sắc ký LỎNG GHÉP KHỐI PHỔ LC 1 2

sắc kí lỏng

SẮC KÝ LỎNG GHÉP KHỐI

PHỔ - LC/MS

Máy HPLC hoạt động trong

điều kiện: Máy khối phổ hoạt động trong điều kiện: + Áp suất cao + Chân không sâu

+ Nhiệt độ tương đối thấp + Nhiệt độ cao

+ Các chất khảo sát ở thể lỏng + Các chất khảo sát phải ở thể khí

+ Vận tốc dòng chảy lớn (vài

ml phút -1 ). + Vận tốc dòng chảy nhỏ (vài µl phút -1 ).

Những sự không tương thích cơ bản giữa hai

loại máy (HPLC-MS)

Giới thiệu chung về thiết bị LC/MS

• Chức năng: phân tích và xác định cấu

trúc phân tử của các hợp chất hữu cơ Xác định hàm lượng đa lượng, vi lượng, hàm lượng vết các hợp chất hữu cơ

• Lĩnh vực ứng dụng: xác định các

vitamin, thuốc diệt cỏ, dư lượng thuốc kháng sinh, trong thực phẩm, nông sản, thủy hải sản, các hoocmon kích thích

tăng trưởng,…

Nguyên tắc của phương pháp:

• Dựa vào ái lực khác nhau giữa các chất cần

xác định với pha tĩnh và pha động mà chúng

được tách ra nhờ thay đổi độ phân cực của

dung môi pha động cùng với cột tách thích hợp Việc định lượng được thực hiện bằng phương pháp đường chuẩn , nội chuẩn

• Sự bắn phá các phân tử hợp chất hữu cơ trung hòa thành các ion phân tử mang điện tích +

hoặc mang điện - phá vỡ thành các mảnh ion, bằng các phân tử mang năng lượng cao thực hiện trong môi trường chân không

Ưu điểm và nhược điểm của phương

pháp khối phổ

• * Ưu điểm:

- Có thể phân tích được các hợp chất cao phân tử và ion thuộc nhiều lĩnh vực,

có thể tách được các hợp chất có độ phân cực gần nhau, các hợp chất tự nhiên không bền, các hợp chất kém bền nhiệt …

- Cột sắc ký có thể sử dụng lại nhiều lần.

- Có nhiều loại đầu dò để phân tích.

- Giới hạn định lượng thấp.

- Không cần làm bay hơi mẫu (LC/MS) và cần làm bay hơi mẫu (GC/MS)

- Độ phân giải cao nhờ quá trình tách trên cột

- Độ nhạy cao (ppm-ppb) nhờ đầu dò

- Thể tích mẫu phân tích nhỏ (1-100L)

Nhược điểm:

- Phải mất thời gian ổn định cột trước khi tiêm mẫu.

- Dung môi sử dụng phải có độ tinh khiết cao (LC/MS, LC/MS/MS) hoặc khí tinh khiết cao cho (GC/MS)

- Mất thời gian để rửa cột sau khi phân tích.

- Thiết bị rất đắt tiền.

1/ Sắc ký lỏng ghép đầu dò một lần khối phổ - LC/MS ( SINGLE MASS)

• Khối phổ đơn ( Single MS) và Double MS (MS/MS)

• Kỹ thuật MS một lần có một số nhược điểm như : không nghiên cứu được cơ chế phân mảnh, sự khác biệt giữa các đồng

phân, xác định thêm chi tiết cấu trúc hoá học, do kỹ thuật ion hoá êm dịu nên khối phổ đồ chỉ cho thấy ion phân tử… Kỹ thuật MS/MS (2 lần) khắc phục được những nhược điểm này đồng thời tăng thêm độ nhạy (cỡ fentogram), cho độ chính xác cao Máy đo khối phổ hai lần liên tiếp (MS/MS) gồm hai hệ máy khối phổ riêng biệt độc lập nhau được nối liền với nhau cách

