Tài liệu Báo cáo thực hành Môn: Công nghệ vi sinh pdf

Dùng 1 tờ giấy báo lớn bao gói các ống nghiệm khoảng 20-50 ống 1 bọc Đối với các dụng cụ như: pipet, que gạt, đũa thuỷ tinh, cối chày sứ… phải dùng giấy báo bao kín toàn bộ Với các đĩa p

Báo cáo:

Công nghệ thực hành

vi sinh

Môn: Công nghệ vi sinh Lớp: 06S

Công nghệ vi sinh là một bộ phận quan trọng trong công nghệ sinh học, là một môn nghiên cứu về những hoạt động sống của VSV nhằm khai thác tốt nhất khả năng kỳ diệu của VSV vào quy trình sản xuất ở quy mô công nghiệp, nhưng để đạt được điều đó ta phải đi từ những hiểu biết về VSV và những phương pháp cơ bản

để phân lập, nhân giống, bảo quản… giống VSV ở quy mô phòng thí nghiệm, Nội dung dưới đây sẽ trình bày một cách cụ thể quá trình phân lập, tuyển chọn, nghiên cứu hình thái, ứng dụng của chủng vi khuẩn lactic trong sản xuất một số sản phẩm lên men truyền thống

CHUẨN BỊ DỤNG CỤ NUÔI CẤY VI SINH VẬT:

1.Các loại hoá chất, dụng cụ, vật liệu

™ Hoá chất để rửa dụng cụ:

- Dung dịch Sulfurbicromate

- Cồn 900

- Xà phòng

- Chlorine 3%

™ Dụng cụ, vật liệu:

Dụng cụ, vật liệu Số lượng Dụng cụ, vật liệu Số lượng

Pipet(1-10-20ml) 18(1 ml), 2

20 ml)

Bình tam giác(100-250 ml)

2(100 8(250 2(500 ml)

Bình định mức

(100-1000 ml) 1(500 1(100

1(1000 ml)

Cốc thuỷ tinh

(100-1000 ml) 2(500 2(100

2(1000ml) Phễu thuỷ tinh 6 Ống đong (100-1000 ml) 1(100ml)

1(1000ml) Bông không thấm nước Giấy báo

2.Chuẩn bị dụng cụ nuôi cấy vi sinh vật

™ Nguyên tắc chung

- Các loại dụng cụ dùng để nuôi cấy vi sinh vật phải đạt độ trung tính, thật

sạch và trong, không bị nứt mẻ

- Dụng cụ được bao gói phải đảm bảo thật sạch và khô

- Bao gói phải thật kín và cẩn thận để dụng cụ sau khi khử trùng phải đảm

bảo sự vô trùng trong lớp giấy gói và lấy ra sử dụng dễ dàng

- Sau khi khử trùng cần phải đảm bảo sự vô trùng cho các dụng cụ

™ Tiến hành:

¾ Các ống nghiệm, đĩa petri, pipet cũ đã bị nhiếm khuẩn phải

hấp khử trùng ở 1210C trong 15 phút sau đó rửa lại thật kỹ sau mới mang ra bao gói

¾ Phương pháp bao gói dụng cụ gồm 2 khâu :

-Làm nút bông cho các ống nghiệm, bình tam giác, pipet…

-Bao gói cho hầu hết các dụng cụ thuỷ tinh

¾ Cách làm nút bông:

*Với các ống nghiệm:

-Lấy 1 miếng bông không thấm nước cuộn lại

-Dùng ngón tay ấn vào giữa cuộn bông

Môn: Công nghệ vi sinh Lớp: 06S

*Yêu cầu: nút có kích thước dộ chặt vừa phải -Đầu nút tròn, phần ngoài lớn hơn phần trong ống nghiệm -Lấy nút ra hay đóng vào dễ dàng

*Với các bình tam giác, chai lọ có kích thước lớn, làm tương tự với ống nghiệm nhưng lượng bông sử dụng phải nhiều hơn

¾ Cách bao gói dụng cụ:

