Xây dựng quy trình định lượng đồng thời metronidazol và spiramycin i trong huyết tương người bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ (lc ms ms)

AUC Area under cover Diện tích dưới đường congAPCI Atmospheric pressure chemical ionization Ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển AS Analytical Substance Chất phân tích CE Collision cell

Trang 1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRẦN THỊ MỸ DUNG

XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI METRONIDAZOL VÀ SPIRAMYCIN I TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG GHÉP KHỐI PHỔ (LC-MS/MS)

Ngành: Kiểm nghiệm Thuốc – Độc chất

Mã số: 8720210

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

Hướng dẫn khoa học:

TS CHƯƠNG NGỌC NÃIPGS.TS NGUYỄN ĐỨC TUẤN

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2018

Trang 2

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi

Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trongbất kỳ công trình nghiên cứu khác

Trần Thị Mỹ Dung

Trang 3

MỤC LỤC

TrangTRANG BÌA PHỤ

1.6 Thẩm định quy trình định lượng thuốc trong dịch sinh học theo

US-FDA và EMA

17

1.7 Một số công trình nghiên cứu định lượng metronidazol và spiramycin

trong huyết tương người bằng kỹ thuật sắc ký lỏng

24

2.4.2 Xây dựng quy trình định lượng đồng thời MET và SPY I trong huyết

tương người bằng phương pháp LC-MS/MS

29

Trang 4

2.4.3 Thẩm định quy trình định lượng đồng thời MET VÀ SPY I, IS trong

huyết tương người bằng phương pháp LC-MS/MS theo hướng dẫn của

US-FDA và EMA

31

3.5 Xác định khoảng nồng độ định lượng MET và SPY I trong huyết tương

người

47

3.6 Thẩm định quy trình định lượng đồng thời MET và SPY I trong huyết

tương người bằng phương pháp LC-MS/MS

47

3.7 Dự thảo quy trình định lượng đồng thời MET và SPY I trong huyết

tương người bằng kỹ thuật LC-MS/MS

4.5 Quy trình xử lý mẫu, hiệu suất chiết và ảnh hưởng của nền mẫu 64

Trang 5

AUC Area under cover (Diện tích dưới đường cong)

APCI Atmospheric pressure chemical ionization (Ion hóa hóa học

ở áp suất khí quyển)

AS Analytical Substance (Chất phân tích)

CE Collision cell (Buồng va chạm)

FAB Fast atom bombardment (Bắn phá nhanh nguyên tử)

CI Chemical Ionization (Ion hóa hóa học)

CV Coefficient of variation (Hệ số phân tán)

ECD Electron capture detection (Đầu dò cộng kết điện tử)

ESI Electrospray Ionization (Ion hóa bằng cách phun điện)

FDA Food and Drug Administration (Cơ quan Quản lý thuốc và Thực phẩm)

FI Field Ionization (ion hóa trường)

EMA European Medicines Agency (Cơ quan Quản lý thuốc Châu Âu)

HQC High Quality Control (Mẫu kiểm tra nồng độ cao)

IS Internal standard (Chuẩn nội)

IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry (Hiệp

hội Quốc tế về Hóa học thuần túy và ứng dụng)

LC Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng)

LC-MS/MS Liquid Chromatography- Mass Spectrometry/Mass

Spectrometry (Sắc ký lỏng – Khối phổ/Khối phổ)LLE Liquid-liquid extraction (Chiết lỏng-lỏng)

LLOQ Lower Limit of Quantification (Giới hạn định lượng dưới)

LQC Low Quality Control (Mẫu kiểm tra nồng độ thấp)

Trang 6

MIC Minimum Inhibitory Concentration (Nồng độ ức chế tối thiểu)MQC Medium Quality Control (Mẫu kiểm tra nồng độ trung bình)

MS Mass Spectrometry (Khối phổ)

MRM Multiple reacting monitoring (Kỹ thuật ghi phổ MRM)

MF Matrix effect (Ảnh hưởng nền mẫu)

PPT Protein precipitation (Tủa protein)

CV Relative Standard Deviation (Độ lệch chuẩn tương đối)

SIM Selected Ion Monitoring (Kỹ thuật ghi phổ SIM)

SD Standard deviation (Độ lệch chuẩn)

SPE Solid phase extraction (Chiết pha rắn)

SRM Selected Reaction Monitoring (Kỹ thuật ghi phổ SRM)

SPY I Spiramycin I

Tmax Thời gian đạt nồng độ đỉnh

t1/2 Thời gian bán thải

ULOQ Upper Limit of Quantification (Giới hạn định lượng trên)

Trang 7

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Các thông số dược động học của thuốc đối chứng và thuốc thử 4

Bảng 1.2 Các thông số dược động học của spiramycin 6

Bảng 1.3 Tóm tắt quy trình xử lý mẫu huyết tương 16

Bảng 1.4 So sánh hướng dẫn US-FDA 2018 và EMA 2015 23

Bảng 2.1 Chất chuẩn đối chiếu và chuẩn nội được sử dụng trong nghiên cứu 27

Bảng 2.2 Dung môi và hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu 27

Bảng 2.3 Nồng độ lý thuyết các dung dịch chuẩn và dung dịch kiểm tra (QC) 29

Bảng 3.1 Tóm tắt thông tin khảo sát nội chuẩn 37

Bảng 3.2 So sánh tỷ lệ thu hồi với 2 dung môi tủa protein ở mức nồng độ MQC 47

Bảng 3.3 Nồng độ lý thuyết của các thuốc trong huyết tương 47

Bảng 3.4 Kết quả kiểm tra tính phù hợp hệ thống (n = 6) 48

Bảng 3.5 Kết quả xác định tính đặc hiệu của phương pháp 49

Bảng 3.6 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính và xây dựng đường chuẩn 50

Bảng 3.7 Kết quả khảo sát tính tương thích của phương trình hồi quy

và ý nghĩa của các hệ số của phương trình hồi quy

Bảng 3.10 Hiệu suất chiết của MET, SPY I và ROX (n = 6) 52

Bảng 3.11 Độ ổn định của MET và SPY I trong dung dịch chuẩn gốc (n = 6) 53

Bảng 3.12 Độ ổn định của MET và SPY I trong huyết tương (n = 6) 54

Bảng 3.13 Kết quả đánh giá sự ảnh hưởng của nền mẫu khi phân tích MET và

Trang 8

DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ VÀ ĐỒ THỊ

Trang

Hình 1.7 Sơ đô ̀ ta ̣o thành ion dương trong kỹ thuật ESI 10

Hình 1.8 Sơ đồ khối của đầu dò khối phổ hai lần tứ cực 11

Hình 1.10 Bộ phận phân tích khối phổ của thiết bị LC-MS/MS 8040

Shimadzu

14

Hình 3.1 Phổ khối của SPY I (A), MET (B), ROX (C) và TIN (D) 36

Hình 3.2 Sắc ký đồ dung dịch MQC với hệ pha động acid formic 0,1%

-MeOH (43:57), cột Gemini NX-C18 (100 x 3 mm; 5 µm), nhiệt độ cột

mm; 5 µm) (D) Cột Gemini C18 (100 x 4,6 mm; 3 µm) (E) Cột Zorbax

C18 (250 x 4,6 mm; 3 µm) Hệ pha động ACN - amoni format 5 mM pH

7,4 (80:20) Thể tích tiêm mẫu 3 µl

42

Trang 9

Hình 3.7 Sắc ký đồ dung dịch MQC với nhiệt độ cột khác nhau.

(A) 30 oC, (B) 35 oC, (C) 40 oC Hệ pha động amoni format 5 mM pH 7,4

-ACN (20:80) Thể tích tiêm mẫu 3 µl

Hình 3.10 Sắc ký đồ dung dịch MQC với các dung môi tủa protein

khác nhau (A) tủa bằng ACN, (B) tủa bằng MeOH

45

Hình 3.11 Sắc ký đồ dung dịch MQC với các dung môi tủa protein khác

nhau (A) tủa bằng ACN trong dung dịch NaOH 0,01 N; (B) và (C) tủa bằng

ACN trong dung dịch NaOH 0,1 N; (D) tủa bằng ACN trong dung dịch

NaOH 1 N; (E) tủa bằng ACN trong dung dịch acid formic 1%; (F) tủa bằng

MeOH trong dung dịch acid formic 1% Hệ pha động amoni format 5 mM

pH 7,4 -ACN (20:80) Nhiệt độ cột 40 oC Thể tích tiêm mẫu 3 µl

46

Hình 3.12 Sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng (A) và mẫu huyết tương tự tạo

có chứa chuẩn ở nồng độ LLOQ (B)

