Xác định các dấu ấn huyết thanh học của nhiễm virus viêm gan B bằng kỹ thuật miễn dịch điện hoá phát quang ECLIA 1 Nhiễm Virus viêm gan B Viêm gan B gây ra do virus HBV (Hepatitis B Virus) Đây là loại virus có hình cầu, vỏ bao quanh của HBV là lipoprotein có chứa kháng nguyên bề mặt HBsAg Cho đến nay, virus HBV được xác định có 8 tuýp kháng nguyên khác nhau Virus HBV có thời gian ủ bệnh từ 3 đến 6 tháng Giai đoạn đầu hoạt động, virus gây bệnh viêm gan B cấp tính Sau 6 tháng, nếu cơ thể.
Trang 1Xác định các dấu ấn huyết thanh học của nhiễm virus viêm gan B bằng
kỹ thuật miễn dịch điện hoá phát quang ECLIA
1 Nhiễm Virus viêm gan B
Viêm gan B gây ra do virus HBV (Hepatitis B Virus) Đây là loại virus có hình cầu, vỏ bao quanh của HBV là lipoprotein có chứa kháng nguyên bề mặt HBsAg Cho đến nay, virus HBV được xác định có 8 tuýp kháng nguyên khác nhau
Virus HBV có thời gian ủ bệnh từ 3 đến 6 tháng Giai đoạn đầu hoạt động, virus gây bệnh viêm gan B cấp tính Sau 6 tháng, nếu cơ thể không thể tự miễn dịch được với virus, bệnh sẽ chuyển sang giai đoạn mãn tính, nguy cơ cao đối mặt với nhiều biến chứng nguy hiểm như xơ gan, ung thư gan và có thể chịu nhiều gánh nặng bệnh tật suốt đời
Viêm gan B lây qua đường nào?
• Lây qua đường máu
• Lây từ mẹ sang con
• Lây qua đường tình dục
Hiện nay, các cơ sở y tế cũng như các cơ sở nghiên cứu, đào tạo về y học ứng dụng nhiều kỹ thuật xét nghiệm để xác định các dấu ấn huyết thanh học của nhiễm virus viêm gan B như:
• Kỹ thuật ngưng kết hồng cầu thụ động ngược (RPHA: Reversed
Passive Hemagglutination Assay)
• Kỹ thuật miễn dịch sắc ký (Chromatography Immuno Assay)
Trang 2• Kỹ thuật miễn dịch phóng xạ (RIA: Radio Immuno Assay)
• Kỹ thuật miễn dịch gắn enzym (ELISA: Enzyme- Linked
Immunosorbent Assay)
• Kỹ thuật miễn dịch enzym vi hạt (MEIA: Microparticles Enzyme
Immuno Assay)
• Kỹ thuật miễn dịch điện hóa phát quang (ECLIA:
Electrochemiluminescence Immunoassay)
2 Kỹ thuật miễn dịch điện hóa phát quang (ECLIA)
Kỹ thuật này được thực hiện trên máy tự động hoàn toàn
Nguyên lý
- Dùng kháng thể đã biết để phát hiện kháng nguyên chưa biết, và ngược lại
- Dùng hệ thống phát hiện là điện hoá phát quang để nhận biết được sự hiện diện của phức hợp kháng nguyên- kháng thể
Kỹ thuật bao gồm các phản ứng:
Hình 1 Phản ứng điện hóa phát quang tại bề mặt điện cực
- Phản ứng miễn dịch: kháng nguyên kết hợp đặc hiệu với kháng thể được
đánh dấu bằng ruthenium Sử dụng sự tương tác của biotin và streptavidin cùng với các vi hạt có từ tính để gắn phức hợp kháng nguyên-kháng thể (đánh dấu bằng ruthenium) vào pha rắn
Kỹ thuật miễn dịch điện hóa phát quang sử dụng chất đánh dấu là ruthenium khởi phát từ điện chứ không phải từ phản ứng hóa học, vì vậy có khả năng phát hiện chất có nồng độ thấp và cho kết quả rất nhanh, trong khoảng 18 phút Các
