công nghệ tổng hợp lysine

Một số phương pháp dùng để cải tạo giống Corynebacterium glutamicum 26 1.6.3 Các plasmid nội sinh của Corynebacteria glutamicum sử dụng trong việc thiết kế vector: .... Lysine là một tr

Luận văn Công nghệ tổng hợp

Lysine

Danh mục hình iv

Danh mục bảng vi

Danh mục đồ thị viii

CHƯƠNG I : TỔNG QUAN 1

1 1.Giới thiệu về lysine 1

1.1.1 Khái niệm 1

1.1.2 Cấu tạo 1

1.1.3 Vai trò và ứng dụng 2

1.1.4 Các dạng tồn tại của lysine 4

1.2 Các phương pháp thu nhận lysine 8

1.2.1 Phương pháp thủy phân 8

1.2.2 Phương pháp tổng hợp hóa học 9

1.2.3 Phương pháp lên men 9

1.2.4 Phương pháp kết hợp 9

1.3 Cơ chế sản xuất L-lysine từ tế bào vi sinh vật 11

1.3.1 Sơ đồ chuyển hóa 11

1.3.2 Thuyết minh các giai đoạn chuyển hóa 13

1.5 Tổng hợp lysine từ Corynebacterium glutamicum 19

1.5.1 Đặc điểm hình thái của Corynebacterium glutamicum 19

1.5.2 Bộ gen của Corynebacterium glutamicum 20

1.5.3 Lịch sử sử dụng Corynebacteria glutamicum 24

1.5.4 Sản xuất lysine theo quy mô công nghiệp 24

1.6 Cải tạo giống Corynebacterium glutamicum 25

1.6.1 Khái niệm 25

1.6.2 Một số phương pháp dùng để cải tạo giống Corynebacterium glutamicum 26 1.6.3 Các plasmid nội sinh của Corynebacteria glutamicum sử dụng trong việc thiết kế vector: 28

1.6.4 Việc biểu hiện gen ở Corynebacterium glutamicum 30

1.6.5 Phương pháp cải tạo giống Corynebacterium glutamicum để thu dư lysine từ aspertate 30

1.7 Cố định tế bào vi sinh vật 37

1.7.1 Định nghĩa cố định tế bào 37

1.7.2 Phương pháp cố định tế bào 38

1.7.3 Chất mang cố định tế bào vi sinh vật: 38

1.8.1 Các vi khuẩn lên men L-lysine 39

1.8.2 Môi trường lên men 40

1.8.3 Các phương pháp lên men 44

1.8.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men 46

1.8.5 Qui trình lên men 48

1.8.6 Thu nhận và tinh sạch sản phẩm 55

1.8.7 Phân tích chất lượng và số lượng L-lysine 57

CHƯƠNG 2: CÁC HƯỚNG NGHIÊN CỨU CÓ LIÊN QUAN 58

2.1 Nghiên cứu về các đối tượng sản xuất lysine 58

2.1.1 Sử dụng dịch cỏ như một gradient trong sản xuất lysine 58

2.1.2 Đặc điểm con đường tổng hợp sinh học lysine trong Obligate Methylotroph Methylophilus methylotrophus 58

2.1.3 Các nghiên cứu về đối tượng sản xuất lysine là Corynebacterium glutamicum 59

2.2 Công nghệ lên men L-lysine 78

2.2.1 Nghiên cứu công nghệ sản xuất acid amin L-lysine 78

2.2.2 Khảo sát quá trình lên men bởi Corynebacterium glutamicum tự do và chế phẩm cố định để ứng dụng thu nhận L-lysine 85

2.2.3 Nghiên cứu quá trình lên men thu nhận L-lysine ở các chế độ lên men khác nhau 88

2.2.4 Nghiên cứu quá trình lên men liên tục L-lysine 90

2.2.5 Nghiên cứu tổng hợp lysine bằng tế bào cố định 96

CHƯƠNG 3: KẾT LUẬN 100

Tài liệu tham khảo 101

Danh mục hình

Hình 1 1 Hai dạng đồng phân quang học của lysine 2

Hình 1 2 Cấu trúc không gian của L-lysine 2

Hình 1 3 Nhu cầu của lysine, threonine và methionine trong thức ăn heo con và thành phần của những amino acid này chứa sẵn trong thưc vật 3

Hình 1 4 Sản xuất lysine lên men (tấn/năm) trong suốt 3 thập kỉ qua 4

Hình 1 5 L-lysine sulphate 4

Hình 1 6 L-lysine HCl 5

Hình 1 7 Sản phẩm thương mại L-lysine với B6 6

Hình 1 8 Sản phẩm thương 6

Hình 1 9 Sản phẩm thương 7

Hình 1 10 Sản phẩm thương mại 7

Hình 1 11 Sản phẩm thương mại Lysine-1000 90ct 8

Hình 1 12 Sản phẩm thương mại Lysine Powder 8

Hình 1 13 Sơ đồ tổng quát chuyển hóa tứ glucose ra lysine và các amino acid khác Hình 1 14 Con đường tổng hợp lysine từ glucose 13

Hình 1 15 Sự chuyển hóa tạo thành Oxaloacetate và Malate 14

Hình 1 16 Con đường tổng hợp lysine 16

Hình 1 17 Sơ đồ diều hòa dị lập thể 18

Hình 1 18 Corynebacterium glutamicum 20

Hình 1 19 Hệ gen của Corynebacterium glutamicum 23

Hình 1 20 Bản đồ cắt giới hạn của các plasmid pHM1519 và pBL1 của Corynebacterium glutamicum 29

Hình 1 21 Con đường tổng hợp phân nhánh của L-lysine trong giống Corynebacteria glutamicum hoang dại 32

Hình 1 22 Cấu trúc của Aspartate kinase 33

Hình 1 23 Trình tự DNA của vùng promoter dapA 36

Hình 1 24 Sơ đồ các phương pháp cố định tế bào 38

Hình 1 25 Mô hình sản xuất các amino acid 50

Hình 2 1 Cô lập gen ddh của C glutamicum và cấu trúc của một plasmid tổ hợp C

glutamicum - E.coli 68

Hình 2 2 Nhuộm họat tính DDH sau polyacrylamide gel Electrophoresis 69Hình 2 3 Sơ đồ vật lý, phân tích và đánh dấu trình tự của DNA 70

Danh mục bảng

Bảng 1 1 So sánh các phương pháp thu nhận lysine 9

Bảng 1 2 Đặc điểm hình thái của C glutamicum 19

Bảng 1 3 Thống kê lượng amino acid được sản xuất hiện nay 24

Bảng 1 4 Các plasmid nội sinh của Corynebacterium được sử dụng trong việc thiết kế vector 28

Bảng 1 5 Ảnh hưởng của số lượng bản sao dapA khác nhau trên tốc độ tăng trưởng, sự bài tiết L-lysine 35