49

Hình 4.1 Công thức cấu tạo của spiramycin I gồm có 3 phân tử đường 61

Trang 10

MỞ ĐẦU

Hiện nay dạng thuốc phối hợp metronidazol và spiramycin với liều cố định được sửdụng phổ biến trong nha khoa để điều trị nhiễm khuẩn răng miệng cấp tính, mạn tính và dựphòng nhiễm khuẩn tại chỗ sau phẫu thuật nha khoa tại Việt Nam Ngoài việc sử dụng cácthuốc kháng viêm giảm đau trong điều trị nhiễm trùng răng miệng, kháng sinh cũng có vaitrò quan trọng trong việc diệt vi khuẩn gây bệnh vùng răng miệng như nướu răng, lợi…Các

vi khuẩn gây bệnh vùng răng miệng khá đa dạng, thường bao gồm cả hai loại kỵ khí vàhiếu khí nên sự phối hợp kháng sinh để điều trị là cần thiết Việc phối hợp metronidazol vàspiramycin nhằm tăng tác dụng điều trị, mở rộng phổ kháng khuẩn, tạo nên tác dụng hiệpđồng ức chế một số chủng vi khuẩn nhạy cảm, giảm nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) 30 lầnđối với metronidazol và giảm MIC 10 lần đối với spiramycin [31], cũng như giảm nhữngtác dụng không mong muốn Spiramycin là một kháng sinh thuộc nhóm macrolid được

phân lập từ Streptomyces ambofaciensand, là một hỗn hợp tự nhiên gồm ba thành phần

spiramycin I, II và III, trong đó hàm lượng spiramycin I trên 85%, spiramycin II vàspiramycin III lần lượt không quá 5% và 10% [27],[32] Spiramycin I có hoạt tính sinh họccao nhất trong số ba đồng phân trên [25] Vì vậy, spiramycin I thường được chọn là chấtđại diện để định lượng spiramycin [5],[9],[32]

Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sắc ký lỏng để định lượngmetronidazol trong dịch sinh học [11],[17],[21],[24],[29],[32],[34],[35],[36] và spiramycin

I [5],[9],[23],[32] Tuy nhiên, việc nghiên cứu định lượng đồng thời metronidazol vàspiramycin I trong mẫu huyết tương người bằng kỹ thuật LC-MS/MS chỉ có một công trìnhcông bố cho đến thời điểm hiện tại [32] Trong nước, vẫn chưa có công trình công bố vềphương pháp định lượng đồng thời metronidazol và spiramycin I trong huyết tương người.Thị trường Việt Nam hiện nay đang lưu hành dạng bào chế phối hợp metronidazol vàspiramycin với nhiều tên biệt dược khác nhau, được sản xuất trong nước với giá thành rẻhơn so với các thuốc ngoại nhập cùng hàm lượng Tuy nhiên, chế phẩm này chưa đượcđánh giá tương đương sinh học so với thuốc gốc Để đảm bảo chất lượng thuốc sản xuấttrong nước, các thuốc generic cần được chứng minh tính hiệu quả và an toàn trong điều trịqua thử nghiệm tương đương sinh học với thuốc gốc

Trang 11

Xuất phát từ những lý do trên, đề tài: “XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI METRONIDAZOL VÀ SPIRAMYCIN I TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI NGƯỜI BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG GHÉP KHỐI PHỔ (LC – MS/MS)” được thực hiện với các mục tiêu sau:

- Xây dựng quy trình định lượng đồng thời metronidazol và spiramycin I trong huyết tươngngười bằng kỹ thuật LC – MS/MS

- Thẩm định quy trình định lượng đồng thời metronidazol và spiramycin I trong huyếttương người bằng kỹ thuật LC – MS/MS theo hướng dẫn của US-FDA và EMA

Trang 12

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về metronidazol (MET)

1.1.1 Danh pháp, cấu trúc

- Cấu trúc hóa học:

Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của metronidazol

- Danh pháp IUPAC: (Metronidazol là 2-(2-methyl-5-nitro-1H-imidazol-1-yl)-ethanol

[1]

- Công thức phân tử: C6H9N3O3 [1]

- Khối lượng phân tử: 171,2 g/mol [1]

1.1.1 Tính chất lý hóa

- Metronidazol là bột kết tinh màu trắng hoặc hơi vàng hoặc gần như trắng, dễ hút ẩm [1]

- Tính chất: khó tan trong nước, aceton, ethanol 96% và methylen clorid [1]

- pKa = 2,5 [12]

- Điểm chảy: 159- 162 oC [12]

1.1.2 Cơ chế tác dụng và dược động học

1.1.2.1 Cơ chế tác dụng

Metronidazol là một dẫn chất 5-nitro imidazol, có phổ hoạt tính rộng trên động vật nguyên

sinh như amip, Giardia, Entamoeba histolytica, Trichomonas vaginalis và trên vi khuẩn

kỵ khí Trong ký sinh trùng, nhóm 5-nitro của thuốc bị khử thành các chất trung gian độcvới tế bào Các chất này liên kết với cấu trúc xoắn của phân tử DNA làm vỡ các sợi này vàcuối cùng làm tế bào chết Nồng độ trung bình có hiệu quả của metronidazol là 8 µg/mlhoặc thấp hơn đối với hầu hết các động vật nguyên sinh và các vi khuẩn nhạy cảm Nồng

độ ức chế tối thiểu các chủng nhạy cảm khoảng 0,5 µg/ml [2]

Metronidazol có tác dụng diệt khuẩn trên Bacteroides, Fusobacterium và các vi khuẩn kỵ

khí bắt buộc khác, nhưng không có tác dụng trên vi khuẩn hiếu khí Khi bị nhiễm cả vikhuẩn hiếu khí và kỵ khí, phải phối hợp metronidazol với các thuốc kháng khuẩn khác [2].

Trang 13

1.1.2.2 Dược động học

Metronidazol thường hấp thu nhanh và hoàn toàn sau khi uống Khoảng 80% liều được hấpthu từ đường tiêu hóa, đạt nồng độ đỉnh trong huyết tương (Cmax) khoảng 11,5 – 13,0 µg/mltrong vòng 1-3 giờ sau khi uống liều đơn 500 mg Khoảng 10 - 20% thuốc liên kết vớiprotein huyết tương Metronidazol thâm nhập tốt vào các mô và dịch cơ thể, vào nước bọt

và sữa mẹ Nồng độ điều trị cũng đạt được trong dịch não tủy Metronidazol chuyển hóa ởgan thành các chất chuyển hóa dạng hydroxy và acid, và thải trừ qua nước tiểu một phầndưới dạng glucuronid [2]

Thời gian bán thải trung bình trong huyết tương khoảng 7 giờ, đối với chất chuyển hóahydroxy là 9,5 - 19,2 giờ Sự bài tiết chủ yếu qua thận, chủ yếu là các chất chuyển hóahydroxy và khoảng 14% liều dùng thải trừ qua phân [2]

Các thông số dược động học của metronidazol, thuốc đối chứng Flagyl® 250 mg và thuốcthử Amin 250 mg [11] được trình bày trong bảng 1.1

Bảng 1.1 Các thông số dược động học của thuốc đối chứng và thuốc thử

Thử (TB ± SD) Đối chứng (TB ± SD)

Cmax (µg/ml) 9,99 ± 1,34 10,61 ± 1,43

Tmax (giờ) 2,17 ± 0,91 2,17 ± 0,86

t1/2(giờ) 9,15 ± 1,84 9,10 ± 0,64

Nồng độ đỉnh của metronidazol và spiramycin sau 2 giờ uống thuốc phối hợp metronidazol

và spiramycin (viên nén Rodogyl® và viên nghiên cứu chứa spiramycin 769.000 UI vàmetronidazol 128 mg trên người tình nguyện) lần lượt là 13,5 µg/ml và 1,06 µg/ml [31].Trên bệnh nhân viêm nha chu, sau 2 giờ uống viên nén Rodogyl® chứa spiramycin 739.000

UI và metronidazol 127,4 mg; nồng độ đỉnh của metronidazol và spiramycin lần lượt là11,8 µg/ml và 1,8 µg/ml [31]

Trang 14

Spiramycin III CO-CH2-CH3 C46H78N2O15 899,1

Danh pháp IUPAC: Spiramycin là một kháng sinh nhóm macrolid được tạo ra khi nuôi cấy

các chủng vi khuẩn Streptomyces ambofaciens hoặc thu được bằng các phương pháp khác Thành phần chính là (4R,5S,6S,7R,9R,10R, 11E,13E,16R)-6-[[3,6-dideoxy-4-O-(2,6- dideoxy-3-C-methyl--L-ribo-hexopyranosyl)-3-(dimethylamino)--D-

glucopyranosyl]oxy]-4-hydroxy-5-methoxy-9,16-dimethyl-7-(2-oxoethyl)-10-[[2,3,4,6-

tetradeoxy-4-(dimethylamino)-D-erythro-hexopyranosyl]oxy]-oxacy-clohexadeca-11,13-dien-2-on (spiramycin I) Ngoài ra còn có spiramycin II (4-O-acetyl spiramycin I) và

spiramycin III (4-O-propanoyl spiramycin I) [1].

