Báo cáo: Thí nghiệm vi sinh vật học thực phẩm

Báo cáo Thí nghiệm vi sinh vật học thực phẩm trình bày các nội dung chính như: Môi trường nuôi cấy vi sinh vật, kỹ thuật gieo cấy và phân lập, định lượng – tách vi sinh vật, quan sát vi sinh vật nói chung trên,...Mời các bạn cùng tham khảo!

Tr ườ ng Đ i h c Bách Khoa Thành ph  H  Chí Minh ạ ọ ố ồ

Khoa K  Thu t Hoá H c ỹ ậ ọ

  Tp HCM, 11/2013 

M C L C Ụ Ụ

BÀI 1: MÔI TR ƯỜ NG NUÔI C Y VI SINH V T Ấ Ậ

I. M c đích thí nghi mụ ệ

­ T o môi trạ ường thu n khi t đ  nuôi c y vi sinh v t.ầ ế ể ấ ậ

­ Bi t cách chu n b  d ng c  c n cho quá trình nuôi c yế ẩ ị ụ ụ ầ ấ

­ Bi t cách bao gói đĩa petri, pipet,  ng nghi m và vô khu n chúng đ  đ m b o môiế ố ệ ẩ ể ả ả  

trường đ  sách cho vi c nuôi c y.ủ ệ ấ

II. S  lơ ược lí thuy tế

Phân lo i theo tr ng thái lý hóa:ạ ạ

Môi trường l ng: lên men, nhân gi ng, nghiên c u m t s  đ c tính.ỏ ố ứ ộ ố ặMôi trường r n(môi trắ ường đ c): môi trặ ường l ng k t h p v i ch t t oỏ ế ợ ớ ấ ạ  

đ c agar (2­2.5%), gelatin (10­15%)­đ  phân l p, đ nh lặ ể ặ ị ượng, gieo gi ngố  

và gi  gi ng vi sinh v t. ữ ố ậMôi trường bán r n: hàm lắ ượng ch t t o đ  đ c ít h n môi trấ ạ ộ ặ ơ ường r nắ  

thường dùng (0.3­0.7% agar) – dùng đ  quan sát kh  năng chuy n đ ngể ả ể ộ  

c a m t s  vi sinh v t ( t o nên đủ ộ ố ậ ạ ường đi trên b  m t môi trề ặ ường).Phân lo i theo thành ph n:ạ ầ

Môi trường t ng h p: ổ ợMôi trường t  nhiên:ựMôi trường hòa tan chu n b  s nẩ ị ẵ

3. Yêu c u môi trầ ường dinh dưỡng

Có đ y đ  các ch t dinh dầ ủ ấ ưỡng c n thi t.ầ ế

Có pH thích h p.ợ

Không ch a các y u t  đ c h i.ứ ế ố ộ ạ

(3) Ch nh đ  đỉ ộ ường: dùng balling k  đ a v  dung d ch đế ư ề ị ường 70

(4) Phân ph i: 3  ng nghi m 1/4, 2  ng nghi m ½ố ố ệ ố ệ

(5) H p ti t trùng: 15­20pấ ệ

Môi trường th ch nghiêng: cho vào 1/4  ng nghi m sau đó đ  nghiêng đ nh hình ạ ố ệ ể ị

Môi trường th ch đ ng: cho vào  ½  ng nghi m sau đó đ  th ng đ ngạ ứ ố ệ ể ẳ ứ

Thao tác phân ph i ph i nhanh, khéo léo đ  môi trố ả ể ường không dính vào mi ng  ngệ ố  nghi m, đĩa petri hay nút bông và c n th c hi n trệ ầ ự ệ ước khi môi trường b  đông đ c.ị ặMôi trường th ch ph i ph ng, nh n.ạ ả ẳ ẵ

IV. K t quế ả

Ta có công th cứ

V1 . N1 = V2 . N2        V2= V1 . N1 / N2Trong đó

V1  Th  tích môi trể ường sau khi l c tinh.ọ

N1  Đ  độ ường sau khi l c tinh.ọ

N2  Đ  độ ường c n đi u ch nh là ầ ề ỉ  = 70 Balling

Th  tích nể ướ ầc c n thêm vào = V2 – V1

N1(0) V1(ml) N2 (0) V2(ml) VH2O thêm vào

V. M t s  chú ý trong ti n trình thí nghi m:ộ ố ế ệ

­ D ng c  bao gói ph i đ m b o s ch và khô.ụ ụ ả ả ả ạ

­ Bao gói ph i th t kín và c n th n đ  d ng c  sau khi kh  trùng v n đ m b o s  vôả ậ ẩ ậ ể ụ ụ ử ẫ ả ả ự  trùng trong l p gi y gói và l y ra s  d ng d  dàng.ớ ấ ấ ử ụ ễ

