Báo cáo thực hành Vi sinh vật học IUH

Báo cáo Vi sinh học Trường đại học công nghiệp Hồ Chí Minh IUH. Hy vọng báo cáo này sẽ giúp các bạn tham khảo ý và vượt qua được môn học này. Goodluck to you. Các bạn chỉ cần cố gắng nghe cô hướng dẫn là oke thôi nhé, cô dễ thương và tận tình lắm nè

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP TP HỒ CHÍ MINH VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC – THỰC PHẨM

-o0o -

BÁO CÁO THỰC HÀNH VI SINH VẬT HỌC

PHÂN LẬP VÀ QUAN SÁT HÌNH THÁI ĐẠI THỂ VÀ VI THỂ CỦA VI SINH

1.Tên vấn đề: Phân lập và quan sát hình thái đại thể và vi thể của vi sinh vật

chọn VK(-), VK(+), nấm men, nấm mốc,cầu khuẩn

cấy truyền làm thuần vi sinh vật vào ống nghiệm

nộp mẫu vsv thuần chủng

4 Kế hoạch

⁕ Tuần 1: (Ngày 6/11-10/11/2020): lên kế hoạch phân công chi tiết, chọn mẫu

⁕ Tuần 2: (Ngày 11/11-16/11/2020): tiệt trùng dụng cụ đĩa petri, pha chế và đổ môi trường

⁕ Tuần 3: (Ngày 17/11-23/11/2020): nuôi và cấy truyền vi sinh vật

⁕ Tuần 4: (Ngày 24/11-30/11/2020): quan sát dưới kính hiển vi, cấy truyền làm thuần vsv

trên đĩa petri

⁕ Tuần 5: (Ngày 1/12-7/12/2020): nhuộm gram, cấy truyền trên ống thạch nghiêng

⁕ Tuần 6: (Ngày 8/12-12/12/2020): xem, kiểm tra kết quả đạt được, hấp bỏ đĩa môi trường,

nộp báo cáo

5 Nhật ký:

⁂ Ngày 6/11/2020

• Công việc: - Đọc và hiểu quy trình làm nuôi cấy vi sinh vật

- Lên kế hoạch phân công công việc cho từng thành viên

- Chọn mẫu vi sinh vật nuôi cấy

• Phương pháp nuôi cấy:

- MT tự nhiên: MT cao thịt-peptone ( nuôi VK)

- MT nhân tạo: MT hansen(nuôi nấm men)

- MT bán tự nhiên: MT Potato Glucose Agar (PGA) (nuôi nấm mốc)

- 15 đĩa peptri (6 đĩa cao thịt, 5 đĩa hansen, 4 đĩa PGA)

• Kết quả:chọn môi trường rắn nuôi cấy vi sinh và chia đều 3 môi trường cho 4 nhóm pha

chế, chọn mẫu không khí và mẫu chung để nuôi cấy vsv

• Thảo luận với giáo viên: 1 đĩa peptri chứa 8-10ml môi trường

• Phương hướng giải quyết: chọn ngày lên pha môi trường dinh dưỡng

1.Chuẩn bị đĩa petri đổ môi trường (15 đĩa):Trước khi sử dụng đĩa petri phải rửa

sạch, sấy khô, sau đó gói giấy báo và sấy tiệt trùng

*THAO TÁC GÓI ĐĨA PETRI

Bước 1: Rửa sạch đĩa petri bằng nước sạch và lau khô đĩa

Bước 2: Chuẩn bị giấy báo để gói đĩa petri

Bước 3: Cho 3-4 cái đĩa petri vào giữa giấy báo

trùng ở 180 độ trong vòng 30 phút

*Chú ý: Các dụng cụ trên cần phải sạch sẽ về mặt hóa học (không dính các chất hữu

cơ, vô cơ, thủy tinh cần phải trung tính) và sạch về mặt vsv học (không chứa bất kì

tế bào vsv, các dụng cụ phải vô trùng)