Bảng 2 1 Các chủng vi khuẩn sản xuất acid L-glutamic hoang dại theo báo cáo như là chủng bố mẹ để sản xuất các amino acid và như là gen chủ cho nhân dòng 60

Bảng 2 2 Kết quả thu được từ sáu chủng đột biến ở điều kiện lên men thu 61

Bảng 2 3 Hiệu quả của gen ddh trong C glutamicum 70

Bảng 2 4 Cách sử dụng codon của gen ddh 71

Bảng 2 5 Giống C glutamicum dùng trong bài nghiên cứu này 73

Bảng 2 6 Vị trí chuỗi primer đặc biệt được sử dụng phổ biến để thay thế trong G glutamicum bằng phương pháp PCR và chuỗi DNA tiếp theo sau 73

Bảng 2 7 Sản lượng và những đặc trưng của sự sản xuất lysine của 75

Bảng 2 8 Sinh khối và các chất chuyển hóa của C glutamicum ATCC 13032 lysCfbr 77

Bảng 2 9 Nhu cầu đồng hóa của C glutamicum ATCC 13032 lysCfbr PEFTUfbp 78

Bảng 2 10 Khả năng lên men của chủng CM24 trên 4 loại môi trường 79

Bảng 2 11 Ảnh hưởng của pH lên sản lượng L-lysine qui mô 50 lít 80

Bảng 2 12 Ảnh hưởng của oxy hòa tan lên sản lượng L-lysine ở qui mô 50 lít 81

Bảng 2 13 Ảnh hưởng của oxy hòa tan lên sản lượng L-lysine ở qui mô 150 lít 82

Bảng 2 14 Ảnh hưởng của oxy hòa tan lên sản lượng L-lysine ở qui mô 1500 lít 83

Bảng 2 15 Hiệu suất thu hồi L-lysine 83

Bảng 2 16 Tỷ lệ rửa trôi tế bào sau tái sử dụng lên men chế phẩm tế bào cố định (%) 87

Bảng 2 18 Ảnh hưởng của hàm lượng đường giới hạn lên năng suất và sản lượng lysine 89Bảng 2 19 Năng suất và sản lượng L-Lysine trong lên men repeat fed batch và liên tục 89Bảng 2 20 Ảnh hưởng của nồng độ CaCl2 lên sinh khối và nồng độ L-Lysine 97Bảng 2 21 Ảnh hưởng của lượng tế bào ban đầu và thời gian lên men lên sự tổng hợp 97

L-Danh mục đồ thị

Đồ thị 2 1 So sánh sản lượng L-lysine tạo bởi C glutamicum từ sáu chủng đột biến

trong môi trường lên men theo phương pháp Fed-batch 62

Đồ thị 2 2 Hoạt động invivo của fructose 1,6-biphosphatase trong các chủng C glutamicum khác nhau 75

Đồ thị 2 3 Ảnh hưởng của thời gian lên men lên sinh khối và sản lượng L-lysine ở qui mô 50 lít 79

Đồ thị 2 4 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sản lượng L-lysine ở qui mô 50 lít 80

Đồ thị 2 5 Ảnh hưởng của thời gian lên men lên sinh khối và sản lượng L-lysine ở qui mô 150 lít 81

Đồ thị 2 6 Ảnh hưởng của thời gian lên men lên sinh khối và sản lượng 82

Đồ thị 2 7 Sản lượng L-lysine của các lần tái sử dụng lên men bằng các chế phẩm 87

Đồ thị 2 8 Thời gian nuôi cấy liên tục 91

Đồ thị 2 9 Ảnh hưởng của tỉ lệ pha loãng lên các thông số trạng thái ổn định 92

Đồ thị 2 10 Ảnh hưởng của tỉ lệ đường bổ sung lên năng suất 93

Đồ thị 2 11 Ảnh hưởng của khuấy đảo lên các thông số trạng thái ổn định 94

Đồ thị 2 12 Ảnh hưởng của khí giàu oxy lên các thông số trạng thái ổn định 95

Đồ thị 2 13 Ảnh hưởng của lượng tế bào ban đầu lên sự tổng hợp L-lysine bằng các tế bào C.glutamicum cố định 98

Lysine tồn tại dạng rắn và tinh thể trong điều kiện bình thường, bị phân hủy

ở nhiệt độ 200-300°C, có màu tím xanh khi tương tác với ninhydrin [38]

Lysine là một trong 9 amino acid không thay thế trong tổng số 20 amino acid, tìm thấy trong cấu trúc của những phân tử protein tự nhiên của tất cả sinh vật sống và được tổng hợp từ vi sinh vật Lysine thuộc họ aspartate, được tổng hợp qua con đường phân nhánh

Lysine là acid amin rất cần thiết cho hoạt động sống của người và động vật Nhu cầu lysine trên thế giới năm 2006 là 950,000-1000,000 tấn

Hình 1 1 Hai dạng đồng phân quang học của lysine [38]

Hình 1 2 Cấu trúc không gian của L-lysine [38]

Tên gọi: Lysine còn có tên gọi khác là axit α-e-diaminocaproic và diaminohexanoic acid

2,6-1.1.3 Vai trò và ứng dụng:

Lysine giữ vai trò sống còn trong tổng hợp protein, là chìa khóa trong sản xuất enzyme, hoocmon và các kháng thể giúp cơ thể tăng cường sức đề kháng, chống bệnh tật đặc biệt ngăn cản sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh mụn gộp môi hay mụn gộp sinh dục

Cơ thể người và động vật thiếu lysine cơ thể sẽ không hoạt động bình thường, đặc biệt ở động vật còn non và trẻ em sẽ xảy ra hiện tượng chậm lớn, trí tuệ phát triển kém Chính vì thế lysine thường được đưa vào phần ăn của trẻ và của gia súc

L-lysine là một amino acid cần thiết và đòi hỏi phải luôn có sẵn trong thức

ăn để đáp ứng nhu cầu dinh dưỡng của động vật, đặc biệt đối với thức ăn từ ngũ cốc, lúa mì hoặc lúa mạch thì nghèo lysine Do đó bổ sung nguồn giàu lysine vào là

cần thiết để tăng hiệu quả thức ăn Ta có thể bổ sung bột đậu nành (chứa nhiều lysine) hoặc thêm trực tiếp lysine vào thức ăn Ưu điểm của việc bổ sung trực tiếp lysine là các amino acid không thay thế khác không được thêm vào nên thành phần của chúng trong cơ thể không bị thay đổi Ví dụ thêm 0.5% lysine tăng chất lượng đạm của thức ăn hiệu quả như là bổ sung 20% đậu nành Từ đó, nitơ của amino acid không giới hạn thêm vào thừa của chế độ ăn có hàm lượng đạm cao thì sẽ bị chuyển hóa thành amoni và được động vật bài tiết ra ngoài, với việc bổ sung lysine làm giảm lượng đạm bổ sung từ đó làm giảm ô nhiễm môi trường từ phân