nhau bởi một buồng va chạm (collision cell) MS đầu tiên ( tứ cực Q1 ) được sử dụng để cô lập ion cha-mẹ (precursor ion), ion này liền ngay sau đó sẽ bị phân mảnh tại buồng va chạm

collision cell để cho ra những ion con (product ion) có khối

lượng nhỏ hơn khối lượng của ion mẹ, tiếp theo MS thứ hai

(tứ cực Q2) sẽ phân tách những ion này Những ion mong muốn

sẽ đi tới detector và chuyển thành tín hiệu.

SẮC KÝ LỎNG GHÉP KHỐI PHỔ Khối phổ đơn ( Single -LC/MS)

LC/MS được áp dụng cho định tính, định lượng vết các hợp chất hữu cơ trong nghiên cứu an toàn

thực phẩm, môi trường, dược phẩm và độc chất… Cấu tạo của thiết bị LC/MS:

Nguyên tắc hoạt động của thiết bị LC/MS ( Sắc ký lỏng một lần MS)

• Mô hình thiết bị sắc ký lỏng một lần MS với 04 cực ( Single quadruple mass spectrometer)

Ion Sourse Optics guide Quadrupole mass

Analyzer- Q1 Detector

Nguyên tắc hoạt động của thiết bị LC/MS(Sắc ký lỏng một lần MS) tiếp

• Mẫu được phân tích bằng đầu dò khối phổ dựa trên nguyên tắc mẫu được ion hóa trong điều kiện chân không

• Mẫu sau khi đi ra khỏi sắc ký lỏng được chuyển đến đầu dò

khối phổ Mẫu được chuyển qua bộ phận ion hóa Tại đây dưới tác dụng của nhiệt độ cao, áp suất cao mẫu chuyển từ dạng

lỏng sang dạng khí - ion hóa trở thành các ion mang điện

dương (+),điện âm (-) và ion trung hòa Các ion với khối lượng đặc trưng của từng chất được chuyển vào tứ cực (Q1) Tại đây

tứ cực có nhiệm vụ chọn lọc những ion có khối lượng m/z định trước cho đi qua, còn các ion khác bị loại bỏ ra ngoài Các ion

đã được chọn lọc qua bộ lọc rồi đi tới đầu dò.Tại đầu dò sẽ cho

ra các chất phân tích mà người phân tích quan tâm.

Ưu điểm và nhược điểm của

Fragment ions – Ion phân mảnh

Phân tích mẫu trên LC/MS cho biết Prcursor ion ( ion chính hay ion mẹ ) của chất , không cho

biết ions product ( các ion con) Tuy nhiên nếu cung cấp năng lượng lớn thì hiện tượng các ion product vẫn có thể xuất hiện Hiện tượng này

goi là fragment ions Sự bắn phá ion chính xấy

ra trong giữa vùng áp suất thấp ở nguồn ion

( ion source) và Q1với hiệu điện thế cao Nhưng

để nhận danh từng ion con định lượng và ion

xác nhận thì single mass không làm được

Muốn làm được điều đó thì phải áp dụng thiết

bị LC/MS/MS – Triple quadrupole mass

Một số kiểu quét khối phổ cho MS một

lần

Full MS: là kiểu quét khối phổ tòan bộ các ion

đã đi qua bộ phận ion hóa, sử dụng một tứ

cực Q1 để phân tích xác định các ion ban

đầu đó mà không thông qua việc đập vỡ

thành ion con

MS, chọn ra các ion mong muốn, là kiểu quét khối phổ có chọn lọc khối lượng ion, khối

lượng chất phân tích được chọn trước, khi đi qua tứ cực Q1 sẽ phân tích và chỉ chọn khối lượng cho trước

2/ TRIPLE QUADRUPOLE

LC/MS/MS

Cấu tạo đầu dò khối phổ 3 tức cực

TRIPLE QUADRUPOLE LC/MS/MS

Cấu tạo của đầu dò khối phổ - MS

Source (nguồn): có tác dụng tách dung môi và tạo ion mang điện

• - First quadrupole Q1: bao gồm 4 tứ cực có dấu dương (+)

và âm (-) đổi chiều nhau , mục đích là lựa chọn các ion cần

phân tích có tác dụng quét phân tích và chọn lọc các ion mẹ sau khi đã được ion hóa ở Q0.