Tất cả các dụng cụ sau khi làm nút bông đều phải được bao gói cẩn thận, phần

có nút bông bằng giây dầu hay giấy A4 cũng được để khi hấp khử trùng nút bông không bị ướt đảm bảo điều kiện vô trùng tốt hơn Cách làm:

Cắt các bao giấy hinh chữ nhật tuỳ theo kích thước dụng cụ cần bao gói

Gấp 1 cạnh của băng giấy, quấn băng giấy quanh đầu có nút bông đặt đầu gấp vào trong phía thành miệng dụng cụ, gấp mép dưới của băng giấy cho kín, gập ống giấy sát vào nút bông ở mặt trước và hai bên, gập phần giấy còn lại và cài sâu vào trong

Dùng 1 tờ giấy báo lớn bao gói các ống nghiệm (khoảng 20-50 ống 1 bọc) Đối với các dụng cụ như: pipet, que gạt, đũa thuỷ tinh, cối chày sứ… phải dùng giấy báo bao kín toàn bộ

Với các đĩa petri bao gói 5-10 đĩa cùng kích cớ trong 1 bọc bằng giấy báo

*Yêu cầu: Phần giấy bao ngoài phải chặt, kín

¾ Phương pháp khử trùng:

Sử dụng phương pháp khử trùng bằng sức nóng khô( dùng tử sấy)

Cho các dụng cụ được bao gói trên vào tủ sấy, đóng tủ, bật công tắc để tủ hoạt động

Xoay các núm để điều chỉnh kim chỉ trên đồng hồ nhiệt độ và kim chỉ trên đồng hồ thời gian với chỉ số nhiệt độ 165oC (hoặc 170oC), trong 2h( hoặc 1,5h)

Sau khi sấy, phải để nguội tới 60oC mới lấy dụng cụ ra, tránh lấy dụng cụ ra khi nhiệt độ tủ còn cao các dụng cụ thuỷ tinh dễ nứt vớ

Các dụng cụ sau khi sấy mà giấy bao có màu hơi vàng là được

*Yêu cầu với các dụng cụ nuôi cấy vi sinh vật:

Các dụng cụ nuôi cấy vi sinh vật phải đạt độ trung tính, thật sạch và trong không bị nứt mẻ

Dụng cụ bao gói phải đảm bảo thật sạch và khô

Bao gói phải thật kín và cẩn thận để dụng cụ sau khi khử trùng phải đảm bảo

sự vô trùng trong lớp giấy gói và lấy ra sử dụng dễ dàng

Sau khi khử trùng cần phải đạt được sự vô trùng tuyệt đối cho các dụng cụ bằng cách bảo quản trong tủ sấy ở 30oC, khi cần dùng mới lấy ra dùng

CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG ĐỂ PHÂN LẬP TUYỂN CHỌN GIỐNG VI

KHUẨN LACTIC

1.Mục tiêu:

Chuẩn bị môi trường để tuyển chọn, phân lập chủng vi khuẩn lactic

Môi trường đặc thù: Môi trường cà chua

Khử trùng môi trường bằng áp suất cao trong nồi hấp

*Dụng cụ thiết bị:

• Tủ vô trùng

• Nồi hấp áp lực

• Cân kỹ thuật, cân phân tích

• Bếp điện

• Đèn cồn

2 Môi trường phân lập: 500ml môi trường có CaCO 3

Môi trường nuôi cấy: 600ml môi trường không có CaCO 3

Thành phần trường 1l 500ml)( có CaCOMôi trường phân

3 ) cấy (600ml) Môi trường

Dung dịch muối A(ml):

− K2HPO4: 2,5g

− KH2PO4: 2,5g

− nước cất 250m

Dung dịch muối B(ml):

− MgSO4: 10g

− NaCl: 0,5g

− FeSO4: 0,5g

− MnSO4: 0,5g

− Nước cất: 250m

*Môi trường được chuẩn bị theo trình tự:

Cà chua quả đem thái lát, băm nhỏ, dùng vải lọc vắt lấy nước, lấy phần nước

đun trên bếp điện hoặc lò vi sóng, sau đó dùng bông thấm nước lọc lấy nước trong,