*CÁC BƯỚC SỬ DỤNG TỦ SẤY

Bước 1: mở cửa tủ và đặt mẫu cần sấy vào buồng tối sao cho không đụng vào thành

của tủ, đóng cửa tủ lại

Bước 2: cắm điện và khởi động tủ sấy

Bước 3: tùy vào đối tượng cần khử khuẩn mà sấy ở nhiệt độ thích hợp (dụng cụ

thủy tinh, kim loại) , thường sấy ở 160 độ C trong 2 giờ hoặc 180 độ C trong 30 phút

Bước 4: khi tủ vận hành,nhiệt độ sẽ đạt đến giá trị điều chỉnh

Bước 5: đợi nhiệt độ trong tủ bằng nhiệt độ môi trường xung quanh thì mở tủ lấy

mẫu vật ra

2.Pha chế môi trường

*Mỗi nhóm pha một môi trường cho tất cả các nhóm trong lớp cùng sử dụng

- Nhóm 1: Pha môi trường cao thịt- peptone

- Nhóm 2: Pha môi trường cao thịt-peptone

- Nhóm 3: Pha môi trường hansen

- Nhóm 4: Pha môi trường PGA

- Tính tỉ lệ pha môi trường: Kim Ngọc

- MT tự nhiên: MT cao thịt-peptone ( nuôi VK)

Bước 1: Cân đong từng hóa chất ( Cao thịt 0,6g , Peptone 2g , Nacl 1g , Agar 4g ,

- Các thành phần của môi trường được hòa riêng rẽ trong nước cất trước khi phối trộn

- Phối trộn các thành phần theo đúng trình tự nhất định, tránh sự tương tác trực tiếp của các thành phần có thể phẩn ứng tạo kết tủa với nhau Phối trộn dựa theo nguyên tắc thể tích tăng dần

- Đối với môi trường rắn, sau khi phối trộn các thành phần phải tiến hành nấu sôi môi trường để làm hòa tan hoàn toàn agar trước khi phân phối vào bình

*CÁCH SỬ DỤNG LÒ VI SÓNG

- Cắm điện, ấn Start để lò bắt đầu hoạt động

- Cho môi trường mới phối trộn xong vào lò

- Đặt thời gian khoảng 2-3 phút cho môi trường sôi để tan agar

- Ấn Start để bắt đầu quá trình làm sôi

*CÁCH SỬ DỤNG NỒI HẤP

Bước 1: kiểm tra nồi hấp, khoá các van (van thông 2 nồi, vặn xả khí) Kiểm tra mật

độ nước (mực nước đạt từ 1/2 đến 2/3 ống nước) không có bọt khí, khóa van nước

Bước 2: bật cầu dao

Bước 3: khi đồng hồ nồi ngoài lên 1at -121độ C Cho dụng cụ môi trường cần hấp

vào nồi, khóa nắp theo quy tắc đối xứng hai bên Mở van thông hai nồi

Bước 4: chờ đồng hồ nồi trong lên 1at, mở van xả khí (3-5phút) Sau đó đóng van

xả khí chờ đồng hồ lên 1at rồi bắt đầu tính giờ trong 30 phút ở 121 độ

Bước 5: Sau khi thời gian hấp tiệt trùng đóng van thông hai nồi, tắt cầu dao, xả khí

,đồng hồ trên xuống 0at, mở nắp

3.Đổ môi trường

Bước 1: Chuẩn bị đĩa petri đã được sấy tiệt trùng và bình môi trường đã hấp tiệt

trùng, đèn cồn

Bước 2: Lau mặt bàn làm việc và rửa tay bằng cồn 70o

Bước 3:Tay phải cầm bình môi trường,tay trái nhẹ nhàng gỡ giấy báo và nút bông,

hơ miệng bình xung quanh đèn cồn

Bước 4: Tay trái cầm đĩa petri hơ nhẹ đĩa xung quanh ngọn lửa để khử trùng xung

quanh miệng đĩa

Bước 5: Mở hé nắp đĩa petri đổ từ từ môi trường vào đĩa cho đến khi lớp thạch được

trải đều

*Chú ý: Đối với đĩa petri, môi trường chỉ được phân phối vào đĩa sau khi hấp tiệt

trùng Thể tích môi trường khoảng 12-15ml mỗi đĩa, lớp môi trường dày khoảng 2mm

• Kết quả: pha được 200ml môi trường và môi trường nhận từ các nhóm khác, đỗ được 15