Trang 15

vi khuẩn và ngăn cản vi khuẩn tổng hợp protein Ở những nơi có mức kháng thuốc rất thấp,

spiramycin có tác dụng kháng các chủng vi khuẩn Gram dương, các chủng Coccus như

Staphylococcus, Pneumococcus, Meningococcus, phần lớn chủng Gonococcus, 75% chủng Streptococcus và Enterococcus Các chủng Bordetella pertussis, Corynebacteria, Chlamydia, Actinomyces, một số chủng Mycoplasma và Toxoplasma cũng nhạy cảm với

spiramycin Spiramycin không có tác dụng với các vi khuẩn đường ruột Gram âm [2]

1.2.3.2 Dược động học

Spiramycin được hấp thu không hoàn toàn ở đường tiêu hóa Thuốc uống được hấp thukhoảng 20 - 50% liều sử dụng Nồng độ đỉnh trong huyết tương đạt được trong vòng 2 - 4giờ sau khi uống và có thể duy trì được 4 đến 6 giờ Nồng độ đỉnh trong huyết tương saukhi uống liều 6 triệu đơn vị spiramycin đạt được tương ứng là 3,3 µg/ml sau 1,5 – 3 giờ.Thức ăn làm giảm khoảng 70% nồng độ tối đa của thuốc trong huyết thanh và làm cho thờigian đạt đỉnh chậm 2 giờ Spiramycin phân bố rộng khắp cơ thể Nửa đời thải trừ trungbình là 5 - 8 giờ Thuốc thải trừ chủ yếu ở mật [2]

Các thông số dược động học của spiramycin được thống kê trên 10 người tình nguyện saukhi uống thuốc thử spiramycin 1,5 g (6 viên Rovanmycin 750000 IU của Rhone-PoulencRorer) [37] được trình bày trong bảng 1.2

Bảng 1.2 Các thông số dược động học của spiramycin

Thông số Thử (TB ± SD)

Cmax (µg/ml) 2,403 ± 1,004

Tmax (giờ) 2,726± 1,234

t1/2(giờ) 6,238 ± 2,811

Trang 16

1.3 Tổng quan về các chất dùng làm chuẩn nội

1.3.1 Roxithromycin (ROX)

Cấu trúc hóa học:

Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của roxithromycin

Danh pháp IUPAC: (3R,4S,5S,6R,7R,9R,11S,12R,13S, methyl-3-O-methyl--L-ribo-hexopyranosyl)oxy]-14-ethyl-7,12,13-trihydroxy-10-[(E)-[(2-

14R)-4-[(2,6-dideoxy-3-C-

methoxyethoxy)methoxy]imino]-3,5,7,9,11,13-hexomethyl-6-[[3,4,6-trideoxy-3-(dimethylamino)--D-xylo-hexapyranosyl]oxy] oxacyclotetradecan-2-on [1].

Công thức phân tử: C41H76N2O15 [1]

Khối lượng phân tử: 837,0 g/mol [1]

Roxithromycin có dạng bột kết tinh trắng, đa hình, rất khó tan trong nước, dễ tan trongaceton, ethanol 96% và methylen clorid, khó tan trong dung dịch acid hydrocloric loãng[1]

pKa = 9,08 (trong kiềm mạnh); pKa = 12,46 (trong acid mạnh) [38]

1.3.2 Tinidazol (TIN)

- Cấu trúc hóa học:

Hình 1.4 Cấu trúc hóa học của tinidazol

Trang 17

Danh pháp IUPAC: 1-[2-(ethylsulphonyl)ethyl]-2-methyl-5-nitro-1H-imidazol [1].

Công thức phân tử: C8H13N3O4S [1]

Tindazol có dạng bột kết tinh gần như trắng hoặc vàng nhạt, thực tế không tan trong nước,tan trong aceton và trong methylen clorid, hơi tan trong MeOH [1]

pKa = 4,7 [39] Điểm chảy: 127 - 128 °C [39]

1.3.3 Carbamazepin

Cấu trúc hóa học:

Hình 1.5 Cấu trúc hóa học của carbamazepin

Danh pháp IUPAC: 5H-dibenzo[b,f]azepin-5-carboxamid [1].

Công thức phân tử: C15H12N2O [1]

Carbamazepin có dạng kết tinh trắng hoặc gần như trắng, đa hình, rất khó tan trong nước,

dễ tan trong dicloromethan, hơi tan trong aceton và ethanol 96% [1]

pKa = 13,9 [40]

1.4 Tổng quan về sắc ký lỏng ghép khối phổ

Sắc ký lỏng ghép khối phổ LC-MS/MS là kỹ thuật phân tích kết hợp khả năng tách của sắc

ký lỏng với khả năng phân tích khối lượng của máy khối phổ LC-MS/ MS đã được ứngdụng thành công trong phân tích các dược chất, nội tiết tố, độc chất và chất chuyển hóa…LC-MS/MS mang đến những đột phá lớn trong lĩnh vực phân tích định lượng trong dịchsinh học do tính đặc hiệu, độ nhạy cao và thời gian phân tích nhanh Ngoài ra, LC-MS/MScũng được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác như mỹ phẩm, môi trường, thựcphẩm…

Trang 18

mm đến 250 mm và hạt có kích thước từ 1,5 μm đến 5 μm Sự phân tách xảy ra dựa trên

sự tương tác của mẫu với pha động và pha tĩnh Sắc ký lỏng tách các thành phần của mẫudựa trên sự khác biệt về tính phân cực của chất đó đối với pha tĩnh hoặc pha động [28]

1.4.2 Đầu dò khối phổ hai lần tứ cực

1.4.2.1 Bộ phận ion hóa phun điện (Electrospray ionization - ESI)

ESI là một kỹ thuật ion hóa được ứng dụng cho những hợp chất kém bền nhiệt, phân cực,

có khối lượng phân tử lớn Kỹ thuật ESI có khả năng tạo thành những ion nhiều điện tích(dương hoă ̣c âm, tùy vào cực điê ̣n thế) [3]

Trong kỹ thuật ESI, dung dịch phân tích được phun ra khỏi đầu mao quản vào vùng có điệntrường mạnh 3-6 kV ở áp suất khí quyển Dưới ảnh hưởng của điê ̣n thế cao, ta ̣i đầu ốngdẫn mao quản bằng thép không rỉ (có đường kính 0,1 – 0,5 mm), mẫu được phun thànhnhững hạt sương nhỏ mang điện tích (dương hay âm) bị bay dung môi dần nhờ dòng khíxung quanh Các giọt sương càng xa đầu phun càng có kích thước nhỏ và bị hút vào bộphân tích khối lượng [3],[18]

Bình chứa pha động

Cột HPLC

Xử lýdữ liệu liệu

Bộ phận tiêm mẫu Bơm

Trang 19

10Những phân tử nhỏ (khoảng dưới 500 Da) có một nhóm chức có khả năng mang điện tích,

sẽ nhận một proton để tạo thành ion phân tử [M+H]+ khi nguồn ion hoạt động ở chế độ iondương hoặc cho một proton để tạo thành ion phân tử [M-H]- khi ở chế độ ion âm Khi có

sự hiện diện của muối (như muối natri, kali, format, acetat, …), sẽ tạo các ion phân tử như[M+Na]+, [M+K]+, [M+format]-, [M+acetat]-…Với những phân tử lớn hơn, có thể có nhiềutâm nhận ion, ESI sẽ tạo ra những ion phân tử mang điện tích như [M+2H]2+, [M+3H]3+[18]

Hình 1.7 Sơ đồ ta ̣o thành ion dương trong kỹ thuật ESI

(Nguồn: http:// pubs.acs.org/ac)

1.4.2.2 Bộ phận phân tích khối 2 lần tứ cực

Máy khối phổ hai lần liên tiếp (MS/MS) gồm hai tứ cực được ghép như hình 1.8

Bộ phận phân tích khối phổ

Dung dịch chất phân tích

Trang 20

Hình 1.8 Sơ đồ khối của đầu dò khối phổ hai lần tứ cực

(Nguồn: https://repositorio.uam.es/bitstream/handle/10486/677482/wojnicz_aneta.pdf?sequence=1)

1 Nguồn ion hóa 2a Bộ phận phân tích khối thứ nhất (Q1), 2b Buồng va chạm (Q2) 2c

Bộ phân phân tích khối thứ hai (Q3) 3 Bộ phận phát hiện (detector)

Máy khối phổ tứ cực hoạt động như một bộ lọc khối Mỗi tứ cực có một chức năng riêng.Đầu tiên tứ cực thứ nhất (Q1) chọn khảo sát một ion cụ thể (ion mẹ) cho vào Q2 là buồng

va chạm (collison cell) với dòng khí trơ (argon) để phân mảnh Các ion trong buồng vachạm được tăng tốc nhờ áp điện thế, tạo ra năng lượng va chạm Nhờ va chạm, các ionđược gia tốc cùng với các phân tử khí trơ để tạo phân mảnh nhỏ Quá trình này được gọi làphân mảnh do va chạm Các mảnh ion được tạo ra ở buồng va chạm được phân tích trong

tứ cực thứ hai (Q3) và đến đầu dò [15],[19]

