BÀI TẬP NHÓM MÔN CÔNG NGHỆ ENZYME

Nhận xét và giải thích: Kết quả thí nghiệm cho thấy tính đặc hiệu của enzyme amylase chỉ thủy phân tinh bột thành glucose và phản ứng với Fehling tạo màu đỏ gạch mà không tủy phân disac

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

- -BÀI BÁO CÁO NHÓM 17 MÔN CÔNG NGHỆ ENZYME GVHD:Ts.Nguyễn Minh Xuân Hồng Thành viên nhóm: 1 Nguyễn Thị Chúc An 16125090

2 Phạm Thị Thúy Dung 16125004

3 Cao Thị Diễm Mi 16125309

4 Lê Thị Thu Sương 16125426

5 Nguyễn Thị Thanh 16125444

6 Trần Phương Thảo 16125456

7 Ngô Diễm Thoa 16125462

8 Trương Trần Tiến 16125502

MỤC LỤC

Bài 1: KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA YẾU TỐ NGOẠI CẢNH ĐẾN

HOẠT TÍNH CỦA ENZYME 1

1 Tính đặc hiệu của Enzyme 1

2 Ảnh hưởng của hiệt độ đến hoạt tính của enzyme 2

3 Ảnh hưởng của PH đến hoạt tính của enzyme 4

4 Khảo sát ảnh hưởng của chất hoạt hóa và ức chế đến hoạt tính enzyme: 6

BÀI 2: ENZYME AMYLASE 9

1 Xác định hoạt lực Enzyme Amylase bằng phương pháp Heinkel 9

BÀI 3: ENZYME PROTEASE 10

Xác định hoạt tính pepsin thô bằng phương pháp Anson cải tiến 10

BÀI 4: ENZYME PECTINASE 13

1.Phương pháp so màu 13

2 Ứng dụng pectinase làm trong nước ép trái cây 14

Bài 1: KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA YẾU TỐ NGOẠI CẢNH ĐẾN HOẠT TÍNH CỦA ENZYME

1 Tính đặc hiệu của Enzyme

Nguyên tắc:

Tính đặc hiệu của enzyme thể hiện ở điểm mỗi enzyme chỉ tác dụng lên một cơ chất nhất định Chẳng hạn amylase chỉ thủy phân polysaccharide mà không tác dụng lên disaccharide

Saccharose không cho phản ứng với Fehling vì trong phân tử có nhóm cetose hoặc aldehid tự do Phản ứng này chỉ dương tính khi saccharose đã được thủy phân thành glucose và fructose

Cách tiến hành

- Cho vào 2 ống nghiệm mỗi ống 0.5ml dung dịch amylase Thêm 1ml dung dịch tinh bột 1% vào ống thứ nhất và 1ml dung dịch saccharose 1% vào ống thứ hai Đặt hai ống trong bình ổn nhiệt 10-20 phút

- Trộn 1ml dung dịch Fehling A và 1ml dung dịch Fehling B với nhau, rồi cho vào mỗi ống nghiệm 1ml dung dịch Fehling vừa trộn đem đi đun 5 phút rồi nhận xét kết quả

Hình 1.1

Kết quả:

Ống nghiệm có tinh bột chuyển thành màu đỏ gạch, ống nghiệm còn lại không có hiện tượng gì

Nhận xét và giải thích:

Kết quả thí nghiệm cho thấy tính đặc hiệu của enzyme amylase chỉ thủy phân tinh bột thành glucose và phản ứng với Fehling tạo màu

đỏ gạch mà không tủy phân disaccharide saccharose

2. Ảnh hưởng của hiệt độ đến hoạt tính của enzyme.