­ Đ u nút tròn, đ  ch t v a ph i.ầ ộ ặ ừ ả

­ L y nút ra hay đóng vào d  dàng.ấ ễ

­ Ph n gi y bao gói ph i ch t kín.ầ ấ ả ặ

VI. Bàn lu n và m  r ngậ ở ộ

1. Đánh giá ch t t o đ c cho môi trấ ạ ặ ường:

Gelatin tuy làm đông môi trường nh ng môi trư ường tan ch y   37 ả ở 0C, m t nhi t độ ệ ộ 

t i  u c a vi khu n gây b nh cho đ ng v t, ngoài ra thì nhi u vi sinh v t phân h yố ư ủ ẩ ệ ộ ậ ề ậ ủ  gelatin làm l ng môi trỏ ường

Agar không ch  đông đ c t t   nhi t đ  dỉ ặ ố ở ệ ộ ưới 400C mà còn không b  vi sinh v tị ậ  phân gi i làm bi n tính.ả ế

2. Gi  gi ng trên môi trữ ố ường th ch nghiêngạ

Phương pháp này khá ph  bi n vì r t đ n gi n và ti n l i, tuy nhiên th i gian giổ ế ấ ơ ả ệ ợ ờ ữ 

gi ng ch  nên kéo dài trong 1 tháng , sau đó ph i c y truy n l i trên môi trố ỉ ẩ ấ ề ạ ường m i.ớ  

Do đó t n nhi u công s c và d  b  m t các đ c tính di truy n ban đ u. Phố ề ứ ễ ị ấ ặ ề ầ ương pháp này được ti n hành nh  sau:ế ư

Thu n khi t ch ng vsv trên môi trầ ế ủ ường agar   đĩa petri, ch n các khu n l c đi nở ọ ẩ ạ ể  hình và c y lên môi trấ ường th ch nghiêng thích h p, sau đó nuôi c y trong t   m đạ ợ ấ ủ ấ ể vsv phát tri n bình thể ường, l y các  ng gi ng ra và cho vào t  l nh gi    4ấ ố ố ủ ạ ữ ở oC, hàng tháng c y truy n l i vào môi trấ ề ạ ường m i.ớ

Nên cho thêm vào môi trường 0,1 M citrat natri ho c 0,3M Oxalat đ  ch ng nhi mặ ể ố ễ  Bacteriophage

Phương pháp Tyndal: Nhi t đ  ti t khu n c a phệ ộ ệ ẩ ủ ương pháp này t  70­ừ

800C/1 gi  làm nh  v y 3 l n, m i l n cách nhau 24gi  ho c dùng nhi t đờ ư ậ ầ ỗ ầ ờ ặ ệ ộ 60­650C/1 gi  làm 5 l n. Th i gian nghĩ đ    nhi t đ  37ờ ầ ờ ể ở ệ ộ 0C. Phương pháp này thường được áp d ng ti t khu n ụ ệ ẩ các s n ph m d  b  h ng   nhi t ả ẩ ễ ị ỏ ở ệ  

đ  cao ộ  Tyndall cho r ng   nhi t đ  60­65ằ ở ệ ộ 0C hay   70­80ở 0C, vi khu n thẩ ể ding dưỡng s  b  ch t nh ng nha bào v n s ng, khi đ  ngu i đ n 37ẽ ị ế ư ẫ ố ể ộ ế 0C, nha bào chuy n sang th  ho t đ ng (th  dinh dể ể ạ ộ ể ưỡng) và l i b  tiêu di t   l nạ ị ệ ở ầ  

h p sau đó.ấ

Nhược đi m: kéo dài th i gian ti t khu n, đ  ti t khu n không  ch c  ch n.ể ờ ệ ẩ ộ ệ ẩ ắ ắ

BÀI 2: K  THU T GIEO C Y VÀ PHÂN L P Ỹ Ậ Ấ Ậ

I. Gieo c yấ

1. Đ nh nghĩaị

Gieo c y là quá trình chuy n các canh trấ ể ường vi sinh v t t  môi trậ ừ ường này sang môi trường khác v i mớ ục đích nhân  giống và gi  ữ giống. Môi trường m i đ m b oớ ả ả  thích h p cho sinh v t sinh trợ ậ ưởng và phát tri n.ể

Canh trường: môi trường đã có vi sinh v t.ậ

2. Yêu c u gieo c yầ ấ

Khi gieo cấy c n đầ ảm bảo vô trùng tuy t đệ ối khu v c xung quanh, gieo c y ph iự ấ ả  

th c hi n trên ng n l a đèn c n hay t  c y.ự ệ ọ ử ồ ủ ấ

Dụng cụ: Que cấy nhọn, móc  hoặc vòng, pipet, que trang,

Hình . M t s  dung c  và k  thu t gieo c y vi khu nộ ố ụ ỹ ậ ấ ẩ

Phương pháp c y trên th ch nghiêng:ấ ạ

Hình . M u c y ziczac và c y song songẫ ấ ấ

Hi u khí: c y đi m, c y ziczac, c y song song.ế ấ ể ấ ấ

Y m khí: đu i khí, c y đâm sâu vào trong  ng nghi m. ế ổ ấ ố ệ

N u c y chuy n vi khu n hay n m men thì di que c y trên b  m t th ch theo hìnhế ấ ề ẩ ấ ấ ề ặ ạ  