1.4.2.3 Một số kỹ thuật ghi phổ

a Kỹ thuật full scan

Đây là phương pháp quét dãy khối trong khoảng thời gian nhất định, đầu dò sẽ nhận đượctất cả các mảnh ion để cung cấp phổ khối tất cả ion của các chất trong suốt quá trình phântích Việc tìm hợp chất quan tâm có thể khó khăn vì nhiều hợp chất có cùng số khối Phươngpháp này chủ yếu được sử dụng để phân tích định tính [18]

Trang 21

b Kỹ thuật SIM (Selected ion monitoring)

Trong kỹ thuật SIM, đầu dò MS chỉ ghi nhận tín hiệu một số mảnh ion đặc trưng cho chấtcần xác định Kỹ thuật SIM chỉ cho tín hiệu của các ion đã được lựa chọn trước đó, nên kỹthuật SIM được sử dụng để phân tích định lượng [18]

c Kỹ thuật SRM (Selected Reaction Monitoring) và MRM (Multiple Reaction Monitoring)

Kỹ thuật SRM: chọn ion mẹ mong muốn (Q1), sau đó phân mảnh ion được chọn đó trong

buồng va chạm, trong các mảnh ion sinh ra, chỉ chọn 1 mảnh ion con cần quan tâm (Q3)

và đưa vào đầu dò để phát hiện [41]

Kỹ thuật MRM: có hiệu quả trong việc phân tích vi lượng trong nền mẫu phức tạp, các ion

con cần quan tâm thường từ 2 trở lên Đầu tiên, chọn ion mẹ trong tứ cực thứ nhất (Q1),sau đó phân mảnh ion được chọn đó trong buồng va chạm Trong các mảnh ion sinh ra,chọn hai hoặc nhiều mảnh ion con cần quan tâm (Q3) và đưa vào đầu dò để phát hiện Kỹthuật MRM có độ đặc hiệu và độ nhạy cao nên được sử dụng để phân tích định lượng [15]

Hình 1.9 Các chế độ làm việc của MS/MS

(Nguồn: https://repositorio.uam.es/bitstream/handle/10486/677482/wojnicz_aneta.pdf?sequence=1)

KHÔNG Phân mảnh

Phân mảnh

Chọn ion mẹ và các ion con Chế độ

Chọn tất cả ion con

Chế độ

PRODUCT-ION

Chọn ion mẹ Chế độ

Tất cả các ion mẹ

m/z

Chế độ 1:

MS2-SCAN

SIM SCAN

Q3

SIM SIM

Trang 22

1.4.3 Hệ thống sắc ký lỏng ghép nối với đầu dò khối phổ 2 lần tứ cực (LC-MS/MS)

Việc ghép hệ thống LC với MS không thể thực hiê ̣n trực tiếp được vì muốn đo khối phổ

cần phải ta ̣o ra các ion ở thể khí, trong khi đó sắc ký lỏng thường được áp du ̣ng cho những

hợp chất ít bay hơi Vấn đề còn phức ta ̣p hơn khi hợp chất ra khỏi cô ̣t sắc ký đang trongpha đô ̣ng lỏng, cần phải loa ̣i bỏ dung môi trước khi đưa vào máy khối phổ

Sự không tương thích cơ bản giữa hai hệ thống là:

- Hệ thống khối phổ hoa ̣t đô ̣ng trong điều kiê ̣n chân không sâu, nhiê ̣t đô ̣ cao, chất khảo sátphải ở thể khí, vâ ̣n tốc dòng chảy nhỏ (vài µl/phút)

- Hệ thống sắc ký lỏng hoa ̣t đô ̣ng trong điều kiê ̣n áp suất cao, nhiê ̣t đô ̣ tương đối thấp, cácchất khảo sát ở thể lỏng, vâ ̣n tốc dòng chảy tương đối lớn (vài trăm microlit/phút) so vớivận tốc dòng chảy của hệ MS

Để khắc phu ̣c những khó khăn trên, cần phải sử dụng giao diê ̣n (interface) là các bộ phậnion hóa Có nhiều loa ̣i giao diê ̣n khác nhau như: ion hóa bằng bắn phá điện tử (EI), ion hóahóa học (CI), ion hóa bắn phá nhanh nguyên tử dòng liên tu ̣c (CF – FAB), ion hóa phunđiện (ESI), ion hóa hóa ho ̣c ở áp suất khí quyển (APCI), ion hóa trường (FI), … Tùy thuô ̣c

vào khối lượng phân tử và đă ̣c tính (phân cực hay không phân cực) của các chất phân tích

mà có thể sử du ̣ng hệ thống LC– MS/MS với các giao diê ̣n khác nhau Giao diện thôngdụng cho hệ thống LC-MS/MS là ESI và APCI [3]

1.4.4 Vài nét về máy Shimadzu LCMS-8040

Thiết bị LC-MS/MS 8040 của hãng Shimadzu bao gồm hai hệ thống sau [42]:

Hệ thống sắc ký lỏng: Dung môi được đưa vào hệ thống bằng bộ phận bơm áp suất cao,

sau đó bộ phận tiêm mẫu tự động có nhiệm vụ hút mẫu cần phân tích cho vào hệ thống,mẫu được phân tách khi đi qua cột

Trang 23

Sau cùng được phát hiện bởi đầu dò.

- Các tín hiệu ion được khuếch đại bởi bộ khuếch đại, sau đó được ghi nhận tín hiệu và xử

lý bằng phần mềm xử lý dữ liệu Labsolution

3 10

Q1Ion không cộng hưởng

Khí nitơ

Bộ phậnphun sương

Ống mao quản

Buồng chânkhông

Q1

Chọn ionmẹ(parent ion)

Bộ phậnphát hiện

Buồng va chạm(Collision Cell)

Q3

Chọn ion con(product ion)

1.5.1.1 Phương pháp kết tủa protein (PPT)

Đây là phương pháp chuẩn bị mẫu chung, đơn giản để làm sạch mẫu và cắt đứt liên kết củathuốc với protein Tủa protein với các tác nhân khác nhau (dung môi hữu cơ, acid mạnh,muối) Tính tan của protein phụ thuộc vào tương tác với dung dịch nước, tương tác ion với

Trang 24

15muối, lực đẩy tĩnh điện giữa các phân tử mang điện Tại điểm đẳng điện, protein khôngmang điện, protein ít tan trong nước; trên điểm đẳng điện, protein tích điện âm; dưới điểmđẳng điện, protein tích điện dương PPT là phương pháp nhanh, đơn giản hơn so với phươngpháp chiết lỏng - lỏng (LLE) và chiết pha rắn (SPE) [30],[33].

Tủa protein bằng các dung môi hữu cơ như ACN, MeOH, ethanol, ACN là dung môiđược lựa chọn đầu tiên để tủa protein do có khả năng tủa hoàn toàn protein với tỷ lệ dungmôi thấp MeOH được chọn làm dung môi tủa sau ACN Tủa bằng các muối vô cơ như

kẽm sulfat 10%, amoni sulfat bão hòa,…các dung dịch acid như acid tricloroacetic 10%(kl/tt), acid phosphoric 5% Sau khi ly tâm, dịch ly tâm được lọc, tiêm trực tiếp vào hệthống sắc ký hay bốc hơi và hòa tan lại trong pha động trước khi tiêm [30],[33]

1.5.1.2 Phương pháp chiết lỏng - lỏng (LLE)

Chiết lỏng – lỏng là phương pháp dựa trên sự phân bố của chất hòa tan trong hai dung môikhông hỗn hòa vào nhau Sự phân bố của các chất phụ thuộc vào độ tan của chúng trongcác dung môi khác nhau Phương pháp chiết lỏng – lỏng sử dụng trong phân tích dịch sinhhọc giúp tách các chất phân tích ra khỏi những chất gây nhiễu có trong nền mẫu sinh học.Chất phân tích được tách ra khỏi mẫu bằng các dung môi hữu cơ sẽ được bay hơi dungmôi, cắn được hòa tan trong thể tích dung môi thích hợp (có thể là pha động) Phương phápcho khả năng thu hồi tốt nhờ chiết liên tục nhiều lần [33]

1.5.1.3 Phương pháp chiết pha rắn (SPE)

Chiết pha rắn là phương pháp xử lý mẫu được sử dụng rộng rãi nhất trong việc phân tíchcác thuốc và các chất chuyển hóa trong dịch sinh học SPE thường dùng những ống nhựanhỏ sử dụng một lần, có chứa chất rắn được nhồi Có nhiều dạng chất rắn như: chất liênkết pha đảo, pha thuận, trao đổi ion và chất hấp phụ Sự hấp phụ dựa trên tương tác giữachất phân tích và chất hấp phụ Chất phân tích sẽ được rửa giải khỏi cột trong khi các tạpchất được giữ lại trên cột, hoặc chất phân tích được giữ lại trên cột còn tạp chất bị rửa rakhỏi cột Cách thứ nhất được lựa chọn khi có một chất phân tích mong muốn có nồng độcao trong mẫu, hoặc nhiều chất cần phân tích quan tâm có nồng độ thấp hoặc có nhiều chấtvới độ phân cực khác nhau cần được tách ra khỏi hỗn hợp Cách thứ hai dùng để làm giàumẫu trong phân tích vết, nồng độ mẫu thấp Đối với những nền mẫu phức tạp có thể sửdụng cả hai phương pháp để tách nhiều chất khác nhau Ưu điểm của phương pháp chiết

