ĐẠI CƯƠNG VỀ sắc ký

Sắc Ký: Đại cương và Cơ sở lý thuyết Mục tiêu - Hiểu được cơ sở lý thuyết của phương pháp sắc ký - Hiểu được các cơ chế sắc ký - Hiểu được các đại lượng đặc trưng của phương pháp sắc

Sắc Ký

Cơ Sở Lý Thuyết & Đại Cương

Bộ môn Phân Tích – Kiểm Nghiệm

Khoa Dược – Đại học Y Dược TPHCM

Đại học Y Dược TPHCM

Sắc Ký: Đại cương và Cơ sở lý thuyết

Mục tiêu

- Hiểu được cơ sở lý thuyết của phương pháp sắc ký

- Hiểu được các cơ chế sắc ký

- Hiểu được các đại lượng đặc trưng của phương pháp sắc ký

Dàn bài

- Định nghĩa – Quá trình sắc ký

- Phân loại các phương pháp sắc ký

- Cơ sở lý thuyết của phương pháp sắc ký

- Các cơ chế tách của phương pháp sắc ký

- Các đại lượng đặc trưng của phương pháp sắc ký

Định nghĩa

 Qui trình trong đó chất tan được tách riêng ra bởi quá trình dịch chuyển khác nhau về động lực học của chúng trong hai hay nhiều pha do khác nhau về phân bố, hấp phụ, điện tích, kích thước phân tử, độ hòa tan và áp suất hơi

 Sắc ký đòi hỏi hai pha:

 Pha động: chất lỏng hay dòng khí mang

 Pha tĩnh:

 Chất rắn hay chất mang trơ tẩm hay trộn chất lỏng

 Tương tác với chất tan theo các cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, rây phân tử, ái lực

 Thực tế: kết quả tách là do sự kết hợp của nhiều cơ chế

A

B

Hợp chất B Hợp chất A

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Quá trình sắc ký

 Đưa hỗn hợp lên pha tĩnh

 Khai triển sắc ký

 Phát hiện các chất

Phân loại các phương pháp sắc ký

 Theo bản chất vật lý các pha

 Sắc ký lỏng – lỏng

 Sắc ký lỏng – rắn

 Sắc ký khí – lỏng

 Sắc ký khí – rắn

 Theo phương tiện giữ pha tĩnh

 Sắc ký trên cột

 Sắc ký lớp mỏng

 Sắc ký giấy

 Theo cơ chế tách

 Sắc ký hấp phụ

 Sắc ký phân bố

 Sắc ký trao đổi ion

 Sắc ký rây phân tử

 Sắc ký ái lực

Phân loại các phương pháp sắc ký

 Sắc ký cột cổ điển (Column Chromatography, CC)

 Sắc ký giấy (Paper Chromatography, PC)

 Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography, TLC)

 Sắc ký khí (Gas Chromatography, GC)

 Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography, HPLC)

 Sắc ký lỏng siêu áp (Ultra Performance Liquid Chromatography, UPLC)

Cơ sở lý thuyết của phương pháp sắc ký

 Sắc ký là sự phát triển một cách logic của sự chiết (phân chia) ngược dòng

 Sắc ký là sự chiết liên tục và sự cân bằng liên tục của chất tan giữa hai pha

Sự phân chia ngược dòng (Counter Current Distribution)

 Mục tiêu: tách hai hay nhiều chất tan

bằng một loạt sự phân chia giữa hai pha

lỏng – lỏng

 Chiết gián đoạn qua nhiều bước

 Chiết liên tục qua nhiều bước

Chiết gián đoạn qua nhiều bước

 Giả sử có hai chất tan A và B trong hỗn hợp AB đang tồn tại ở pha dưới L (lower phase), được chiết bằng pha trên U (upper phase)