Hình 1 3 Nhu cầu của lysine, threonine và methionine trong thức ăn heo con và thành phần

của những amino acid này chứa sẵn trong thưc vật [34]

Trong năm 2000, việc sản xuất L-lysine khắp nơi trên thế giới được sử dụng như là một nguồn chất bổ sung vào thức ăn đạt sấp xỉ 550.000 tấn và trên thị trường vẫn cho thấy một sự tăng trưởng tiềm năng từ 7-10% mỗi năm [34] Vì chỉ

có L-lysine là có hiệu quả như là một nguồn chất bổ sung và tất cả các quy trình sản xuất hiện nay sử dụng phương pháp lên men quen thuộc

Hình 1 4 Sản xuất lysine lên men (tấn/năm) trong suốt 3 thập kỉ qua [34]

Lysine có nhiều trong trứng, thịt, cá, đậu nành…nhưng dễ bị phá hủy trong quá trình chế biến và nấu nướng thức ăn Người ta bổ sung lysine cho động vật dưới dạng thức ăn như cho lysine vào sữa Ở người lysine được bổ sung vào thuốc dạng viên và thuốc uống

1.1.4 Các dạng tồn tại của lysine:

Hình 1 5L-lysine sulphate [18]

Thành phần: Lysine Sulphate là muối sulphate với lysine

L-lysine : 51% min, trung bình là 65%

Sulphate : 15% max

Các acid amin : 10% min

Độ ẩm : 3% max

Muối amoni (như NH4) : 1% ma

Kim loại nặng : 0,003% max

Arsen : 0,0002% max

Lysine Sulphate có thể được bổ sung vào L-lysine HCl làm thức ăn cho vật nuôi, chúng có hiệu quả như L-lysine HCl

Xuất xứ : Trung Quốc

1.1.5 Các sản phẩm lysine thương mại:

Hình 1 7 Sản phẩm thương mại L-lysine với B6 [37]

Thành phần: L-lysine, vitamin B6 (Pyridoxine hydrochloride), Mg, Si, men, gluten, muối, đường và các sản phẩm sữa

Mỗi Capsule sẽ cung cấp: L-lysine 500mg, Vitamin B6 6mg

 Lysine capsures [40]

Hình 1 9 Sản phẩm thương

mại Lysine Capsures

Thành phần của sản phẩm này là L-lysine HCl [40]

Hình 1 10 Sản phẩm thương mại Lysine Vit – B12 Granules [40]

Hình 1 11 Sản phẩm thương mại Lysine-1000 90ct [40]

Hình 1 12 Sản phẩm thương mại Lysine Powder [40]

Thành phần L-Lysine

1.2 Các phương pháp thu nhận lysine:[2]

1.2.1 Phương pháp thủy phân:

Người ta dùng acid hoặc kiềm để thủy phân các nguyên liệu chứa nhiều protein

Các phương pháp này hiện nay vẫn đang được sử dụng rộng rãi.Tuy nhiên, phương pháp này có nhược điểm là:

Thiết bị phải chịu được acid hay kiềm

Trường hợp sử dụng kiềm để thủy phân sẽ tạo ra nhiều acid amin dạng D Trường hợp sử dụng acid để thủy phân sẽ ô nhiễm môi trường không khí do lượng acid dư bay hơi trong quá trình thủy phân

Giá thành thường cao

1.2.2 Phương pháp tổng hợp hóa học:

Ưu điểm của phương pháp là sản xuất ổn định, có thể tiêu chuẩn hóa điều kiện sản xuất, đảm bảo hiệu suất nhưng nhược điểm là thu được các acid amin dạng Racemic( L và D- acid amin) mà cơ thể không sử dụng dạng D nên công đọan tách ra rất phức tạp

1.2.3 Phương pháp lên men:

Ở đây ta tiến hành nuôi cấy vi sinh vật để thu nhận các acid amin Ưu điểm của phương pháp là:Phương pháp này cho phép ta thu nhận acid amin dạng L Nguyên liệu để sản xuất rẻ, dễ kiếm Tốc độ trao đổi chất, tốc độ sinh sản và phát triển mạnh của vi sinh vật cho phép ta được năng suất cao Giá thành sản phẩm thấp hơn giá thành sản phẩm từ các phương pháp khác

1.2.4 Phương pháp kết hợp:

Người ta kết hợp phương pháp hóa học và sinh học Bằng con đường hóa học, thu nhận hợp chất dạng L-Keto và các tiền chất của acid amin Sau đó sử dụng

vi sinh vật để chuyển hóa những chất này thành acid amin

Nhìn chung, phương pháp dùng vi sinh vật để chuyển các chất tiền thân của acid amin thành acid amin tương ứng là một phương pháp có nhiều triển vọng và thường được sử dụng trong sản xuất lysine Cơ sở khoa học của phương pháp là: trong quá trình trao đổi chất, vi sinh vật có khả năng tích lũy acid amin trong môi trường Ở điều kiện sống bình thường, lượng acid amin mà chúng tổng hợp được thường đủ đáp ứng nhu cầu bản thân, nhưng trong điều kiện nào đó, lượng acid amin này có thể vượt xa nhu cầu bản thân và tích lũy lại trong tế bào hay thoát ra môi trường Hiện tượng này được gọi là siêu tổng hợp acid amin của vi sinhvật

Trong khoảng 10 năm gần đây, trên thị trường có một bước tiến mạnh mẽ trong công nghệ sản xuất Lysine bằng con đường lên men

Bảng 1 1 So sánh các phương pháp thu nhận lysine [2]

pháp

Phương

pháp thủy

phân

Dùng acid hoặc kiềm

để thủy phân tinh bột chứa protein

- Sử dụng rộng rãi do phản ứng nhanh và triệt

- Dùng acid gây ô nhiễm môi trường

- Giá thành cao Phương

pháp hóa

học

Dùng hóa chất để tổng hợp nên lysine

- Phản ứng nhanh

- Dễ thực hiện

- Sản phẩm ít tạp chất

- Cho ra raxemic (hỗn hợpL-lysine

và D-lysine)_tốn kém khi tách

- Giá thành cao Phương

pháp

lên men

Nhờ khả năng tổng hợp thừa của một số

vi sinh vật, nuôi cấy thu nhận lysine

- Giá thành thấp

- Thời gian lên men dài

- Điều khiển phản ứng khó, và phức tạp do điều khiển tế bào sống

- Đòi hỏi phải có kiến thức vi sinh

- Sản phẩm có thể

bị lẫn tạp chất do tế bào tiết ra

- Sản phẩm ức chế ngược lại tế bào làm giảm hiệu suất phản ứng

Phương

pháp

- Kết hợp giữa con đường hóa học và

- Rút ngắn được thời gian lên men

- Con đường hóa học có thể gây ô

vi sinh vật để chuyển hóa những chất này thành lysine

- Tạo ra các hợp chất trung gian kích thích sự sinh amino acid của tế bào nhiều

-Năng suất cao

nhiễm môi trường

- Tốn nhiều kinh phí

- Giá thành sản phẩm cao

1.3 Cơ chế sản xuất L-lysine từ tế bào vi sinh vật:

1.3.1 Sơ đồ chuyển hóa:

Điểm quan trọng trong cơ chế tổng hợp lysine của vi khuẩn là lysine được tổng hợp cùng với methionine, threonine và đều xuất phát từ một chất chung đó là Aspactat - β - semialdehyde Quá trình tổng hợp xảy ra theo sơ đồ tổng quát sau:

Hình 1 13 Sơ đồ tổng quát chuyển hóa tứ glucose ra lysine và các amino acid khác [2]

Dựa vào sơ đồ trên, nhận xét tổng quát đầu tiên là muốn vi khuẩn tạo ra nhiều lysine thì làm sao để sự chuyển hóa phải theo nhánh [3]

1.3.2 Thuyết minh các giai đoạn chuyển hóa:

Sự chuyển hóa từ glucose ra lysine với sự tham gia của các enzyme:

Hình 1 14 Con đường tổng hợp lysine từ glucose [2]

Từ sơ đồ hình 1.14 ta thấy vai trò của Oxaloacetate như là một tiền chất cho

họ Aspartic acid Do đó Oxaloacetate thì có tầm quan trọng thiết yếu cho việc sản xuất lysine

Vào những năm trước 1969, Ozaki và Shiio đã khảo sát các quy luật của

phosphoenolpyruvate carboxylase và pyruvate kinase trong Brevibacterium

lactofermentum để tìm hiểu điểm phân nhánh của quá trình chuyển hóa glucose

Tăng cường các phosphoenolpyruvate carboxylase thì thấy có thể kích thích sự tạo

thành acid aspartic thu được nhiều acid amin trong Brevibacterium

lactofermentum Sau đó, người ta có thể thấy trong Corynebacterium glutamicum,

phosphoenolpyruvate carboxylase thì không cần thiết cho tăng trưởng và việc sản xuất lysine Điều đó cho thấy rõ ràng là đã có phản ứng phục hồi khác phải chịu trách nhiệm bổ sung các nguồn oxaloacetate Nổi bật nhất là pyruvate carboxylase, một enzyme xúc tác sự chuyển đổi pyruvate và CO2 tạo ra oxaloacetate dưới sự thủy phân của ATP

Hình 1 15 Sự chuyển hóa tạo thành Oxaloacetate và Malate [34]

Khi oxaloacetate được sử dụng để làm tiền chất tổng hợp aspartate thì để giúp cơ thể giữ được cân bằng của chu trình ATC, oxaloacetate đã được bù đắp bằng một số phản ứng phục hồi (hình 1.15) Trong đó chủ yếu có sự tham gia của các enzyme xúc tác phản ứng gắn CO2 sử dụng vitamin biotin làm coenzyme Đó

là các phản ứng gắn CO2 lên pyruvate, phosphoenolpyruvate (PEP) tạo thành

oxaloacetate và malte được xúc tác bởi pyruvate carboxylase, PEP carboxylase, PEP carboxykinase và enzyme malic Trong đó pyruvate carboxylase là enzyme điều hòa quan trọng nhất xúc tác phản ứng phục hồi pyruvate thành oxaloacetat ở gan và thận của động vật có vú và bị ức chế mạnh khi không có acetyl-CoA, còn khi xuất hiện trở lại, acetyl-CoA sẽ kích thích enzyme này xúc tác phản ứng tạo oxaloacetate Các phản ứng:

Giai đọan tổng hợp lysine từ aspartate:

Hình 1 16 Con đường tổng hợp lysine [34].

Trong cơ chế sinh tổng hợp lysine của vi khuẩn thì lysine được tổng hợp cùng lúc với methionie, threonine, isoleunine và đều thuộc họ aspartate có chất

chung là Aspartate-β- semialdehyde Điều khiển quá trình tổng hợp lysine ở tế bào

vi khuẩn ta có thể chia ra thành 2 giai đoạn:

Giai đoạn 1: Giai đoạn tạo ra oxaloacetate (tiền chất để tổng hợp aspartate):

Để tổng hợp lysine thì phải cung cấp nguồn nguyên liệu giàu glucose ( hoặc các nguyên liệu cung cấp nguồn cacbon khác nhưng hiệu suất chuyển hóa giảm) Từ glucose, tế bào vi khuẩn thực hiện chuyển hóa theo con đường EMP ( chu trình đường phân) tạo ra fructose 1,6-diphosphate và chất này sẽ tiếp tục chuyển hóa tạo thành pyruvic (pyruvate) Một phần piruvate bị oxy hóa tạo ra Acetyl-CoA- tiền chất của chu trình Krebs tạo ra năng lượng cho tế bào, một phần pyruvat chuyển hóa tạo ra oxaloacetate-tiền chất của họ aspartate Aspartate là cơ chất cung cấp toàn bộ nguồn cacbon cho lysine Do đó, để tổng hợp nhiều lysine thì nguồn aspartat phải đủ và ổn định Vì vậy, một trong những hướng để cải tạo giống sản xuất nhiều lysine là ta có thể điều khiển quá trình tổng hợp oxaloacetate theo các

cơ chế như đã trình bày phía trên

Giai đoạn 2: Quá trình sinh tổng hợp lysine từ aspartate: Từ aspartate qua các phản ứng tạo ra Aspartate-β- semialdehyde, tại đây thì con đường chuyển hóa chia làm 2 nhánh Một nhánh đi theo con đường tổng hợp ra homoserin tạo ra các amino acid khác như methionine, threonine, isoluenine, một nhánh tổng hợp ra lysine Quá trình này được thực hiện với sự tham gia của nhiều enzyme trong đó enzyme xem như là enzyme chìa khóa quyết định hiệu suất thu nhận lysine là aspatokinase, aspartate semildehydedehydrogenase và Dihydrodipicolinate synthase Do đó để sản xuất lysine ta có thể điều khiển ba enzyme này Ngoài ra ở hình 1.16, ta thấy để rút ngắn con đường chuyển hoá tạo sản phẩm lysine ta có thể điều khiển enzyme diamino pimelatedehydrogenase để từ piperideine-2,6-dicarboxylate tạo ra diaminopimelate Bên cạnh đó ta có thể điều khiển hoạt động của enzyme permease để kiểm soát lượng lysine tiết ra ngoài (Hình 1.16)

1.4 Điểu kiện tổng hợp dư L-lysine:

Sơ đồ điều hòa dị lập thể tổng hợp lysine:

Hình 1 17 Sơ đồ diều hòa dị lập thể [5]

Giải thích sơ đồ:

Phổ biến nhất trong quá trình tổng hợp lysine (amino acid) là cơ chế điều hòa ngược phản ứng đầu tiên của chuỗi phản ứng bởi sản phẩm cuối Thông thường đây là phản ứng một chiều và được xúc tác bởi enzyme điều hòa dị lập thể

