BÀI BÁO CÁO-CHƯƠNG 1-ENZYME VÀ MỘT SỐ PHẢN ỨNG ENZYME PHỔ BIẾN TRONG CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

Khái niệm enzyme Enzym là chất xúc tác cĩ bản chất protein được cơ thể tổng hợp và tham gia vào các phản ứng sinh học “Enzyme là chất xúc tác sinh học” • Enzym được tạo ra trong tế bào s

CHƯƠNG 1 ENZYME VÀ MỘT SỐ PHẢN ỨNG ENZYME

PHỔ BIẾN TRONG CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM

1.1 Đại cương về enzyme

1.1.1 Khái niệm enzyme

1.1.2 Cấu tạo phân tử enzyme

1.1.3 Cơ chế xúc tác của enzyme

1.2 Danh pháp và phân loại enzyme

1.2.1 Danh pháp

1.2.2 Phân loại enzyme, giới thiệu một số

enzyme thuộc mỗi loại

1.1.1 Khái niệm enzyme

Enzym là chất xúc tác cĩ bản chất protein

được cơ thể tổng hợp và tham gia vào các phản ứng sinh học

“Enzyme là chất xúc tác sinh học”

• Enzym được tạo ra trong tế bào sinh vật

• Enzym tham gia phản ứng trong tế bào và cả khi tách ra khỏi cơ thể

• Enzym tham gia phản ứng trong điều kiện nhiệt độ ơn hịa (nhiệt độ cơ thể).

• Enzyme cĩ thẻ thu nhận từ: Động vật, thực vật

và vi sinh vật

CẤU TẠO ENZYM

• Dựa vào thành phần hoá học của enzym người

ta chia enzym thành hai nhóm:

• Enzym một cấu tử: trong thành phần cấu tạo chỉ

có protein.

• Enzym hai cấu tử: ngoài protein còn có một

phần phi protein

– Phần protein gọi là “feron” hay “apoprotein” có vai trò

quyết định tính đặc hiệu của enzyme ;

– Phần nhóm ngoại là “Agon” hay “Coenzym” là bộ

thể là các ion kim loại hoặc là các dẫn suất của

vitamin

Phần lớn enzyme có dạng cầu hoặc dạng sợi

Coenzyme cĩ chứa kim loại

• Tham gia phản ứng vận chuyển điện tử, vận chuyển oxy

• Điển hình là heme

•Chuyển e - , H + hoặc nguyên tử H)

• A - + B ↔ A + B

-Phản ứng chuyển nhóm chức

• A-B + C ↔ A + B - C Phản ứng phân ly nhờ nước ( thuỷ giải) (chuyển nhóm chức cho phân tử nước) : A-B + H 2 O ↔ A-H + B-OH Phản ứng chuyển hóa nhờ bổ sung nhóm chức vào liên kết đôi hoặc tạo liên kết đôi nhờ lấy đi nhóm chức (phân giải không có nước tham gia)

• A-B ↔ A=B + X-Y Chuyển nhóm chức trong phân tử tạo các dạng đồng phân

• X Y Y X

• A-B ↔ A-B

•Tổng hợp liên kết C-C, C-S, C-O và C-N nhờ phản ứng

trùng ngưng liên hợp với sự thủy giải ATP.

Oxidoreductase

Transferase

Hydrolase

Lyase

Isomerase

•

Ligase

1

2

3

4

5

6

Phản ứng xúc tác

•Nhóm chính

của Enzym

STT

PHÂN LOẠI ENZYME DỰA VÀO CHỨC NĂNG

1 Oxidoreductase

• Là nhĩm xúc tác cho các phản ứng oxy hĩa khử

AH2 + B → A + BH2

• Nếu chất chuyển hay chất nhận rõ ràng thì gọi tên theo chúng Ex

Dehydrogenase (NAD, FAD, FMN,…) oxydase (nhận hydro), oxygenase (kết hợp trực tiếp với oxy)

• Nếu chất cho hydro khơng rõ ràng thì gọi là reductase

• Các enzyme thường gặp trong nhĩm này là: dehydrogenase, oxydase, peroxidase, catalase,…

