NH HNG CA NNG d DNG SUCROSE DN

HCM KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC VÀ THỰC PHẨM ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ ĐƯỜNG SUCROSE ĐẾN ĐỘNG HỌC SINH TRƯỞNG CỦA SACCHAROMYCES CEREVISIAE TRONG QUÁ TRÌNH NUÔI CẤY MẺ Tp... ẢNH HƯỞNG CỦA HÀM L

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT TP HCM

KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC VÀ THỰC PHẨM

ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ ĐƯỜNG SUCROSE ĐẾN ĐỘNG HỌC

SINH TRƯỞNG CỦA SACCHAROMYCES CEREVISIAE

TRONG QUÁ TRÌNH NUÔI CẤY MẺ

Tp Hồ Chí Minh, tháng 10 năm 2019

1

THE EFFECT OF SUCROSE CONCENTRATION ON GROWTH KINETICS

BATCH-CULTURE PROCESS

ABSTRACT

Investigation of the effect of sucrose concentration on the growth kinetics of yeast

Saccharomyces cerevisiae was conducted at the microbiology laboratory - Ho Chi Minh City

University of Technology and Education, evaluated based on kinematic parameters Study of yeast growth: growth rate, total sugar content, ratio of live and dead yeast cells over time

In this study, yeast strains were carried out by batch culture technique in tomato extract supplemented with peptone 1 g/l medium with sucrose 20 g/l, 100 g/l, 200 g/l, 300 g/l Cultured on a shaker, the optimal growth rate is in medium with sucrose concentration of 200 g/l, temperature of 30 oC, pH 5.0, shaking mode of 240 rpm, inoculation ratio of 5%, Carbon source is sucrose, nitrogen source is peptone, culture time is 11 hours and the number of cells

in log phase is 57,71,106 cells, growth rate is 0,2722 h-1 Researching the optimal environment for the growth and development of yeast helps to obtain high biomass yield with high economic efficiency

Keywords: Saccharomyces cerevisiae, yeast, sucrose concentration, batch culture

ẢNH HƯỞNG CỦA HÀM LƯỢNG SUCROSE LÊN ĐỘNG HỌC SINH TRƯỞNG

CỦA NẤM MEN SACCHAROMYCES CEREVISIAE TRONG QUÁ TRÌNH NUÔI

CẤY MẺ

MỞ ĐẦU

Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng sucrose lên động học sinh trưởng của nấm men

Saccharomyces cerevisiae được thực hiện ở phòng thí nghiệm vi sinh – Trường Đại học Sư

Phạm Kĩ Thuật Thành phố Hồ Chí Minh, được đánh giá dựa vào các thông số động học của sinh trưởng của nấm men: tốc độ sinh trưởng, hàm lượng đường tổng, tỉ lệ tế bào nấm men sống chết theo thời gian Trong nghiên cứu này, chủng nấm men được thực hiện theo kĩ thuật nuôi cấy mẻ trong môi trường dịch chiết cà chua bổ sung peptone 1 g/l với các hàm lượng sucrose 20 g/l, 100 g/l , 200 g/l, 300 g/l Thí nghiệm nuôi cấy trên bình lắc, có tốc độ sinh trưởng cao nhất khi được nuôi cấy trong môi trường có hàm lượng sucrose 200 g/l, nhiệt

độ 30 oC, pH 5.0, chế độ lắc 240 rpm, tỉ lệ giống cấy 5%, nguồn carbon là sucrose, nguồn nitơ là peptone, thời gian nuôi cấy 11 giờ và số lượng tế bào trong pha log là 57,71.106 tế

2

bào, tốc độ sinh trưởng là 0,2722 h-1 Việc nghiên cứu môi trường tối ưu cho nấm men sinh trưởng, phát triển giúp thu lượng sinh khối lớn với hiệu suất cao mang lại hiệu quả kinh tế