Trang 3kháng thể (hoặc kháng nguyên) gắn biotin và chất đánh dấu ruthenium cùng vi hạt phủ streptavidin được ủ trong hỗn hợp phản ứng Khi đặt một điện thế lên điện cực buồng đo, phức hợp ruthenium tác dụng với prophylamine, chuyển sang trạng thái kích thích, và tín hiệu phát quang được hình thành Tín hiệu ánh sáng được đo và kết quả xét nghiệm được xác định qua đường chuẩn xét nghiệm
đã được thiết lập Một đường cong qui chiếu được ghi nhớ trong một thanh đã
mã hóa các thuốc thử và được xác định một lần nữa bởi máy phân tích tự động bởi một đường chuẩn ở hai điểm [1], [2], [3]
- Phản ứng điện hoá phát quang: để phát hiện sự hiện diện của phức hợp
kháng nguyên- kháng thể đánh dấu bằng ruthenium Dưới tác dụng của điện, phức hợp ruthenium phản ứng với tripropylamine (TPA) và phát quang
Kết quả phản ứng điện hóa phát quang là tín hiệu ánh sáng được máy ghi nhận
và suy ra nồng độ ban đầu của kháng nguyên hoặc kháng thể có trong mẫu thử
Nguyên lý ECLIA kiểu sandwich
Hình 2 Nguyên lý sandwich của kỹ thuật miễn dịch điện hóa phát quang [3]
Trang 4+ Ở bước đầu tiên, trong một ống phản ứng, mẫu thử được cho vào cùng với
antiHBs đơn dòng gắn biotin và một hỗn hợp antiHBs đơn dòng- đa dòng được đánh dấu bằng ruthenium Trong quá trình ủ 9 phút, các kháng thể sẽ bắt giữ HBsAg nếu có trong mẫu thử
+ Ở bước thứ hai, các vi hạt từ tính có áo một lớp streptavidin được thêm vào
Trong quá trình ủ 9 phút, phức hợp kháng nguyên kháng thể gắn vào pha rắn
do tương tác giữa biotin và streptavidin
+ Sau khi ủ lần 2, hỗn hợp phản ứng chứa phức hợp miễn dịch được chuyển đến buồng đo; chỉ phức hợp miễn dịch có từ tính bị bắt giữ bởi từ trường ở bề mặt điện cực, còn những thành phần thuốc thử và mẫu thử khác sẽ bị rửa trôi
đi
+ Trong phản ứng điện hóa phát quang, phức hợp miễn dịch được giữ lại ở điện cực có chứa ruthenium, dưới tác dụng kích thích của điện, sẽ tác dụng với triprophylamine (TPA) và phát quang Tín hiệu ánh sáng thu được tỉ lệ thuận với lượng HBsAg có trong mẫu thử [1], [2], [3], [4]
Kỹ thuật lấy mẫu
• Lấy máu đầu ngón tay
• Lấy máu tĩnh mạch
Xử lý mẫu
Tách huyết thanh/huyết tương
Giữ ống máu ổn định ở nhiệt độ phòng tối thiểu 30 phút mới tiến hành tách huyết thanh/huyết tương nhưng không quá 2 giờ Khi không tách được huyết thanh/huyết tương trong vòng 2 giờ, mẫu sau khi để ổn định ở nhiệt độ phòng
30 phút chuyển bảo quản ở nhiệt độ 4oC - 8oC Tách huyết thanh/huyết tương trong vòng tối đa 24 giờ Mẫu xét nghiệm sinh học phân tử, tách huyết thanh/huyết tương thực hiện trong vòng 6 giờ hoặc theo hướng dẫn của bộ sinh phẩm xét nghiệm
Nếu có máy ly tâm: Tốc độ và thời gian ly tâm 2.000 – 2.500 vòng/phút trong
10 phút Khi xếp ống máu vào máy phải đảm bảo cân bằng ở các vị trí đối xứng Dùng pipette hút phần huyết thanh/huyết tương sang ống lưu mẫu có mã số tương ứng