đong lượng nước ca chua cần thiết cho mỗi loại môi trường

Với 1 cốc thuỷ tinh khác, cho thạch vào thêm nước cất, khuấy đều, đun sôi trên

bếp điện, dùng đũa thuỷ tinh khuấy đều cho thạch tan hết

Song song đó dùng cốc thuỷ tinh khác cho một ít nước cất vào và cho các thành

phần còn lại, đun trên bếp điện và đun cho tan hết

Môn: Công nghệ vi sinh Lớp: 06S

Chú ý: tổng nước cất dùng ở trên là nước cất đã chuẩn bị ở phần chuẩn bị hoá

chất (tuỳ theo môi trường đã kê theo bảng)

Hoà trộn các thành phần trên, ta được môi trường cần dùng

Nhanh chóng phân phối môi trường dinh dưỡng vào các ống nghiệm có nút bông đã vô trùng bằng phễu để tránh môi trường bám vào ống nghiệm( lượng môi trường cho vào khoảng 1/3 ống nghiêm- không cho quá nhiều môi truờng) đối với môi trường có CaCO3 thì phân phối vào 3 bình tam giác loại 250ml có nút bông đã

vô trùng

Chú ý: môi trường cà chua là môi trường cung cấp khoáng, vitamin, và có độ

pH thích hợp với đa số VSV (pH ≈ 6,9 ) nên không cần phải chuẩn pH, còn đối với các môi trường khác như khoai tây tuy dinh dưỡng nhiều hơn nhưng không có độ pH thích hợp nên không được sử dụng nhiều, nếu sử dụng phải chuẩn pH môi trường đến 6,9

* Chuẩn bị nước cất để pha loãng mẫu thí nghiệm:

Dùng pipét 10 – 20ml, hút chính xác vào các ống nghiệm đã vô trùng mỗi ống 9ml nước cất Đậy chặt bằng nút bông không thấm nước

Dùng ống đong cho vào 2 bình tam giác loại 250ml có nút bông đã vô trùng mỗi bình 99ml nước cất

* Khử trùng môi trường, làm thạch nghiêng và thạch đĩa:

*Phương pháp khử trùng môi trường: Sử dụng nồi hấp áp lực cao, cách tiến hành như sau:

− Bật công tắc nguồn nồi hấp

− Mở nắp nồi cho nước vào nồi hấp đến mức quy định ( ngang thanh ngang dưới đáy nồi là được)

− Xếp các dụng cụ chứa môi trường vào giỏ và đưa vào nồi hấp

− Đóng chặt nắp nồi hấp

− Gạt cần sang chế độ Lock

− Cài đặt chế độ hấp khử trùng ở mode 2( 1210C trong 25phút)

− Để nồi tự động, khi nhiệt độ giảm xuống khoảng 600 có thể lấy môi trường ra làm thạch nghiêng hoặc thạch đứng… chờ thạch nguội cho vào tủ ấm bảo quản để sử dụng dần

− Các ống nghiệm chứa môi trường đặc thì được làm thạch nghiêng để cấy chuyền và bảo quản giống

*Cách làm thạch nghiêng:

Các ống nghiệm được khử trùng xong được đặt ở tư thế nghiêng góc sao cho mặt nghiêng và phần thạch sâu dạt yêu cầu

Có thể dùng các pipét lớn nhỏ khác nhau đặt trên mặt phẳng bàn để làm bề mặt nghiêng tuỳ theo lượng môi trường trong ống nghiêm nhiều hay ít

Để yên cho đến khi môi trường đặc lại, bề mặt thạch nghiêng phải nhẵn, phẳng, không gồ ghề và liên tục, thạch không được dính nút bông

Đối với môi trường thạch đứng thì ống nghiệm sau khi lấy ra khỏi nồi hấp, dựng thẳng đứng cho đến khi thạch đông cứng là đượcoảmoi trường khoảng 1/3 ống nghiệm)

PHÂN LẬP GIỐNG VI KHUẨN LACTIC:

Mẫu: nem chua

™ Chuẩn bị mẫu:

Nem chua bóc vỏ, chỉ lấy phần không có ớt , tỏi hay tiêu, vì những loại này có chứa các chất kháng sinh thực vật( như fitoxit có trong tỏi chẳng hạn) sẽ ảnh hưởng

có thể gây ức chế VSV cần phần lập

Cân 1g nem trên cho vào cối sứ, nghiền mịn, càng mịn càng tốt

™ Pha loãng mẫu thập phân: Qúa trình pha loãng mẫu được tiến hành trong tủ

cấy vô trùng, Thực hiện dưới ngọn lửa đèn cồn, trong điều kiện vô trùng

-Chuẩn bị các dụng cụ cho vào tủ cấy:

Đèn cồn

Đĩa petri, Pipet

Ống nghiệm chứa môi trường và ống nghiệm chứa nước cất đã thanh trùng

kỹ

Giá ống nghiệm, Bình tam giác

-Bật đèn tử ngoại trong tủ cấy cấy vô trùng khoảng 30-60 phút( thao tác này lặp lại trước mỗi lần cấy chuyền) Nhớ che chắn cẩn thận vì tia tử ngoại rất có hại

-Sau khi tắt đèn tử ngoại, bật quạt gió, một lúc sau mới tiến hành cấy

Cho toàn bộ nem trong cối vào ống nghiệm đầu tiên (chứa 9ml nước cất đã chuẩn

bị trên) lắc nhẹ ống nghiệm bằng cách một tay cầm nghiêng ống nghiệm, lắc nhẹ đáy ống lên lòng bàn tay kia, khoảng 2-3 phút cho đều, ta được mẫu pha loãng 10-1, tiếp tục pha loãng mẫu ở các nồng độ tiếp theo 10-2 , 10-3, 10-4, 10-5, 10-6- dựa vào sơ đồ dưới: Dùng pipet loại 1ml hút 1ml mẫu ở ống nghiệm thứ nhất cho vào ống nghiệm chứa nước cất vô trùng thứ hai, Trộn đều dung dịch bằng cách hút lên rồi thổi xuống 3-5 lần nhờ bóp cao su gắn trên đầu pipet., ta có độ pha loãng 10-2

-Tiếp tục thao tác tương tự để có các độ pha loãng 10-3, 10-4, 10-5, 10-6

Môn: Công nghệ vi sinh Lớp: 06S

™ Cách gieo cấy mẫu để tách khuẩn lạc vi khuẩn: Phương pháp tạo hộp đổ:

-Lấy các ống nghiệm có độ pha loãng 10-3, 10-5,10-6, mỗi ống lấy 1ml, (dùng pipet 1ml) cho lên bề mặt đĩa petri, Tương ứng với mỗi độ pha loãng sẽ thực hiện trên 3 đĩa petri

-Việc phân phối mẫu và môi trường vào đĩa petri phải được thực hiện trong tủ cấy

vô trùng

-Đĩa petri phải hoàn toàn vô khuẩn

-Tiến hành song song với các kỹ thuật vô trùng

-Dùng thạch trơ đã chuẩn bị trong bình tam giác (sau khi đã đun nóng, làm nguội đến khoảng 500C) rót trực tiếp môi trường phân lập( môi trường có CaCO3) ra đĩa petri vừa cấy mẫu xong, đổ một lớp mỏng vừa phải, để cho bề mặt thạch thật khô -Lưu ý nắp đĩa chỉ được mở 1 phần khi cho môi trường vào đĩa

-Đậy nắp lại, xoay đĩa tròn theo1 hướng nhẹ nhàng để tránh môi trường dấy lên thành và nắp đĩa, đồng thời cũng nhằm phân bố vi sinh vật đều trong môi trường về sau sẽ dễ quan sát, tách khuẩn lạc

-Để yên cho đến khi môi trường nguội và đặc lại

-Dùng giấy báo gói các đĩa petri thật kỹ, ghi đầy đủ tên mẫu, độ pha loãng, ngày cấy…rồi đem lật ngược nuôi trong tủ ấm ở 37oC, sau khoảng 24-48 giờ

