Báo cáo Thực Hành Vi Sinh Học Đại Cương

Phương pháp cấy truyền • Vi khuẩn – Bacillus cereus cấy truyền trên ống nghiệm môi trường TSA trái.. 2.1.3.Phương pháp phân lập Phương pháp phân lập vi sinh vật: Lưu ý : Dán nhãn ghi tên

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM

BÁO CÁO THỰC HÀNH

VI SINH HỌC ĐẠI CƯƠNG

Nhóm: I

Sinh viên thực hiện:

Giảng viên hướng dẫn:

TP.HCM, ngày 25 tháng 6 năm 2020

HÌNH ẢNH CỦA BÀI BÁO CÁO 3

BÀI 1: MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG, PHƯƠNG PHÁP KHỬ TRÙNG 4

1.1 Các thiết bị trong PTN vi sinh 4

1.2 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật 4

1.3 Phương pháp khử trùng 6

BÀI 2: PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP VÀ CẤY TRUYỀN VI SINH VẬT 7

2.1 Phân lập 7

2.2 Phương pháp cấy truyền 8

2.3 Kết quả thực hành 9

BÀI 3: PHƯƠNG PHÁP LÀM TIÊU BẢN VÀ QUAN SÁT TẾ BÀO VSV 10 3.1 Quan sát đại thể 10

3.2 Quan sát vi thể 10

BÀI 4: ĐẾM TRỰC TIẾP NẤM MEN BẰNG BUỒNG ĐẾM HỒNG CẦU 13 4.1 Giới thiệu buồng đếm hồng cầu 13

4.2 Quy trình đếm nấm men 13

4.3 Tính kết quả 13

4.4 Ưu điểm của phương pháp đếm trực tiếp tế bào nấm men bằng BĐHC 14

4.5 Nhược điểm của pp đếm trực tiếp nấm men bằng BĐHC 14

4.6 Ứng dụng của đếm trực tiếp nấm men bằng BĐHC 14

BÀI 5: KHẢO SÁT ĐẶC TÍNH SINH HÓA CỦA VSV 15

5.1 Mục đích 15

5.2 Yêu cầu khi thực hiện phản ứng sinh hóa 15

5.3 Một số phản ứng cơ bản 15

HÌNH ẢNH CỦA BÀI BÁO CÁO

Hình bài 2

2.3 Kết quả thực hành

Phương pháp phân lập

• Nấm men – M6 phân lập trên đĩa petri môi

trường Sab

Phương pháp cấy truyền

• Vi khuẩn – Bacillus cereus cấy truyền trên ống

nghiệm môi trường TSA (trái)

• Nấm men – M6 cấy truyền trên ống nghiệm môi

trường PDA (phải)

Hình bài 3

3.2 Quan sát vi thể:

• Nấm men – M6 quan sát trên kính hiển vi

Hình bài 5

Vi khuẩn Nấm men

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

BÀI 1: MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG, PHƯƠNG PHÁP KHỬ TRÙNG

1.1 Các thiết bị trong PTN vi sinh

Nồi hấp tiệt trùng Khử trùng môi trường dụng cụ

Cân Cân hóa chất, môi trường

Tủ ủ Ủ, nuôi cấy vi sinh vật ở các nhiệt độ mong muốn

Bếp khuấy từ Nấu môi trường và giúp quấy đều môi trường

Kính hiển vi Quan sát vi sinh vật

Tủ sấy

Sấy khô hoặc khử trùng dụng cụ ( thủy tinh, kim loại ) Ở nhiệt độ 160 độ C thời gian là 2 tiếng, nhiệt độ 180 độ C thời gian là 30 phút

Máy ly tâm Thu sinh khối

Máy đồng nhất mẫu

Stomacher 400 Đồng nhất mẫu ( chất rắn ).

Máy đếm khuẩn lạc Đếm các khuẩn lạc

Tủ lạnh Bảo quản hợp chất và môi trường, vi sinh vật và mẫu

Máy rung ống

nghiệm Dùng đồng nhất chất lỏng trong ống nghiệm.