Trang 25

16pha rắn là lượng dung môi hữu cơ sử dụng ít hơn so với chiết lỏng - lỏng Phương pháp có

độ thu hồi và độ lặp tốt, có thể tự động hóa, tuy nhiên khá đắt tiền và tốn kém [33]

1.6 Thẩm định quy trình định lượng thuốc trong dịch sinh học theo US-FDA và EMA

1.6.1 Các chỉ tiêu thẩm định và mức yêu cầu

1.6.1.1 Tính phù hợp hệ thống

Kiểm tra tính phù hợp hệ thống để đảm bảo các thiết bị có khả năng cho kết quả chính xác

và đáng tin cậy tại thời điểm sử dụng.Tiêu chí chấp nhận: hệ số đối xứng, độ phân giải,thời gian lưu, tỷ số diện tích pic chất phân tích/chuẩn nội Sự phù hợp của hệ thống đượcđánh giá trước khi phân tích mẫu Mẫu dùng kiểm tra tính phù hợp với hệ thống phải khác

tính phù hợp của hệ thống trước khi tiến hành phân tích [6],[10],[13],[43]

1.6.1.2 Tính đặc hiệu

Tính đặc hiệu của một quy trình phân tích là khả năng có thể phân biệt và xác định chínhxác và đặc hiệu chất phân tích trong nền mẫu gồm nhiều thành phần khác nhau Để xácđịnh tính đặc hiệu, tiến hành phân tích các mẫu trắng (huyết tương, nước tiểu hoặc các nềnmẫu sinh học khác) từ ít nhất 6 lô khác nhau Mỗi mẫu trắng phải được kiểm tra về sự nhiễu

và tính chọn lọc ở giới hạn định lượng dưới (LLOQ) [13]

Các chất gây nhiễu trong dịch sinh học gồm các chất nội sinh, các chất chuyển hóa, các sảnphẩm phân hủy hay các thuốc dùng đồng thời với thuốc đang nghiên cứu

Nếu phương pháp định lượng đồng thời nhiều chất phân tích, mỗi chất phân tích phải đượckiểm tra để đảm bảo không có sự nhiễm chéo [13]

1.6.1.3 Hiệu suất chiết (tỷ lệ thu hồi)

Hiệu suất chiết của chất phân tích trong quy trình định lượng là đáp ứng của đầu dò ghinhận được từ một lượng chất phân tích thêm vào và chiết ra trong nền mẫu dịch sinh học,được so với đáp ứng của đầu dò ghi nhận nồng độ thực của chất phân tích trong dung môipha mẫu Lượng thu hồi là hiệu suất chiết của phương pháp phân tích Tỷ lệ thu hồi củachất phân tích không đòi hỏi 100% nhưng khoảng thu hồi của chất phân tích và chuẩn nộiphải ổn định, chính xác và có tính tái lặp [13]

Trang 26

17Tiến hành xác định tỷ lệ thu hồi bằng cách so sánh kết quả phân tích của mẫu chiết được

từ mẫu tự tạo ở 3 mức nồng độ LQC, MQC và HQC với kết quả của mẫu chuẩn khôngchiết được pha trong dung môi pha mẫu (đại diện cho tỷ lệ thu hồi 100%) [13]

1.6.1.4 Đường chuẩn và khoảng tuyến tính

Đường chuẩn thể hiện mối quan hệ định lượng giữa đáp ứng của đầu dò và các nồng độbiết trước của chất phân tích Để xây dựng đường chuẩn cho trường hợp có nhiều chất phântích, mỗi chất phân tích phải xây dựng một đường chuẩn, các mẫu thuộc đường chuẩn phảiđược chuẩn bị trên cùng một loại nền mẫu dịch sinh học như mẫu thử trong nghiên cứubằng cách thêm chất phân tích biết trước nồng độ vào nền mẫu Nồng độ của chất đối chiếudùng trong đường chuẩn phải dựa trên khoảng nồng độ định lượng thực tế trong nghiêncứu cụ thể [10],[13]

Các điểm của đường chuẩn bao gồm ít nhất từ 6 đến 8 mẫu với nền mẫu được xử lý gồm

có chất phân tích và chuẩn nội, mẫu trắng là mẫu huyết tương được xử lý không có chấtphân tích và không có chuẩn nội, mẫu “không” là mẫu huyết tương trắng được xử lý cóchuẩn nội Các mẫu chuẩn phải phủ được khoảng nồng độ cần định lượng Đường chuẩngồm mẫu có nồng độ tại giới hạn định lượng dưới (LLOQ) [10],[13]

Các đường chuẩn xây dựng (ít nhất là 3) phải được báo cáo trong quá trình thẩm định [10].Tiến hành thẩm định phương pháp phải gồm tối thiểu sáu điểm của đường chuẩn được thựchiện trong một số ngày, với ít nhất bốn nồng độ (bao gồm LLOQ, LQC, MQC và HQC)được phân tích hai lần trong mỗi lần thử nghiệm [13]

Mẫu kiểm tra (QC)

Phải kết hợp ít nhất ở ba mức nồng độ kiểm tra (QC) tiêm hai lần cho mỗi lần thử nghiệm,bao gồm nồng độ thấp (LOQ), nồng độ trung bình (MQC), nồng độ cao (HQC) trongkhoảng nồng độ nghiên cứu xây dựng [13]

Trang 27

18Các mẫu của đường chuẩn và mẫu kiểm (QC) được chuẩn bị từ các dung dịch chuẩn gốcriêng biệt, phải báo cáo về độ chính xác và độ đúng [13].

Điểm của đường chuẩn ở nồng độ LLOQ có yêu cầu độ lệch không quá 20% so với nồng

độ lý thuyết và không quá 15% ở các nồng độ khác [13]

Tiến hành xác định độ chính xác trong ngày và độ chính xác khác ngày để xem xét độ lặplại của phương pháp theo thời gian và ảnh hưởng do các yếu tố về kiểm nghiệm viên, thiết

bị, hóa chất, thuốc thử và phòng thí nghiệm [13]

Khi nồng độ mẫu thử cao hơn giới hạn định lượng trên của đường chuẩn thì phải được phaloãng Độ đúng và độ chính xác của các mẫu pha loãng cũng cần được tiến hành thẩm định[13]

1.6.1.6 Giới hạn định lượng dưới

Điểm thấp nhất của đường chuẩn phải được xem là giới hạn định lượng dưới (LLOQ) nếuđáp ứng LLOQ ít nhất gấp 5 lần so với đáp ứng của mẫu trắng và đỉnh chất phân tích LLOQphải phân biệt rõ ràng, tách riêng biệt, có tính tái lặp Nồng độ tìm lại LLOQ có độ chính

Trang 28

19xác không vượt quá 20% và đạt độ đúng ± 20% so với nồng độ lý thuyết LLOQ phải đượcthực hiện ít nhất 5 mẫu [10].

1.6.1.7 Độ ổn định của mẫu

Độ ổn định hóa học của thuốc trong nền mẫu được chọn dưới điều kiện cụ thể trong khoảngthời gian qui định được đánh giá bằng một số phương pháp Đánh giá sự ổn định bao gồmbản quản mẫu thử tại một số điều kiện bảo quản trong suốt quá trình nghiên cứu, gồm điềukiện bảo quản tại vị trí lâm sàng, trong quá trình gửi mẫu và tại các vị trí liên quan khác[13]

Độ ổn định của thuốc trong dịch sinh học phụ thuộc vào điều kiện bảo quản, tính chất hóa

lý của chất phân tích, nền mẫu chứa thuốc và bao bì Độ ổn định của chất phân tích trongnền mẫu và bao bì cụ thể không thể ngoại suy áp dụng cho nền mẫu và bao bì khác [13].Phép thử độ ổn định của chất phân tích phải bao gồm đánh giá độ ổn định trong suốt quátrình từ thu thập mẫu, bảo quản, rã đông, đánh giá sự ổn định ngắn hạn (để ở điều kiệnphòng thí nghiệm, ở nhiệt độ phòng), độ ổn định dài hạn (trữ đông ở nhiệt độ mong muốn),

