Công nghệ tế bào động vật ứng dụng

Trong đó bao gồm các lĩnh vực như công nghệ gene và công nghệ chuyển gene đã phát hiện ra những liệu pháp gene mới dựa trên việc sản xuất protein tái tổ hợp sữa của bò chuyển gene cung c

UBND TỈNH BÌNH DƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT

CÔNG NGHỆ TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

ỨNG DỤNG

TS Nguyễn Thanh Bình

LỜI NÓI ĐẦU

Hiện nay công nghệ sinh học đóng một vai trò khá lớn trong việc kết hợp các quy trình và thiết bị kỹ thuật ở mức độ tế bào vi sinh vật, tế bào động thực vật để sản xuất ở quy mô công nghiệp các sản phẩm sinh học có chất lượng cao, phục vụ cho lợi ích, nhu cầu của con người, phát triển kinh tế - xã hội và đồng thời góp phần vào bảo

vệ môi trường sống

Sự thay đổi về điều kiện sống qua biến đổi khí hậu toàn cầu, sự gia tăng về dân

số đã thách thức khoa học công nghệ, nhất là công nghệ sinh học ứng dụng, để giải quyết việc tăng nguồn lương thực có nguồn gốc từ động thực vật, giải quyết các vấn đề

về y tế, đồng thời giảm những tác động tiêu cực đến môi trường do những hoạt động nông nghiệp gây ra

Nội dung trong quyển sách đã được tổng hợp từ nhiều nguồn sách, tạp chí khoa học có uy tín trên thế giới, và một số công trình nghiên cứu của tác giả sách được công bố trong và ngoài nước Quyển sách cung cấp những kiến thức cơ bản về các kỹ thuật sinh học, khả năng ứng dụng, các kỹ thuật tác động trên tế bào và các thành phần tế bào phục vụ thực tiển trong quy trình sản xuất Đồng thời giới thiệu một số phương pháp giải quyết các vấn đề tạo giống động vật, chữa bệnh, giải quyết thức ăn sinh học trong chăn nuôi bằng những tác động đến kỹ thuật sinh học ở mức độ tế bào mà hiện nay ở Việt Nam còn thiếu những tài liệu chuyên ngành bằng tiếng việt

Xin trân trọng giới thiệu cùng bạn đọc và hy vọng sẽ là nguồn tài liệu tham khảo, học tập, nghiên cứu và ứng dụng trong sản xuất

Trân trọng cám ơn Quý giáo sư, đồng nghiệp, các chuyên gia trong lĩnh vực

nghiên cứu; GS TS Masahi Miyake- Nguyên Hiệu trưởng Trường Đào tạo Sau đại

học Đại học Kobe - Nhật Bản đã tạo điều kiện, động viên, cung cấp tài liệu để tác giả hoàn thành cuốn sách này

Tác giả

TS Nguyễn Thanh Bình

MỤC LỤC

CHƯƠNG I: ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RECOMBINANT DNA VÀ TẠO