đĩa môi trường (6 cao thịt, 5 hansen, 4 PGA),có 2 đĩa bị dính môi trường trên bề mặt nắp đậy

• Thảo luận với giáo viên : việc đo pH trong việc pha chế môi trường

• Phương hướng giải quyết:

- Không cần đo Ph vì đây là những môi trường cơ bản

- Có 2 đĩa sai xót và số đĩa còn lại vẫn đủ để tiến hành thí nghiệm

4.Nuôi cấy vsv:

A.Mẫu không khí

- Lấy 7 đĩa môi trường (3 cao thịt, 2 hansen, 2 PGA), mở ra lấy mẫu vsv từ không khí

đặt trong phòng thí nghiệm T3.09 trường Đại Học Công Nghiệp TPHCM

- Sau 30 phút đậy nắp 7 đĩa petri gói lại gọn gàng cẩn thận bằng giấy báo đem đi ủ 3ngày

B.Mẫu chung

Bước 1: khử trùng khu vực cấy và bàn tay bằng dung dịch cồn 70 độ

Bước 2: các thao tác đều thực hiện quanh ngọn lửa đèn cồn, tay trái cầm micropipet

gắn vào đầu tuýp đã tiệt trùng (121 độ trong 30 phút) hút 0,1ml dịch canh khuẩn có sẵn trong ống, tay phải cầm đĩa petri hơ quanh miệng đĩa sau đó dùng micropipet chuyển 0,1ml dịch canh khuẩn lên trên bề mặt môi trường thạch trong đĩa petri

Bước 3: Nhúng đầu que cấy trải vào cồn 96 độ và hơ qua ngọn lửa để tiệt

trùng (2-3 lần) Sau đó, để đầu que nguội trong không gian vô trùng của ngọn lửa đèn cồn

Bước 4:Mở đĩa petri nhẹ nhàng, dùng que cấy trải đặt lên nắp petri dùng ngón tay

cái áp vào để cảm nhận độ nóng, xem que nguội hay chưa sau đó nhẹ nhàng

để lên bề mặt thạch của đĩa petri Dùng đầu que cấy trải đều dịch vi khuẩn lên trên bề mặt thạch Quá trình thực hiện hãy xoay đĩa một vài lần, mỗi lần khoảng nửa chu vi đĩa để tạo điều kiện cho que cấy trải dịch vi khuẩn đều khắp bề mặt môi trường

Bước 5: Lật ngược đĩa và ủ (gói bằng giấy báo) để ở nhiệt độ, thời gian thích hợp

trong tủ

• Kết quả: nuôi thành công mẫu vsv trong không khí, mẫu chung thì do quá trình cấy trải

chưa khô dẫn đến là mẫu vsv tạo thành từng bệch nên không tách được từng khuẩn lạc

Mẫu chung

Cấy ria lại mẫu chung

Mẫu không khí nuôi vi sinh vật

• Thảo luận với giáo viên: Cấy lại mẫu chung

• Phương hướng giải quyết:

- Mẫu vsv tạo thành từng bệch thì dùng que cấy lấy một ít vsv từ mẫu đó cấy ria trên đĩa môi trường khác

⁂ngày 17/11/2020

• Công việc: pha môi trường dinh dưỡng (hansen, PGA)

• Người thực hiện: Phụng, Linh, Kim Ngọc, Bích Ngọc, Nguyên

• Phương pháp thực hiện:

- Hấp bỏ đĩa nuôi mẫu vsv bị hư ( tiến hành như hấp lấy)