độ ổn định sau các chu trình đông- rã đông và độ ổn định của quy trình phân tích mẫu [13].Điều kiện thử nghiệm độ ổn định phải phản ánh được tình trạng tương tự diễn ra trong suốtquá trình xử lý mẫu và phân tích mẫu thật Nếu điều kiện bảo quản mẫu trong suốt quátrình phân tích mẫu nghiên cứu có thay đổi trong lúc thẩm định phương pháp, thì phải thiếtlập đánh giá độ ổn định ở điều kiện mới [13]

Quy trình thẩm định phải bao gồm đánh giá sự ổn định của hoạt chất trong dung dịch chuẩngốc do các mẫu định lượng trong khảo sát độ ổn định được pha loãng từ một dung dịch gốc(và pha ngay trước khi phân tích) trong dịch sinh học không được có chất gây nhiễu vàkhông có mặt của chất cần phân tích Dung dịch chuẩn gốc khảo sát độ ổn định cần đượcpha trong dung môi thích hợp và có nồng độ biết trước Mẫu khảo sát độ ổn định phải được

so sánh với đường chuẩn hay mẫu kiểm tra (QC) được pha mới ngay trước khi phân tích.Tiêm ít nhất ba lần lặp lại ở mỗi nồng độ thấp và cao Kết quả mẫu thử độ ổn định phảinằm trong khoảng ± 15% nồng độ lý thuyết [13]

a Độ ổn định dung dịch gốc

Độ ổn định dung dịch chuẩn gốc và chuẩn nội phải được đánh giá Khi dung dịch chuẩngốc tồn tại ở trạng thái khác (dạng dung dịch, rắn) Dữ liệu độ ổn định của dung dịch chuẩn

Trang 29

20gốc phải được xây dựng để xác định khoảng thời gian ổn định của dung dịch chuẩn gốc khibảo quản [13].

b Độ ổn định trong huyết tương

- Độ ổn định ngắn hạn: Thực hiện trên 3 mẫu khác nhau ở mỗi nồng độ cao và thấp, sau

khi rã đông ở nhiệt độ phòng, giữ ở nhiệt độ phòng từ 4 – 24 giờ và được phân tích Nênthiết kế và tiến hành giống điều kiện xử lý tại phòng thí nghiệm cho các mẫu nghiên cứu[13]

- Độ ổn định dài hạn: Thời gian thử độ ổn định dài hạn phải được đánh giá là tương đương

hoặc dài hơn thời gian tính từ ngày đầu tiên lấy mẫu đến ngày phân tích mẫu cuối cùng

Độ ổn định dài hạn được xác định bằng cách bảo quản ít nhất 3 mẫu ở hai nồng độ thấp vàcao Thể tích mẫu phải đủ cho phân tích trong 3 lần khác nhau, nồng độ của mẫu sau mỗilần xác định được so sánh với giá trị trung bình của nồng độ ở ngày bắt đầu thử nghiệm độ

ổn định dài hạn [13]

- Độ ổn định đông và rã đông: Độ ổn định của chất phân tích được xác định sau 3 chu kỳ

đông và rã đông Thực hiện ít nhất 3 mẫu ở hai nồng độ cao và thấp được làm lạnh ở nhiệt

độ bảo quản dự kiến trong 24 giờ và rã đông ở nhiệt độ phòng, khi rã đông hoàn toàn cácmẫu được làm đông trở lại trong vòng 12 – 24 giờ giống lần đầu, sau 3 chu kỳ như thế mẫuđược đem đi phân tích Nếu mẫu phân tích không ổn định ở nhiệt độ dự kiến thì phải bảoquản ở nhiệt độ -70 oC Trong quá trình đánh giá độ ổn định đông - rã đông, nên tiến hành

ở điều kiện bảo quản mẫu dự kiến giống với điều kiện phân tích mẫu [13]

- Độ ổn định sau khi xử lý mẫu (trong bộ phận tiêm mẫu tự động): Độ ổn định của mẫu đã

xử lý là độ ổn định sau khoảng thời gian từ khi đã xử lý xong đến lúc phân tích, thời gianchờ ở bộ phận tiêm mẫu tự động Độ ổn định của chất phân tích và chuẩn nội phải đượcđánh giá qua thời gian này bằng cách so sánh với nồng độ ban đầu sau khi xử lý với nồng

độ sau một thời gian bảo quản ở nhiệt độ phòng [13]

1.6.1.8 Ảnh hưởng của nền mẫu và lượng mẫu tồn dư (sample carry over)

Trong trường hợp sử dụng kỹ thuật LC-MS/MS, hướng dẫn US-FDA 2018 đề cập xem xét

sự thay đổi của nền mẫu, bảo đảm phương pháp phân tích không bị ảnh hưởng của nềnmẫu, đạt yêu cầu về tính đặc hiệu và độ nhạy trong quá trình thẩm định phương pháp [13].

Trang 30

21Trong hướng dẫn của EMA 2015 có qui định rõ việc thẩm định ảnh hưởng của nền mẫu vàlượng mẫu tồn dư.

- Ảnh hưởng của nền mẫu: Khi sử dụng kỹ thuật khối phổ phải khảo sát ảnh hưởng của nền

mẫu, sử dụng ít nhất 6 lô mẫu nền khác nhau Với mỗi chất phân tích và IS, yếu tố nền mẫu(MF) được tính toán cho từng lô mẫu nền bằng cách lập tỷ số diện tích pic của chất phântích có trong nền mẫu (định lượng chất phân tích được thêm vào nền mẫu sau khi chiết hoạtchất) với diện tích pic khi không có mặt chất phân tích trong nền mẫu (chất phân tích phatrong dung môi pha mẫu) Tỷ số MF của chuẩn nội IS cũng phải được tính với CV tính từ

6 lô mẫu huyết tương trắng không được quá 15% Tiến hành phân tích ở nồng độ thấp(LQC) và nồng độ cao (HQC) Đánh giá ảnh hưởng của nền mẫu MF bằng cách phân tíchkhông ít hơn 6 lô mẫu nền khác nhau được thêm chất phân tích vào Báo cáo thẩm địnhphải gồm diện tích pic của chất phân tích và chuẩn nội (IS) Nồng độ được tính toán chomỗi mẫu độc lập Giá trị CV tính cho mỗi nồng độ không được quá 15% [10]

- Lượng mẫu tồn dư (sample carry over): Lượng mẫu tồn dư phải được xem xét trong quá

trình xây dựng phương pháp Trong quá trình thẩm định, lượng mẫu tồn dư được đánh giábằng cách tiêm mẫu trắng ngay sau khi tiêm mẫu có nồng độ cao hoặc giới hạn định lượngtrên của đường chuẩn (ULOQ) Lượng mẫu tồn dư không được quá 20% ở giới hạn địnhlượng dưới (LLOQ) và 5% cho chuẩn nội (IS) [10]

1.6.1.9 Độ pha loãng

Việc pha loãng mẫu không được ảnh hưởng đến độ đúng và độ chính xác Pha loãng mẫu

từ nền mẫu được thêm chất phân tích có nồng độ cao hơn ULOQ và pha loãng mẫu vớimẫu huyết tương trắng (thực hiện không ít hơn năm mẫu để xác định cho mỗi hệ số phaloãng) Độ đúng và độ chính xác nằm trong khoảng ± 15% [10],[13]

Trang 31

1.6.2 So sánh hướng dẫn của US-FDA 2018 và EMA 2015

Bảng 1.4 So sánh hướng dẫn US-FDA 2018 và EMA 2015

và độ nhạy

Đường chuẩn trong dịchsinh học được so sánh vớiđường chuẩn trong dungmôi pha mẫu

Tỷ số diện tích pic củachất phân tích trong nềnmẫu đã được xử lý vớidiện tích pic của chấtphân tích trong dungmôi pha mẫu

10 Ảnh hưởng mẫu tồn dư

(Sample Carryover)

Hướng dẫn US-FDA năm 2018 [13]

Xây dựng phương pháp phân tích trong dịch sinh học bao gồm tối ưu hóa các quy trình vàđiều kiện liên quan đến việc xử lý mẫu và phát hiện các chất phân tích Các thông số tối ưutrong phân tích dịch sinh học: chất chuẩn, thuốc thử, đường chuẩn, mẫu kiểm tra (QC), tínhchọn lọc và độ đặc hiệu, độ nhạy, độ đúng, độ chính xác, tỷ lệ thu hồi, độ ổn định của chấtphân tích trong nền mẫu

Trang 32

23Những điểm cần lưu ý trong hướng dẫn:

- Chất chuẩn và thuốc thử phải được mô tả và lưu hồ sơ về định tính, độ tinh khiết và độ

ổn định Các chất chuẩn đối chiếu có chứng nhận phân tích (CoA) bao gồm nguồn gốc, số

lô và hạn sử dụng

- Hiệu suất chiết không đòi hỏi 100% mà phải ổn định và có tính lặp lại

- Độ nhạy là điểm thấp nhất của đường chuẩn (LLOQ), đáp ứng của chất phân tích tạiLLOQ có tín hiệu ít nhất gấp 5 lần đáp ứng tín hiệu của mẫu nền