Phản ứng đầu tiên nhất được xúc tác bởi 3 enzyme đồng phân (A1, A2,A3)được điều hòa độc lập nhau cho phép duy trì sự tổng hợp hài hòa của 4 amino acid

Các hiệu ứng ức chế ngược được phối hợp bởi lysine và threonine có ảnh hưởng trên enzyme đầu tiên là aspartokinase Ngoài ra, enzyme đầu tiên của nhánh threonine là homodehydrogenase bị ức chế bởi threonine và quá trình tổng hợp threonine bị ức chế bởi methionine

Muốn điều chỉnh sơ đồ trên nhằm mục đích chỉ sản xuất lysine và đạt hàm lượng cao thì cải tạo giống để enzyme aspartokinase không bị mẫn cảm với hỗn hợp sản phẩm trên và ức chế enzyme hemoserin dehydrogenase

1.5 Tổng hợp lysine từ Corynebacterium glutamicum:

1.5.1 Đặc điểm hình thái của Corynebacterium glutamicum:

Bảng 1 2 Đặc điểm hình thái của C glutamicum

Ngoài ra, C glutamicum có vách tế bào chứa arabino-galatan và acid

mycolic gồm 26-36 cacbon, có thể cô lập từ đất, thành phần GC là 54.1%, có quan

hệ rất gần với vi khuẩn có C melassecola, Brevibacterium thiogenitalis, B

lactofermentum và B flavum, hai cơ thể sinh vật sau được chứng minh là những

giống của C glutamicum

Hình 1 18 Corynebacterium glutamicum [39]

1.5.2 Bộ gen của Corynebacterium glutamicum:

1.5.2.1 Phân tích hệ thống gen Corynebacterium glutamicum-xác định tất cả

gen từ việc bổ sung đường để tiết lysine.[39]

Hơn 10 năm qua, nhờ kĩ thuật di truyền các nhà sinh học phân tử đã điểu khiển được con đường quan trọng trong việc sản xuất L-lysine Khi mô tả hệ thống gen với mục đích là điều chỉnh quá trình trao đổi chất trong những giống

sản xuất C glutamicum hướng tới hiệu quả chuyển đổi cao cơ chất glucose

thành sản phẩm cuối cùng L-lysine Các phương pháp như đột biến gen nhảy, chuyển DNA bằng kỹ thuật điện biến nạp chuyển những phần nhỏ của plasmid hoặc đột biến gen gián đoạn và thay thế gene đã được thiết lập một cách thành

công cho Corynebacterium để tối ưu hóa giống nhờ thực hiện kỹ thuật di truyền Một loạt các gene C glutamicum đã được tạo dòng nhờ sự bổ sung đầy

đủ của heterologous những thể đột biến E coli hoặc bằng cách sử dụng kỹ thuật

PCR Hơn nữa, các tác động của hầu hết các gene trong việc tổng hợp lysine acid amin trên con đường sản xuất amino acid đã được thiết lập

Tuy nhiên, mặc dù sự thành công về kĩ thuật trao đổi chất còn có một số

bí mật vẫn còn tồn tại trong các con đường chuyển hóa trung tâm của vi khuẩn nhóm coryneform cái mà không chỉ quan trọng đối với khoa học thế giới mà còn là sự quan tâm lớn đối với kĩ thuật sinh học công nghiệp Chỉ có một ít kiến

thức về các quy luật của các mạng lưới tiêu thụ đường trong C.glutamicum và

về ảnh hưởng đến hiệu suất tăng trưởng Các công cụ mạnh nhất để điền vào các thông tin vào mảng kiến thức này là phân tích về toàn bộ trình tự hệ thống gen

Ngày nay, việc xác định toàn bộ hệ thống gen của một cơ thể được thực hiện trong vòng một thời gian nhất định và ít tốn công sức Toàn bộ hệ gen của

27 vi sinh vật đã được xác định trình tự và có thể truy cập dữ liệu trong cơ sở

dữ liệu công cộng, các chú thích của 17 hệ gen là tiến bộ và hơn 70 dự án xác định trình tự gen sẽ được hoàn tất trong vòng năm đầu tiên của thiên niên kỷ mới (www.tigr.org, www.ncbi.nlm.nih.gov, www.geta.life.uiuc.edu) Với sự phát triển của những khả năng xác định trình tự đạt mức cao thì trình tự hệ gen

đã cung cấp thông tin về tất cả các gen xác định trong một cơ thể như

định trình tự, xác định trình tự hệ gen bằng súng bắn gen và việc xác định trình

tự đó dựa vào những thư viện về trật tự cosmid/bac

Phương pháp súng bắn gen Shotgun: ở đây hệ gen được cắt một cách ngẫu nhiên và trình tự DNA trong khoảng 1,5 kb thì được chèn vào những plasmid có trình tự đã được xác định Những đoạn chèn nhỏ này thường chỉ chứa một phần của một gene do đó thì thích hợp với sự trao đổi chất của tế bào

Sử dụng kỹ thuật này, một lượng DNA lớn hơn phải được xác định trình tự để cung cấp đầy đủ các sự thừa thải (gấp khoảng 10) để tập hợp tính toán với những trình tự lặp đi lặp lại Trong thời gian gần đây, những bất lợi này được đền bù bằng chi phí xác định trình tự thấp hơn và thông tin về sinh học rõ hơn Thư viện trật tự cosmid/BAC

Các phương pháp tiếp cận khác được dựa trên các thư viện cosmid hoặc BAC, được biểu diễn những phần che lấn lên nhau tối thiểu bằng kỹ thuật lai tại chỗ Bằng cách này sự thừa thải cần thiết thì được tối thiểu hoá

1.5.2.2 Xác định trình tự hệ gen của C glutamicum sản xuất amino acid: Đối với việc giải mã gen C glutamicum, Degussa AG áp dụng chiến

lược bằng cách sử dụng một bản đồ vật lý của hệ gen như một điểm bắt đầu

Được biết, nhiều gene từ C glutamicum được biểu hiện một cách hiệu quả trong E coli dẫn đến hiệu ứng độc hại làm cho nhân dòng của nhiều khu vực

của hệ gen trên vector có bản sao chép cao rất khó khăn hoặc không thể đạt được

Tương tự như những bài thí nghiệm được tiến hành để xác định trình tự

gen Bacillus subtilis Bằng cách xác định trình tự gen Mycobacterium

tuberculosis, một số yếu tố DNA lặp đi lặp lại được xác định Ngoài ra, khoảng

10% khả năng mã hóa của hệ gen được hiện diện bởi hai polymorphic khác

nhau lặp đi lặp lại những trình tự Bởi vì Mycobacterium tuberculosis thì liên quan đến Corynebacterium glutamicum nên những sự kiện tương tự đã được dự

kiến cho các dự án xác định trình tự này

Vì vậy, các bản đồ vật lý được cung cấp một khuôn khổ quan trọng trong suốt cả kế hoạch xác định trình tự gen Chiến lược đã được chia thành 6 bước:

(i) Hệ gen C glutamicum đã được cắt bằng cách sử dụng ba enzyme cắt

giới hạn hiếm thấy là SwaI, PacI và PmeI và với kĩ thuật PFGE, một bản đồ vật

lý của hệ gen đã được thành lập Khoảng 40 gen được biết từ cơ sở dữ liệu phổ biến trên bản đồ nhờ kĩ thuật lai tại chỗ

(ii) Một thư viện cosmid của khoảng 2300 cosmid đã được thành lập (iii) Thư viện cosmid đã được xem xét và những dòng có phần lấn ác nhỏ nhất được chọn lựa từ thư viện nhờ kĩ thuật lai tại chỗ bằng cách sử dụng bản đồ vật lý như là một hướng dẫn trong suốt dự án

(iv) Xác định trình tự của hệ gen 3.282 Kbp của C glutamicum ATCC

13032 bằng một cosmid-của- chiến lược trình tự cosmid Một thiết lập của 98 cosmid bao gồm khoảng 90% toàn bộ hệ gen được nhân dòng và xác định trình

tự

(v) Tập hợp dữ liệu, xác định các khoảng trống còn lại

(vi) Hoàn thành các khoảng trống còn lại trong trình tự 3,282 Kbp được tiến hành bằng cách thiết lập một thư viện BAC và sau đó xác định trình tự khoảng trống còn lại trên các mẫu BAC

Hình 1 19 Hệ gen của Corynebacterium glutamicum [39]

1.5.3 Lịch sử sử dụng Corynebacteria glutamicum:

Vi khuẩn Corynebacterium glutamicum là đối tượng vi sinh vật có quy trình

trao đổi chất của tế bào được nghiên cứu hơn 40 năm qua Sau khi khám phá ra chúng như là một vi khuẩn bài tiết L-glutamate thì những giống đột biến hữu ích cho sản xuất lên men L-glutamate trên một quy mô lớn đã được gây giống Đột biến gen và lên men quy mô nhỏ đã được thực hiện để lựa chọn trong số hàng trăm giống tìm ra giống có khả năng sản xuất cao nhất Giống sau này sau đó phải chịu đột biến gen lần nữa để thích nghi quy mô lên men nhỏ để lựa chọn lại giống tốt nhất Các bước này được lặp đi lặp lại nhiều lần để tạo một dòng có thể sản xuất L-glutamate tăng lên rỏ rệt Rõ ràng, những giống có khả năng sản xuất cao được thực hiện bằng những nguyên tắc này Sự cô đặc thu được lượng L-lysine và L-glutamate vượt quá 150g/l với sản lượng hơn 0.5g/g chất khô Về cơ bản cùng một nguyên tắc áp dụng để có được

1.5.4 Sản xuất lysine theo quy mô công nghiệp:

Sản xuất trên quy mô lớn với C glutamicum đã bắt đầu vào trước những

năm 1958 trong kế hoạch của Kyowa Hakko ở Nhật Những công ty khác tham gia

vào việc kinh doanh và sau đó suốt 4 thập kỉ sản xuất với C glutamicum, quy trình

sản xuất lysine bằng kỹ thuật sinh học đã được cải thiện liên tục bằng các kỹ thuật cải tiến giống Những tối ưu này làm cho lượng lớn lysine đủ để đáp ứng nhu cầu ngày nay

Bảng 1 3 Thống kê lượng amino acid được sản xuất hiện nay

Quy mô sản xuất

(tấn/năm)

xuất ưa chuộng

Mục đích sử dụng

550000 D,L-Methionine Tổng hợp hóa học Bổ sung thức ăn

40000 40000 L-Threonine Lên men Bổ sung thức ăn

16000 Glycine Tổng hợp hóa học Bổ sung thực phẩm,

chất tạo vị ngọt

14000 L-Aspartate Enzyme xúc tác Tạo vị ngọt, polymer

13000 L-Phenylalanine Lên men Tạo vị ngọt

cystine

Bổ sung thực phẩm, dược phẩm

3500 L-Cystine Lên men, tách chiết Cysteine,dược phẩm

2000 t-Arginine Lên men, tách chiết Dược phẩm, chất tạo

vị ngọt

15000 L-Alanine Lên men, tách chiết Chất tạo vị ngọt

1200 L-Leucine Lên men, tách chiết Dược phẩm

1000 L-Valine Lên men, tách chiết Dược phẩm

Dựa vào bảng 1.3 ta thấy lượng L-lysine được sản xuất hàng năm cũng rất lớn chỉ đứng sau L-Glutamate Chi phí sẽ quyết định vị trí của những nhà máy sản xuất Những yếu tố chính bao trùm là giá của nguồn carbon và thi trường địa phương Những nhà máy sản xuất L-glutamate với lượng lớn có mặt trên khắp thế giới, nhiều nhất ở Viễn Đông, như Thái Lan và Indonesia nhưng trường hợp của L-lysine thì lại khác Chỉ có khoảng 1/3 thị trường trên thế giới ở vùng Bắc Mỹ có điều kiện thuận lợi, chẳng hạn như nguyên vật liệu cung cấp cho quá trình lên men Trong hầu hết các trường hợp, những công ty sản xuất L-lysine đều có mối liên hệ với công nghiệp xay ngô, có sự nối kết các dự án cũng như có mối liên hệ với các nhà cung cấp đường rẻ Điều này minh họa cho một chi tiết, đó là việc sản xuất amino acid thương mại đang được phát triển mạnh mẽ, thay đổi nhiều lĩnh vực và tác động toàn cầu

1.6 Cải tạo giống Corynebacterium glutamicum:

1.6.1 Khái niệm:

Cải tạo giống là quá trình làm đổi mới một phần bộ máy di truyền của tế bào nhằm đáp ứng nhu cầu, mục đích sử dụng của con người

Có nhiều phương pháp cải tạo giống cho động vật, thực vật và vi sinh

vât.Mỗi phương pháp có nhiều ưu điểm và nhược điểm đặc trưng, tùy theo mỗi hòan cảnh và mỗi đối tượng mà ta chọn lựa phương pháp thích hợp

1.6.2 Một số phương pháp dùng để cải tạo giống Corynebacterium glutamicum:

1.6.2.1 Huấn luyện thích nghi: [2]

Nguyên tắc của phương pháp:

Khả năng thích nghi với điển kiện sống của vi sinh vật rất cao do cơ thể chúng là cơ thể đơn bào Mọi tác động của môi trường đều có thể là những tác động trực tiếp Mặt khác, cơ thể vi sinh vật thực hiện những quá trình trao đổi chất, sinh sản, phát triển rất nhanh trong một chu kỳ sống rất ngắn Do đó giai đoạn thích nghi phải được xảy ra nhanh và mạnh trong một giai đọan phải rất ngắn so với chu kỳ phát triển và chu kỳ sống của chúng