Trang 5Không có máy ly tâm: Tách huyết thanh/huyết tương khi thấy mẫu đã được phân tách rõ ràng
Kiểm tra thể tích huyết thanh/huyết
Qui trình kỹ thuật
1 Đặt hóa chất cần thử vào máy, chạy mẫu chuẩn và mẫu chứng
2 Tách 200 µl huyết thanh cho vào ống eppendort, đặt vào máy
3 Khai báo các thông tin của mẫu thử, yêu cầu xét nghiệm, ấn nút khởi động
4 Máy sẽ tự động đưa ra kết quả sau khi làm xong
5 Thời gian: 18 phút
Đọc kết quả:
+ Kết quả được máy xác định tự động bằng phần mềm, bằng cách so sánh tín hiệu ánh sáng có được từ sản phẩm phản ứng với tín hiệu của giá trị cắt có trước bằng các chuẩn đã biết trước nồng độ
+ Kết quả dương tính khi chỉ số cắt (coi: cut off index) của mẫu thử ≥ 1
+ Kết quả âm tính khi coi của mẫu thử < 0,9
+ Khi 0,9 ≤ coi < 1: lặp lại xét nghiệm lần nữa Khi mẫu lần hai có coi ≥ 0,9 thì được xem là dương tính
Ưu điểm của kỹ thuật ECLIA
• Độ nhạy và độ đặc hiệu cao [1], [3], [4]
• Qui trình thực hiện xét nghiệm đơn giản
• Thời gian xét nghiệm nhanh
• Chèn được mẫu ưu tiên khi máy đang thực hiện xét nghiệm
• Được xem như là một trong những phương pháp hiện đại nhất xét nghiệm các chất như nội tiết tố, chất chỉ điểm ung thư
Nhược điểm của kỹ thuật ECLIA:
• Thiết bị đắt tiền, giá thành cao
• Không phát hiện các dấu ấn huyết thanh trong các trường hợp như mức
độ nhân lên của virus quá thấp, đột biến preS/S hoặc đột biến core/precore [3], [4]
Trang 6• Việc lựa chọn và chỉ định sử dụng các kỹ thuật tùy thuộc vào mức độ trang bị và yêu cầu lâm sàng, trong các trường hợp sàng lọc trong truyền máu thì phải tuân thủ theo quy định để đảm bảo an toàn truyền máu [5]
Tài liệu tham khảo:
1 Louisirirotchanakul S, Khupulsup K, Akraekthalin S, Chan KP, Saw S, Aw
TC, Cho DH, Shin MG, Lim J (2010), "Comparison of the technical and clinical performance of the Elecsys HBsAg II assay with the Architect, AxSym,
and Advia Centaur HBsAg screening assays", J Med Virol., 82(5), pp 755-762
2 Maylin S, Boyd A, Martinot-Peignoux M, Delaugerre C, Bagnard G, Lapalus
M, Zoulim F, Lavocat F, Marcellin P, Simon F, Girard PM, Lacombe K (2013), "Quantification of hepatitis B e antigen between Elecsys HBeAg and
Architect HBeAg assays among patients infected with hepatitis B virus", J Clin Virol., 56(4), pp 306-311
3 Wursthorn K, Jaroszewicz J, Zacher BJ, Darnedde M, Raupach R, Mederacke I, Cornberg M, Manns MP, Wedemeyer H (2011), "Correlation between the Elecsys HBsAg II assay and the Architect assay for the
quantification of hepatitis B surface antigen (HBsAg) in the serum", J Clin Virol, 50(4), pp 292-306
4 Xu W, Li Y, Wang M, Gu J (2011), "Comparison of two immunoassays for
determining hepatitis B virus serum markers", Clin Chem Lab Med, 50(1),
pp.153-157
5 WHO (2014), "Blood safety and availability", Fact sheet No279, Updated June 2014