- Sau đó đổ môi trường bị hư vào túi rác, rửa lại các đĩa bằng xà phòng và lau khô đĩa

- Gói đĩa peptri vào giấy báo đem đi sấy tiệt trùng 181 độ 30 phút (như trên)

- Cân hóa chất để pha môi trường PGA, hansen

- Tính tỉ lệ pha môi trường: Kim Ngọc

(Cách pha chế môi trường như ngày 14/11)

- Môi trường Hansen (Nguyên, Phụng ,Kim Ngọc)

+ Thêm nước cất cho đủ 200ml

- Môi trường PGA (Linh, Bích Ngọc):

+ Khoai tây: 40g

+ Agar: 4g

+ Glucose: 4g

+ Thêm nước cất cho đủ 200ml

- Cho 2 môi trường vừa phối trộn vào lò vi sóng cho tan agar rồi lấy ra đem đổ vào lọ, đậy nút bông và đem hấp tiệt trùng ở 121°C trong 30 phút

- Đổ môi trường vào đĩa petri (đã trình bày 14/11)

• Kết quả: pha chế thành công 4 đĩa môi trường (2 hansen, 2PGA) để chuẩn bị cho

18/11/2020 lên tiến hành cấy truyền vsv

⁂ngày 18/11/2020

• Công việc: cấy truyền làm thuần vsv lên đĩa petri

• Người thực hiện: Phượng, Kim Ngọc

• Phương pháp thực hiện

Cấy truyền bằng que cấy đầu tròn (đối với vi khuẩn và nấm men)

Bước 1: Vệ sinh tay trước khi làm việc và mặt bàn bằng cồn

70

Bước 2 : Chuẩn bị que cấy đầu tròn và tiệt trùng que cấy bằng

lửa đèn cồn

Bước 3: Tay phải cầm que cấy hơ trên ngọn lửa cho nóng đó

và hơ phần thân gần nơi đầu que cấy

Bước 4: Tay trái cầm đĩa chứa mẫu vi sinh vật hơ xung quanh

đĩa mở nghiêng đĩa gần ngọn lửa sao cho vừa đủ để

que cấy vào trong đĩa

Bước 5 :Để que cấy nguội rồi đưa que cấy vào đĩa petri lấy 1 ít

sinh khối vi sinh vật và đậy nắp đĩa petri và hơ kỹ

Bước 6: Lấy đĩa petri có môi trường mới và cấy vào đĩa

Cấy truyền bằng que cấy đầu móc (đối với nấm mốc)

Bước 1: Vệ sinh tay trước khi làm việc và mặt bàn bằng cồn 70

Bước 2: Chuẩn bị que cấy đầu móc và tiệt trùng que cấy bằng lửa

đèn cồn

Bước 3: Tay phải cầm que cấy hơ trên ngọn lửa cho nóng đó và

hơ phần thân gần nơi đầu que cấy

Bước 4: Tay trái cầm đĩa chứa mẫu vi sinh vật hơ xung quanh

đĩa khẽ mở nghiêng đĩa gần ngọn lửa sao cho vừa đủ để que cấy

vào trong đĩa

Bước 5: Để que cấy nguội rồi đưa que cấy vào đĩa petri lấy 1 ít

bào tử hoặc sợi nấm và đậy nắp đĩa petri và hơ kỹ phần mở nắp

lúc nãy úp ngược đĩa đẩy đĩa vuông góc mặt bàn

Bước 6: Lấy đĩa petri có môi trường mới và cấy vào đĩa.