Khi đã tạo được khả năng thích nghi của giống vi sinh vật đối với một tác động môi trường nào đó phải luôn luôn duy trì tác động đó ở mức độ tạo ra tính thích nghi

Thực chất của tính thích nghi là thường biến nên không di truyền, do đó đặc điểm này không bền, dễ bị mất đi khi ngưng tác động hoặc làm thay đổi mức độ tác động

1.6.2.2 Kỹ thuật di truyền:[1], [4], [9]

a Kỹ thuật di truyền cổ điển:

Phương pháp lai: là tiến hành cho lai giữa hai tế bào có đặc điểm di truyền tốt khác nhau để tạo ra dòng chứa đặc điểm di truyền tốt của cả 2 tế bào ban đầu Phương pháp này không phức tạp nhưng có sự giới hạn về sự pha trộn đặc tính di truyền chỉ trong một vài loài

Phương pháp gây đột biến nhân tạo nhờ tác nhân hóa học (acid nitric – HNO2), Bromode xiuridine, 5-bromuraxil, EMS, MMS, EI, NG…) hoặc tác nhân vật lý (tia tử ngoại): là phương pháp gây đột biến điểm, đột biến này nằm trong cấu trúc của các nucleotide ( trong cấu trúc của các base chứa nitơ)

Ưu điểm: Dễ thực hiện, tạo ra được giống vi sinh vật có rất nhiều đặc

tính quý

Nhược điểm: Tần số xảy ra đột biến thấp, không định hướng, không

ổn định

Do những nhược điểm trên mà kĩ thuât di truyền cổ điển ít được sử

dụng để cải tạo Corynebacterium glutamicum mà thường áp dụng các kĩ

thụật hiện đại

b Kỹ thuật di truyền hiện đại:

Kỹ thuật sử dụng polyethylenglycol (PEG): Các protoplast sẽ được biến nạp trong điều kiện có PEG và ion Ca2+ Tần số biến nạp khỏang 105-

106 thể biến nạp/mg DNA Để đạt được hiệu suất biến nạp cao, trước khi biến nạp DNA cần phải được methyl hóa để tránh việc giới hạn của vật chủ PEG không chỉ hữu dụng trong biến nạp mà còn hữu dụng trong quá trình

dung hợp protolast của các chủng Corynebacterium sinh tổng hợp lysine

Kỹ thuật sử dụng calcium phosphate (calcium phosphate technique)

đã được phát triển đầu tiên là để xác định sự lây nhiễm của DNA virus (Graham,1973) và hiện nay được sử dụng rộng rãi để thử nghiệm hoạt động biến nạp của DNA virus cũng như DNA tách chiết từ các tế bào eukaryote (Wigler, 1978; Graham, 1979; Pellicer, 1980) Kỹ thuật này yêu cầu ủ các tế bào nhận với các chất đồng kết tủa DNA và calcium phosphate Kết tủa này bám vào tế bào và sau đó sẽ hấp thụ vào tế bào qua quá trình ẩm bào (Loyter, 1982) Trong tế bào, các phân tử DNA ngoại lai nằm trong không bào được tạo thành do tế bào và lysosome thứ hai nhưng rất ít DNA đi đến nhân và hợp nhất vào genome chủ Cho đến nay, đây là kỹ thuật vô cùng có giá trị đối với các nghiên cứu chuyển gen vào các tế bào soma nuôi cấy và đang được sử dụng nhiều để chuyển các dòng genome vào tế bào đích Tỷ lệ các tế bào được biến nạp ổn định của kỹ thuật này là tương đương với phương pháp vi tiêm nhưng khác với vi tiêm là nhiều tế bào được biến nạp cùng một lần Hơn nữa, biến nạp DNA tách chiết từ các tế bào ung thư vào các tế bào nhận không ung thư đã cho thấy đây là phương pháp duy nhất để nghiên cứu sự kiểm soát di truyền của ung thư Phương pháp này được sử dụng phổ biến bởi vì đơn giản, protocol dễ thực hiện, ít tốn kém, số tế bào chết sau biến nạp không đáng kể, sự biểu hiện gen có thể là nhất thời hoặc

ổn định và quan trọng trong việc thiết kế vector virus tái tổ hợp Tuy nhiên hiệu quả biến nạp và mức độ biểu hiện của gen chuyển thấp dựa vào sự hình

thành một phức hợp DNA-calcium dễ được tế bào thu nhận qua cơ chế thực bào.[1]

Kỹ thuật điện biến nạp: dung dòng điện có điện áp cao có khả năng tạo lỗ thủng trên màng tế bào khiến DNA từ môi trường dễ xâm nhập vào bên trong Lực điện trường là 12,5kV/cm Phương pháp này ít tốn thời gian,

dễ thực hiện và rất phổ biến hiệu quả 4.107 thể biến nạp

Phương pháp tiếp hợp hay dùng plasmid chuyển gen từ vi khuẩn

gram âm (E coli) vào vi khuẩn gram dương (Corynebacteria) Quá trình

tiếp hợp này được thực hiện bằng cách sử dụng màng lọc nitrocellulose, màng lọc này dùng làm giá thể cho vi khuẩn Ta có thể xử lý nhiệt cho

chủng Corynebacteria glutamicum ở 48-49°C trong 9 phút để tăng tính hữu

thụ

1.6.3 Các plasmid nội sinh của Corynebacteria glutamicum sử dụng trong việc thiết kế vector:

Bảng 1 4 Các plasmid nội sinh của Corynebacterium được sử dụng trong

việc thiết kế vector [4]

Tên plasmid Nguồn gốc Kích

thước (kb)

Marker Tài liệu tham khảo

pTP10 C xerosis 50 Tc,Cm,Em,Km Kono ET AL.,1983 pHM1519 C glutamicum 3.055 cryptic MIWA etal.,1984 pCC1 C callunae

4.2 cryptic SANDOVAL et al.,

1984 pCG2 C glutamicum 6.8 cryptic OZAKI et al., 1984 pCG4 C glutamicum

AL.,1984 pXZ10145 C glutamicum 5.3 Cm ZHEN et al., 1987

pAG1 C melassecola 20.4 Tc Takeda ET AL.,1990

CHION et al.,1991

Dung hợp các loại phasmid trên với các vector, các vector thường được sử dụng là vector tạo dòng của E.coli, tạo ra hệ thống vector trên khuôn là plasmid

cho Corynebacterium

Các loại plasmid nhỏ tiềm ẩn số lượng bản sao lớn Một vài plasmid lớn hơn

có mang gen kháng kháng sinh đã được phân lập

Trong các plasmid ở bảng trên, loại pBL1 và pHM1519 là được sử dụng nhiều nhất Cả hai đơn vị sao chép được sử dụng để thiết kế các vector có đồng

thời hai chức năng mà có thể sao chép ở E.coli và Corynebacteria, cũng như là các

vector chỉ có một chức năng duy nhất Các vector plasmid dựa trên cơ sở của các

đơn vị sao chép này có khỏang từ 5-30 bản sao/1 tế bào vi khuẩn Corynebacterium

Hình 1 20 Bản đồ cắt giới hạn của các plasmid pHM1519 và pBL1 của Corynebacterium

glutamicum [4]