2 Transferase

Là nhóm enzyme xúc tác chuyển nhóm, chuyển gốc từ chất này sang

chất khác

Phản ứng tổng quát là AX + B Æ A + BX

Cách gọi tên: theo chất nhận nhóm chuyển vận transferase

Transferases (transfer of functional groups)

Transferring C-1 groups

Methyltransferases

Hydroxymethyltransferases and formyltransferases

Carboxyltransferases and carbamoyltransferases

Transferring aldehydic or ketonic residues

Acyltransferases

Glycosyltransferases

Transferring N-containing groups

Aminotransferases

Transferring P-containing groups

With an alcohol group as acceptor

2

2.1

2.1.1

2.1.2

2.1.3

2.2

2.3

2.4

2.6

2.6.1

2.7

2.7.1

2.8

Tên và các nhóm phụ xúc tác E.C Number

Nhóm transferase được chia ra làm 7 nhóm phụ

2.1 chuyển nhóm carbon đơn như methyl, carboxyl,…

2.2 chuyển nhóm aldehyde hoặc cetone, có 2 enzyme điển hình là transketolase (chuyển 2C) và transaldolase (chuyển 3C) 2.3 chuyển gốc acyl, acyltransferase

2.4 chuyển gốc glycosyl, glycosyl transferase 2.6 chuyển nhóm đạm, aminotransferase 2.7 chuyển nhóm phosphate, phosphotransferase

2.8 chuyển nhóm lưu huỳnh, sulphurtransferase

3 Hydrolase

• Là nhóm enzyme xúc tác các phản ứng thủy phân các hợp chất hữu

cơ với sự tham gia của nước

• Phản ứng tổng quát XY + H 2 O Æ XOH + YH

• Cách gọi tên: tên của cơ chất được tách ra hydrolase

• Nhóm này được chia ra 11 nhóm phụ

• Các enzyme thường gặp là esterase, phosphatase, nuclease,

peptidase, lipase

4 Lyase

Là enzyme phân cắt chất hữu cơ không có sự tham gia của nước

Được chia làm 7 nhóm phụ

Cách gọi tên: tên cơ chất + tên của nhóm được tách ra + lyase Ex

Aspactate ammonia lyase

Các enzyme thường gặp: decarboxylase, aldolase, hydratase,…

5 Isomerase

Là nhóm enzyme xúc tác cho chuyển hóa giữa 2 dạng đồng phân D và

L, cis và trans, aldose và ketose

Các enzyme thường gặp là epimerase, mutase, isomerase

Isomerase

Ví dụ: Galactose Glucose

6 Synthetase (ligase)

Là nhóm enzyme xúc tác tổng hợp chất hữu cơ và cần năng lượng từ ATP, GTP,…

Được chia thành 4 phụ nhóm tạo các liên kết: - C – O -, - C – S-, - C –

N -, - C – C –

Cách gọi tên: Tên cơ chất + ligase (hay synthetase); ex Glutamin synthetase

DANH PHÁP HAY TÊN GỌI ENZYM

9 Đuôi tận cùng – ase.

9 Theo cơ chất phản ứng”

Phần thể hiện cơ chất + phần thể hiện loại phản

ứng + phần đuôi ase

• sucrase – phản ứng sucrose

lipase - phản ứng lipid

oxidase – catalyzes oxidation

hydrolase – catalyzes hydrolysis

9 Đối với các enzym xúc tác cho các quá trình

tiêu hoá thức ăn thường tận cùng là “in”

pepsin, trypsin

1.4 Danh pháp quốc tế và phân loại

enzym

• Tên gọi enzym thường theo cơ chất đặc hiệu với kiểu phản ứng mà chúng tham gia:

• VD: Urease (carbamite-amideohydrolase)

- Urea: tên cơ chất

- -ase: chỉ tên enzym Năm 1960, Hiệp hội hĩa sinh QT (IUB) đã thống nhất phân lọai enzym thành 6 lớp: một lớp chia làm nhiều tổ, mỗi tổ chia thành nhiều nhĩm Chính vì thế tên của enzym gồm cĩ 4 số

TRUNG TÂM HOẠT ĐỘNG

¾ Chỉ có một phần nhỏ phân tử enzym tham gia trực

tiếp liên kết với cơ chất, quyết định hoạt tính xúc

tác enzym – gọi là “ trung tâm hoạt động ”.