Nguyên tắc: Vận tốc của phản ứng enzyme thường tăng khoảng hai

lần khi nhiệt độ tăng khoảng 10°C Ở nhiệt độ thấp, ví dụ khoảng 0°C, vận tốc xúc tác của men rất thấp, coi như không đáng kể, nhưng

ở nhiệt độ này, enzyme được bảo quản tốt Ở 40-50°C, các enzyme hoạt động mạnh nhất, cao hơn 50°, enzyme bắt đầu biến tính, vận tốc xúc tác giảm dần Đến 60-80°C, enzyme mất khả năng hoạt động Ở 100°C, enzyme bắt đầu mất tác dụng

Cách tiến hành:

Lấy 2 ống nghiệm cho vào:

 Ống 2: 0,5 ml dung dịch amylase đã pha loãng và 0,5 ml dung dịch đệm pH 7

Đặt cả 2 ống vào bình ổn nhiệt ở 30°C trong vòng 5 phút Tương tự làm với 60°C

và 90°C Sau đó trộn 2 ống vào nhau và tiến hành khảo sát hoạt tính của enzyme dưới ảnh hưởng của nhiệt độ bằng cách xác định thời gian thủy giải của amylase Phương pháp xác định thời gian thủy giải của amylase: Cứ sau mỗi 1 phút, nhỏ 1 giọt dung dịch lugol ( hoặc iod) lên mặt kiếng, sau đó nhỏ vò đó 1 giọt hổn hợp dung dịch Khi nào không thấy màu xanh xuất hiện nữa là lúc tinh bột đã bị thủy phân hoàn toàn bởi amylase

Kết quả:

Đồ thị:

Nhận xét và giải thích:

 Nhận xét: Với ống 30°C thời gian thủy phân tinh bột bởi

amylase là nhanh nhất, ống 60°C là chậm hơn, còn ống 90°C amylase không thể thủy phân tinh bột

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

4

6

9

 Giải thích: Vì nhiệt độ ảnh hưởng đến vận tốc và khả năng

xúc tác của enzyme Ở 30°C nhiệt độ này enzyme có vận tốc xúc tác tương đối cao vì vậy nên có thể nhanh chóng thủy phân hết tinh bột trong 4 phút, Ở nhiệt độ 60°C enzyme bắt đầu biến tính và biến tính vì vậy vận tốc xúc tác chậm lại, và

ở 90°C thì với nhiệt độ này enzyme bị biến tính hoàn toàn và không thể thủy phân tinh bột được vì vậy màu xanh sẽ không thể không biến mất

3 Ảnh hưởng của PH đến hoạt tính của enzyme

Nguyên tắc :

-Hoạt tính của enzyme thể hiện trong vùng PH tương đối hẹp là PH tối ưu

PH tối ưu của một số enzyme như pepsin là 1.2-2.5; catalase 7.0 ; trysin 8.0-9.0; …

-Mức độ ion hóa của các enzyme phụ thuộc vào môi trường Enzyme có thể

có hoạt tính cao khi ở dạng tích điện dương hay tích điện âm hoặc ở trạng thái đẳng điện

Cách tiến hành:

 Lấy 3 ống nghiệm , cho vào :

- Ống 1 : 1 ml dung dịch hồ tinh bột 1% và 1 ml dung dịch đệm PH

4

- Ống 2 : 1 ml dung dịch hồ tinh bột 1% và 1 ml dung dịch đệm PH

6

- Ống 3: 1 ml dung dịch hồ tinh bột 1% và 1 ml dung dịch đệm PH

8

cho vào 9 ml nước

trên cho vào 3 ống nghiệm trên( làm với từng ống 1 vì thời gian mất màu khá nhanh)

 Tiến hành khảo sát hoạt tính của enzyme dưới ảnh hưởng của PH bằng cách xác định thời gian thủy giải của amylase:

- Cứ sau vài giây nhỏ 1 giọt lugol (hoặc iod) lên mặt kiếng ,sau đó

nhỏ vào đó 1 giọt hỗn hợp dung dịch.( có màu xanh đậm)

- Làm đến khi nào không thấy màu xanh xuất hiện nữa là lúc tinh

bột đã bị thủy phân hoàn toàn bởi amylase

- Ghi nhận lại thời gian thủy giải( tính từ lúc cho enzyme vào )

Kết quả khảo sát:

- Với ống có PH=4 thời gian thủy giải là 2 phút 45s

- Với ống có PH=6 thời gian thủy giải là 36s

- Với ống có PH=8 thời gian thủy giải là 2 phút 10s

Biểu đồ:

Hình 1.3

3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5 8 8.5 0

20 40 60 80 100 120 140 160

180

Biểu độ sự biến thiên thời gian thủy giải theo PH

Biểu độ sự biến thiên thời gian thủy giải theo PH

Độ PH

Nhận xét và gải thích :