Sơ đồ chiết gián đoạn qua nhiều bước

Chiết gián đoạn qua nhiều bước

Bước 2: Pha U0 được chuyển vào ống có L2 mới

Pha U1 được chuyển vào ống có L1 cũ Pha U2 mới được đổ lên pha L0 cũ

Sau khi cân bằng ở mỗi ống sự phân chia theo DA = 4, DB = 1

Chiết gián đoạn qua nhiều bước

1 (A)

0,8

(B) 0,5

0

(A) 0,2

(B) 0,5 (A)

0,16

(B) 0,25

(A) 0,64

(B) 0,25

1

(A) 0,04

(B) 0,25

(A) 0,16

(B) 0,25 (A)

0,032

(B) 0,125

(A) 0,256

(B) 0,25

(A) 0,512

(B) 0,125

2

(A) 0,008

(B) 0,125

(A) 0,064

(B) 0,25

(A) 0,128

(B) 0,125 (A)

0,0064

(B) 0,0625

(A) 0,0768

(B) 0,1875

(A) 0,3072

(B) 0,1875

(A) 0,4096

(B) 0,0625

3

(A) 0,0016

(B) 0,0625

(A) 0,0192

(B) 0,1875

(A) 0,0768

(B) 0,1875

(A) 0,1024

(B) 0,0625 (A)

0,00128

(B) 0,03125

(A) 0,02048

(B) 0,125

(A) 0,12288

(B) 0,1875

(A) 0,32768

(B) 0,125

(A) 0,32768

(B) 0,03125

4

(A) 0,00032

(B) 0,03125

(A) 0,00512

(B) 0,125

(A) 0,03072

(B) 0,1875

(A) 0,08192

(B) 0,125

(A) 0,08192

(B) 0,03125 (A)

0,000256

(B) 0,15625

(A) 0,00512

(B) 0,078125

(A) 0,04096

(B) 0,15625

(A) 0,16384

(B) 0,15625

(A) 0,32768

(B) 0,078125

(A) 0,262144

(B) 0,015625

5

(A) 0,000064

(B) 0,15625

(A) 0,00128

(B) 0,078125

(A) 0,01024

(B) 0,15625

(A) 0,04096

(B) 0,15625

(A) 0,08192

(B) 0,078125

(A) 0,065536

(B) 0,015625

S* (A)

0,00032

(B) 0,03125

(A) 0,0064

(B) 0,15625

(A) 0,0512

(B) 0,3125

(A) 0,2048

(B) 0,3125

(A) 0,4096

(B) 0,15625

(A) 0,32768

(B) 0,03125

Phân chia ngược dòng của A và B

S: % A hoặc B trong mỗi ống sau 5 bước

Chiết gián đoạn qua nhiều bước

 Sau 5 bước gộp các ống 0, 1 và 2 vào lọ I và

các ống 4 và 5 vào lọ II Ta có:

A (mM) Tỷ lệ B (mM) Tỷ lệ Mức độ tinh khiết*

Chiết liên tục qua nhiều bước

 Sơ đồ minh họa chiết ngược dòng liên tục từ sơ đồ

chiết gián đoạn qua nhiều bước

Dấu * là các pha mới

Với:

 Pha trên U di động dọc theo pha dưới L bất động

 Pha trên gọi là pha động MP (Mobile Phase)

 Pha dưới gọi là pha tĩnh SP (Stationary Phase)

 Giả sử A được chiết bằng phân chia ngược dòng theo

sơ đồ trên Phân đoạn A ở pha trên là p% và ở pha dưới

là q% Ta có p + q = 1

Chiết liên tục qua nhiều bước

- Trước khi cân bằng

Chiết liên tục qua nhiều bước

- Trước khi cân bằng

- Sau khi cân bằng

0 0 pq 2 2p 2 q p 3

q3 2pq2 p2q 0 0 số ống r = 0 1 2 3 4

Chiết liên tục qua nhiều bước

Phân đoạn A ở mỗi ống sau mỗi bước chiết

Nhận xét: Nhị thức (p + q)n khai triển

Số ống r Bước

Chiết liên tục qua nhiều bước

 Phân đoạn f (fraction) trong ống r sau bước chiết n:

r n q

r

p r r

A có p = 4/5, sau 100 bước chiết ta có rmax # 100 x 4/5 # 80: ống 80

B có p = ½, sau 100 bước chiết ta có rmax # 100 x 1/2 # 50: ống 50

Độ rộng của dải và năng suất phân giải

Tách A và B bằng phân chia ngược dòng qua 100 bước chiết

- Ống 70 - 90 hoàn toàn là A

- Ống 40 - 60 hoàn toàn là B

Độ tinh khiết

Cơ chế tách – Phân bố

Chất phân tích hòa tan trong pha tĩnh lỏng bao trên bề mặt chất mang rắn trơ

K

S1 (pha 1) <====> S2 (pha 2)

K: hệ số phân bố

1 ] [ 2

] [

S

S

K 

- Pha 1 (V1) có m mol chất tan S, được chiết bằng pha 2 (V2)

- q1 là % S còn lại trong pha 1, nồng độ S trong pha 1:

Cơ chế tách – Phân bố

1 1 2

) 1 1

(

V

m q

V

m q

(

1 1

2 1

1 2

V q

KV V

V q

Sau n lần chiết với V2, S còn lại trong pha 1:

n

KV V

V n

1

q luôn luôn nhỏ hơn 1, sau n lần chiết nào đấy tức là qn sẽ vô cùng nhỏ

và có thể coi như bằng 0

Cơ chế tách – Hấp phụ

n: số mol pha động bị thay thế từ bề mặt

SADS : phân tử chất tan bị hấp phụ

MADS : phân tử pha động bị hấp phụ : bề mặt hoạt động của pha tĩnh

SM + nMADS  SADS + nMM

n ADS M

n M ADS

M S

M

S K

] ][

[

] ][

[



- Pha động luôn chạy theo một chiều nhất định nên luôn xảy ra quá trình

hấp phụ và phản hấp phụ

- Các chất tan sẽ bị kéo theo pha động và có ái lực khác nhau với pha tĩnh

Chất tan hấp phụ trên bề mặt pha tĩnh

Cơ chế tách – Trao đổi ion

Pha tĩnh là các chất trao đổi ion Gồm 2 loại:

 Nhựa trao đổi cation (cationit):

Cationit acid mạnh -SO3-H+

Cationit acid yếu -COO-H+

 Nhựa trao đổi anion (anionit):

Anionit base mạnh -N(CH3)3+OH

-Anionit base yếu -NH3+OH

-Tiến trình trao đổi: (Mx+ và Ax-: ion chất tan)

Cation: xRSO3-H+ + Mx+ (RSO3-)xMx+ + xH+

Anion: xRN(CH3)3+OH- + Ax- [RN(CH3)3+]xAx-+ xOH-

- Pha động thường là các dung dịch đệm có pH và chất điện ly thích hợp

- Pha động có thêm một số dung môi hữu cơ như MeOH, EtOH,…để làm tăng độ hòa tan hay độ chọn lọc cho chất tan  các ion chất tan cạnh tranh trên mạng ion

Ion phân tích

Ion trái dấu

Ionit

Điện tích cố định

Quá trình trao đổi ion

Cơ chế tách – Rây phân tử

- Ở trạng thái cân bằng: Cs  Cm

Cs, Cm: nồng độ chất tan trong pha tĩnh và pha động Hệ số K được tính theo phương trình:

m V

m

V R

V m

VR: thể tích rửa giải của chất tan

- Sắc ký rây phân tử = Sắc ký lọc qua gel = Sắc ký thẩm thấu gel

- Dùng trong sinh hóa để tách các protein, các carbohydrat,…

Cơ chế tách – Aùi lực

- Mới và có tính chọn lọc cao

- Dựa vào tương tác đặc hiệu giữa một

loại phân tử chất tan với một phân tử thứ

hai liên kết cộng hóa trị với pha tĩnh

Ví dụ: phân tử liên kết cộng hóa trị với

pha tĩnh là một kháng thể của một

protein Khi cho hỗn hợp gồm hàng ngàn

protein qua cột, chỉ có một pretein phản

ứng với kháng thể được giữ lại trên cột,

các protein còn lại được rửa khỏi cột

Protein bị giữ lại trên cột sẽ được tách ra

khỏi kháng thể bằng cách thay đổi pH

hay nồng độ ion trong pha động

Sắc ký ái lực

Một phân tử tương tác với phân tử liên kết cộng hóa trị với pha tĩnh

Các phân tử khác được rửa khỏi cột

Quá trình tách sắc ký

Hai cách tách hai chất xen phủ

Sự tách sắc ký và sắc ký đồ

Nồng độ chất tan tại các dãi A và

- Rf = 0: chất tan hoàn toàn không di chuyển,

nằm tại điểm xuất phát

- Rf = 1: chất tan di chuyển cùng với vận tốc của

dung môi

- dR: khoảng di chuyển được của chất cần tách

- dM: khoảng di chuyển được của dung môi

- v: vận tốc di chuyển của chất cần tách

- V0: vận tốc di chuyển của dung môi

Đại lượng đặc trưng cho sắc ký – SKLM & SKG

- Các yếu tố ảnh hưởng đến Rf

 Chất lượng và hoạt tính của chất hấp phụ

 Chiều dày của lớp mỏng, quảng đường chạy

sắc ký, lượng chất chấm

 Vị trí và số lượng chất cần tách trên bản mỏng

 Thành phần và độ tinh khiết của pha động

 Phương pháp khai triển sắc ký

 Độ bão hòa của dung môi trong bình sắc ký

(hiện tượng “bờ”)

 Aûnh hưởng của các cấu tử khác có trong thành

phần hỗn hợp cần tách

 Độ ẩm, nhiệt độ và pH

Hiện tượng “bờ”

Đại lượng đặc trưng cho sắc ký – SKLM & SKG

- Sử dụng chất đối chiếu

OX OF OA OF

OX OAs

* Hai chất phải có cùng lượng chấm như nhau

và được triển khai trong cùng điều kiện sắc ký

Đại lượng đặc trưng cho sắc ký – SKLM & SKG

Sắc ký đồ sắc ký đối chứng

Đại lượng đặc trưng cho sắc ký – HPLC & GC

- Sắc ký khí và sắc ký lỏng hiệu năng cao

Thời gian lưu t R (phút): thời gian cần thiết để một chất di chuyển từ nơi

tiêm mẫu qua cột sắc ký, tới detector và cho peak trên sắc ký đồ (tính từ

lúc tiêm đến lúc xuất hiện đỉnh của peak)

 tM (hoặc to): thời gian lưu của

một chất không bị lưu giữ, còn

gọi là thời gian chết

 tR càng lớn, chất tan bị lưu giữ

càng mạnh và tốc độ di chuyển

của nó càng nhỏ

 Thời gian lưu hiệu chỉnh t'R được

tính theo công thức:

t'R = tR - tM (hay t'R = tR - to)

Cấu hình máy HPLC

* Hai chất giống nhau lần lượt phải có tR và t’R bằng nhau

* Hai chất phải có cùng thể tích tiêm mẫu như nhau và được

triển khai trong cùng điều kiện sắc ký

Nếu trên trục hoành của sắc ký đồ sử dụng đơn vị đo là thể

tích dung môi:

- thể tích lưu VR

- thể tích lưu hiệu chỉnh V'R

- thể tích chết của cột VM (thể tích rỗng Vo): thể tích dung

môi từ nơi tiêm trong cột đến detector

Đại lượng đặc trưng cho sắc ký – HPLC & GC