Lò vi sóng Làm lỏng môi trường

1.2 Môi trường nuôi cấy VSV

1.2.1 Khái niệm:

Môi trường là nơi có điều kiện thích hợp cho vi sinh vật phát triển, cung cấp đầy đủ chất dinh dưỡng, và có nồng độ pH thích hợp

1.2.2 Yêu cầu của môi trường dinh dưỡng nuôi cấy VSV

Môi trường cần phải đủ lượng và đủ chất mới đảm bảo được sự phát triển vủa vi sinh vật là trạng thái tốt nhất

1.2.3 Phân loại

1.2.3.1 Phân loại môi trường theo công dụng

Phân lập, cấy truyền…

1.2.3.2 Phân loại môi trường theo thành phần hoá học

1.2.3.3 Phân loại môi trường theo trạng thái vật lý

Ảnh hưởng của agar tới trạng thái vật lý của môi trường:

1.2.4 Công thức môi trường

Môi trường P.D.A (Potato Dextrose Agar): dùng để nuôi cấy men, mốc

có

trong công thức môi trường:

• Tên môi trường: P.D.A (Potato Dextrose Agar)

• Công dụng: nuôi cấy men, mốc

• pH: 4.5 – 5

• Chế độ khử trùng: 121 ℃ /15’/ 0.1 Mpa

• Thành phần hóa học:

Trạng thái

vật lý

Hàm lượng agar/lit Công dụng của môi trường

Đặc 15-20 g/l Phân lập, nhân giống

Hơi sệt sệt ( bán

Kiểm tra khả năng di động của vi sinh vật

Agar: 20 g 121 ℃ /15’/ 0.1 Mpa

Khoai tây: 200 g Dextrose: 40 g

Agar: 20 g

1.2.5 Các bước để nấu môi trường

Chuẩn bị môi trường

Bước 1: Cân, đong ( bằng ống đong ) môi trường theo công thức

Bước 2: Đun ( nếu cần ), kiểm tra pH

Bước 3: Phân phối môi trường vào dụng cụ vô trùng

Bước 4: Khử trùng theo yêu cầu

1.3 Phương pháp khử trùng

1.3.1.Khử trùng môi trường

 Phương pháp khử trùng môi trường: nhiệt ẩm, lọc, dùng tia U.V

 Khử trùng môi trường bằng phương pháp nhiệt ẩm:

Phương

Nguyên lý khả năng diệt VSV

Nhiệt ẩm Nhiệt độ: 121 ℃

Thời gian: khoảng 10-15 phút

Dựa vào hơi nước bão hòa

ở nhiệt độ cao, áp suất cao

1.3.2 Khử trùng dụng cụ

• Dụng cụ thủy tinh: sử dụng nhiệt ẩm ( nồi hấp tiệt trùng ), nhiệt khô ( tủ sấy )

• Dụng cụ nhựa: sử dụng nhiệt ẩm ( nồi hấp tiệt trùng )

• Khử trùng phòng thí nghiệm: phun hơi độc, đèn UV

BÀI 2 PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP VÀ CẤY CHUYỀN VSV

2.1 Phân lập

2.1.1.Khái niệm

Chuyển từ quần thể qua khuẩn lạc

2.1.2.Mục đích phân lập

Tạo dòng thuần

2.1.3.Phương pháp phân lập

Phương pháp phân lập vi sinh vật:

Lưu ý : Dán nhãn ghi tên giống vi sinh vật, tên môi trường nuôi cấy, ngày cấy vào thành ống nghiệm và tên người thực nghiệm trên đĩa pitre

 Với nấm men, vi khuẩn : dùng que cấy vòng

Bước 1:Hơ nóng khử trùng que cấy dưới đèn cồn

Bước 2: Dùng que cấy lấy vi sinh vật trong ống môi trường nuôi cấy nấm men hoặc vi khuẩn

Bước 3: Một tay hé mở nắp đĩa pêtri vừa đủ để cho que cấy vào ( để kế bên đèn cồn

để không bị nhiễm vi sinh vật từ môi trường ngoài ) Sau đó lướt que cấy lên mặt thạch theo phương pháp sau:

