PP Kiểm Tra Hiện Đại

Kỹ thuật ELISA? Là kỹ thuật dùng để phát hiện các phân tử đặc trưng trong mẫu e.g.. Phản ứng cơ chất với enzym được thực hiện thường tạo hợp chất màu Màu của sản phẩm= đo được sự hiện

MỘT SỐ KỸ THUẬT KiỂM TRA

HIÊN ĐẠI

Enzyme Linked

Immunosorbent Assay

Kỹ thuật ELISA?

 Là kỹ thuật dùng để phát hiện các phân tử đặc trưng trong mẫu (e.g proteins &

carbohydrates, vi khuẩn, virus, độc tố )

 Là công nghệ của lĩnh vực miễn dịch: sử dụng kháng thể (antibodies).

 Dùng để định tính và định lượng mẫu.

 Rất nhạy.

 Được ứng dụng nhiều trong y học và thực phẩm

Fc fragments

Các bước cơ bản của

phương pháp ELISA

E nzyme L inked I mmuno s orbent A ssay

1 Antigen được hấp thu trên bề mặt plastic (‘sorbent’).

2. Antigen được nhận biết bởi các antibody đặc trưng

(‘immuno’).

3. Antibody được nhận diện bởi antibody (‘immuno’) thứ 2

có gắn với enzyme (‘enzyme-linked’).

4. Phản ứng cơ chất với enzym được thực hiện (thường tạo hợp chất màu)

Màu của sản phẩm= đo được sự hiện

diện của antigen

Primary antibody

Secondary antibody

Different antigens in sample

Coloured

product

Botrytis cinerea

conidiophore

glass rod

Filter into new tube using muslin

Coating the wells

 Nhỏ 1 giọt mẫu vào giếng (well)

 Giữ yên trong khoảng 10 phút để mẫu hấp thu vào bề mặt plastic.

Thêm kháng thể (primary antibody)

 Thêm vào khoảng

4 giọt primary

antibody (mouse

monoclonal) vào mỗi

giếng

Sản xuất kháng thể đơn dòng

(Monoclonal antibody)

Fuse B-lymphocytes with myeloma cells

Inject mouse with

Unlimited supply

of antibody specific for single epitope

Keep clone producing antibody which best detects

antigen

Screen hybridomas for antibody production

individual

producing cells

Select anti-mouse antibodies from

plasma

Polyclonal antibodies which can recognise any mouse antibody

 Thêm vào 4 giọt

secondary antibody

(anti-mouse polyclonal) vào

mỗi giếng

 Để yên trong khoảng 20 phút.

1 Add antigen

7 Add substrate for enzyme

2 Wash with

PBST

4 Wash with PBST

3 Add primary

antibody

6 Wash with PBST

5 Add secondary

antibody

8 Observe colour development

Ứng dụng ELISA

 Phát hiện bệnh ở người, động vật và thực vật.

 Phát hiện các tác nhân gây dị ứng trong

PCR và real-time PCR là một kỹ thuật hoàn toàn mở do vậy chúng ta có khả năng không phải bị

lệ thuộc vào các hãng sản xuất kit ở nước ngoài, nhờ vậy giá thành sẽ rẽ

PCR

KHÁI NIỆM

• PCR là chữ viết tắt của cụm từ Polymerase Chain Reaction

• PCR là Phản ứng chuỗi trùng hợp hay gọi là "phản ứng

khuếch đại gen"

• PCR là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm

khuyếch đại (tạo ra nhiều bản sao) một đoạn DNA mà không cần sử dụng các sinh vật sống như E coli hay nấm men

• PCR được sử dụng trong các nghiên cứu sinh học và y học phục vụ nhiều mục đích khác nhau, như phát hiện các bệnh di truyền, nhận dạng, chẩn đoán những bệnh nhiễm trùng, tách dòng gene, và xác định huyết thống

LỊCH LỊCH SỬ SỬ

Mullis phát minh, ông đã đoạt giải Nobel về Hóa học vào tháng 10 năm 1993 cho thành tựu này, chỉ sau 7 năm khi ông đưa ra ý tưởng Ý kiến của Mullis là phát triển một quy trình mà DNA có thể nhân lên nhiều lần một cách nhân

polymerase

THỰC

• PCR được dùng để khuếch đại một đoạn DNA ngắn, đã xác định được một phần Đó có thể là một gen đơn, hay một phần của gen

• PCR cần rất nhiều thành phần

- DNA mẫu (template) chứa mảnh DNA cần khuếch đại

- Cặp mồi (primer),

- DNA-polymerase enzym xúc tác cho việc nhân lên của DNA

- Nucleotides (ví dụ dNTP) là nguyên liệu cho DNA-polymerase

để xây dựng DNA mới

- Dung dịch đệm, cung cấp môi trường hóa học cho

DNA-polymerase

THỰC THỰC NGHIỆM PCR NGHIỆM PCR

PCR machine

Chu kỳ nhiệt: Đây là máy đun

nóng và làm nguội trong ống

phản ứng ở nhiệt độ chính xác

cho mỗi phản ứng Để ngăn ngừa

sự bay hơi của hỗn hợp phản

ứng, phần nắp đậy của máy PCR

cũng được đun nóng, trường hợp

lượng dung dịch phản ứng quá ít,

người ta cho một lớp dầu (natural

oil) lên trên bề mặt hỗn hợp phản

ứng

1 Đoạn mồi

Mồi là những đoạn ngắn, sợi DNA nhân tạo

(vì DNA thường là sợi đôi, chiều dài của nó được xác định bằng số lượng cặp base

(bp); chiều dài của sợi đơn DNA được đo bằng base hay nucleotides)

Mồi Taq polymerase

dNTP PCR buffer + MgCl2

PCR

MIX

DNA đích (Template)

2 Quy trình

Quy trình PCR gồm 20 đến 45 chu kỳ Mỗi chu kỳ gồm 3 bước:

- Nhiệt độ tăng lên 94-96°C để tách hai sợi DNA ra Bước này gọi

là biến tính, nó phá vỡ cầu nối hydrogen nối 2 sợi DNA

- Sau khi 2 sợi DNA tách ra, nhiệt độ được hạ thấp xuống để mồi

có thể gắn vào sợi DNA đơn Bước này gọi là gắn mồi

- Cuối cùng, DNA polymerase gắn tiếp vào sợi trống Nó bắt đầu bám vào và hoạt động dọc theo sợi DNA Bước này gọi là kéo dài

 qua kích thước (điện di)

 hay qua trình tự (lai)

Ct curve

Standard curve Melt

curve

Real-time PCR

chạy PCR và đồng thời phát hiện sản phẩm khuếch đại

Laser or

UV

Camera

Thiết bị Real-time PCR

Primers Taq polymerase

dNTP PCR buffer + MgCl2

Định danh dựa vào kiểu hình sinh vật hóa

học biểu hiện từ các kiểu gen

Xác định dựa vào kích thước đoạn gen hay một trình tự đặc hiệu của

Các bước trong xét nghiệm PCR phát hiện

tác nhân vi sinh vật

Mẫu thửChuẩn bị mẫu thửTách chiết nucleic acid

Chạy PCRPhát hiện sản phẩm PCR và phân tích kết quả

Một xét nghiệm PCR định tính chuẩn mực

Một xét nghiệm qPCR định lượng chuẩn mực

• Vân tay di truyền

• Kiểm tra huyết thống

• Chuẩn đoán bệnh di truyền

• Tách dòng gen

• Gây đột biến điểm

• Phân tích mẫu DNA cổ

• Xác định gen của các đột biến

• So sánh mức độ biểu hiện của gen