-Nhận xét: với ống có PH =6 có thời gian thủy giải nhanh nhất , còn với

PH=4 và PH=8 có thời gian thủy giải chậm hơn

-Giải thích: Tùy thuộc vào nguồn gốc thì enzyme amylase sẽ có các PH

tối ưu khác nhau, nhưng dựa vào kết quả thí nghiệm thì ta có PH tối ưu của

enzyme amylase dùng làm thí nghiệm là 6( vì thời gian enzyme thủy giải

tinh bột nhanh nhất), với độ PH này rất thích hợp cho enzyme hoạt động

thủy giải tinh bột,chỉ mất khoảng có 36s để thủy giải cùng một lượng tinh

bột trong ống nghiệm Còn đối với PH=4 và PH=8 không phải là độ PH tối

ưu của amylase và ở độ PH này có thể ức chế hoạt tính của enzyme nên là

khả năng thủy giải tinh bột của enzyme giảm nên thời gian mất màu

xanh( màu xanh do tinh bột phản ứng với iod) lâu hơn(với ống có PH=4 thời

gian thủy giải là 2 phút 45s ;với ống có PH=8 thời gian thủy giải là 2 phút

10s )

4 Khảo sát ảnh hưởng của chất hoạt hóa và ức chế đến hoạt tính

enzyme:

Nguyên tắc:

Amylase của nước bọt (α – amylase) sẽ tăng hoạt động của môi trường có NaCl

ngược lại CuSO4 sẽ ức chế tác dụng của enzyme này

Trong 3 ống nghiệm có chứa α – amylase và tinh bột

Cho NaCl vào ống 1, CuSO4 vào ống 2, nước vào ống 3 Sau cùn một thời gian tác dụng ta thấy:

ống 1: tinh bột được thủy giải hoàn toàn

ống 2: không có sự thủy phân tinh bột

ống 3: tinh bột chỉ được thủy giải đến dextrin

Các tiến hành:

Chuẩn bị 3 ống nghiệm:

- ống 1: 0,5 ml dd amylase đá pha loãng và 0,5 ml NaCl 1%

- ống 2: 0,5 ml dd amylase pha loãng và 0,5 ml CuSO4 1%

- ống 3: 0,5 ml dd amylase pha loãng và 0,5 ml nước cất

Sau đó, cho vào mỗi ống 1ml đ hồ tinh bột 1% Để 3 ống vào nhiệt độ phòng ( khoảng 25oC) tronbg từ 3-5 phút

Tiếp theo nhỏ 1 giọt Iod lần lượt vào 3 ống nghiệm 1, 2, 3 Rồi lắc nhẹ cho phản ứng xảy xa

Kết quả:

- ống 1 có màu vàng nâu

- ống 2 có màu xanh rêu đậm

- ống 3 có màu vàng nâu

Hình 1.4

Giải thích kết quả:

- ống 1: Vì có Cl- là tác nhân hoạt hóa cho amylase nên tinh bột sẽ được thủy phân hoàn toàn Khi chi iod vào thì không có tinh bột để bắt màu nên dd thu được có màu của thuốc thử iod

- ống 2: Vì có Cu2+ ức chế hoạt động của amylase nên tinh bột không bị thủy phân Do vậy khi cho thuốc thử iod vào thì có màu tím do kết hợp với màu xanh lam của dd CuSO4 nên cho màu xanh rêu đậm

- ống 2: Do có nước cất nên nồng độ enzyme amylase bị loãng đi Do đó hiệu suất thủy phân tinh bột chỉ đến các phân tử dextrin, không bắt màu với iod nên khi cho iod vào dd thu được có màu của thuốc thử iod

BÀI 2: ENZYME AMYLASE

1 Xác định hoạt lực Enzyme Amylase bằng phương pháp

Heinkel

Nguyên tắc:

Xác định lượng tinh bột bị phân hủy dựa trên cơ sở xác định mức độ giảm cường độ màu hỗn hợp phản ứng với dung dịch iot

Đơn vị hoạt động Enzyme là lượng Enzyme có khả năng phân giải 1 mg tinh bột sau 30 phút ở 300C

Cách tiến hành:

- Lấy hai ống nghiệm ghi chú lên ống thứ nhất là ống enzyme; ống thứ hai là ống đối chứng

- Chuẩn bị dung dịch NaCl 0,1% : ta cân 0,1g muối NaCl cho vào 10ml nước cất, khuấy đều ta được dung dịch NaCl 0,1%

- Dùng pipette 1ml hút lần lượt 1ml dung dịch tinh bôt cho vào mỗi ống nghiệm sau đó lại cho vào mỗi ống nghiệm 1 ml dung dịch NaCl 0,1% và 2ml dung dịch đệm phosphate 0,05M, pH= 6, lắc đều Sau đó để ở nhiệt độ phòng trong 20 phút

- Sau đó, cho vào ống Enzyme 1 ml dung dịch Enzyme ở nhiệt độ phòng; ống đối chứng 1ml nước cất, lắc đều, tiếp tục để ở nhiệt độ phòng 30 phút

- Sau đó cho vào mỗi ống 5ml dung dịch acid sulfosalisilic 20% để ngừng phản ứng Rồi cho vào mỗi ống 9ml dung dịch iod pha loãng 150 lần

- Sau đó đem đi đo màu ở bước sóng 560nm

Số liệu lập đồ thị chuẩn:

OD560nm 0,064 0,275 0,491 0,751 0,987 1,262

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 0

0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

1.4 f(x) = 1.2 x + 0.04 R² = 1

OD560nm

OD560nm Linear (OD560nm)

số mg tinh bột

Số liệu thu được :

- Ống đối chứng: OD560nm= 0,77

 Gọi A1 là kết quả của ống Enzyme:

A2 là kết quả của ống đối chứng:

 Tra lên biểu đồ ta được X= 0,556 mg tinh bột

Số tinh bột được phân giải là X = 0,556mg tinh bột*150=83,4 mg tinh bột

 Vậy số tinh bột bị phân giải trong thí nghiệm trên là 83,4 mg

BÀI 3: ENZYME PROTEASE

Xác định hoạt tính pepsin thô bằng phương pháp Anson cải tiến.

Nguyên tắc:

Casein được pepsin phân giải trong môi trường acid tạo các đoạn peptit ngắn không tủa bởi T.C.A (trichloro acetic acid) trong đó lượng tyrosin, trytophan được xác định bởi phản ứng màu với thuốc thử folin Đo mmật độ quang của dung dịch này suy ra nồng độ sản phẩm

và tính hoạt tính protein

Quá trình thực hiện:

 Ống A1: Enzyme pepsin dạ dày heo

 Ống B (đối chứng): H2O

vòng 10 phút

Hình 3.1

Xây dựng đường chuẩn tyrosin nguyên chất:

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1

1.2

f(x) = 0.96 x + 0.08 R² = 0.99

đường chuẩn tyrosin

µmol tyrosin

Kết quả:

 Ồng A1: 1,52

 Hiệu số giá trị OD mẫu thí nghiệm và mẫu kiểm tra:

 ∆OD1 = ODA1 - ODB = 1,52 – 0,178 = 1,342

 ∆OD2 = ODA2 - ODB = 165 – 0,178 = 164,822

 ∆OD= |∆OD1−∆ OD2|= 163,48

 Từ ∆OD dựa theo đồ thị chuẩn tính lượng μmol tyrosin tương ứng:

163,48 = 0,962*X + 0,08 => X cần tìm là 169,854

 Hoạt tính protease của pepsin biểu thị bằng số đơn vị Protease/1g chế phẩm theo công thức:

 Hoạt độ protease/1ml enzyme =µ mol Tyr∗V t = 169,854∗1610 = 271,77

V: thể tích toàn bộ hỗn hợp (cơ chất + enzyme + TCA = 5+1+10=16 ml)

t: thời gian thủy giải 10 phút

Hình 3

BÀI 4: ENZYME PECTINASE

1.Phương pháp so màu

Nguyên tắc:

Là phương pháp dựa trên việc so sánh cường độ màu của dung dịch nghiên cứu với cường độ màu của dung dịch tiêu chuẩn có nồng độ xác định Dùng phương pháp so màu chủ yếu để xác định lượng nhỏ các chất phân tích Phương pháp này mất ít thời gian so với các phương pháp hóa học khác Nguyên tắc của phương pháp này là xác định lượng acicd galacturonic được tạo ra bởi quá trình thủy phân bằng pectinase Cơ chất pectin không kết tủa bởi ZnSO4.