2.2 Phương pháp cấy chuyền

Men

, VK

Que cấy vòng

2.2.1.Khái niệm

Truyền vi sinh vật từ môi trường này sang môi trường khác

2.2.2.Mục đích

Giúp bảo quản, nhân giống và khảo soát sinh hóa

2.2.3 Phương pháp cấy chuyền

Phương pháp cấy chuyền VSV:

+ Lưu ý : Dán nhãn ghi tên giống vi sinh vật, tên môi trường nuôi cấy, ngày cấy vào thành ống nghiệm và tên người thực nghiệm trên đĩa pitre

Bước 1:Hơ nóng khử trùng que cấy dưới đèn cồn

Bước 2: Dùng que cấy lấy vi sinh vật trong ống môi trường nuôi cấy nấm men hoặc vi khuẩn

Bước 3: Tay khác lấy ống môi trường để nuôi cấy hơ qua ống dưới đèn cồn để khử trùng (để kế bên đèn cồn để không bị nhiễm vi sinh vật từ môi trường ngoài ) Sau đó đưa que cấy chứa vi sinh vật vô môi trường theo phương pháp sau:

Kết quả thực hành

Hình trang 3 ( HÌNH CHUNG ) Hình ảnh kết quả của:

 Phương pháp phân lập nấm men – M6 trên môi trường SAD trong đĩa petri

 Phương pháp cấy truyền nấm men – M6 trên môi trường PAD trong ống nghiệm thạch nghiêng

 Phương pháp cấy truyền vi khuẩn – Bacillus cereus trên môi trường TSA trong ống nghiệm thạch nghiêng

VSV Môi

trường

Que

Men,

VK

Lỏng

Q ue cấy vò ng

Thạch nghiêng

Thạch nghiêng sâu

Q ue cấy thẳ ng Thạch đứng

Mốc

Thạch nghiêng

Q ue cấy mó c

BÀI 3 PHƯƠNG PHÁP LÀM TIÊU BẢN VÀ QUAN SÁT TẾ BÀO VSV

3.1 Quan sát đại thể

• Quan sát khuẩn lạc bằng mắt để thấy được đặc điểm của khuẩn lạc như màu sắc,

hình dạng, đường kính, độ vun, bóng, nhăn, có sợi

• Việc quan sát đại thể các khuẩn lạc điển hình trên môi trường phân lập chọn lọc giúp

dự đoán được đó là VSV nào

• Mô tả khuẩn lạc cuả VSV đã phân lập ở Bài 2:

Khuẩn lạc của nấm men - M6, trên môi trường Sab Hình dạng: tròn Bờ, mép khuẩn lạc: bóng Đường kính: Màu sắc: trắng đục

3.2 Quan sát vi thể

Làm tiêu bản và quan sát tiêu bản đó dưới kính hiển vi (KHV) để thấy được:

Hình dạng, cách sắp xếp, kích thước của tế bào

Ví dụ: Hình ảnh quan sát nấm men - M6: Hình ở trang 3 ( hình chung )

3.2.1 Làm tiêu bản nấm mốc (phương pháp giọt ép)

3.2.2 Làm tiêu bản bằng phương pháp nhuộm đơn

Bước 1: Ghi tên VSV Làm vết bôi

Bước 2: Cố định vết bôi: hơ trên ngọn lửa đèn cồn đến khi vết bôi khô Mục đích cố

định vết bôi:

+ Giết chết VSV + Giúp VSV dễ bắt màu thuốc nhuộm

+ Gắn chặt VSV trên lame + Giúp VSV không bị trôi khi rửa nước

Bước 3: Nhuộm màu.