• Kết quả: nấm men bị nhiễm và đường cấy không đẹp, cấy thành công nấm mốc

Nấm men Nấm mốc

• Thảo luận với giáo viên: nhóm đã thảo luận với giáo viên về quá trình cấy truyền vsv

bị nhiễm hay là do khi cấy tryền lấy quá ít vsv hoặc hơ lửa quá lâu làm chết vsv

• Phương pháp giải quyết: khắc phục bằng việc chọn một ngày khác lên pha môi trường,

tiếp tục cấy truyền để thu được mẫu thuần khiết để kịp hoàn thành tiến độ công việc

⁂ngày 21/11/2020

• Công việc: Hấp bỏ đĩa cấy vsv bị hư

• Người thực hiện: Cả nhóm

• Phương phápthực hiện

- Gói các đĩa vào giấy báo đem đi hấp bỏ trong 30 phút

- Sau đó đổ môi trường bị hư vào túi rác, rửa lại các đĩa bằng xà phòng và lau khô đĩa

- Gói đĩa petri vào giấy báo đem đi sấy tiệt trùng 181 độ 30 phút (như trên)

• Kết quả: thu được đĩa đã sấy tiết trùng

• Phương pháp giải quyết: tiếp tục chuẩn bị đĩa để cấy truyền vsv

⁂ngày 24/11/2020

• Công việc: cấy truyền làm thuần vsv, hấp và đổ môi trường

• Người thực hiện: Cấy vi khuẩn (cao thịt):Linh

Cấy nấm men (hanse): Bích Ngọc

Hấp và đổ môi trường vào đĩa: Phụng, Phượng, Nguyên

• Phương pháp thực hiện:

1.Cấy truyền (đã trình bày ngày 18/11/2020)

2.Hấp và đổ môi trường

- Cho 3 lọ môi trường ( cao thịt, hansen và PGA ) còn dư đem hấp tiệt trùng trong 30 phút

- Sau đó lấy mt đổ vào đĩa petri Đợi đĩa nguội rồi gói vào giấy báo

• Kết quả: cấy thành công nấm men, đường cấy đĩa vi khuẩn vẫn chưa đẹp, đĩa nấm mốc

của ngày 18/11 vẫn tiếp tục phát triển, có 2 đĩa vi khuẩn màu trắng và màu vàng có thể tiếp tục cấy truyền

• Công việc: - Quan sát trên kính hiển vi

- Tiến hành nhuộm Gram

• Người thực hiện: Linh, Nguyên, Bích Ngọc,

• Phương pháp thực hiện:

1 Sử dụng kính hiển vi

Bước 1: Chuẩn bị kính

- Cắm điện, bật công tắc kính, điều khiển núm chỉnh ánh sang ở đế kính để có được ánh sáng thích hợp Xoay vật kính nhỏ nhất (vật kính 10x) về trục kính.

- Trước khi đặt tiêu bản vào mâm kính, phải chọn mặt phải, mặt trái của tiêu bản Mặt phải của tiêu bản thường có dán lamen, dán nhãn (nếu có lamen và nhãn) hoặc làm giảm bớt độ lóa của gương khi để nghiêng soi ra ánh sáng (nếu không

có lamen, không có nhãn)

- Để mặt phải của tiêu bản lên trên, tay phải mở kẹp tiêu bản, tay trai cầm phía đầu nhãn tiêu bản, đặt tiêu bản vào mâm kính và tay phải thả kẹp giữ tiêu bản

ra Tiêu bản được giữ chặt vào xe đẩy, trên mâm kính

- Dùng ốc xe đẩy để điều chỉnh sao cho mẫu vật nằm đúng vào trục kính (giữ

lỗmâm kính)

BẢO QUẢN KÍNH HIỂN VI

- Sau khi sử dụng xong, xoay tất cả các vật kính ra trước, mở kẹp tiêu bản, lấy tiêu bản ra trả về chỗ cũ, hạ mâm kính, hạ hộp tụ quang Dùng hai tay bê kính cất vào tủ chống ẩm

- Khi lau kính, khi sử dụng kính, không thao rời các bộ phận của kính Không được dùng tay xoa lên mặt các thấu kính, mà nên dùng một bút lông nhỏ sạch để chải bụi

ở các mặt kính hoặc dùng bông mềm, sạch để lau

- Nếu sử dụng vật kính x100 thì phải thấm giấy lau kính với một giọt dầu xylen để lau vật kính