DÒNG GENE ĐỂ ĐIỀU CHẾ CÁC SẢN PHẨM SINH HỌC 9

PHẦN 1 Giới thiệu 9

PHẦN 2 Tổng quan 9

1.1 Lịch sử ra đời của kỹ thuật DNA tái tổ hợp 9

1.2 Kỹ thuật DNA tái tổ hợp (Recombinant DNA) và tạo dòng (Gene cloning) 10

1.2.1 Kỹ thuật DNA tái tổ hợp 10

1.2.2 Tạo dòng gene 10

1.2.3 Các bước thực hiện 11

1.2.4 Các enzyme chủ yếu dùng trong kỹ thuật DNA tái tổ hợp 12

1.2.4.1 Các enzyme giới hạn 12

1.2.4.2 Các enzyme polymerase 13

1.2.4.3 Các enzyme nối (Ligase) 13

1.2.4.4 Các nuclease 14

1.2.5 Các vector sử dụng trong DNA tái tổ hợp 14

1.2.5.1 Các vector plasmid 15

1.2.5.2 Các vector phage 16

1.2.5.3 Cosmid vector 16

1.2.5.4 Các vector khác 17

1.2.6 Các loại tế bào chủ 17

1.2.6.1 Tế bào chủ nhân sơ 17

1.2.6.2 Tế bào chủ nhân chuẩn 18

1.2.7 Tạo, tách và chọn lọc dòng rDNA 19

1.2.7.1 Tạo plasmid tái tổ hợp 19

1.2.7.2 Tách dòng DNA tái tổ hợp 19

1.2.7.3 Chọn lọc dòng DNA đặc hiệu và biểu hiện gene 20

1.3 Một số ứng dụng của công nghệ DNA tái tổ hợp và cloning gene trong điều chế sản phẩm y sinh học 20

1.3.1 Human alpha antitrypsin 20

1.3.1.1 Sơ lược về bệnh thiếu men Alpha -1- Antitrypsin (AAT) 20

1.3.1.2 Sản xuất AAT bằng cách sử dụng cừu biến đổi gene 21

1.3.2 rBST (recombinant Bovine somatotrobin)/ rBGH (recombinant bovine

growth hormone) 22

1.3.2.1 Giới thiệu về rBGH/rBST 23

1.3.2.2 Ứng dụng công nghệ sinh học trong sản xuất rBST 23

1.3.2.4 Ảnh hưởng của rBST đến khả năng sản xuất sữa ở bò 24

1.3.2.5 Lợi ích và rủi ro khi sử dụng BST 25

PHẦN 3 Kết luận 25

TÀI LIỆU THAM KHẢO 27

CHƯƠNG II: MÔ DA DÙNG TRONG DÒNG HÓA 29

Phần A: MÔ DA DÙNG TRONG DÒNG HÓA 29

PHẦN 1 Giới thiệu 29

PHẦN 2 Nội dung 29

2.1 Các lớp tế bào ở da 29

2.1.1 Lớp biểu bì 30

2.1.1.1 Lớp đáy (stratum basale) hay lớp mầm (stratum germinativum) 30

2.1.1.2 Lớp gai (stratum spinosum) 31

2.1.1.3 Lớp hạt (Stratum granulosum) 31

2.1.1.4 Lớp bóng (Stratum lucidum) 31

2.1.1.5 Lớp sừng (Stratum corneum) 31

2.1.2 Lớp bì 32

2.1.3 Lớp hạ bì 32

2.2 Tế bào gốc da 32

2.2.1 Tế bào gốc da ở lớp biểu bì 33

2.2.1.1 Các yếu tố quyết định sự phân chia tế bào gốc biểu bì 36

2.2.2 Nang lông tóc 40

2.2.2.1 Sự hình thành nang lông 40

2.2.2.2 Chu kỳ lông tóc và các tế bào gốc ở nang lông 41

2.2.2.3 Các yếu tố quyết định sự phân chia tế bào gốc nang 42

2.2.3 Tuyến nhờn (SG) 45