Nhỏ thuốc nhuộm Gentiant Violet (Crystal violet) Để 1 phút Rửa nước Nhỏ Lugol

Để 1 phút Rửa nước Tấy cồn Rửa nước

Nhỏ thuốc nhuộm Fuschin (hoặc Safranin) Để 30 giây Rửa nước

Bước 4: Quan sát KHV vật kính 100 (vật kính dầu) Vẽ hình quan sát được Miêu tả

hình dạng 1 tế bào, cách sắp xếp tế bào, tế bào bắt màu thuôc nhuộm nào

Bài tập ở nhà:

So sánh phương pháp nhuộm đơn và nhuộm kép

Giống kính hiển vi.Đều phải cố định vết bôi rồi mới nhuộm để quan sát tiêu bản dưới

Khác

Quy trình

Chỉ cần nhuộm màu 1 lần (sử dụng 1 trong các loại thuốc nhuộm sau: Gentiant violet, Fuschin, Xanh metylen, Xanh

coton)

Phải nhuộm màu 2 lần Đầu tiên nhỏ thuốc nhuộm Gentiant Violet (Crystal violet) Sau đó nhỏ Lugol Nhuộm them 1 lần nữa bằng thuốc nhuộm Fuschin (hoặc Safranin)

Mục đích

Giúp phân biệt hai nhóm vi khuẩn (gram dương và gram âm) dựa trên sự khác nhau về đặc điểm thành tế bào

Giúp ta quan sát và phân biệt cấu trúc tế bào dễ dàng hơn so với việc

nhuộm đơn

3.2.2.1 Tại sao phải nhỏ dầu xem kính lên tiêu bản khi quan sát KHV ở vật kính 100?

Vì dầu soi kính hiển vi là dầu trong suốt, có chỉ số khúc xạ cao, nên nó hỗ trợ làm tăng độ phân giải hình ảnh, cho chất lượng hình ảnh khi quan sát rõ nét hơn

3.2.2.2 Giải thích cơ chế bắt màu tím của VK Gram + và màu hồng của VK Gram- ?

Vi khuẩn Gram dương và Gram âm có cấu tạo vách tế bào khác nhau, do đó khi thực hiện nhuộm thì chúng sẽ bắt màu các thuốc nhuộm khác nhau

+ Vi khuẩn Gram (+): có màu tím

+ Vi khuẩn Gram (-): có màu hồng

- Với vi khuẩn Gram dương: chúng có lớp vách tế bào peptidoglycan dày, dạng lưới có khả năng bắt màu tím của thuốc nhuộm tím gentian tinh thể Cũng vì lớp vách dày nên việc tẩy cồn sẽ khó khăn hơn do đó vi khuẩn giữ được màu tím của thuốc nhuộm tím Gentian

- Với vi khuẩn Gram âm: lớp vách peptidoglycan mỏng hơn và nó có thêm lớp màng

lipopolysaccharide phía ngoài, khi tẩy cồn cồn hòa tan lớp màng và do lớp vách mỏng bị cồn tẩy dễ dàng nên nó không giữ được màu tím của thuốc nhuộm mà sẽ bắt màu thuốc nhuộm sau là dung dịch Fushin kiềm

BÀI 4 ĐẾM TRỰC TIẾP NẤM MEN BẰNG BUỒNG ĐẾM HỒNG CẦU 4.1. Giới thiệu buồng đếm hồng cầu

Buồng đếm hồng cầu là phiến kính thuỷ tinh hình chữ nhật, trên đó có khắc lưới đếm

Lưới đếm là 1 hình vuông, có cạnh 1mm gồm 25 ô vuông lớn, 1 ô vuông lớn có 16 ô vuông nhỏ; các ô vuông lớn chia cắt nhau bởi 3 đường kẻ song song, chiều cao đường khắc trên lưới đếm là 0,1 mm

S lưới đếm = 1mm2 S ô vuông nhỏ = 1/ 400mm2

S ô vuông lớn = 1/25 mm2 V ô vuông nhỏ = 1/ 4000 mm3

4.2. Quy trình đếm nấm men

Bước 1 Pha loãng dịch mẫu

Bước 2 Đưa dịch mẫu vào lưới đếm

Bước 3 Đếm tế bào nấm men

Quan sát lưới đếm ở vật kính 10, chuyển qua vật kính 40 để đếm các tế bào trong 5 ô vuông lớn theo vị trí đường chéo góc Ghi lại kết quả