- Nếu phương pháp có định lượng mẫu được pha loãng, phải xem xét tính toàn vẹn của cácdung dịch pha loãng trong quá trình thẩm định bằng cách pha loãng mẫu kiểm tra (QC) cónồng độ cao hơn giới hạn định lượng trên (ULOQ) trong khoảng nồng độ định lượng Cácmẫu QC pha loãng phải đạt độ đúng và độ chính xác trong giới hạn cho phép

- Ảnh hưởng của nền mẫu không có hướng dẫn chỉ tiêu cụ thể, nhưng bảo đảm phươngpháp phân tích không bị ảnh hưởng của nền mẫu, đạt yêu cầu về tính đặc hiệu và độ nhạy

- Lượng mẫu tồn dư (nếu có) phải được đánh giá

Hướng dẫn EMA năm 2015 [10]

So sánh với quy định của US-FDA, quy định EMA 2015 có vài điểm khác biệt như sau[10]:

- Trong phương pháp sắc ký với đầu dò khối phổ phải thẩm định chỉ tiêu ảnh hưởng nềnmẫu

- Không đề cập đến hiệu suất chiết của phương pháp

Trang 33

1.7 Một số công trình nghiên cứu định lượng metronidazol và spiramycin trong huyết tương người bằng kỹ thuật sắc ký lỏng Bảng 1.5 Một số công trình nghiên cứu định lượng metronidazol và spiramycin trong huyết tương người

Hoạt

nội (IS)

Tài liệu tham khảo

MET và

SPY I LC-MS/MS

500 µl HT + 50 µl chuẩn nội + 50 µl NaOH 0,1 N + 1 ml đệm pH 9 + 6 ml ethyl acetat

- Lắc xoáy, sau đó ly tâm trong 5 phút với tốc độ 3500 vòng/phút ở 4 o C

- Dịch ly tâm được bay hơi dung môi bằng dòng khí nitơ ở 40 o C

- Cắn được hòa tan vào 600 µl ACN + 3,4 ml dung dịch acid formic 0,1% và tiến hành sắc ký

Kromsil C18 (150 × 4,6 mm; 5 µm)

- A: acid formic 0,1%

với ACN-nước (15:85, tt/tt); - B: acid formic 0,1% với ACN-nước (50:50, tt/tt)

- Rửa giải gradient

ACN (85:15, tt/tt) Tinidazol [29]

MET LC-MS/MS

- 250 µl HT + 50 µl chuẩn nội, lắc xoáy 30 giây

- Thêm 3 ml ethyl acetat, lắc xoáy 60 giây

- Ly tâm trong 10 phút với tốc độ 3500 vòng/phút, bay hơi dung môi bằng dòng khí N 2 ở 40 o C

- Hòa tan cắn trong 300 µl pha động và tiến hành sắc ký

C18 (150 x 4,6 mm; 5 µm)

ACN – amoni acetat 10

mM (80:20, tt/tt) Zidovudin [34]MET HPLC-UV(324 nm) Tủa protein với 50 µl ZnSO 4 10% (300 x 4,6 mm; 5 µm)Bondapal phenyl ACN – KHpH 4,5 (5:95, tt/tt)2PO4 0,1 M Ranitidin [17] MET và 5

kháng

sinh khác

LC-MS/MS

- 200 µl IS + 45 µl HT + 5 µl dimethyl sulfoxid, lắc xoáy 15 phút

- Ly tâm trong 10 phút với tốc độ 15600 vòng/phút ở 4 o C

- Lọc qua màng lọc 0,22 µm và tiến hành sắc ký (IS: dicloxacillin 1,0 mg/ml, pha trong dimethyl sulfoxid, hút 0,3 ml pha loãng thành 100 ml trong ACN)

Aquasil C18 (50 x 2,1 mm; 5 µm)

omeprazol

HPLC-UV (254 nm) Chiết pha rắn, cột SPE C 2 , 500 mg

Omni Pax 500 (chứa 2 pha tĩnh: trao đổi anion và pha đảo)

MeOH – ACN NaHPO 4 0,1 M (20:20:60) pH 7

Polaris C18 (150 x 3,0 mm; 5 µm)

- 500 µl HT + 100 µl chuẩn nội (ROX) + 100 µl NaOH 0,1 M; lắc xoáy 30 giây

- Thêm 3 ml hỗn hợp cloroform-ethyl acetat (1:2), lắc xoáy 3 phút, ly tâm trong 3 phút với tốc

độ 3000 vòng/phút ở 4 o C

- Dịch ly tâm được bay hơi dung môi bằng cách thủy ở 30 o C

- Cắn được hòa tan vào 200 µl ACN và tiến hành sắc ký

Chromatorex ODS (150 x 4,6 mm; 5 µm)

(Amoni acetat 0,1% + acid acetic 0,15% ) - ACN (60:40)

Roxithromycin [23]

Trang 34

Nhận xét

- Các công trình nghiên cứu đã ứng dụng kỹ thuật HPLC-UV hoặc LC-MS/MS Sử dụng kỹthuật HPLC phù hợp với điều kiện có sẵn tại phòng kiểm nghiệm và tính chất của chất cầnphân tích Ưu điểm của phương pháp LC-MS/MS là giới ha ̣n phát hiê ̣n thấp nên được áp dụng

để định lượng các chất có hàm lượng thấp trong nền mẫu phức ta ̣p Hơn nữa, kỹ thuật MS/MS có thể đi ̣nh tính nhanh chóng, dựa trên cơ sở dữ liê ̣u phổ có sẵn, độ đặc hiệu cao dotính phân mảnh riêng, định lượng đồng thời các chất có thời gian lưu giống nhau, thời gianphân tích nhanh, giảm tiêu tốn dung môi

LC Các nghiên cứu trên đã áp dụng nhiều phương pháp xử lý mẫu huyết tương như phương phápkết tủa protein (PPT) dùng tác nhân gây tủa protein như ACN Sử dụng dung môi phù hợp vớitính tan của spiramycin và metronidazol nhưng gây tủa protein Đây là cách đơn giản và hiệuquả để loại bỏ protein Phương pháp tủa protein đơn giản, thao tác nhanh chóng, ít độc ha ̣i môitrường, ít hao tốn dung môi, ít tốn thời gian, nhưng mẫu sau xử lý bị pha loãng nhiều, ít tinhkhiết hơn, không thích hợp với hoạt chất có nồng độ thấp trong huyết tương với dung môi hữu

cơ ACN, MeOH hoặc MeOH trong acid percloric 2% hoặc sử dụng muối kẽm sulfat 10%;phương pháp chiết lỏng - lỏng (LLE) được sử dụng khá phổ biến để tách các hoạt chất với kỹthuật đơn giản, dễ thực hiê ̣n Để chiết metronidazol và spiramycin trong mẫu huyết tương, sửdụng các dung môi như ethyl acetat, cloroform… mẫu được kiềm hóa bằng NaOH 2 N, sau

đó được chiết với dicloromethan hoặc kết hợp các dung môi này theo một tỷ lệ thích hợp,Mẫu sau khi chiết tương đối sạch, nồng độ mẫu được tăng lên làm tăng tín hiệu các chất,thích hợp với hoạt chất có nồng độ trong huyết tương thấp Tuy nhiên tốn nhiều dung môi;phương pháp chiết pha rắn SPE để chiết hoạt chất trong huyết tương người với cột chiếtpha rắn SPE C18 và C2

- Cột sắc ký được sử dụng là cột pha đảo C18 và phenyl với các kích thước khác nhau và

cỡ hạt 5 µm, thích hợp cho phân tích metronidazol và spiramycin bằng phương pháp HPLChoặc LC ghép nối đầu dò MS/MS

- Pha động bao gồm các dung môi phân cực phù hợp với sắc ký pha đảo như MeOH, ACN,nước có thể có thêm acid formic 0,1%, amoni acetat, đệm acetat, … giúp tăng khả năngtách và phù hợp với thiết bị HPLC hoặc LC-MS/MS

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh

Trang 35

-Tinidazol, roxitromycin, ordinazol …được dùng làm chuẩn nội vì có cấu trúc hóa học gầngiống với chất khảo sát (metronidazol và spiramycin), cùng nhóm, bền vững Trong cùngđiều kiện sắc ký, chuẩn nội tách khỏi chất phân tích, thời gian lưu gần với chất phân tích,

ổn định, không tương tác với chất phân tích khi phân tích bằng khối phổ chuẩn nội có độtinh khiết cao và dễ kiếm

Trang 36

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Các mẫu huyết tương người tự tạo chứa hỗn hợp thuốc metronidazol và spiramycin I

2.2 Địa điểm nghiên cứu

Trung tâm đánh giá tương đương sinh học, Viện Kiểm nghiệm thuốc TP HCM

2.3 Nguyên vật liệu

2.3.1 Chất chuẩn đối chiếu và chuẩn nội

Bảng 2.1 Chất chuẩn đối chiếu và chuẩn nội được sử dụng trong nghiên cứu Tên chất Số lô theo nguyên trạng) Hàm lượng (tính Nguồn gốc