¾ Số trung tâm hoạt động của phân tử enzym có thể

là một hay nhiều hơn

¾ Enzym một cấu tử trung tâm hoạt động gồm một số

nhóm chức acid amin.

¾ Enzym hai cấu tử trung tâm hoạt động gồm một số

nhóm chức của acid amin và nhóm ngoại.

TRUNG TÂM HOẠT ĐỘNG ENZYME

R H R’

Chymotrypsin Has A Site for Specificity

O

-C

Ser

Active Site

Specificity

Site

Specificity

Site Catalytic Site

Juang RH (2004) BCbasics

Specificity of Ser-Protease Family

COO

-C Asp

-C Asp

Active Site

Trypsin Chymotrypsin Elastase

Non-polar pocket

Shallow and non-polar pocket

O O –C–N–C–C–N–

C C C C

NH 3 +

O O –C–N–C–C–N–

C

O O –C–N–C–C–N–

CH3

Mô hình “Chìa và khóa” của Fisher

về sự ăn khớp của enzyme và cơ chất

(Năm 1894).

TTHĐ

Cơ chất

Cơ chất

TTHĐ

Cơ chất

Cơ chất

* Hình 3 Mô hình “Khớp cảm ứng” của Koshland về sự ăn khớp của Enzyme và cơ

chất (Năm 1958).

k-1

k2

k-2

9 ĐẶC HIỆU PHẢN ỨNG

9 ĐẶC HIỆU CƠ CHẤT

ƒĐẶC HIỆU TUYỆT ĐỐI

ƒĐẶC HIỆU TƯƠNG ĐỐI

ƒĐẶC HIỆU NHÓM

ƒĐẶC HIỆU ĐỒNG PHÂN QUANG HỌC

ĐẶC HIỆU PHẢN ỨNG

Oxy hoá nhờ oxydase:

NH2

Khử carboxyl nhờ decarboxylase:

RCHCOOH RCH2NH3 + CO2

NH2

Chuyển Amin nhờ transaminase:

R1CHCOOH + R2COCOOH

R1COCOOH + R2−CH – COOH NH3

NH3

Urease

H 2 O

Urease

H 2 O

ĐẶC HIỆU Cơ chất TUYỆT ĐỐI

Mỗi một enzyme chỉ tác dụng lên một cơ chất nhất định

ĐẶC HIỆU Cơ chất TƯƠNG ĐỐI

CH2– O – CO -R 1

CH – O – CO -R 2

CH2– O – CO -R 1 HO - H

LIPA SE CH2– O – H HOOC –R 1

CH – O – H + HOOC –R 2

CH2– O – H HOOC –R 3

Enzyme cĩ tác dụng lên một kiểu liên kết hĩa học nhất định

ĐẶC HIỆU NHÓM

COOH

R’

R’

Carboxyl peptidase

H 2 O

Enzyme tác dụng lên một kiểu liên kết hĩa học nhất định với điều kiện một trong hai thành phần tham gia tạo thành liên kết phải cĩ cấu tạo xác định

HO–CH CH–COOH

ĐẶC HIỆU ĐỒNG PHÂN QUANG HỌC

Enzyme chỉ tác dụng với một trong hai dạng

đồng phân quang học của cơ chất

1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến vận tốc

phản ứng enzyme

k-1

k2

k-2

-Nồng độ enzyme - Nồng độ cơ chất

-Các chất kìm hãm - Các chất hoạt hĩa

- Nhiệt độ - pH mơi trường

Vận tốc phản ứng enzyme

protein trypsin polypeptides

Controlled variables:

•Volume and concentration of substrate (milk)

•Volume and concentration of enzyme (trypsin)

•pH (controlled by buffers)

•Temperature

Vận tốc phản ứng enzyme được xác định bằng thời gian

cơ chất bị chuyển hĩa hoặc sản phẩm được tạo thành

1.4.1 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme

k-1

k2

k-2

Trong điều kiện dư thừa cơ chất, nghĩa là [S] >>[E] thì tốc

độ phản ứng phụ thuộc vào [E]

V= K[E] cĩ dạng y=ax

Nhờ đĩ người ta đã đo [E] bằng cách đo vận tốc phản ứng

do enzyme đĩ xúc tác.