Định nghĩa đơn vị hoạt tính:

Một đơn vị hoạt tính pectinase là lượng Enzyme trong điều kiện tiêu chuẩn ( ở nhiệt độ 30°C pH 3,9-4,1, thời gian phản ứng là 60 phút với nồng độ pectin trong môi trường phản ứng là 0,66%, mức độ thủy phân pectin là 30%) có khả năng xúc tác, làm biến đổi 1g pectin sau 60 phút thành acid galacturonic

.Hóa chất:

- Dung dịch petin 1%

- Dung dịch Enzyme 1%

- Dung dịch Antrone 0,2% (C6H4COH4CH2) trong acid sulfuric đậm đặc

Tiến hành:

Cho 20ml dung dịch pectin 10% vào ống nghiệm rồi tiếp theo cho 10ml dung dịch Enzym 1%, lắc đều cho vào tủ ấm ở nhiệt độ 30°C (dung dịch pectin có PH = 3,9-4,1)

Sau 60 phút lấy ra thêm 2ml ZnSO4 15%, đem lọc qua giấy lọc, dung dịch lọc được đem pha loãng 5 lần dùng cho phản ứng với Anthrone

Lấy 5ml Anthrone cho vào ống nghiệm, rồi cho 2,5ml dung dịch lọc đã pha loãng, lắc mạnh trong thời gian 10 phút Sau đó đặt trong nồi thủy ở nhiệt độ 70°C trong thời gian 12 phút rồi lấy ra là nguội đến nhiệt độ phòng và tiến hành đo giá trị OD ở bước sóng X = 584 nm

Tính hoạt độ

Giá trị OD ở bước sóng X=584 là 0,363 (đã pha loãng dung dịch 100 lần)

Hoạt tính pectinase = 0,34OD  0,0104/m = 0,34.0,3630,0104/10 =0,011302

 OD = ODTN  ODĐC = 0,363 0,3= 0,063

ODTN: Giá trị OD của thí nghệm

OD ĐC: Giá trị OD của đối chứng

2 Ứng dụng pectinase làm trong nước ép trái cây

Hóa chất

- Nước ép táo

- Dung dịch pectinase 1%

Các bước tiến hành

- Cân 30g táo, ép lấy dịch quả, pha loãng thành 100ml nước cất

- Hút 8ml dung dịch trên cho vào mỗi ống nghiệm của 5 ống nghiệm khác nhau

- Thêm dung dịch pectinase 1% vào từng ống nghiệm với thể tích tuần tự trong các ống là 0; 0,4; 0,8; 1,2; 1,6ml

- Sau đó thêm nước cất vào sao cho mỗi ống có đủ 10ml

- Để tất cả các ống nghiệm ở 45-50 độ C trong 30 phút

- Sau đó lấy 5ml dung dịch bên trên mỗi ống đem độ truyền suốt ở bước sóng 584nm

Kết quả

Ống nghiệm

0 ml

Ống nghiệm 0,4ml

Ống nghiệm 0,8ml

Ống nghiệm 1,2 ml

Ống nghiệm 1,6ml

Hình 4.2

- Đường biểu diễn độ truyền suốt của dung dịch nước ép táo

0

5

10

15

20

25

30

35

40

Biểu diễn đ truyền suốt của dung dịch ộ truyền suốt của dung dịch

Biểu diễn đ truyền suốt của ộ truyền suốt của dung dịch

Nhận xét và giải thích:

 Nhận xét: Dịch quả trong ống nghiệm 1,2ml có độ trong cao nhất, dịch quả trong ống nghiệm 1,6ml có độ trong thấp nhất

 Giải thích: Enzyme pectinase sẽ thủy phân pectin, làm giảm độ nhớt, giúp dịch quả thoát ra dễ dàng, nâng cao hiệu suất ép và làm trong dịch quả Vì vậy, dịch quả có độ truyền suốt càng lớn thì dịch quả càng trong, tức là có nhiều enzyme pectinase làm trong dịch quả