Cách đếm: Đếm tất cả tế bào trong ô vuông lớn và tế bào nằm trên 2 cạnh liên tiếp

4.3 Tính kết quả

A: Tổng tế bào đếm được ở 5 ô vuông lớn V: thể tích ô vuông nhỏ

10–n: nồng độ pha loãng được đếm 1000: hệ số chuyển mm3 thành mL

Số tế bào trong 5 ô vuông lớn:

Ô 1: 10

Ô 2: 18

Ô 3: 19

Ô 4: 26

Tổng: A = 87 tế bào

Kết quả:

Số tế bào /ml =

Tổng số tế bào

Số vuông nhỏ Thể tích ô vuông nhỏ Nồngđộ pha loãngđược đếm.100=

A

5.16 1

4000 10

0

.100

=

87 5.16 1

4000 10

0

.100 = 435000

4.4 Ưu điểm của pp đếm trực tiếp tế bào nấm men bằng BĐHC

Đếm dễ dàng, nhanh, tiết kiệm được thời gian

4.5 Nhược điểm của phương pháp đếm trực tiếp nấm men bằng BĐHC

Tỉ lệ sai số cao: 10%

4.6 Ứng dụng của đếm trực tiếp nấm men trên BĐHC

Dùng để đếm tế bào hồng cầu trong máu, nấm men và vẽ đường cong sinh trưởng

BÀI 5 KHẢO SÁT ĐẶC TÍNH SINH HOÁ CỦA VSV 5.1 Mục đích

Góp phần định danh VK

5.2 Yêu cầu khi thực hiện phản ứng sinh hoá

Yêu cầu về VSV:

• Còn non (nếu già vsv sẽ chuyển hóa chậm)

• Dòng thuần, không bị tạp nhiễm

• Đọc kết quả đúng thời gian quy định ( thời gian đọc kết quả: sau 24 – 4 giờ

nuôi cấy)

5.3 Một số phản ứng cơ bản

Đối với vi khuẩn E.coli

Một số phản ứng sinh hoá cơ bản:

Phản

ứng

Mục

Cách thực

Đọc kết quả

CIT

(số 6)

Simmon

citrate

Kiểm tra vi

khuẩn có

sử dụng citrate như

nguồn carbohydra

te duy nhất

trong môi

trường các

chất vô cơ

tổng hợp

-Tên: Simmons citrate agar

-pH:6.9+/- 0.2, 25℃ -Chỉ thị màu:

Bromothymol Blue -Đặc điểm đổi màu:

+ph<7 (axit): màu vàng +pH=6.9: xanh lá

+pH>7 (kiềm):xanh dương

-Thành phần và tỷ lệ các

Cấy vi sinh vật vào ống nghiệm (môi trường thạch nghiêng) theo đường zich zag Sau

Khi vi khuẩn sử dụng citrate, muối ammonium chuyển thành ammoniac, do

đó tăng tính kiềm

Sự chuyển đổi pH (pH>7.6) dẫn tới chuyển chất chỉ thị Bromthymol blue chuyển từ xanh

lá thành xanh da trời

Dương tính Dung dịch màu xanh biển, cho thấy vi sinh vật

đã sử dụng citrate

hay không chất quan trọng:

+ Sodium Citrate (dehydrate) – nguồn carbohydrate duy nhất :2g

+Bromothymol Blue:

0,08g

đó ủ 24 giờ ở 37℃

ESC

(số 7)

Giúp phân

biệt các

loài bacillus

đường

ruột

-Tên môi trường: Kligler Iron Agar (KIA)

- pH : 7.4 +/- 0.2 ở 25ºC -Chỉ thị màu: Phenol Red

-Đặc điểm đổi màu:

+pH=7.4 (kiềm): màu đỏ +pH<7 (axit): màu vàng -Thành phần và tỷ lệ các chất quan trọng:

+ Dextrose: 1g + Lactose: 10g + Peptone: 15g + Phenol Red: 0,024g

Cấy vi sinh vật vào môi trường

Sau đó ủ

24 giời ở

37℃

Lên men glucose (dextrose), làm giảm

pH môi trường, chỉ thị phenol red chuyển từ đỏ sang

vàng

Lên men lactose (nếu thuộc nhóm lên men lactose) sau khi sử dụng hết glucose, tạo sản phẩm có tính acid, nên vẫn giữ pH