• - Collision cell- Q2 là nơi khí Argon có động năng lớn đi vào, có tác dụng đập vỡ các phân tử hóa chất bằng dòng khí argon

cùng điện thế cao tạo thành những ion con (fragment ions) có khối lượng phân tử nhỏ hơn Áp suất cao và điện thế cao từ 10 – 550V

- Third quadrupole Q3 Nơi xác nhận lại các ion con theo khối

lượng phổ của chúng m/z sau khi đã được đập vỡ tại Q2.

Detector : Đầu dò cho ra các pick cần phân tích bao gồm cả các mũi mẹ và các mũi con

Nguyên tắc họat động của LC/MS/MS

Mẫu sau khi được tiêm vào sắc ký lỏng và đi ra khỏi sắc

ký lỏng ở dạng lỏng, mẫu tiếp tục được đưa vào đầu

dò khối phổ Tại đây ( ion source) dưới áp suất, nhiệt

độ cao > 400 0 C mẫu chuyển sang thể aersol khí có hạt rất mịn, mẫu được khí mang là khí trơ Ar, hoặc He, N2loại bỏ các dung môi và chuyển các ion mẫu vào Q1 Tại Q1 với cấu tạo có 04 tứ cực khác dấu và đối nhau

sẽ chọn ra các ion có khối lượng m/z đã được chọn

trước đưa vào collison cell (Q2) Tại đây dòng khí trơ như N2 , He…sẽ va đập vào các ion từ Q1 chuyển đến cho vỡ ra thành những mảnh (fragment) nhỏ hơn có

khối lượng m/z và tất cả các mảnh nhỏ này được

chuyển tiếp đến Q3 Tại đây một lần nữa Q3 sẽ chọn những ion định lượng và ion xác nhận cần phân tích và chuyển đến đầu dò ( detector)

Nguyên tắc hoạt động của thiết bị LC/MS (tiếp)

• lượng ion cần quan sát và năng lượng

đập vỡ cho Q2 Khi đó Q1 sẽ quét tất cả các ion có khối lượng nằm trong khoảng quan sát Khi chất đi qua Q2 sẽ bị đập vỡ bởi dòng khí argon mang năng lượng kích thích như đã cài đặt Tại Q3 sẽ quét tất cả khối lượng các ion nằm trong khoảng khối lượng đã chọn Mục đích của cách quét

này là xác định khối lượng ion mẹ và các ion con chính sau khi đập vỡ tại năng

lượng xác định

Nguồn ion hóa – Ion Source

Bộ kết nối phun điện ( Electrospray Ionizaton : ESI )

• Nguyên tắc của phương pháp ion hóa phun điện là dòng chảy từ máy sắc ký lỏng cao áp (HPLC) ra với tốc độ 1-40ml/phút đi qua 1

ống capilary có đường kính 0,1mm và điện trường cao 3- 6kV Chất lỏng được phun ra dưới dạng hạt rất nhỏ mang điện ở áp suất thường Các hạt này đi đến điện cực của

nguồn ion hóa áp suất khí quyển (API) Dòng khí N2 thổi vào làm mẫu bay hơi nhanh biến các hạt rất nhỏ trở thành cực nhỏ trước khi đưa đến buồng ion hóa

Nguồn ion hóa –Ion source

Đầu ESI

Bộ kết nối phun điện (Electrospray Ionizaton: ESI )