Hình . C y g c trên môi trấ ạ ường đĩa petri

­ C y tr n:  ph i tr n d ch c y v i th ch (50ấ ộ ố ộ ị ấ ớ ạ 0C) sau đó l c đ u và đ  vào h pắ ề ổ ộ  petri đã kh  trùng. Xoay tròn đĩa đ  th ch phân b  đ u, đ  yên cho môi trử ể ạ ố ề ể ườ  ng

đ c l i và cu i cùng là bao gói và nuôi trong t   m. (có th  cho d ch c y vàoặ ạ ố ủ ấ ể ị ấ  petri trước và ti p theo đ  th ch vào đĩa petri).ế ổ ạ

­ C y ria: là vi c s  d ng que c y có ch a m u sau đó lấ ệ ử ụ ấ ứ ẫ ướt que c y lên m tấ ặ  

th ch  theo hình ch  chi hay đạ ữ ường song song ho c theo 4 góc.ặ

Hình . Cách c y truy n trên môi trấ ề ường đĩa th chạ

Hình . Các ki u c y trên đĩa th chể ấ ạ

5. Ti n hành thí nghi m (gieo c y trên môi trế ệ ấ ường th ch nghiêng  ng nghi m)ạ ố ệ

Hình . Trình t  c y truy nự ấ ề

Mô t  qui trình:ả

a) M t tay c m 2  ng nghi m: m t  ng canh trộ ầ ố ệ ộ ố ường và m t  ng môi trộ ố ường ( ng canhố  

trường n m bên ngoài,  ng môi trằ ố ường n m bên trong)ằ

Tay còn l i c m que c y và đ t đ  que c y trên ng n l a đèn c n.ạ ầ ấ ố ỏ ấ ọ ử ồ

Dùng ngón út và áp út rút nút bông c a  ng canh trủ ố ường ra

b) H  nóng kh  trùng mi ng  ng nghi m.ơ ử ệ ố ệ

c) Đ i que c y ngu i, l y vi sinh v t t   ng canh trợ ấ ộ ấ ậ ừ ố ường đ a sang  ng môi trư ố ường

d) Nh  nhàng lẹ ướt que c y trên m t th ch theo ki u hình ch  chi.ấ ặ ạ ể ữ

e) Rút que c y ra và đ t nóng que c yấ ố ấ

Kh  trùng l i ph n không khí n i mi ng  ng nghi m r i đ y nút bongử ạ ầ ơ ệ ố ệ ồ ậ

o Dùng pipet 10ml hút 5ml vi sinh v t cho vào bình tam giác có ch a s n 95mlậ ứ ẵ  

nước vô khu n và l c đ u (bình m u).ẩ ắ ề ẫ

o Dùng pipet 1ml hút 1ml vi sinh v t t  bình m u cho vào  ng nghi m th  nh tậ ừ ẫ ố ệ ứ ấ  

có ch a s n 9ml nứ ẵ ước vô khu n (đ  pha loãng 10­1)ẩ ộ

o Ti p t c dùng pipet 1ml hút 1ml vi sinh v t t   ng nghi m 1 cho vào  ngế ụ ậ ừ ố ệ ố  nghi m th  2 có ch a s n 9ml nệ ứ ứ ẵ ước vô khu n (đ  pha loãng 10­2)ẩ ộ

o L n lầ ượt ta làm tương t  đ i v i  ng th  3, th  4 và th  5(đ  pha loãng 10­3,ự ố ớ ố ứ ứ ứ ộ  

đ  pha loãng 10­4, đ  pha loãng 10­5)ộ ộ

b. Phân l p: đ i v i m u có đ  pha loãng: 1  ng 10ậ ố ớ ẫ ộ ố ­3, 1  ng 10ố ­4, 1  ng 10ố ­5

H p cách th y, rã đông môi trấ ủ ường ½ 

Tháo bao gói petri đã vô khu n, h  quanh h p petri trên ng n l a đèn c n.ẩ ơ ộ ọ ử ồ

Tay trái c m h p petri, dùng ngón tay hé m  n p và r i dùng tay ph i đ  th chầ ộ ở ắ ồ ả ổ ạ  

đã rã đông vào trong h p petri.ộ

Xoay đ u đ  th ch phân b  đ u trong h p và b  m t ph ng, nh n. Đ  ngu iề ể ạ ố ề ộ ề ặ ẳ ẵ ể ộ  cho th ch đông l i.ạ ạ

