì lúc đó các dãy chất tan sẽ khuếch tán hoặc trải dài theo mọi hướng làm xấu quá trình tách

• Thông thường trong đa số sắc ký cột, vận tốc giải ly khoảng 5-50 giọt/phút hoặc 1-2 cm/phút

20

Trang 26

Theo dõi quá trình giải ly cột

- Với mẫu có màu: quan sát bằng mắt thường ta thấy các dãy lớp có màu sắc khác nhau đang tách xa nhau ra Theo dõi các dãy màu và hứng chúng khi được giải ly khỏi cột

- Với các mẫu không màu: hứng dung dịch giải ly trong những hủ bi có thể tích như

nhau và đánh số thứ tự Dung dịch trong những hủ bi hứng được sẽ được sắc ký lớp mỏng trên cùng một bản mỏng Những lọ nào có sắc ký bản mỏng giống nhau sẽ được gom chung lại với nhau thành một phân đoạn Đuổi dung môi ở áp suất kém các phân đoạn này sẽ cho cao của các phân đoạn đó

Trang 27

Ghi nhận kết quả sắc ký

• Phân đoạn thu được là một chất tương đối sạch tuy vẫn có chứa một ít tạp chất: khi trên bản mỏng có một vết chính chiếm 80%, ngoài ra còn một số vết mờ

• Phân đoạn thu được là hỗn hợp nhiều chất: khi trên bản mỏng có nhiều vết, các vết có độ đậm như nhau

• Để kiểm tra xem một hợp chất có tinh khiết hay không ta sử dụng sắc ký lớp mỏng lần lượt với 3 hệ dung môi giải ly hoàn toàn khác hẳn nhau Nếu chất chỉ cho hiện ra một vết duy nhất thì có thể kết luận là chất tinh khiết Nếu chất không tinh khiết thì sẽ cho thấy bên cạnh vết chính có thêm vết khác

• Muốn khảo sát rõ hơn thì dùng HPLC

22

Trang 28

Xác định cấu trúc hóa học của một hợp chất

Chỉ nên tìm cách xác định cấu trúc hóa học của một hợp chất tinh khiết sau khi đã kết tinh nhiều lần trong dung môi phù hợp (độ tinh khiết 95%)

Kết quả khảo sát cấu trúc hóa học của một hợp chất theo các chi tiết sau:

• Mô tả hình dạng, màu sắc và mùi của sản phẩm.

• Sắc ký lớp mỏng trong hệ dung môi gì, thuốc hiện hình gì, giá trị Rf của vết, hình chụp bản mỏng.

• Điểm nóng chảy, Năng lực triền quang

• Khối phổ, Phân tích nguyên tố, Phổ hồng ngoại IR, Phổ tử ngoại: λmax, Phổ 1H –NMR, Phổ 13C-NMR

Sau khi biện luận các tín hiệu của các loại phổ, so sánh với các số liệu trong tài liệu sẽ đề xuất cấu trúc hóa học của hợp chất cô lập được

Trang 29

Ưu - nhược điểm

• Có thể sử dụng trong cả hai lĩnh vực phân

tích và điều chế

• Sắc ký cột không những dùng để xác định số

lượng các thành phần của hỗn hợp mà nó còn

có thể được dùng để tách và tinh chế những

thành phần phân tích

• Pha tĩnh và các dụng cụ thí nghiệm rẻ tiền,

dễ kiếm; có thể triển khai với một lượng lớn

• Quá trình chạy cột mất thời gian

• Quá trình tách chậm và hiệu quả thấp so với sắc ký lỏng cao áp

24

Trang 30

Thank For Watching

Định dạng
Số trang	30
Dung lượng	3,97 MB