Từ khóa: Saccharomyces cerevisiae, nấm men, hàm lượng sucrose, nuôi cấy mẻ

1 Giới thiệu

Saccharomyces cerevisiae (men bia hoặc men bánh mì) đã được sử dụng trong các

ứng dụng lên men thực phẩm cổ điển (bia, bánh mì, chiết xuất men / vitamin, rượu vang, saké, rượu chưng cất) Ngoài ra nó được sử dụng trong sản xuất nhiên liệu cồn, glycerol, invertase (L Camacho-Ruiz, 2003) Bên cạnh các ứng dụng trong ngành công nghiệp đồ ăn

và thức uống, sinh khối nấm men Saccharomyces cerevisiae được sử dụng rộng rãi như

nguồn cung cấp protein cho người và động vật trong thức ăn chăn nuôi hoặc các sản phẩm bổ

sung cho con người (Solomon SG, 2017) Các tế bào S cerevisiae chứa enzyme invertase

ngoại bào (-d-fructosidase, EC 3.2.1.26) thủy phân sucrose thành glucose và fructose, được vận chuyển vào trong tế bào bởi các chất vận chuyển hexose và chuyển hóa qua glycolysis (A S Batista et al, 2004) Sucrose (α-D-glucopyranosyl- (1↔2) -β-D-fructofuranoside) là carbohydrate phân tử thấp tự do có nhiều nhất trên thế giới (Marques, 2016) Sucrose có lẽ là

loại đường quan trọng nhất sử dụng trong công nghiệp của nấm men Saccharomyces

cerevisiae Việc nghiên cứu môi trường tối ưu cho nấm sinh trưởng, phát triển giúp thu lượng

sinh khối lớn với hiệu suất cao đang là vấn đề được quan tâm

Trong thí nghiệm do Barotti tiến hành trong môi trường YP phong phú (10 g/L chiết xuất men và peptone 20 g/L), ở nồng độ ~ 0,73 M sucrose (250 g/L), tất cả các hoạt động trao

đổi chất có mặt ở cả hai chủng Saccharomyces cerevisiae hoạt động với công suất cao cho

phép lên men sucrose hiệu quả, các tế bào nấm men đã tiêu thụ sucrose nhiều hơn, sự gia tăng sinh khối trong quá trình lên men mẻ này là giống nhau cho cả hai chủng Thí nghiệm này cũng cho thấy sản xuất sinh khối cao hơn có thể đạt được với nuôi cấy mẻ trong 20 g/L sucrose (Badotti et al., 2008) Ngoài ra, trong thí nghiệm do Atiyeh thực hiện trong môi trường chứa glucose (10,0 g), chiết xuất nấm men (30,0 g), peptone (3,5 g), KH2PO4 (2,0 g), MgSO4.7H2O (1.0 g),(NH4) 2SO4 (1,0 g) và nước khử ion (tối đa 1 l) được nuôi cấy mẻ, tốc

độ thủy phân sucrose ban đầu cụ thể tăng từ 5,72 đến 19,87 g sucrose/g sinh khối.h với sự gia tăng nồng độ sucrose tương ứng từ 35 đến 168 g/l Tuy nhiên, khi nồng độ sucrose tăng trên

168 g/l, tỷ lệ thủy phân sucrose cụ thể giảm 20% (Atiyeh, H., & Duvnjak, Z 2001)

Kết quả có được từ hai nghiên cứu trên là cơ sở khoa học tin cậy để đánh giá cho nghiên cứu được thực hiện nhằm khảo sát về động học sinh trưởng của nấm men dưới sự ảnh hưởng của sucrose ở các nồng độ khác nhau trong quá trình nuôi cấy mẻ

2 Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu

3

Vi sinh vật:

Nghiên cứu này được thực hiện trên chủng nấm men thương mại Sachharomyces

cerevisiae (instant dry yeast, sản xuất bởi công ty AB Mauri Vietnam Limited)

Môi trường hoạt hóa và nhân giống:

Nấm men (0.1 g) được hoạt hóa và nhân giống trong 100 ml môi trường M1 vô trùng trên máy lắc ở 30oC trong 24 giờ với tốc độ 240 rpm Môi trường M1 chuẩn bị bao gồm các thành phần sau đây: 100g cà chua, sucrose 200 g/l, pepton 1 g/l, thêm 1000 ml nước cất, đun sôi 30 phút, sau đó thu nhận phần dịch trong, định lượng đủ 1000ml Môi trường được điều chỉnh độ pH về 5 bằng dung dịch NaOH 0.1N, được phân phối vào bình nuôi cấy và được tiệt trùng (121oC, 15 phút)