2.3 Vai trò của tế bào gốc ở da 46

PHẦN 3 Kết luận 47

TÀI LIỆU THAM KHẢO 49

Phần B: DÒNG HÓA BÒ 50

PHẦN 1 Mở đầu 50

PHẦN 2 Nội dung 50

2.1 Những nghiên cứu cơ bản trong dòng hóa bò 50

2.2 Kỹ thuật dòng hóa 52

2.2.1 Bước 1: Chuẩn bị tế bào chất nhận 52

2.2.2 Bước 2: Xử lý tế bào cho 53

2.2.3 Bước 3: Tái kết cấu 54

2.2.4 Bước 4: Nuôi cấy in vitro noãn tái kết cấu 54

2.2.5 Bước 5: Cấy phôi vào tử cung "mẹ nuôi" để cho phát triển thành bào thai 55 2.3 Dòng hóa từ tế bào thai 55

2.3.1 Tế bào phôi lấy từ thai 55

2.3.2 Tế bào sinh dưỡng lấy từ thai 55

2.4 Dòng hóa từ tế bào sinh dưỡng trưởng thành 55

2.4.1 Chiến lược chuyển nhân tế bào sinh dưỡng và chu kỳ tế bào 55

2.4.2 Đồng pha của tế bào cho 56

2.4.3 Các loại tế bào sinh dưỡng được sử dụng 56

2.5 Hiệu quả của dòng hóa bò 56

2.5.1 Dòng hóa từ phôi 56

2.5.1.1 Phát triển in vitro 56

2.5.1.2 Phát triển in vivo 57

2.5.1.3 Hiệu quả chung 57

2.5.1.4 Những yếu tố giới hạn 57

2.5.2 Hiệu quả của dòng hóa từ tế bào sinh dưỡng 58

2.5.2.1 Phát triển in vitro 58

2.5.2.2 Phát triển trước khi sanh 58

2.5.2.3 Sức sống của bò dòng hóa 59

PHẦN 3 Kết luận 59

TÀI LIỆU THAM KHẢO 61

Phần C: TÁI LẬP TRÌNH NHÂN 62

2.1 Khái niệm tái lập trình nhân 62

2.2.Tái lập trình nhân của tế bào sinh dưỡng 62

2.2.1.Tái lập trình nhân bằng chuyển nhân 62

2.2.2.Tái lập trình nhân bằng dung hợp tế bào 64

2.2.3.Tái lập trình nhân bằng dịch chiết tế bào 66

2.2.4.Cấy ghép tế bào 66

2.2.5.Tái lập trình nhân bởi các phân tử nhỏ 67

2.3.Các yếu tố kiểm soát quá trình tái lập trình nhân 68

2.3.1.Các yếu tố ngoài tế bào 69

2.3.2.Các nhân tố bên trong 71

2.4.Giới hạn về sinh học và kỹ thuật trong tái lập trình nhân 74

2.4.1.Sự bất hoạt NST X 74

2.4.2.Dị ty thể (Mitochondrial heteroplasmy) 75

2.4.3.Sự ngắn dần của telomere 75

2.4.4.Sự đột biến 76

2.4.5.Thất bại trong quá trình in dấu bộ gene 76

2.4.6.Sai sót về mặt kỹ thuật 76

2.5.Khiếm khuyết của động vật tạo dòng vô tính 77

Kết luận 77

TÀI LIỆU THAM KHẢO 78

Phần D: ỨNG DỤNG CHUYỂN NHÂN Ở HEO 80

PHẦN 1 Mở đầu 80

PHẦN 2 Nội dung 80

2.1 Những nghiên cứu bước đầu 80

2.2 Những sự kiện phân tử của tái lập trình nhân trên heo 81

2.2.1 Định nghĩa chung 81

2.2.2 Tái lập trình nhân trên heo 81

2.2.2.1 Sự phồng lên của nhân chuyển 81

2.2.2.2 Sự tổng hợp mRNA 82