Nhìn vào bản đố cắt giới hạn trên, ta thấy các vị trí cắt của enzyme cắt giới hạn trong khung đọc – mở lớn được suy ra từ các trình tự nucleotide Đơn vị sao chép nhỏ (biều thị bằng đường gạch xiên) và vùng ori V (màu đen) được xác định trong pHM1519

Chú ý các plasmid pHM1519, pBL1, pCG1, pGA1 có thể tồn tại trong cùng một tế bào

1.6.4 Việc biểu hiện gen ở Corynebacterium glutamicum:

Việc biểu hiện của các gen tương đồng và dị tương đồng ở Corynebacterium

đòi hỏi những hiểu biết chi tiết về cấu trúc và chức năng của các tín hiệu phiên mã

và dịch mã Các tín hiệu khởi đầu dịch mã từ các vi khuẩn khác bao gồm E.coli hòan tòan có chức năng trong Corynebacterium Khía cạnh tín hiệu phiên mã thì

phức tạp hơn Bằng cách sử dụng các vector dò tìm vùng promoter đã kiểm tra các

promoter hiệu quả cao của E.coli như Ptrp, PlacUV5, Ptac, lPRPL ở

Corynebacterium Hiệu quả của những promoter này cũng như là tính chất điều

hòa của chúng được xác định bởi các gen ức chế tương ứng Trp, LacI, CI Điều này

giới hạn việc thiết kế các vector biểu hiện cao bằng cách sử dụng hệ thống

lacI/Plac Để kết thúc phiên mã sử dụng một nhân tố kết thúc phiên mã nội sinh

của B lactofermentum

1.6.5 Phương pháp cải tạo giống Corynebacterium glutamicum để thu dư lysine

từ aspertate:

1.6.5.1 Các hướng truyền thống:

Sau khi khám phá những khả năng của Corynebacterium glutamicum để

bài tiết acid amin, sản xuất quy mô lớn lysine đã được bắt đầu bằng cách sử dụng thể đột biến khuyết dưỡng amin acid Những thể đột biến sớm này đã hiển thị một khả năng sản xuất lysine vượt trội Trong vòng 70 giờ, một trong những giống thế hệ đầu tiên là giống ATCC 13287 khuyết dưỡng homoserine được công khai vào năm 1961 là 2979439 US, thu sản lượng là 44g/l với sự chuyển đổi sản lượng xấp xỉ 26% g lysine HCl/(g đường) Ngoài ra sự phát triển giống

đã được thực hiện bằng cách giới thiệu thêm những khuyết dưỡng amino acid

bổ sung vào, khuyết dưỡng vitamin và chống lại sự ức chế trao đổi chất Những giống này sản xuất lysine tăng đến một sản lượng chuyển đổi hơn 50% dựa trên lượng đường

Vào trước những năm 1970, đã có những nỗ lực để vượt qua những bất lợi của các giống khuyết dưỡng vì dịch lên men cần phải được bổ sung các nhân

tố tăng trưởng xác định và dáng kể Việc tìm kiếm những giống có những đòi hỏi thấp cho nhu cầu về phức chất dẫn đến như vậy gọi là leaky strains: con đường tổng hợp sinh học có nhiều thất thoát vẫn còn chức năng nhưng chỉ có thể cung cấp rất hạn chế số lượng theo nhu cầu trao đổi chất Vì thế, việc trao đổi chất này sẽ trở nên hạn chế tốc độ tăng trưởng mà không cần hiển thị các

mô hình trao đổi chất điển hình nghèo nàng Hậu quả là dịch nội bào sẽ rất ít do

đó tránh được sự ức chế ngược và sự ức chế của một enzyme quan trọng trong con đường sản xuất mong muốn Ví dụ là những giống làm giảm hoạt động tổng hợp citrate hoặc giảm homoserine dehydrogenase Sugimoto và cộng sự cho thấy sự đột biến leaky có thể được gây ra bởi một cơ sở dẫn đến những thay đổi có liên quan thay thế acid amin trong hoạt động xúc tác của các enzyme

1.6.5.2 Kỹ thuật gen đối với các enzyme chìa khóa là Aspartase kinase và Dihydrodipicolinate Synthase:

Con đường tổng hợp sinh hợp lysine từ oxaloacetate và pyruvate trong

C glutamicum xảy ra thông qua một con đường phân chia Nhưng một con

đường phân chia thì không đặc trưng cho một con đường tổng hợp sinh học Điều đó đã được chứng tỏ rằng, thêm vào sự hình thành L - lysine thì cơ chế con đường tổng hợp này bảo đảm sự cung cấp đáng tin cậy của tế bào với chất trung gian D, L-diaminopimelate- một đơn vị liên kết quan trọng trong lớp peptidoglycan Một trong những bước kiểm soát dòng chuyển hóa thông qua con đường tổng hợp là ở cấp độ của enzyeme aspartate kinase,nó được xem như là enzyme điển hình ở đầu con đường tổng hợp, enzyme kinase được kiểm soát trong hoạt động xúc tác Hoạt động enzyme bị ức chế khi L-Lysine cộng L-threonine cùng có mặt vượt quá giới hạn cho phép của tế bào Do đó, tầm quan trọng của điều này trong việc kiểm soát dòng chuyển hóa tại một trong những dòng của đối tượng sản xuất là việc kiểm soát phản ứng ngược thì được lấy ra nhờ những thể đột biến trong tiểu đơn vị β của enzyme kinase Ngoài ra, một giống với hai bản sao của gen kinase đã được thực hiện và cho kết quả hiển thị tăng việc tích lũy L-lysine

Hình 1 21 Con đường tổng hợp phân nhánh của L-lysine trong giống Corynebacteria

glutamicum hoang dại [10]

Enzyme aspartate kinase xúc tác phản ứng đầu tiên trong quá trình tổng hợp L-lysine Enzyme này được chứng tỏ như là một enzyme chìa khóa trong tổng hợp sinh học L-lysine

Đối với Escherichia coli, ba enzyme đồng phân với các hoạt động và biểu hiện được kiểm soát bởi các cơ chế khác nhau Ngược lại với E coli, chỉ

có một aspartate kinase đã được phát hiện trong C glutamicum Trong thời gian đầu của việc sản xuất lysine từ C glutamicum, người ta thấy rằng enzyme aspartate kinase trong C glutamicum bị ức chế bởi hai sản phẩm cuối của quá

trình tổng hợp, đó là L-lysine và L-threonine và việc kiểm soát chính cho dòng carbon được điều hòa bằng phản ứng ức chế ngược