Điều kiện sinh trưởng:

Sau quá trình nhân giống, nấm men (10 ml) được bổ sung vào 190 ml môi trường M1

đã được thay đổi điều kiện sucrose với các mức 20 g/l, 100 g/l, 200 g/l, 300 g/l đã được tiệt trùng (121oC, 15 phút) để khảo sát ảnh hưởng của nồng độ sucrose đến động học sinh trưởng của nấm men trong quá trình quá trình nuôi cấy mẻ trong suốt 12 giờ Quá trình nuôi cấy mẻ được tiến hành ở nhiệt độ phòng (30oC) trên máy lắc 240 rpm

Phương pháp

A Khảo sát các thông số động học sinh trưởng của nấm men trong môi trường nuôi cấy

mẻ dưới ảnh hưởng của các nồng độ đường sucrose khác nhau

Nghiên cứu đã sử dụng buồng đếm hồng cầu (hemocytometer) để định lượng nấm men với độ phóng đại x100 đến x400 Huyền phù nấm men được nhuộm với dung dịch methylen blue để phân biệt tế bào nấm men sống và chết Khi đếm số lượng ta đưa dịch pha loãng vào phòng đếm, đậy lá kính lên trên, sau đó tiến hành đếm số lượng dưới kính hiển vi

Trong suốt quá trình nuôi cấy, bắt đầu từ giờ thứ 0, cứ mỗi 1 giờ sẽ kiểm tra và ghi nhận các thông số: (a) mật độ tế bào/ml, (b) tỉ lệ tế bào sống, (c) tỉ lệ tế bào nảy chồi Các thông số động học sẽ được tính toán và đưa ra kết luận

Phương pháp đếm trực tiếp trên buồng đếm hồng cầu đưa ra số liệu nhanh chóng, giúp quan sát được hình thái tế bào Tuy nhiên, phương pháp này không xác định được với các mẫu có số lượng vi khuẩn quá nhỏ, độ chính xác không cao vì không phân biệt được giữa tế bào sống và tế bào chết

Phương pháp phân tích phương sai một yếu tố one - way ANOVA trên phần mềm SPSS được sử dụng để phân tích dữ liệu thu thập được trong quá trình làm thí nghiệm

B Phương pháp định lượng đường tổng số (hoặc % sucrose)

4

Song song với quá trình khảo sát động học sinh trưởng của nấm men, lấy một lượng nhỏ huyền phù dung dịch trong bình nuôi cấy, đun cách thủy trong vòng 10 phút và đi ly tâm với tốc độ 3000 vòng/ phút trong vòng 10 phút Lượng đường tổng số sẽ được đo bằng Brix

kế và các thông số sẽ được ghi lại để mô tả, so sánh, giải thích và biện luận

3 Kết quả

Kết quả

A Động học sinh trưởng của Saccharomyces cerevisiae ở các nồng độ đường khác nhau

Khi thực hiện đo mẫu giống nuôi cấy ở nồng độ đường 200g/l sau 24 giờ tại tất cả các lần làm thí nghiệm ta thu được tổng số lượng tế bào, phần trăm tế bào sống, phần trăm tế bào chết, phần trăm tế bào nảy chồi và % độ brix Dùng kết quả này đem đi kiểm định thống kê với từng yếu tố, kết quả là không có sự khác biệt nào có ý nghĩa thống kê trong bốn mẫu được đo Điều này giúp khẳng định lại điều kiện nhân giống và kết quả giống dùng để cấy vào môi trường mới thực hiện thí nghiệm là không có sự sai khác Tương tự, khi giống được cho vào môi trường thí nghiệm nuôi cấy đã chuẩn bị sẵn tại bốn nồng độ đường khác nhau, tại giờ thứ 0 ta thực hiện ghi nhận kết quả tổng số tế bào sống, phần trăm tế bào chết và phần trăm tế bào nảy chồi, lấy kết quả đem kiểm nghiệm thống kê, kết quả không có sự khác biệt

có ý nghĩa tại thời điểm này Hai lần đo này khẳng định rõ ràng rằng thiết kế thí nghiệm là đúng như định hướng