Tinidazol (chuẩn nội) QT032 110915 99,51%

Roxithromycin

2.3.2 Dung môi, hóa chất

Bảng 2.2 Dung môi và hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu

Huyết tương người (mẫu

Bệnh viện Truyền máuhuyết học TP.HCM

- Cân kỹ thuật Mettler Toledo (Nhật)

- Cân phân tích 5 số A&D - GH 202 (Nhật)

- Cột sắc ký Gemini NX-18 (100 x 3 mm; 5 µm) (Mỹ)

- Micropipet Eppendorf: 1 – 10 μl, 10 – 100 µl, 100 – 1000 µl

- Bình định mức, dụng cụ thủy tinh màu, ống eppendorf dùng trong phân tích

Trang 37

- Máy đo pH Mettler Toledo Seven Compact (Thụy Sĩ)

- Máy ly tâm lạnh Eppendorf (Đức)

- Bể siêu âm Power Sonic 410 (Hàn Quốc)

- Máy lắc Unimax 1010 (Đức)

- Hệ thống máy LC-MS/MS Shimadzu 8040 (Nhật)

- Tủ lạnh đông Sanyo -20 oC (Nhật)

- Tủ lạnh đông Froilabo -70 oC (Pháp)

Các thiết bị phân tích đã được hiệu chuẩn đạt yêu cầu

- Thiết bị phân tích sắc ký LC-MS/MS Shimadzu 8040 (Nhật)

Hệ thống sắc ký lỏng ghép khối phổ Shimadzu LC-MS 8040 bao gồm các bộ phận như sau:

hệ thống bơm dung môi LC-30AD, hệ thống loại khí chân không DGU-20A3, máy sinhkhí nitơ Peak Scientific NM 32 LA, bộ phận tiêm mẫu tự động SIL-30AC, buồng ổn nhiệtcho cột CTO-20AC và đầu dò khối phổ LC-MS 8040 Hệ thống được điều khiển bằng phầnmềm LabSolutions phiên bản 5.0

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Chuẩn bị mẫu

Dung dịch chuẩn gốc: Cân chính xác khoảng 100 mg chuẩn MET và 50 mg chuẩn SPY I,

cho vào bình định mức 100 mL, hòa tan trong MeOH

Dung dịch chuẩn: Từ dung dịch chuẩn gốc MET và SPY I, tiến hành pha dãy dung dịch

chuẩn có nồng độ MET và SPY I lần lượt nằm trong khoảng 1,0 500,0 µg/ml và 0,5 250,0 µg/ml trong MeOH Tất cả các dung dịch chuẩn được bảo quản ở -20 oC

-Dung dịch xây dựng đường chuẩn và dung dịch mẫu kiểm tra (QC): Chuẩn bị các dung

dịch xây dựng đường chuẩn và dung dịch mẫu kiểm tra (mẫu QC) từ dung dịch chuẩn phatrong huyết tương trắng

Trang 38

Bảng 2.3 Nồng độ lý thuyết các dung dịch chuẩn và dung dịch kiểm tra (QC)

Dung dịch chuẩn nội: Cân chính xác khoảng 10 mg chuẩn roxithromycin (ROX), cho vào

bình định mức 100 ml, hòa tan trong MeOH Pha loãng dung dịch chuẩn gốc ROX vớiMeOH để thu được dung dịch có nồng độ 5 µg/ml

2.4.2 Xây dựng quy trình định lượng đồng thời MET và SPY I trong huyết tương người bằng phương pháp LC-MS/MS

2.4.2.1 Khảo sát điều kiện khối phổ để thu được tín hiệu MET, SPY I và IS cao nhất

Sử dụng chế độ Auto-tune để khảo sát các thông số khối phổ nhằm thu được tín hiệu caonhất của MET, SPY I và IS Các điều kiện khối phổ ban đầu:

- Nebulizing gas flow (nitơ): 3,0 lít/phút

- Áp suất khí phun: 25 psi

- Điện thế đầu cone: 4500 V

- Chế độ ESI dương và kỹ thuật ghi phổ MRM

Dung dịch MET, SPY I và IS có nồng độ khoảng 1 µg/ml trong MeOH được bơm trực tiếpvào máy khối phổ để tối ưu hóa điều kiện khối phổ, bao gồm:

- Xác định ion phân tử của MET, SPY I và IS

- Xác định ion phân mảnh của MET, SPY I và IS có cường độ tín hiệu cao và ổn định

Các thông số khối phổ được khảo sát: thế phân mảnh và năng lượng buồng va chạm.

Trang 39

2.4.2.2 Khảo sát chuẩn nội

Trong cùng điều kiện sắc ký, các chuẩn nội được tách hoàn toàn với các thành phần khác, sựion hóa và phân mảnh tương tự chất phân tích, không phản ứng hay chuyển hóa thành cácthành phần trong hỗn hợp chất phân tích, có thời gian lưu gần thời gian lưu của chất phântích, có độ tinh khiết cao và dễ kiếm Qua tham khảo các tài liệu và điều kiện sẵn có tạiphòng thí nghiệm, tiến hành khảo sát các chuẩn nội như tinidazol, roxithromycin

2.4.2.3 Khảo sát điều kiện sắc ký để phân tích đồng thời MET, SPY I và IS trong huyết tương người

Điều kiện sắc ký khảo sát:

- Pha động: MeOH, ACN, nước, acid formic 0,1%, amoni acetat 0,1 M và acid acetic0,15% Thay đổi loại dung môi, tỷ lệ dung môi và pH

- Cột sắc ký: Cột Gemini NX-C8 và C18 (100-150 x 3,0-4,6 mm; 3-5 µm); Cột NucleosilC8 và C18 (150 x 4,6 mm; 3-5 µm); Cột Zorbax (250 x 4,6 mm; 3 µm)

- Nhiệt độ cột: 30 oC, 35 oC và 40 oC

- Tốc độ dòng: 0,3, 0,4 và 0,5 ml/phút

Tiêu chí lựa chọn: pic MET, SPY I và IS có thời gian lưu phù hợp, cân đối, tín hiệu cao và

ổn định

2.4.2.4 Khảo sát quy trình xử lý mẫu huyết tương

hưởng đến chất cần phân tích, đảm bảo tính toàn vẹn và đồng nhất của các chất phân tích

có trong mẫu, phù hợp với điều kiện sẵn có phòng thí nghiệm, đơn giản, dễ thực hiện, tiếtkiệm dung môi hóa chất, ít độc hại, không ảnh hưởng đến nền mẫu

Qua tham khảo tài liệu nghiên cứu, phương pháp tủa protein được áp dụng để xử lý mẫuhuyết tương giả lập theo 2 cách sau đây:

- Cách 1: tủa protein với MeOH hoặc ACN với tỷ lệ dung môi và huyết tương khác nhau,

ly tâm loại bỏ tủa, lọc dịch ly tâm và tiến hành sắc ký

- Cách 2: thực hiện giống cách 1 nhưng sử dụng dung môi được kiềm hóa bằng dung dịchNaOH hoặc acid hóa bằng dung dịch acid formic

Trang 40

Yêu cầu:

- Quy trình phân tích phải đảm bảo có khả năng nhận diện, phân biệt rõ ràng được MET,SPY I và IS Các pic này phải tách hoàn toàn các pic tạp và không bị ảnh hưởng bởi cácthành phần khác có trong mẫu

- Đáp ứng của mẫu trắng tại thời điểm trùng với thời gian lưu của MET và SPY I khôngvượt quá 20% đáp ứng của chất phân tích ở nồng độ LLOQ

- Đáp ứng của mẫu trắng tại thời điểm trùng với thời gian lưu của chuẩn nội không đượcvượt quá 5% đáp ứng của chuẩn nội ở mẫu LLOQ

2.4.3.3 Hiệu suất chiết

Mẫu tự tạo: MET, SPY I và IS trong huyết tương ở 3 nồng độ LQC, MQC, HQC, chuẩn bị

6 mẫu ở mỗi nồng độ

Mẫu chuẩn: MET, SPY I và IS được pha trong dung môi pha mẫu ở 3 nồng độ tương ứng

LQC, MQC, HQC, chuẩn bị 6 mẫu ở mỗi nồng độ

Tiêu đề	Xây dựng quy trình định lượng đồng thời metronidazol và spiramycin i trong huyết tương người bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ (lc-ms/ms)
Tác giả	Trần Thị Mỹ Dung
Người hướng dẫn	TS. Chương Ngọc Nãi, PGS.TS. Nguyễn Đức Tuấn
Trường học	Đại Học Y Dược Thành Phố Hồ Chí Minh
Chuyên ngành	Kiểm nghiệm thuốc – Độc chất
Thể loại	Luận văn thạc sĩ dược học
Năm xuất bản	2018
Thành phố	Thành phố Hồ Chí Minh

Định dạng
Số trang	112
Dung lượng	7,1 MB