ở mức thấp và giữ nguyên màu vàng của thạch

Lên men glucose và biến dưỡng acid amin, tạo NH3, làm

pH môi trường tăng, chỉ thị phenol red chuyển từ vàng sang

đỏ Môi trường chia

2 phần (đỏ/vàng) sau

18 – 24h nuôi cấy

Âm tính Dung dịch

có màu vàng Không lên men glucose lẫn lactose giữ nguyên

pH môi trường

IND

(số 8)

Thử nghiệm

sinh indole,

được sử

-Tên môi trường:

Trytophan broth -pH: 7.5+/-0.2 ,25℃

-Chỉ thị màu: Kovac -Thành phần và tỷ lệ các

Cấy vi sinh vật vào môi trường

Sau đó ủ

Khi vi khuẩn có trytophan sẽ phân hủy trytone thành indole, sau đó nhỏ thêm 1 giọt Kovac,

Dương tính Sau khi nhỏ 1 giọt Kovac ta

dụng trong

việc khẳng

định E.coli,

Shigella và

Salmonell

chất quan trọng:

+Tryptone: 10,0 g +DL-Tryptophan: 1,0 g

24 giờ ở

37℃

nếu xuất hiện vòng

đỏ chứng tỏ vi sinh vật là E.coli

thấy xuất hiện vòng tròn đỏ cho thấy

vi sinh vật

là E.coli

VP

(số 9)

Xác định

khả năng

sinh acetylmeth

ylcarbinol

(acetoin)

trong quá

trình lên

men glucose

của một số

vi sinh vật

Từ đó xác

định nhóm

trực khuẩn

gram âm

đường

ruột

-Tên môi trường:

MR-VP broth -pH:6.8 – 7.0 (17 g/l,

H O, 37 °C) (sau khử ₂O, 37 °C) (sau khử trùng ướt)

-Chỉ thị màu:

+ KOH 40%, (chất oxi hóa)

+ α−¿naphtol, (chất tăng cường màu)

-Đặc điểm đổi màu:

+pH 6.8-7 (trung tính):

màu vàng +pH>7(kiềm): màu đỏ -Thành phần và tỷ lệ các chất quan trọng:

+Dextrose: 5g

Cấy vi sinh vật vào môi trường

Sau đó ủ

24 giờ ở

37℃

Vi sinh vật lên men glucose sau đó chuyển hoá axit pyruvic để tạo thành acetyl-methyl carbinol (acetoin)

Sau khi ta cho α−¿

naphtol, cho thêm KOH 40% thì acetion chuyển thành diacetyl (do KOH) sau đó được chuyển thành một phức hợp màu đỏ (do α−¿

naphtol) Escherichia coli (âm tính), Klebsiella–

Enterobacter (dương

tính)

Âm tính Dung dich màu vàng cam trên

bề mặt môi trường (như màu của thuốc thử), cho thấy vi sinh vật là E.coli

MLO

(số 10)

Xác định

khả năng

sử dụng

Sodium

malonate

là nguồn

carbon duy

nhất cùa vi

sinh vật và

kết quả là

tạo môi

-Tên môi trường:

Malonate broth

-pH: 6.7 ± 0.2, 25 ° C -Chỉ thị màu:

Bromthymol blue – chất chỉ thị pH

-Đặc điểm đổi màu:

+pH 6.7 (axit): màu xanh lá

+pH>7 (kiềm): màu xanh dương

-Thành phần và tỷ lệ các

Cấy vi sinh vật vào môi trường

Sau đó ủ

24 giờ ở

37℃

Malonate phá vỡ tạm thời chu trình Krebs khiến vi sinh vật không phát triển được trừ khi vi sinh vật phải sử dụng malonate là nguồn carbon để phát triển

Âm tính Dung dịch màu xanh

lá cho thấy vi sinh vật không sử dụng malonate