* Khi sử dụng kính hiển vi quan sát tiêu bản vsv sống cần chú ý: có thể dùng điểm

sáng của hộp tụ quang để làm điểm chuẩn khi điều chỉnh mẫu vật về điểm trục kính, nếu mẫu vật quá nhỏ

2 Làm tiêu bản VSV sống

Bước 1: Nhỏ 1 giọt nước muối sinh lý NaCl lên phiến kính

Bước 2: Dùng que cấy chuyển giống vi sinh vật từ đĩa petri lên phiến kính

Bước 3:Hòa sinh khối vi sinh vật vào giọt nước muối này

Bước 4: Đặt lá kính lên giọt canh trường thật nhẹ nhàng

Bước 5: Đưa tiêu bản lên quan sát trên kính hiển vi ở vật kính x10 rồi x40

• Kết quả: phát hiện nấm mốc có tên là Aspergillus niger vì nấm có hệ sợi bao phủ như

mạng lưới, phát triển nhanh, bao trùm lên khắp đĩa với đầu là những chấm màu đen

Sợi nấm

3 Tiến hành nhuộm Gram đối với vi khuẩn:

- Dụng cụ: que cấy, cốc 100ml, đèn, bình tia, chậu thuỷ tinh, kính hiển vi, phiến kính,

lamen…

- Hoá chất: cồn 96o, dung dịch xylen, thuốc nhuộm Fuchsin Zeihl, thuốc nhuộm

Safranin O, thuốc nhuộm Crystal violet, dung dịch lugol, dầu soi kính

- Nhóm nhuộm màu vi sinh vật bằng phương pháp nhuộm Gram (nhuộm kép)

LÀM TIÊU BẢN NHUỘM MÀU VSV CỐ ĐỊNH

✓ Nhỏ một giọt nước muối sinh lý NaCl 0.9% lên phiến kính, hoà sinh khối vi sinh vật vào giọt nước

✓ Hơ khô trên ngọn lửa đèn cồn

✓ Nhuộm vết bôi bằng dung dịch tím kết tinh nhỏ 3 giọt methyl violet lên vết bôi giữ trong vòng 1 phút

✓ Sử dụng bình tia chứa nước rửa sạch phẩm nhuộm trong vòng 30 giây cho đến khi màu nhạt dần (lưu ý rửa nhẹ không tia nước trực tiếp vào vết bôi để tránh trôi hết vi sinh vật)

✓ Nhuộm vết bôi bằng dung dich Lugol giữ trong vòng 1 phút

✓ Sử dụng bình tia chứa cồn 96 độ rửa sạch phẩm nhuộm trong vòng 30 giây cho đến khi màu nhạt dần, tiếp theo dùng bình tia chứa nước rửa 30 giây (lưu ý rửa nhẹ, không tia trực tiếp lên vết bôi để tránh trôi hết vi sinh vật)

✓ Hơ khô trên ngọn lửa đèn cồn

✓ Nhuộm màu bổ sung bằng dung dịch Safranin 0 hoặc Suchsin Ziehl trong vòng

1 phút, rửa nước, làm khô

✓ Nhỏ 1 giọt dầu lên vết bôi

✓ Quan sát bằng vật kính X100 với dầu soi kính:

*Cách nhận biết :

- Gram dương: bắt màu xanh đen hoặc tím;

- Gram âm: bắt màu đỏ vàng hoặc màu đỏ tía

*Ý nghĩa của việc nhuộm gram:

- Giúp dễ dàng hóa việc quan sát hình dạng tế bào, các thành phần cấu trúc của

tế bào vsv trên kính hiển vi

-Giúp phân biệt các loài vi khuẩn thành hai nhóm gram dương và gram âm

• Kết quả: phát hiện được chủng vi khuẩn Gram dương hình que và chủng vi khuẩn

Ecoli Gram âm hình que

Trực khuẩn Gram dương Ecoli Gram âm