Dùng pipet l y m u    ng nghi m có đ  pha loãng 10­3 và cho vào h p petriấ ẫ ở ố ệ ộ ộ  (v n dùng tay đ  hé n p h p petri).ẫ ể ắ ộ

Vô khu n que trang b ng c n và h  nóng, sau đó đ  ngu i r i dàn đ u m uẩ ằ ồ ơ ể ộ ồ ề ẫ  trên b  m t th ch đ  n m men phát tri n đ u trên kh p b  m t th ch.ề ặ ạ ể ấ ể ề ắ ề ặ ạ

Đ   n đ nh trong 5 phút, l t ngể ổ ị ậ ược h p petri l i và ti n hành bao gói.ộ ạ ế

Đ  ngu i trong t   m   nhi t đ  thích h p (28­30ể ộ ủ ấ ở ệ ộ ợ 0C), trong vòng 48­72 gi ờIII. Bàn lu n và m  r ngậ ở ộ

I. S  lơ ượ ược l c lý thuy tế

1. Khái ni mệ

Đ nh lị ượng vi sinh v t là quá trình pha loãng m u sau đó c y chuy n m u quaậ ẫ ấ ề ẫ  

m t môi trộ ường m i nh m m c đích t o ra các t  bào riêng l  và đ m t ng s  t  bàoớ ằ ụ ạ ế ẻ ế ổ ố ế  

có trong 1g hay 1ml m u ban đ u.ẫ ầ

2. Phương pháp đ nh lị ượng:

Đ nh lị ượng tr c ti p: là phự ế ương pháp đ m tr c ti p s  t  bào vi sinh v t cóế ự ế ố ế ậ  trên tiêu b n làm t  m u.ả ừ ẫ

o Ưu đi m: cho k t qu  nhanh chóng.ể ế ả

o Nhược đi m: không phân bi t để ệ ượ ếc t  bào s ng và t  bào ch t.ố ế ế

o Phương pháp đ nh lị ượng tr c ti p: Phự ế ương pháp dùng bu ng đ m h ngồ ế ồ  

c u (thầ ường dùng nh t).ấ

Đ nh lị ượng gián ti p: là phế ương pháp đ nh lị ượng thông qua môi trường m iớ  

b ng cách gieo c y m t lằ ấ ộ ượng nh t đ nh m u lên m t môi trấ ị ẫ ộ ường dinh dưỡng thích 

h p, nuôi c y trong t   m, sau đó đ m t ng s  khu n l c và d a vào công th c đợ ấ ủ ấ ế ổ ố ẩ ạ ự ứ ể tính s  t  bào có trong 1g hay 1ml m u ban đ u.ố ế ẫ ầ

o Ưu đi m: k t qu  chính xác h n.ể ế ả ơ

o Nhược đi m: ể

­ M t nhi u kinh phí đ  làm môi trấ ề ể ường

­ M t nhi u th i gianấ ề ờ

3. Nguyên lý:

o Phương pháp đ  đĩa: m t ít vi sinh v t đã pha loãng đổ ộ ậ ược tr n đ u v i môiộ ề ớ  

trường agar nóng ch y và đả ược đ  vào h p petri vô khu n. Sau th i gian nuôiổ ộ ẩ ờ  

c y vi sinh v t s  m c thành nh ng khu n l c riêng l ấ ậ ẽ ọ ữ ẩ ạ ẽ

o Phương pháp c y ria: que c y đấ ấ ượ ử ục s  d ng đ  c y ria nhi u l n h n h p viể ấ ề ầ ỗ ợ  sinh v t phân l p trên kh p b  m t môi trậ ậ ắ ề ặ ường đ c trong petri. Sau m i l n viặ ỗ ầ  sinh v t s  tách d n ra kh i h n h p và phát tri n thành m t khu n l c riêngậ ẽ ầ ỏ ỗ ợ ể ộ ẩ ạ  

l ẽ

II. Ti n hành thí nghi mế ệ

Chu n b  d ng c :ẩ ị ụ ụ

o Erlen ch a 95ml nứ ước vô khu nẩ

o 5  ng nghi m ch a 9ml nố ệ ứ ước vô khu nẩ

Hình . Trình t  pha loãng m uự ẫ

­ L u ý:ư

o S  d ng  ng nghi m ch a 9ml nử ụ ố ệ ứ ước vô khu n.ẩ

o Gi a nh ng l n pha loãng nên đánh đ u b ng máy Vortex.ữ ữ ầ ề ằ

o Pipet nào thì dùng riêng cho  ng nghi m  ng v i đ  pha loãng đó. ố ệ ứ ớ ộ

o Thao tác nên th c hi n g n đèn c n đ  đ m b o vô khu n.ự ệ ầ ồ ể ả ả ẩ

o Không nên m  n p h p petri quá l n đ  tránh nhi m khu n.ở ắ ộ ớ ể ễ ẩ

o Thao tác th c hi n ph i nhanh.ự ệ ả

o Dùng nút bông đ y các  ng nghi m đ  tránh nhi m khu n.ậ ố ệ ể ễ ẩ

2. Phương pháp đ  h p (phổ ộ ương pháp tr n)ộ

o H p cách th y, rã đông môi trấ ủ ường ½  gi  môi trữ ường   nhi t đ  50ở ệ ộ 0C