2.2.2.3 Một số gene tham gia quá trình tái lập trình 84

2.3 Hoạt hóa trứng 86

2.3.1 Chu kỳ tế bào 86

2.3.2 Cơ chế hoạt hóa trứng 86

2.4 Sự phát triển in vitro của phôi chuyển nhân 87

2.5 Vấn đề sản xuất heo chuyển nhân 88

2.6 Ứng dụng tạo đời con bằng kỹ thuật chuyển nhân 89

PHẦN 3 Kết luận 91

TÀI LIỆU THAM KHẢO 92

CHƯƠNG III: LẬP TRÌNH CỦA DI TRUYỀN NGOÀI NHÂN DNA (EPIGENETIC) 93

3.1.Định nghĩa epigenetic 93

3.2.Cơ sở phân tử của epigenetic 93

3.3.Các yếu tố epigenetic ảnh hưởng đến biểu hiện gene 95

3.4.Các vấn đề cần quan tâm 97

TÀI LIỆU THAM KHẢO 98

CHƯƠNG IV: XÁC ĐỊNH TÍNH ĐA NĂNG CỦA TẾ BÀO 99

4.1 Khái niệm 99

4.2 Phân loại tế bào gốc 99

4.3 Đặc điểm sinh học 101

4.3.1 Tính vạn năng 101

4.3.2 Tính tự làm mới 101

4.3.3 Tính mềm dẻo 101

4.4 Những ứng dụng tính đa năng của tế bào 101

4.4.1 Trong nghiên cứu cơ bản 101

4.4.2 Ghép tế bào gốc trị liệu (stem cell therapy) 102

4.5 Phương pháp thu nhận tế bào gốc 103

TÀI LIỆU THAM KHẢO 104

CHƯƠNG V: CƠ CHẾ DI TRUYỀN PHÂN TỬ TRONG VIỆC TẠO CÁC LOẠI TẾ BÀO CHUYÊN BIỆT 106

5.1 Protein điều hòa 106

5.2 Methyl hóa DNA 109

5.3 Đoạn DNA giàu CG (vùng CpG (CG) hoặc đảo CpG) 113

5.4 Sự in dấu di truyền và biểu hiện gene theo nguồn gốc 114

5.5 Kiểm soát sau phiên mã (post-transcription control) 116

5.5.1 Biến đổi sau phiên mã ở đầu 5’ và 3’ của tiền mRNA (pre-mRNA) 116

5.5.2 Quá trình trưởng thành của tiền mRNA 118

5.5.3 Sự vận chuyển mRNA trưởng thành ra khỏi nhân – Đời sống mRNA, phân hủy mRNA 120

TÀI LIỆU THAM KHẢO 122

CHƯƠNG VI: KỸ THUẬT SINH HỌC TRONG CẢI TIẾN TỶ LỆ SINH SẢN VÀ CHẤT LƯỢNG THƯƠNG PHẨM 123

6.1 Cấy truyền phôi và bảo quản phôi 123

6.1.1 Lịch sử phát triển công nghệ cấy truyền phôi (CTP) 123

6.1.2 Cấy truyền phôi (Embryo Transfer - ET) 124

6.1.3 Kỹ thuật cấy truyền phôi trên bò 125

6.1.4 Bảo quản phôi 126

6.1.5 Ý nghĩa của công nghệ bảo quản và chuyển cấy phôi 127

6.1.6 Ứng dụng chuyển cấy và bảo quản phôi trong chăn nuôi 128

6.2 Công nghệ thụ tinh nhân tạo (Artificial Insemination - AI) 128

6.3 Kỹ thuật PCR trong xác định giới tính phôi 129

6.3.1 PCR 129

6.3.2 Nguyên tắc của PCR 130

6.3.3 Kỹ thuật xác định giới tính phôi bò bằng PCR 130

6.3.4 Ý nghĩa xác định giới tính trong chăn nuôi 131

6.4 Đánh giá chất lượng tinh trùng bằng kỹ thuật Hypoosmotic swelling test (HOST) 133