Bảng 1 Kết quả so sánh các thông số động học của giống tại giờ thứ 24 (với độ tin cậy

95%)

Tế bào Sống (%) 86.19±0.21a 86.29±0.26a 86.40±0.19a 86.35±0.19a

Tế bào Chết (%) 13.81±0.21b 13.71±0.26b 13.60±0.30b 13.49±0.19b

Tế bào nảy chồi (%) 4.61±0.58c 3.9±0.29c 4.00±0.28c 4.28±0.47c

Độ brix (%) 15.07±0.96d 14.95±0.58d 15.05±0.13d 15.08±0.13d

5

Đường cong sinh trưởng của nấm men tại các nồng độ đường khác nhau được thể hiện trong Hình 1 Ở điều kiện nồng độ sucrose 20 g/l , 200 g/l, 300g/l, sự sinh trưởng của nấm men không trải qua pha lag Với điều kiện đường 20 g/l, tốc độ sinh trưởng của nấm men là thấp nhất so với các nồng độ còn lại Pha log trong điều kiện này có chiều dài trung bình, độ dốc thấp, nấm men có khả năng sinh trưởng yếu nhất Ở nồng độ sucrose 100 g/l nấm men thể hiện rõ ràng bốn giai đoạn của quá trình sinh trưởng Độ dốc của pha log cao, thời gian diễn ra ngắn Khi sinh trưởng trong điều kiện nồng độ sucrose môi trường là 200g/l, ta thấy nấm men có thời gian diễn ra pha log dài nhất, độ dốc cao, mật độ tế bào sinh ra cao nhất Đối với đường cong sinh trưởng của nấm men trong điều kiện 300g/l, pha log diễn ra dài, độ dốc thấp hơn, pha giảm tốc giữa pha log và pha ổn định dài, thời gian bước vào pha ổn định muộn

Hình 1 Đường cong sinh trưởng của S cerevisiae tại các nồng độ đường khác nhau

y = -0.0022x 3 + 0.0206x 2 + 0.247x + 15.407

R² = 0.8992

y = 0.0009x 3 - 0.0383x 2 + 0.492x + 15.513

R² = 0.9333

y = -0.0097x3 + 0.1257x2 - 0.1327x + 15.535

R² = 0.853

y = -0.0035x 3 + 0.0296x 2 + 0.1992x + 15.32

R² = 0.8854

15.0

15.5

16.0

16.5

17.0

17.5

18.0

18.5

t (h)

200g/l 300g/l 100g/l 20g/l

6

Hình 2 Đường cong sinh trưởng tại pha log của S cerevisiae tại các nồng độ đường khác

nhau

Hình 2 thể hiện sự sinh trưởng của nấm men trong kì tăng trưởng Có thể thấy nấm men trong nồng độ đường 200 g/l có tốc độ tăng trưởng cao nhất và trong thời gian dài Trong khi đó, ở nồng độ đường 20 g/l, pha tăng trưởng của nấm men bị rút ngắn và tốc độ tăng trưởng kém Thời gian đạt mật độ tế bào cực đại của pha log của các mẫu đường cũng có

sự nhanh chậm khác nhau cụ thể là mẫu đường 300g/l-7h, 200g/l-9h, 100g/l-8h, 20g/l-7h Sự kiểm định thống kê cho ra kết quả mật độ tế bào cực đại được nuôi cấy tại các nồng độ đường khác nhau đều có sự khác biệt mang ý nghĩa thống kê cụ thể là ở nồng độ và chúng ta hoàn toàn có thể sử dụng sự sai khác để đánh giá tại phần sau của bài báo

y = 10^6*4.9809e 0.2722x R² = 0.8694

R² = 0.8359

y = 10^6*6.8997e 0.2591x R² = 0.9116

y = 10^6*4.938e 0.2359x R² = 0.8428

0

10

20

30

40

50

60

t (h)