o Cho 0.2ml m u v i đ  pha loãng tẫ ớ ộ ương  ng vào petri và đ   ng nghi m ch a môiứ ổ ố ệ ứ  

trường vào. 

o Xoay đ u h p petri cho m t th ch đ u và ph ng. Đ  môi trề ộ ặ ạ ề ẳ ể ường đ c l i. ặ ạ

o L t ngậ ược petri, bao gói, đ  vào t   m có nhi t đ  thích h p.ể ủ ấ ệ ộ ợ

o Sau 2­3 ngày, l y ra, đ m s  khu n l c và tính toán k t qu ấ ế ố ẩ ạ ế ả

3. Phương pháp c y ria (phấ ương pháp tách)

o H  đ  que c y, làm ngu i và l y m t ít vi sinh v t c n phân l pơ ỏ ấ ộ ấ ộ ậ ầ ậ

o Nghiêng hé m  h p petri, dùng que c y c y đở ộ ấ ấ ường dích d c trên ¼ h p petri.ắ ộ

o L y que c y ra đ t nóng đ  ngu i và ti p t c kéo vi sinh v t   ¼ đã c y và c y tấ ấ ố ể ộ ế ụ ậ ở ấ ấ ươ  ng

t  nh  trên t i ¼ c a ph n th  2ự ư ạ ủ ầ ứ

o Ti p t c thao tác trên v i ph n th  ba và th  t ế ụ ớ ầ ứ ứ ư

o L t ngậ ược, bao gói h p petri và nuôi trong t   m trong 48 gi L u ý:ộ ủ ấ ờ ư

o Thao tác ph i th c hi n g n đèn c n.ả ự ệ ầ ồ

o H  nóng que c y sau m i l n kéo di   nh ng ph n t  khác nhau.ơ ấ ỗ ầ ở ữ ầ ư

Hình . Các ki u c y riaể ấ

III. Tính toán và k t quế ả

K t qu  thu đế ả ược:

B ng  . K t qu  thí nghi m tìm s  t  bào/1ml m uả ế ả ệ ố ế ẫ

V y s  t  bào/1ml m u: X= 5.619.048   5,6×10ậ ố ế ẫ ≈ 6 t  bào.ế

S  t  bào/ 1ml m u ban đ u = X.100/5 = 112.380.960   1,1×10ố ế ẫ ầ ≈ 8 t  bàoế

IV. Bàn lu n và m  r ngậ ở ộ

M t s  phộ ố ương pháp khác đ  đ nh lể ị ượng vi sinh v t ho c đánh giá s  sinh trậ ặ ự ưởng c aủ  chúng

B ng  . Nhóm các phả ương pháp đ nh lị ượng vi sinh v tậ

Nhóm phương pháp Tên phương pháp Ph m vi áp d ngạ ụ

Phương pháp xác đ nh ị

sinh kh iố Phương pháp đo đ  đ cộ ụ

Phương pháp xác đ nh ịhàm lượng ch t khô ấ

c a sinh kh i ủ ố

Kh o   sát   s   sinh   trả ự ưởng   c aủ  VSV trong canh trường lên men

NADH,

Hàm lượng nit  t ngơ ổ

Kh o   sát   s   sinh   trả ự ưởng   c aủ  VSV trong canh trường lên men

 đây xin cung c p thêm m t s  thông tin v  2 ph ng pháp đ nh l ng VSV

tr c ti p thự ế ường dùng sau phương pháp dùng bu ng đ m hình c u: phồ ế ầ ương pháp đo 

đ  đ c và MPNộ ụ

Phương pháp đo đ  đ cộ ụ :

o C  s : khi pha l ng ch a nhi u ph n t  không tan s  t o thành h  huy n phù và có đơ ở ỏ ứ ề ầ ử ẽ ạ ệ ề ộ 