Sự phụ thuộc của vận tốc phản ứng vào [E]

1.4.2 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất

mơ hình Michaelis - Manten

k1 k2

E + S ES P + E

k-1 k1, k-1, k2: Hằng số vận tốc của các phản ứng tương ứng

Phản ứng chuyển hoá phức ES → P + E là phản ứng quyết định quá trình xúc tác chuyển hoá S → P của enzyme

Nồng độ ES càng cao thì V phản ứng càng lớn:

v = k2 [ES]

• Gọi V 1 là vận tốc của phản ứng tạo thành phức chất ES.

V 1 = k 1 [E][S]

• Gọi V -1 là vận tốc của phản ứng tạo phân ly phức chất ES

tạo thành E và S.

V -1 = k -1 [ES]

• Gọi V2 là vận tốc của phản ứng tạo thành E và P (sản

phẩm).

V 2 = k 2 [ES]

k-1

k2

Khi hệ thống đạt trạng thái cân bằng ta cĩ:

k -1 [ES]+k 2 [ES] = k 1 [E][S]

(k -1 +k 2 )[ES] = k +1 [E][S] (2) Gọi E 0 là nồng độ ban đầu:

[E 0 ]=[E]+[ES]=>[E]=[E 0 ]-[ES] (3) Thay trị số [E] từ (3) vào (2) ta cĩ:

(k -1 +k 2 )[ES] = k 1 ([E 0 ]-[ES]) [S]

k 1 [E 0 ] [S]

[ES] =

-k -1 + k 2 +k 1 [S]

Nếu đặt K m = k -1 +k 2 / k 1

(K m : gọi là hằng số Michalis Menten)

Ta cĩ: [ES] = [E 0 ][S]/ Km+[S]

Mặt khác vận tốc phản ứng tạo thành sản phẩm P là:

V = k2[ES]

Thay [ES] bằng giá trị ở trên ta thu được:

k2[E 0 ] [S]

V = - (4)

Km + [S]

V max = k 2 [E 0 ]

Thay vào phương trình (4) ta được:

[S]

V = V max - (5)

K m + [S]

• Michaelis-Menton Equation

V = Vmax [S]

Km + [S]

2

0

0 2 4 6 8

Cơ chất (μmole)

80

60

40

20

0

S +

E

↓ P

Đồ thị biểu diễn quan hệ giữa (V) vμ nồng độ cơ

chât ([S])

Km - đặc trưng cho ái lực giữa enzym vμ cơ chất:

ắKhi ([S] >> Km), V đạt cực đại (Vmax) Enzym

bị cơ chât bão hoμ.

ắKhi [S] << Km thì phương trình lμ V = Vm [S]/Km, Vận tốc phản ứng phụ thuộc vμo [S]

ắKhi Km = [S] thì V = Vmax/2 Km lμ [S] mμ ở

đó V = Vmax/2.

Bóo hũa cơ chất của một enzyme

A [S] thấp B [S] = Km C [S] cao, bóo hũa

Km = [S] (units moles/L=M) Khi vận tốc phản ứng bằng ẵ Vmax (1/2 of enzyme bound to S)

V max = là vận tốc tại đú toàn bộ enzyme kết hợp với cơ chất

Phương trỡnhLineweaver-Burk

• Năm 1934 Lineweaver và Burk nghịch đảo phương

trỡnh Michaelis-Menten:

• Phương trỡnh này là phương trỡnh tuyến tớnh,

y = mx + b Trong đú: y = 1/v o , m (slope) = K m /V max , x = 1/[S] và

b = 1/V max

Khi vẽ đồ thị đường thẳng sẽ cắt trục tung ở 1/Vmax và

cắt trục hoành ở -1/Km và độ nghiờng Km/Vmax

1.4.3 Ảnh hưởng của chất kỡm hóm

(inhibitior) Chaỏt kỡm haừm (I): Laứ chaỏt laứm giaỷm hoaùt tớnh cuỷa Enzyme do laứm giaỷm aựi lửùc cuỷa Enzyme vụựi cụ chaỏt hoaởc laứm Enzyme maỏt khaỷ naờng keỏt hụùp vụựi cụ chaỏt Coự 2 loaùi:

- Chất kỡm hóm cạnh tranh

- Chất kỡm hóm khụng cạnh tranh

- Kỡm haừm caùnh tranh: coự caỏu truực gaàn gioỏng cụ chaỏt,

noự keỏt hụùp vụựi trung taõm hoaùt ủoọng cuỷa Enzyme do ủoự

chieỏm choó cuỷa cụ chaỏt vaứ laứm giaỷm hoaùt tớnh Enzyme:

E + S → ES → E + P

E + I → EI + S → EI + S (I laứ chaỏt ửực cheỏ caùnh tranh).

* Kỡm hóm khụng cạnh tranh (Uncompetitive

inhibition)

ảnh hưởng của chất hoạt hoá

Chất hoạt hoá: Lμ những chất lμm cho enzym từ trạng thái không hoạt động thμnh trạng thái hoạt động, từ trạng thái hoạt động yếu sang trạng thái hoạt động mạnh

Bản chất hoá học:

ắ Chất hoạt hoá gián tiếp: Tham gia phản ứng nhưng không tác dụng trực tiếp với phân tử enzym VD: Axit ascorbic

ắ Chất hoạt hoá trực tiếp: Tác dụng vμo TTHĐ hoặc lμm biến đổi cấu hình không gian của phân tử enzym

• ễÛ ủoọ raỏt thaỏp thỡ hoaùt tớnh xuực taực

cuỷa enzym cuừng raỏt thaỏp.

1.4.4.Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhưng điều này chỉ xảy ra khi nhiệt độ tăng đến nhiệt

độ tối ưu (thường khoảng

40 o C)

Nhiệt độ mà tại đú tốc độ phản ửng xảy ra nhanh nhất gọi là nhiệt độ tối ưu

Khi nhiệt độ tăng thỡ tốc độ phản ứng cũng tăng lờn do cỏc phõn tử cú động năng lớn hơn.

Hoạt tính xúc tác enzyme giảm cùng với sự biến

tính của enzyme khi ở nhiệt độ cao

Enzyme bị thay đổi hình dạng và trung tâm hoạt động khơng cịn phù hợp với hình dạng của cơ chất

Tốc độ phản ứng

Nhiệt độ o C

Nhiệt độ tối ưu

Enzyme

bị biến tính

Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tốc độ phản ứng enzyme

Các phân tử tăng động năng

9Hoạt tính xúc tác đạt cực đại ở pH optimum.

9Hoạt tính xúc tác của enzym rất nhạy khi thay đổi pH.

9Hoạt tính xúc tác enzym giảm khi ở pH rất thấp hoặc rất cao.

- Enzyme là một đa cation khi chúng trong môi trường pH < pI

- Enzyme là một đa anion khi chúng trong môi trường pH > pI

9Tại giá trị pH môi trường bằng pI – (pHi đẳng điện) enzyme bị kết tủa

ẢNH HƯỞNG CỦA pH

Reaction

Rate

Optimum pH

3 5 7 9 11

pH

• Enzymes hoạt động tốt nhất ở pH opt Ngồi khoảng pH thích hợp của nĩ thì enzyme sẽ bị biến tính

Tốc độ phản ứng

pH

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme

Optimum pH

ẢNH HƯỞNG CỦA pH Xác định hoạt độ của enzyme

• 1 Kat = 1mol cơ chất/giây = 60 mol/phút =….

• Số chuyển hĩa = mol cơ chất đã chuyển hĩa / phút

• Đơn vị enzyme quốc tế UI = hoạt tính xúc tác sự chuyển

hĩa của 1 µmol cơ chất trong 1 phút

• Hoạt tính riêng = số Katal / 1 kg protein hoạt động

• Hoạt tính molar = số Katal / mol enzyme

• Độ hoạt động riêng là độ hoạt động ứng với 1 mg protein

enzyme

Các phương pháp để xác định cơ chất mất đi hoặc sản phẩm tạo thành bằng các phương pháp hĩa học, quang phổ, sắc