200g/l 100g/l 300g/l 20g/l

y = -0.0469x 3 + 0.5028x 2 + 1.3555x + 3.0889

R² = 0.9031

y = -0.0229x 3 - 0.0445x 2 + 3.8009x + 3.5193

R² = 0.7265

y = -0.041x 3 + 0.4423x 2 + 0.8347x + 6.8882

R² = 0.7819

y = -0.0456x 3 + 0.2751x 2 + 2.4991x + 1.9471

R² = 0.7021

0.00

5.00

10.00

15.00

20.00

25.00

30.00

35.00

t (h)

7

Hình 3 Biểu đồ thể hiện tỉ lệ nảy chồi của S cerevisiae ở các nồng độ đường khác nhau

Dựa trên Hình 3 ta có thể nhận thấy trong giai đoạn đầu, ở tất cả các nồng độ đường đều có sự gia tăng của tỉ lệ tế bào nảy chồi Lượng tỉ lệ tế bào nảy chồi đạt cực đại trong giai đoạn gần cuối pha log và có chiều hướng suy giảm ở pha ổn định Trong pha tăng trưởng, tỉ

lệ tế bào nảy chồi cực đại ở nồng độ đường sucrose 20 g/l là thấp nhất và thời gian đạt được

tỷ lệ này là ngắn nhất Ở nồng độ 100g/l, tỉ lệ tế bào nảy chồi đạt cực đại trong thời gian ngắn Trong khi đó, ở nồng độ đường 200 g/l và 300 g/l, tỉ lệ nảy chồi cực đại khá lớn và thời gian duy trì sự sinh tế bào mới kéo dài hơn so với nồng độ đường 20 g/l và 100 g/l Ở nồng

độ 300 g/l, tỉ lệ nảy chồi trong thời gian đầu cao hơn nhưng tốc độ tăng tế bào mới lại thấp hơn so với trường hợp nấm men ở 200 g/l

Dựa trên Hình 4 ta có thể thấy, tỉ lệ tế bào nấm men chết khi được nuôi cấy ở điều kiện

300 g/l khá cao và duy trì trong suốt quá trình lên men, có xu hướng tăng từ cuối pha log Ở nồng độ đường 200 g/l và 20 g/l, số lượng tế bào chết giảm một cách nhanh chóng và tăng lên tại giờ thứ 6 đây là giai đoạn chuyển từ pha log sang pha ổn đinh Bên cạnh đó, ở nồng độ đường 100 g/l, tỉ lệ tế bào chết lại duy trì ở mức rất cao, có sườn thoải tại thời gian pha lag và

tỉ lệ này giảm giảm mạnh khi sinh trưởng bước vào pha log, cũng như những nồng độ đường khác tỉ lệ chết cũng có dấu hiệu tăng lên ở cuối pha log (giờ thứ 7)

Hình 4 Biểu đồ thể hiện tỉ lệ tế bào chết của S cerevisiae ở các nồng độ đường khác nhau

y = -0.022x 3 + 0.6479x 2 - 5.4024x + 14.628

R² = 0.8905

y = 0.028x 3 - 0.2399x 2 - 1.554x + 16.523

R² = 0.7999

y = -0.0133x 3 + 0.3686x 2 - 2.5159x + 14.253

R² = 0.8169

y = -0.0143x 3 + 0.5596x 2 - 5.2863x + 14.589

R² = 0.8158

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

t(h)

8

Bảng 2: Các thông số động học của S cerevisiae tại các nồng độ đường khác nhau (với độ tin

cậy 95%)

N 0 (Cell/ml) 6.90 x106 4.98 x106 4.68 x106 4.94 x106

N T (Cell/ml) 42.32 x106 57.71 x106 34.10 x106 25.75 x106

Y N/s (cell/(ml.g)) 4.84 x 106 a 7.47 x106 b 8.11 x106 c 22.33 x106 d

r N (cell/(ml.h)) 9.18 x 106 a 14.35 x 106 b 10.44 x 106 c 4.9 x 106 d

Y ’ N/S (cell/(ml.g)) 4.37 x 106 a 9.92 x 106 b 10.34 x 106 c 19.6 x 106 d Trong đó:

N0: Mật độ tế bào thời điểm ban đầu pha log

Nt: Mật độ tế bào thời điểm cuối pha log

Td: Thời gian thế hệ

µ: Tốc độ sinh trưởng tế bào

YN/S: Hiệu suất lý thuyết tạo thành tế bào dựa trên lượng cơ chất

rN: Tốc độ hình thành tế bào theo thời gian

rs: Tốc độ tiêu hao cơ chất theo thời gian

Y’N/S: Hiệu suất tạo thành sản phẩm của một đơn vị cơ chất

Bảng 2 trình bày các số liệu được tính toán tại pha log của saccharomyces cerevisiae ở

bốn nồng độ đường khác nhau Theo đó tốc độ sinh trưởng ở nồng độ đường 200g/l là cao nhất ứng với độ dốc lớn và kéo dài của đồ thị pha log, thấp nhất là ở nồng độ đường 20g/l ứng với đồ thị pha log có độ dốc thấp và ngắn Hiệu suất tạo thành tế bào tính theo cơ chất cũng có sự khác biệt khi hiệu suất này cao nhất tạo nồng độ đường giới hạn nhất (20g/l) và thấp nhất tại nồng độ 300g/l Tốc độ tạo thành sản phẩm cao nhất tại nồng độ đường 300 và giảm dần theo chiều giảm nồng độ đường, tốc độ tạo thành tế bào cao nhất tại nồng độ đường 200g/l ứng với pha log dài nhất và sườn dốc, thấp nhất tại nồng độ đường 20g/l ứng với pha

9

log ngắn và sườn thoải Bên cạnh đó hiệu suất tạo thành sản phẩm tính theo tế bào lớn nhất tại nồng độ đường 300g/l và có xu hướng giảm dần theo chiều giảm của nồng độ đường Với kết quả này có thể giúp sự nghiên cứu đưa ra kết luận nồng độ đường thích hợp tùy vào mục đích mong muốn

B Xác định lượng đường tổng nấm men sử dụng trong quá trình lên men

Hình 5: Biểu đồ thể hiện lượng đường tổng số trong quá trình nuôi cấy mẻ S cerevisiae tại

các nồng độ đường khác nhau

Lượng đường được sử dụng bởi nấm men trong suốt quá trình lên men được thể hiện như Hình 5 Trong điều kiện nuôi cấy trong môi trường có nồng độ 300g/l, lượng đường mà nấm men sử dụng có xu hướng giảm nhanh và rõ rệt nhất và nồng độ đường còn khá cao sau khi quá trình nghiên cứu kết thúc Ở nồng độ đường trong môi trường 100 g/l cũng giảm nhanh và nhiều trong giai đoạn diễn ra pha log của quá trình sinh trưởng Trong môi trường

có nồng độ đường 200 g/l, lượng đường mà nấm men sử dụng có xu hướng giảm đều và vẫn còn tương đối sau khi nghiên cứu kết thúc Môi trường có nồng độ đường 20 g/l giảm ít và chậm nhất, có sự chênh lệch rất ít trong suốt quá trình nghiên cứu

Hình 1 , Hình 3 , Hình 4 và Hình 5 thể hiện mối quan hệ giữa nồng độ cơ chất làm ảnh hưởng tới lượng tế bào sinh ra, số lượng tế bào chết đi và sự tăng trưởng của tế bào nấm men Trong giai đoạn pha log, tỉ lệ tế bào sinh ra lớn hơn rất nhiều so với tỉ lệ tế bào chết đi, đường cong sinh trưởng có xu hướng tăng Khi tỉ lệ tế bào sinh ra bằng lượng tế bào mất đi,

sự sinh trưởng của nấm men bước vào pha ổn định Đồng thời, hàm lượng đường cũng giảm theo thời gian cùng với sự sinh trưởng của nấm men, ở nồng độ đường khác nhau thì lượng

y = 0.0618x 2 - 1.3239x + 18.46

R² = 0.9051

R² = 0.9811

y = 0.0851x 2 - 1.6468x + 29.468

R² = 0.9819

y = -0.0152x 2 - 0.0176x + 3.0703

R² = 0.9619

0

5

10

15

20

25

30

35

t(h)