TUYỂN CHỌN, CẤY CHUYỂN VÀ BẢO QUẢN GIỐNG

VI KHUẨN LACTIC

™ 1.Mục tiêu

Tuyển chọn giống vi khuẩn lactic có hoạt lực mạnh

Cấy chuyền và bảo quản giống trên môi trường thạch nghiêng

™ 2.Tuyển chọn và cấy chuyền giống vi khuẩn lactic:

*Tuyển chọn:

Sau khi nuôi trong tủ ấm 24-48 giờ thì các khuẩn lạc xuất hiện Môi trường cà chua đã dùng là môi trường tập trung nên có thể có khuẩn lạc của cả vi khuẩn lactic lẩn khuẩn lạc của những loài vi khuẩn khác, như acêtic(hình giọt-núi lứa-nhăn nheo), hay của nấm mốc…

Khuẩn lạc của vi khuẩn lactic là khuẩn lạc có vòng phân giải CaCO3, hình giọt, hoặc hình dẹt, trơn nhẵn, màu trắng đục

Tiến hành tuyển chọn các khuẩn lạc mọc tách biệt và có vòng phân giải CaCO3 lớn để cấy chuyền vào các ống nghiệm thạch nghiêng, hay các đĩa petri nhằm để cho các thí nghiệm tiếp theo

Nhận xét chủng lactic phân lập từ nem có hoạt lực mạnh hơn chủng lactic phân

lập từ mẫu giá, sữa chua và nước dưa cải Do ở các đĩa mẫu nem khuẩn làc lactic mọc nhiều ngay cả ở dộ pha loãng 10-6-, các khuẩn lạc mọc to, vòng phân giải CaCO3 lớn, môi trường hầu như trong suốt ở đĩa petri có độ pha loãng 10-3

*Cấy chuyền giống sang ống nghiệm thạch nghiêng:

Chuẩn bị các dụng cụ bỏ vào tủ cấy:

ƒ Đèn cồn

ƒ Đĩa petri, Pipet

ƒ Ống nghiệm chứa môi trường và ống nghiệm chứa nước cất đã thanh trùng kỹ

ƒ Giá ống nghiệm, Bình tam giác

-Bật đèn tử ngoại trong tủ cấy cấy vô trùng khoảng 30-60 phút( thao tác này lặp lại trước mỗi lần cấy chuyền) Nhớ che chắn cẩn thận vì tia tử ngoại rất có hại

Sau khi tắt đèn tử ngoại, bật quạt gió, một lúc sau mới tiến hành cấy

-Sát trùng tay kỹ với cồn trước khi vào cấy

-Đốt đỏ que cấy trên ngọn lửa đền cồn

Dùng tay trái hé mở nắp đĩa petri vừa đủ cho que cấy vào, tay phải cầm que cấy chạm vào bề mặt thạch cho nguội đi và lấy một ít giống trên vòng que cấy Đậy nắp đĩa petri lại

Tay trái cầm ống nghiệm thạch nghiêng, tay phải mở nút bông bằng các kẻ ngón tay và hơ miệng ống nghiệm trên ngọn lửa đền cồn, đưa que cấy có giống vào tận đáy ống nghiệm Nhẹ nhàng để đầu que cấy tiếp xúc với bề mặt thạch rồi đưa từ dưới lên trên theo đường zích zắc hoặc cấy theo đường vệt thẳng

Thao tác phải nhanh, chính xác, chú ý trong suốt quá trình cấy luôn luôn để ống nghiệm nghiêng 1 góc khoảng 450 để tránh các vi sinh vật khác rơi vào ống nghiệm Các thao tác thực hiện trước ngọn lửa đèn cồn

Hơ lại miệng ống nghiệm và nút bông trên ngọn

lửa đèn cồn

Ghi tên mẫu, ngày cấy chuyền, nhóm thực hiện

trên giấy bao gói nút bông của ống nghiệm

Chuyển các ống nghiệm vào nuôi trong tủ ấm

370C, sau 24-48 giờ giống phát triển và đem bảo quản trong tủ lanh hoặc để trong tủ