6.4.1 Định nghĩa 133

6.4.2 Phương pháp 133

6.4.3 Ứng dụng 133

TÀI LIỆU THAM KHẢO 135

CHƯƠNG VII: KỸ THUẬT TẠO THÚ BIẾN ĐỔI GENE VÀ ỨNG DỤNG TRONG SẢN PHẨM THUỐC VÀ Y SINH HỌC 136

7.1 Khái niệm chung 136

7.1.1 Sinh vật biến đổi gene 136

7.1.2 Sự phát triển của khoa học chuyển gene ở động vật 137

7.2 Công nghệ tạo động vật chuyển gene 137

7.2.1 Tách chiết, phân lập gene mong muốn và tạo tổ hợp gene biểu hiện trong tế bào động vật 138

7.2.1.1 Tách chiết, phân lập gene mong muốn 138

7.2.1.2 Tạo tổ hợp gene chuyển biểu hiện trong tế bào động vật 139

7.2.2 Tạo cơ sở vật liệu biến nạp gene 139

7.2.3 Chuyển gene vào động vật 140

7.2.3.1 Phương pháp vi tiêm 140

7.2.3.2 Phương pháp xung điện 141

7.2.3.3 Phương pháp tiêm trực tiếp 142

7.2.3.4 Phương pháp lây nhiễm retrovirus 142

7.2.3.5 Sử dụng súng bắn gene 142

7.2.3.6 Sử dụng tế bào gốc phôi 143

7.2.3.7 Đóng gói DNA ngoại lai trong liposome chuyển vào tế bào hay phôi 144

7.2.4 Nuôi cấy phôi trong ống nghiệm 144

7.2.5 Kiểm tra động vật được sinh ra từ phôi chuyển gene 144

7.2.5.1 Phương pháp thẩm tách DNA 145

7.2.5.2 Phương pháp PCR 145

7.2.6 Tạo nguồn động vật chuyển gene một cách liên tục 145

7.3 Một số thành tựu trong lĩnh vực tạo động vật chuyển gene 146

7.3.1 Chuột chuyển gene 146

7.3.2 Heo chuyển gene 146

7.3.3 Gà chuyển gene 147

7.3.4 Dê biến đổi gene 148

7.3.5 Chống sốt rét bằng muỗi biến đổi gene 148

7.3.6 Điều trị thành công liệu pháp gene cho người mù 148

Kết luận 148

TÀI LIỆU THAM KHẢO 149

PHẦN THAM KHẢO 150

CHƯƠNG I: L-LYSINE TRONG TỔ HỢP KHẨU PHẦN THỨC ĂN 150

PHẦN 1 Mở đầu 150

PHẦN 2 Tổng quan về L-lysine 150

1.1 Giới thiệu chung 150

1.2 Vai trò của lysine 151

1.3 Cơ chế hoạt động của lysine 151

1.4 Các trường hợp cần bổ sung lysine trong khẩu phần thức ăn 152

1.4.1 Trên người: Thực phẩm chức năng, điều trị bệnh 152

1.4.2 Vật nuôi: Bổ sung vào thức ăn cho gia súc, gia cầm 153

1.5 Sản xuất lysine 155

1.5.1 Lịch sử quá trình sản xuất lysine 155

1.5.2 Phương pháp sản xuất L-lysine 155

PHẦN 3 Kết luận 159

TÀI LIỆU THAM KHẢO 160

CHƯƠNG II: DÒNG VI KHUẨN LACTOBACILLUS TẠO CHẤT BỔ SUNG TRONG THỨC ĂN CHĂN NUÔI VÀ BACTERIOCIN KHÁNG KHUẨN 161 2.1 Biến đổi dòng vi khuẩn 161

2.2 Bacteriocin 161

2.2.1 Khái niệm về Bacteriocin 161

2.2.2 Hoạt động của Bacteriocin 162

2.2.3 Cơ chế hoạt động 162

2.2.4 Ứng dụng 162

2.2.4.1 Bảo quản lương thực – thực phẩm 162

2.2.4.2 Bacteriocin trong chăn nuôi 166

2.2.4.3 Một số sản phẩm trên thị trường 166

2.3 Đặc điểm chung của vi khuẩn lactic 169

2.4 Lên men lactic 170

2.5 Ứng dụng lactobacillus 172

2.5.1 Sản xuất probiotic 172

2.5.2 Sản xuất ACIDIFIER 176

KẾT LUẬN 178

TÀI LIỆU THAM KHẢO 178

CHƯƠNG III: CHUẨN ĐOÁN BỆNH VIÊM VÚ Ở BÒ SỮA 179

3.1 Bệnh leukocyte trên bò sữa Holstein Friesian 179

3.1.1 Khái niệm bệnh leukocyte 179

3.1.2 Kỹ thuật sinh học chẩn đoán bệnh leukocyte 180

3.1.2.1 Kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) 180

3.1.2.2 Kỹ thuật lai phân tử Southern blot 185

3.2 Bệnh viêm vú trên bò sữa 187

3.2.1 Khái niệm bệnh viêm vú 187

3.2.2 Kỹ thuật sinh học chẩn đoán bệnh viêm vú 188

3.2.2.1 Phương pháp thử viêm vú CMT (California Mastitis Test) 188

3.2.2.2 Máy đếm tế bào (flow cytometer) 190

3.2.2.3 Kỹ thuật ELISA (Enzymee-linked immunosorbent assay) 192

3.2.2.4 Một số phương pháp khác chẩn đoán viêm vú tiềm ẩn bò sữa 196

Kết luận 196

TÀI LIỆU THAM KHẢO 197

CHƯƠNG I ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RECOMBINANT DNA VÀ TẠO DÒNG GENE ĐỂ

ĐIỀU CHẾ CÁC SẢN PHẨM SINH HỌC PHẦN 1 Giới thiệu

Những cố gắng không ngừng của con người trong việc nâng cao sức khỏe, trong

đó có sự đóng góp những tiến bộ của khoa học hiện đại Trong đó bao gồm các lĩnh vực như công nghệ gene và công nghệ chuyển gene đã phát hiện ra những liệu pháp gene mới dựa trên việc sản xuất protein tái tổ hợp (sữa của bò chuyển gene cung cấp một nguồn protein an toàn, có giá trị cao hoặc các chế phẩm khác có thể điều trị bệnh cho người như sản xuất men Alpha antitrypsin từ cừu biến đổi gene )