Ion hoá hoá học ở áp suất khí quyển

(Atmospheric Pressure Chemical Ionization: APCI)

•

• Hỗn hợp khí này đến một vùng có áp suất khí quyển, và xảy ra sự ion hoá hoá học khi va chạm với 1 dòng ion dương (H2, CH4, H2O ) hoặc âm để biến các phân tử trung hòa thành các ion phân tử hay các ion qua sự bắn phá bởi dòng electron mang năng lượng cao do thanh Corona tạo ra Mỗi phân tử khí có thể tạo ra các ion dương khác nhau làm tác nhân cho ion

hóa hóa học.

• Tạo ion dương

• N2 + e-  N2.+ +

2e-• H2O + e-  H2O.+ +

2e-• H2O + H2O.+  H3O+ + .OH [phản ứng ion – phân tử]

M + H3O+  MH+ + H2O [phản ứng ion – phân tử]

Tạo ion âm

Với những phân tử có H linh động trong vùng phóng điện, có sự ion hóa của phân tử bằng cách mất đi H+, phần còn lại là một anion.

Ion hoá hoá học ở áp suất khí quyển (Atmospheric

Pressure Chemical Ionization: APCI)

Multimode

Tứ cực – Q1

• Tứ cực gồm 4 hình trụ và kết nối với nhau

thành một ống hình trụ bằng một cái vòng bằng

sứ, có dấu ngược nhau Hai cặp rods đối nhau

sẽ tích dòng điện một chiều trái nhau cùng với tần số vô tuyến luôn biến đổi

• Khi các ion phân tích đi vào vùng tứ cực (Q1)sẽ

di chuyển theo hình sin do tác dụng của dòng điện một chiều tích điện trên các thanh tứ cực

và sự quét tín hiệu tần số vô tuyến Mỗi ion có khối lượng khác nhau và có một tần số quét

khác nhau Các ion có cùng tần số với tần số

quét sẽ đi ra ngoài, các ion còn lại sẽ tiếp tục đi vào vùng va chạm Q2 Các ion con được chọn

sẽ đi tiếp vào detector

TỨ CỰC

Một số kiểu quét khối phổ MS/MS.

đã đi qua bộ phận ion hóa, sử dụng một tứ cực Q1 hoặc Q3 để phân tích xác định các ion ban đầu đó mà không thông qua việc đập vỡ thành ion con

chọn ra các ion mong muốn, là kiểu quét khối phổ có chọn lọc khối lượng ion, khối lượng chất phân tích được chọn trước, khi đi qua tứ cực

Q1 hoặc Q3 sẽ phân tích và chỉ chọn khối

lượng cho trước Không sử dụng Q2

• Chọn Ion parent:

Chọn ion bố mẹ chọn khoảng khối lượng ion cần quan sát và năng lượng đập vỡ cho Q2 Khi đó Q1 sẽ quét tất cả các ion có khối lượng nằm

trong khoảng quan sát Khi chất đi qua Q2 sẽ bị đập vỡ bởi dòng khí argon mang năng lượng

kích thích như đã cài đặt Tại Q3 sẽ quét tất cả khối lượng các ion nằm trong khoảng khối

lượng đã chọn Mục đích của cách quét này là xác định khối lượng ion mẹ và các ion con

chính sau khi đập vỡ tại năng lượng xác định

Mô hình kiểu quét Parent

scan argon scan

• Tại tứ cực Q1 chọn ion mẹ và chuyển ion này tới Q2 để đập vỡ ion mẹ đã chọn Bằng dòng khí argon Tại đây các ion con xuất hiện, các

ion được chuyển đến Q3 Tại Q3 sẽ quét và

xác định tất cả khối lượng các ion con đã vỡ từ ion mẹ đã chọn Kiểu quét này có thể nhận

dạng được cấu trúc của ion mẹ đã chọn ở Q1

selected mass

all fragments

Mô hình kiểu quét Product