ấm đến lần thí nghiệm tiếp theo nếu thời gian ngắn

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI,

SINH LÝ, SINH HOÁ CỦA VI KHUẨN 1.Mục đích:

Làm tiêu bản giọt ép vi sinh vật

Nhuộm Gram, phân biệt tế bào gram âm, gram dương

Xác định một số đặc điểm sinh lý, sinh hoá của chủng lactic đã phân lập

2.Quan sát đặc điểm hình thái:

2.1 Tiêu bản giọt ép:

Dùng que cấy hoặc pipet vô trùng lấy 1 lượng nhỏ tế bào vi khuẩn trong ống giống để làm vết bôi

Làm vết bôi trên hiến kính: Cho giọt dịch chứa vi khuẩn trên đầu que cấy lên mặt của 1 phiến kính sạch, nếu vi khuẩn ở trạng thái sinh khối phải hoà sinh khối này với 1 giọt nước cất vô khuẩn để tạo được huyền phù

Đặt lá kính lên giọt huyền phù vi khuẩn sao cho không tạo bọt khí

Quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi điện tử

2.2 Nhuôm Gram:

™ Nguyên tắc:

Khi nhuôm Gram, vi khuẩn Gram dương có lớp vỏ dày tạo bởi peptidoglican

sẽ giữ được phức chất tạo thành giữa tím gentian và iot có màu tím cộng thêm màu thuốc nhuôm bổ sung sẽ có màu tím hồng Vi khuẩn Gram âm có lớp vỏ mỏng hơn, không giữ được phức chất nên sẽ chỉ có màu hồng của thuốc nhuộm bổ sung

Môn: Công nghệ vi sinh Lớp: 06S

™ Hoá chất:

-Dung dịch a: Tím gentian 1g

Rượu etylic96% 10ml -Dung dịch b: Phenol đã tinh chế lại 5g

Nước cất 100ml Trộn 2 dung dịch a và b với nhau

Hoà 2g KI vào 5ml nước cất, sau đó cho thêm 1g iot, chờ cho iot tan hết mới thêm nước cho đủ 300ml

-Thuốc nhuộm :lấy 1ml thuốc nhuộm fuchsin trộn với 9ml nước cất

™ Tiến hành:

¾ Chuẩn bị mẫu:

Lấy 1 ống giống vi khuẩn lactic đã có sinh khối tương đối nhiều, lấy 1 ít nước cất cho vào ống, lắc đều tay cho tế bào vsv hoà vào nước, pha loãng mẫu tuỳ theo lượng sinh khối trong ống nghiệm sao cho khi làm tiêu bản tế bào vsv không quá nhiều

Dùng đũa thuỷ tinh lấy 1 giọt vsv đã pha loãng dàn đều trên phiến kính tạo vết bôi, chiều dày vết bôi không nên vượt quá chiều dày của 1 tb vi khuẩn Cố định vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn., tránh vết bôi tiếp xúc trực tiếp với ngọn lửa

Nhỏ thuốc nhuộm tím gentian lên vết bôi vsv, giữ khoảng 1-2 phút

Đổ thuốc nhuộm thừa trên phiến kính đi, có thể rửa bằng nước cất, nhỏ dịch lugol lên vết bôi giữ từ 1,5-2 phút, (hoặc có thể quan sát khi vết gentian bi bong ra khỏi phiến kính nổi lên trên dịch lugol )rồi đổ đi

Dùng cồn rửa bản mẫu trong khoảng 30s, rửa quá lâu có thể làm tế bào vsv biến dạng, khó quan sát

Rửa tiêu bản lại bằng nước cất sau đó làm khô trên ngọn lửa đèn cồn

Nhỏ thuốc nhuộm bổ sung (fuchsin)lên chỗ vết bôi và giữ khoảng 2 phút

Rửa nước sau đó đợi khô, đem quan sát dưới kín hiển vi Tế bào gram dương bắt màu tím và gram âm bắt màu tím hồng

2.1.Kết quả:

Các tế bào vi khuẩn lactic có màu tím hồng đậm, có hình que, hình hạt đậu, có những tế bào đang phân chía, nhưng hầu hét đều có thành tế bào màu Tím hồng