Kể từ những năm 1970, các nhà khoa học đã có thể chuyển một gene lạ vào vi khuẩn và bắt nó biểu hiện gene Tuy nhiên, có những protein phục vụ cho nhu cầu của con người ngày càng đòi hỏi phức tạp và cơ thể vi khuẩn không biểu hiện được và cần đến động vật chuyển gene Sản phẩm thành công đầu tiên của con người về sản xuất sản phẩm sinh học thông qua chuyển gene là Insulin và hoocmon sinh trưởng vào vi

khuẩn E coli

PHẦN 2 Tổng quan

1.1 Lịch sử ra đời của kỹ thuật DNA tái tổ hợp

Năm 1972, các phân tử DNA tái tổ hợp đầu tiên được tạo ra tại trường Đại học Stanford (Mỹ) do nhà khoa học Paul Berg và các cộng sự thực hiện bằng cách sử dụng đặc tính cắt của enzyme giới hạn (Restriction enzyme) và khả năng nối các mạch DNA với nhau của enzyme nối ligase Nhờ kỹ thuật này vật chất di truyền thường là một hay vài gene có thể lắp ghép vào phân tử DNA có nguồn gốc khác (Ví dụ: lắp ghép gene của động vật, thực vật vào plasmid của vi khuẩn hoặc vào phage) để hình thành DNA tái tổ hợp Khi các cơ thể DNA tái tổ hợp được tạo thành có thể được chuyển từ

cơ thể này (cơ thể cho) sang cơ thể hoặc tế bào khác (cơ thể nhận hoặc tế bào nhận) Điều cơ bản và quan trọng là các gene tái tổ hợp này vẫn duy trì chức năng cũ của nó trong cơ thể, hoặc tế bào nhận

Năm 1973, các nhà khoa học đã nối nhiều đoạn DNA vào plasmid được tách ra từ

vi khuẩn Escherichia coli (E coli) Plasmid này có thể hoạt động, tự sao chép khi đưa vào tế bào vi khuẩn E coli, từ đó tạo ra công nghệ quan trọng trong công nghệ di truyền

là tách dòng gene

Thành tựu đầu tiên của kỹ thuật DNA tái tổ hợp là việc sản xuất ra kích thích tố

sinh trưởng người (hGH-human growth hoocmon) nhờ vi sinh vật nhận là E coli Các nhà khoa học đưa được gene mã hóa hGH vào E coli E coli có DNA tái tổ hợp đã

sản sinh ra một lượng rất lớn kích thích tố sinh trưởng người và được sử dụng vào thực tiễn y học

Tiếp đó, vào những năm đầu của thập kỷ 80 thế kỷ XX, nhờ kỹ thuật DNA tái tổ

hợp, người ta đã sản xuất được interferol, sản xuất protein chống đông máu…

1.2 Kỹ thuật DNA tái tổ hợp (Recombinant DNA) và tạo dòng gene (Gene cloning)

1.2.1 Kỹ thuật DNA tái tổ hợp

DNA tái tổ hợp (còn gọi là kỹ thuật di truyền hay kỹ thuật gene) là DNA được tạo

ra từ hai hay nhiều nguồn vật liệu di truyền khác nhau Phân tử DNA tái tổ hợp được tạo ra nhờ kỹ thuật ghép nối các đoạn DNA của các cá thể khác nhau trong cùng một loài, hoặc của các loài khác nhau Các kỹ thuật này còn được gọi là tạo dòng gene (cloning gene) do nó có thể sản xuất ra một số lượng lớn gene xác định

Công nghệ DNA tái tổ hợp (DNA recombinant technology) Hệ thống các phương pháp phòng thí nghiệm cho phép cắt đoạn DNA từ một sinh vật để ghép nối vào DNA của một sinh vật khác tạo ra phân tử DNA tái tổ hợp Phân tử này được đưa vào các sinh vật khác nhau để tạo ra những giống chủng vi sinh vật, thực vật và động vật mới có những phẩm chất đặc biệt, đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của sản xuất và đời sống con người Công nghệ này có ứng dụng rộng rãi trong y học, dược học, nông nghiệp và nhiều ngành công nghiệp khác