đ c b i các thành ph n trong môi trụ ở ầ ường l ng c n ánh sang, làm phân tán chùm sángỏ ả  

t i. T  bào VSV là m t th c th  nên khi hi n di n trong môi trớ ế ộ ự ể ệ ệ ường cũng làm đ c môiụ  

trường

o Phương pháp: xác l p quan h  t  l  tuy n tính gi a m t đ  t  bào VSV và đ  đ c.ậ ệ ỉ ệ ế ữ ậ ộ ế ộ ụ

o Xây d ng phự ương trình đường chu nẩ

o Đ nh lị ượng gián ti p thông qua đ  đ c OD d a v o đế ộ ụ ự ả ường chu n.ẩ

I. Gi i thi u s  lớ ệ ơ ược kính hi n viể

Kính hi n vi là m t h  th ng quang h c dùng đ  phóng đ i  nh c a v t c n quanể ộ ệ ố ọ ể ạ ả ủ ậ ầ  sát. Phân lo i: kính hi n vi quang h c, kính hi n vi hu nh quang, kính hi n vi đi n t ạ ể ọ ể ỳ ể ệ ử

C u t o c a kính hi n vi quang h c( g m 2 b  ph n: c  h c và quang h c):ấ ạ ủ ể ọ ồ ộ ậ ơ ọ ọ

B ng  . C u t o kính hi n vi quang h cả ấ ạ ể ọ

Th  kính: l p   đ u  ng kính, cóị ắ ở ầ ố  

c u t o g m hai th u kính (th  kínhấ ạ ồ ấ ị  7x, 10x, 15x…)

Đèn chi u sáng.ế

Hình . C u t o kính hi n vi quang h cấ ạ ể ọ

II. Các s  d ng kính hi n vi quang h cử ụ ể ọ

Làm tiêu b n, sau đóả

1. B t đèn sangậ

2. Đ t tiêu b n lên bàn kínhặ ả

3. Xoay v t kính nh  nh t v  phía tiêu b n (10ậ ỏ ấ ề ả x)

4. Dùng các  c di chuy n ngang v  phía có lá kínhố ể ề

5. Dùng  c di chuy n thô (nhanh, ngố ể ược chi u kim đ ng h ) đ  tìm th y  nh.ề ồ ồ ể ấ ả

6. Xoay v t kính sang 40ậ x

7. Dùng  c di chuy n tinh (ch m) đ  tìm th y  nh rõ nh t.ố ể ậ ể ấ ả ấ

8. Dùng  c di chuy n tinh (ch m) xoay đ  nhìn th y  nh rõ nét nh t.ố ể ậ ể ấ ả ấ

Đ  phóng đ i = th  kính * v t kínhộ ạ ị ậ

III. Phương pháp làm tiêu b n t m th iả ạ ờ

Có hai phương pháp ph  bi nổ ế

B ng  . So sánh tiêu b n gi t ép và gi t treoả ả ọ ọ

Tiêu b n gi t épả ọ Tiêu b n gi t treoả ọCách 

làm Dùng   que   c y   ho c   đũa   th y

tinh l y m t  ít vi sinh v t  đấ ộ ậ ể 

làm v t bôi. Ép lam men lên gi tế ọ  

canh trường t  t  h  lam menừ ừ ạ  

lên m t lam kính. Tránh đ t lamặ ặ  

nhanh  và  m nh  quá,  gi t  canhạ ọ  

c a   lam   kính,   cho   1   gi tủ ọ  canh   trường   lên   gi a   lamữ  men, C n th n xoay ngẩ ậ ượ  clam   kính   cho   gi t   canhọ  

trường xu ng phía dố ướ ồ  i r i

đ t lam men lên lam kính saoặ  cho gi t canh trọ ường “treo” 

trong   không   gian   lõm   c aủ  phi n   kính   Không   đ   gi tế ể ọ  canh   trường   lan   r ng   hayộ  

Hình . Cách làm tiêu b n gi t épả ọ

Hình , cách làm tiêu b n gi t treoả ọ

IV. Ti n hành thí nghi mế ệ

V. K t qu ­bàn lu n­ m  r ngế ả ậ ở ộ

B ng  . K t qu  quan sát n m men, vi khu nả ế ả ấ ẩ

N m menấ Vi   khu n   Bacillusẩ  

Tr c khu n ng n, ự ẩ ắ tr c khu n dàiự ẩ

Sinh s nả N y ch iả ồ Bào t  hình h t mè, cóử ạ  

Nhân  Nhân th c ự Không   có   nhân   (nhân 

Di chuy nể Không   di 

chuy nể Chuy n đ ngể ộ Chuy n đ ngể ộ

Do đi u ki n kính hi n vi không t t l m nên vi c quan sát g p nhi u khó khăn. Nênề ệ ể ố ắ ệ ặ ề  hình  nh c a n m men thì tả ủ ấ ương đ i riêng vi khu n thì khó quan sát.ố ẩ