ký, điện di, so màu, …

1.5.1 Phản ứng thủy phân bởi enzyme

1.5.1.1 Ý nghĩa của phản ứng thủy phân

1.5.1.2 Đặc điểm của các cơ chất bị

enzyme thủy phân

1.5.1.3 Đặc điểm chung của tâm hoạt

động của enzyme thủy phân

1.5.1.4 Một số đặc điểm của phản ứng

thủy phân bởi enzyme

1.5.1.1 Ý nghĩa của phản ứng thủy phân

• Phản ứng thủy phâm làm tăng thêm phẩm

chất cho thực phẩm

- Enzyme amylase thủy phân chuyển hĩa tinh bột thành đường glucose

- Enzyme protease thủy phân chuyển hĩa protein thành nước chấm, phomat, chao, hoặc làm mền thịt

• Phản ứng thủy phân làm giảm chất lượng sản

phẩm thực phẩm

Đặc điểm của các cơ chất bị enzyme thủy phân

Các cơ chất được enzyme thủy phân thường

là protein, gluxit, lipit cơ chất này là cĩ

"liên kết bị thủy phân"

• Liên kết peptit trong protein:

• Liên kết glucozit trong các polysacarit:

Một vài enzym hydrolase điển hình và

ứng dụng của chúng trong thực phẩm

Hệ enzyme amylase

• Amylase thuộc nhóm enzyme thủy phân hydrolase

• Cơ chất tác dụng là tinh bột và glycogen

• Sản phẩm của sự thủy phân là dextrin, maltose, glucose

• Nguồn gốc: nước bọt, dịch tiêu hóa ở người và động vật,

hạt nảy mầm, nấm mốc, nấm men và vi khuẩn

• Các dạng chính: α-, β- và γ-amylase

• pH tối thích cho α-amylase ở mầm lúa nước là 5,3 (thực

hành pH = 5,0)

• Nhiệt độ tối thích 58 – 60 o C (thực hành t o = 50 o C)

•α-amylase được hoạt hóa bởi Ca 2+ và Cl - Bị ức chế bởi

Cu 2+ , Ag + và Hg 2+

Cơ chế tác dụng của enzyme amylase

a-Amylase

Amylose (Amylopectin) Æ oligosaccharides

b-Amylase Amylose (Amylopectin) Æ b-Maltose

Nảy mầm hạt, làm bánh mì, biến hình tinh bột

Protease

Protein Æ peptides + amino acids

Protease phân bố ở: thực vật, động vật, vi sinh vật

+ HN C

O

C N C COO

-R 1 H R 2

H H

+ H 2 O

+ HN C COO

-R 1 H

+ HN C COO

-R 2

H +

Protease là nhóm enzym thuỷ phân protein thành các sả phẩm

đơn giả hơn peptid mạch ngắ , pepton, acid amin…

Protease

• Protease là nhóm enzyme xúc tác sự thuỷ phân

liên kết peptide, là loại liên kết chủ yếu trong phân

tử protein và peptide

• Cơ chế thuỷ phân như sau:

Endopeptidase

HO H HO H

NH 2 – CH – CO – NHCH……NHCHCO – NHCHCO – NHCHCO – NHCHCOOH

R1 R2 R3 R4 R5 R6

Amino peptidase HO H Carboxy peptidase

Pepsin

• Pepsin hoạt động trong dịch vị của động vật có vú,

chim, bò sát, cá Ở heo, bò, dê… pepsin tập trung

chủ yếu ở phần đáy dạ dày

• Pepsin thô là hỗn hợp của pepsin, gelatinase,

cathepsin Pepsin heo thô chứa pepsin chính A và

pepsin phụ B, C, D và gastricsin.

amino acid, đầu C là alanin và đầu N là isoleucine.

Pepsin

• Pepsin dễ hút ẩm, tan trong nước cho dung dịch đục lờ, không tan trong ethanol, ester, chloroform Điểm đẳng điện của pepsin ở gần pH=1

• Pepsin thuỷ phân protein trong vùng acid khá rộng từ 1.0-4.0 pH hoạt động tối ưu của pepsin thay đổi tuỳ theo bản chất và trạng thái của cơ chất, thường pH trong khoảng từ 1.8-2.2