Hình  nh m u quan sát đả ẫ ược

Hình . N m men (trên) Bacillus Subtilis (dấ ưới) dưới kính hi n viể

Hình  Vi khu n Lactose Bacillus ẩ

o M  r ngở ộ

d ng  c ch  m t s  vi sinh v t gây b nh, ngăn ch n s  phát tri n c a các ngu n b nhụ ứ ế ộ ố ậ ệ ặ ự ể ủ ồ ệ  trong th c ph m (Batt, 1999; Dubernet et al., 2002). Vì các ch ng lactobacillus thự ẩ ủ ườ  ng

c  trú trong đư ường ru t c a ngộ ủ ười và đ ng v t v i m t lộ ậ ớ ộ ượng s n có s  giúp kíchẵ ẽ  thích tiêu hoá th c ăn và tiêu di t m t s  vi khu n gây b nh đứ ệ ộ ố ẩ ệ ường ru t khác nên hi nộ ệ  nay trên th  trị ường có nhi u th c ph m, dề ự ẩ ược ph m có b  sung các ch ng probioticẩ ổ ủ  còn s ng.ố

Vi khu n Lactobacillus đẩ ược s  d ng trong nhi u s n ph m probiotic, cácử ụ ề ả ẩ  

ch ng Lactobacillus có đ c tính probiotic   đủ ặ ở ường d  dày – ru t ngạ ộ ười. Ngoài ra, các 

ch ng Lactobacillus có đ c tính probiotic   trên cũng th  hi n m t s  ích l i đ iủ ặ ở ể ệ ộ ố ợ ố  

v is c kh e con ngớ ứ ỏ ười nh : kháng v i các vi khu n gây b nh, t o ra bacteriocin vàư ớ ẩ ệ ạ  các ch t kháng khu nkhác. Đ ng th i, chúng cũng kháng v i m t s  lo i kháng sinh.ấ ẩ ồ ờ ớ ộ ố ạ  Tùy theo kh  năng kháng kháng sinh c a m i ch ng, chúng có th  đả ủ ỗ ủ ể ược đ a vào cư ơ 

th   c a   các   b nh   nhân   s   d ng   các   lo i   kháng   sinh   (nh :   amikacin,   kanamycin,ể ủ ệ ử ụ ạ ư  gentamicin, streptomycin, vancomycin và co­trimoxazole) mà không b  tiêu di t b i cácị ệ ở  

lo i kháng sinh mà chúng kháng l i, t  đó t o nên nh ng hi u qu  có l i cho b nhạ ạ ừ ạ ữ ệ ả ợ ệ  nhân

 H n n a, các ch ng Lactobacillus này cũng an toàn đ i v i ngơ ữ ủ ố ớ ườ ử ụi s  d ng khi 

nh y c m v  m t s  lo i kháng sinh. Đ c bi t, 11 ch ng Lactobacillus (g m: L.ạ ả ớ ộ ố ạ ặ ệ ủ ồ  paracasei/ casei B5, L. salivarius B6, L. gasseri B8a, L. fermentum B8b, L. fermentum B9a, L. gasseri B9b, L. rhamnosus B11, L.paracasei/ casei B17, L. rhamnosus M3, L. salivarius M5 và L. fermentum T16) có kh  năng kh  m c cholesterol huy t thanh đángả ử ứ ế  

k  10% – 33,34%. Các ch ng Lactobacillus này c n để ủ ầ ược ti p t c nghiên c u sâu h nế ụ ứ ơ  

đ   ng d ng s n xu t các s n ph m probiotic có tác d ng làm gi m cholesterol huy tể ứ ụ ả ấ ả ẩ ụ ả ế  thanh, nh m ngăn ch n b nh tim m ch   ngằ ặ ệ ạ ở ười

Có kh  năng sinh axit lacticả

ng d ng trong s n ph m th c ph m lên men  nh  salad cà chua, nem chua,…

Hình . D a c i mu i chua, nem chuaư ả ố

Ngoài ra Lactobacillus rhamnosus: Vi khu n giúp phòng và tr  nhi m xẩ ị ễ ạ

B. subtilis thường t n t i trong s n ph m   tr ng thái bào t , nh  v y khi u ngồ ạ ả ẩ ở ạ ử ờ ậ ố  vào d  dày, nó không b  acid cũng nh  các men tiêu hóa   d ch v  phá h y.   ru t, bàoạ ị ư ở ị ị ủ Ở ộ  

t  n y m m và phát tri n thành th  ho t đ ng giúp cân b ng h  vi sinh có ích trongử ẩ ầ ể ể ạ ộ ằ ệ  

đường ru t, c i thi n h  th ng tiêu hóa, nh t là sau khi s  d ng kháng sinh kéo dài.ộ ả ệ ệ ố ấ ử ụ

I. N m men và m c đích quan sát n m menấ ụ ấ

1. Đ c đi m hình thái t  bào n m men:ặ ể ế ấ

Hình .Hình v  n m menẽ ấ

­ Hình d ng: có hình b u d c, hình tr ng,… (tùy đi u ki n môi trạ ầ ụ ứ ề ệ ường). 

­ C u t o t  bào: thành t  bào, màng t  bào, t  bào ch t, ty th , riboxom, nhân, khôngấ ạ ế ế ế ế ấ ể  bào và các h t d  tr ạ ự ữ

­ Nh ng thay đ i c a t  bào n m men trong quá trình phát tri n:ữ ổ ủ ế ấ ể

o N m men tr  (qua 12­16 gi  nuôi c y): màng m ng, t  bào ch t đ ng nh t, không bàoấ ẻ ờ ấ ỏ ế ấ ồ ấ  

ch a có ho c m i b t đ u xu t hi n, t  bào sinh s n chi m t  l  cao.ư ặ ớ ắ ầ ấ ệ ế ả ế ỷ ệ

o N m men trấ ưởng thành (24­48 gi ): không bào l n, s  không bào có th  đ n hai,ờ ớ ố ể ế  

lượng glycogen tăng, t  bào sinh s n chi m t  l  cao 10­15%.ế ả ế ỷ ệ

o N m men đã già (72 gi  tr  lên): màng dày, nh n, nguyên sinh ch t không đ ng nh t,ấ ờ ở ẵ ấ ồ ấ  không bào l n, lớ ượng ch t béo tăng, t  bào h u nh  không sinh s n n a, không cóấ ế ầ ư ả ữ  glycogen, t  bào ch t chi m t  l  l n.ế ế ế ỷ ệ ớ

Đ  bi t để ế ượ ước,  c tính lượng d ch cho vào nuôi c yị ấ

Đánh giá canh trường đã nuôi đang   giao đo n nào, th i gian bao lâu (tr , trở ạ ờ ẻ ưở  ngthành hay già). Bi t đế ượ ố ấc s  n m men s ng ch t.ố ế

Thao tác l i cách làm tiêu b n gi t ép.ạ ả ọ

II. Cách đánh gía canh trường

o Quan sát kính hi n vi   5 đi m khác nhauể ở ể

o Ghi k t qu , đánh giá canh trế ả ường

K t qu : canh trế ả ường không b  nhi m khu nị ễ ẩ

2. Quan sát t  l  n y ch iỉ ệ ả ồ

L u ý: t  bào đư ế ược xem là đang  n y ch i là nh ng t  bào có t  bào con bé h n ho cả ồ ữ ế ế ơ ặ  

b ng ½ t  bào m , n u t  bào con l n h n ½ t  bào m  thì ph i tính là 2 t  bào.ằ ế ẹ ế ế ớ ơ ế ẹ ả ế

B ng  .T  l  n y ch i c a n m menả ỷ ệ ả ồ ủ ấ

Vùng N y ch iả ồ T ng n mổ ấ % t  l  n y ch iỷ ệ ả ồ % t  l  không n yỷ ệ ả  

K t lu n: t  l  t  bào n y ch i chi m trung bình 17% t c là t  bào n m men đang ế ậ ỷ ệ ế ả ồ ế ứ ế ấ ở 

cu i giai đo n trố ạ ường thành (t  l  n y ch i 10 – 15%) đ u giai đo n già.ỷ ệ ả ồ ầ ạ

3. Quan sát t  l  s ng ch t:ỷ ệ ố ế

C  s  c a vi c nhu m màu n m menơ ở ủ ệ ộ ấ

o Thu c nhu m đi qua màng t  bào ch t d  h n t  bào s ng.ố ộ ế ế ễ ơ ế ố

o Nguyên sinh ch t t  bào ch t d  b t màu.ấ ế ế ễ ắ

 Vì v y ta dùng xanh metylen (pha loãng 10 l n)  đ  nhu m màu, phân bi t t  bào

s ng và t  bào ch t.ố ế ế

Ch  kho ng 1­2 phút đ  th i gian đ  màu th m vào t  bào n m men.ờ ả ủ ờ ể ấ ế ấ

4. Đ m t  bào n m men trong 1ml canh trế ế ấ ường: (dùng bu ng đ m Thomas)ồ ế

o Pha loãng m u v i đ  pha loãng 10ẫ ớ ộ ­2

o Ti t trùng bu ng đ m b ng cách ngâm trong c n 70ệ ồ ế ằ ồ 0

.

Hình . Cách pha loãng m u và hình  nh bu ng đ mẫ ả ồ ế

Đ y lá kính lên trên bu ng đ m và nh  m u vào khe h p phía trên bu ng đ m,ậ ồ ế ỏ ẫ ẹ ồ ế  dùng gi y th m , sau đó ti n hành quan sát b ng kính hi n vi trên 3 trong 5 vùng c aấ ấ ế ằ ể ủ  

bu ng đ m. (l u ý: khi vi sinh v t n m   biên gi i thì ch  đ m trên 2 c nh liên ti p).ồ ế ư ậ ằ ở ớ ỉ ế ạ ế