Ngày nay, nhờ công nghệ DNA tái tổ hợp người ta đã tạo ra các đối tượng sản xuất thích hợp hơn, có thể thay đổi cả về lượng và chất so với công nghệ sinh học truyền thống trước đây bằng cách thay đổi gene của chúng và mở ra những triển vọng

to lớn cho các lĩnh vực hoạt động của công nghệ sinh học

1.2.2 Tạo dòng gene

Gene là đơn vị cơ sở của thông tin di truyền nằm trên nhiễm sắc thể của tế bào Các nhiễm sắc thể là các cấu trúc sợi dài và mảnh nằm trong nhân, bao gồm chủ yếu là DNA Thông tin di truyền được bảo quản trong một chuỗi trình tự của các base nucleotide gồm có một đoạn DNA

Trong kỹ thuật gene, tạo dòng gene là một bước rất quan trọng vì tách chiết được một gene có thể giúp đánh giá trình tự nucleotide của nó Từ đó có thể xác định được những giới hạn bên trong một gene Không chỉ vậy, với nguồn gene có được, nhà khoa học có thể so sánh trình tự DNA giữa các gene để làm rõ hơn tiến hóa của gene hoặc dịch mã trình tự DNA của một gene thành trình tự amino acid nhờ vào bảng mã di truyền qua đó có thể dự đoán được cấu trúc của protein được mã hóa cũng như chức năng của gene đó

Bên cạnh đó, nhờ kỹ thuật gene, nhà khoa học có thể chuyển gene mục tiêu vào một cá thể tạo ra cá thể chuyển gene Cá thể chuyển gene được dùng cả trong nghiên cứu về các tiến trình sinh học ở phòng thí nghiệm cũng như ứng dụng trong phát triển

Có thể hiểu tạo dòng gene (còn gọi là nhân dòng, tách dòng hay dòng hóa) là sự sản sinh nhiều bản sao của một phân tử DNA, thường là phân tử DNA tái tổ hợp trong plasmid vector, bằng cách sao chép phân tử đó trong một vật chủ thích hợp chẳng hạn

như vi khuẩn E coli

1.2.3 Các bước thực hiện

Kỹ thuật tái tổ hợp DNA hay còn gọi là kỹ thuật tạo dòng gene được thực hiện qua nhiều công đoạn phức tạp, tinh vi Thực chất là một công nghệ gồm các bước chủ yếu sau:

Bước 1: Nuôi tế bào cho plasmid để tạo vector chuyển gene và nuôi tế bào cho (Ví

dụ: tế bào của người) để cung cấp DNA

Bước 2: Tách chiết DNA plasmid và DNA tế bào cho Bước này còn được gọi là phân

lập gene

Bước 3: Cắt cả hai loại DNA (DNA plasmid và DNA tế bào cho) bằng cùng một

loại enzyme giới hạn (restriction enzyme-RE) Ví dụ: sử dụng enzyme giới hạn

endonuclease EcoRI tạo ra các đầu so le

Bước 4: Trộn chung DNA plasmid đã bị cắt với DNA tế bào cho cũng đã bị cắt bởi

một loại enzyme giới hạn như đã nêu trên

Bước 5: Bổ sung enzyme để tạo ra DNA tái tổ hợp hoàn chỉnh

Bước 6: Biến nạp DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ (ví dụ vi khuẩn E coli) và nhân

dòng

Bước 7: Chọn lọc và tạo dòng tế bào chủ (vi khuẩn) mang DNA tái tổ hợp và theo

dõi hoạt động, biểu hiện của gene thông qua sản phẩm của gene lấy từ tế bào cho

Hình 1.1 Các bước tái tổ hợp DNA (Nguồn http://thuviensinhhoc.com/ebook/sinh-hoc)

1.2.4 Các enzyme chủ yếu dùng trong kỹ thuật DNA tái tổ hợp

1.2.4.1 Các enzyme giới hạn

Trong công nghệ di truyền muốn tạo ra DNA tái tổ hợp để đưa vào tế bào chủ cần phải có công cụ cắt plasmid hình vòng và đoạn DNA của tế bào rồi cho chúng nối lại với nhau Công cụ cắt DNA là các enzyme giới hạn

 Khái niệm về enzyme giới hạn

Enzyme giới hạn là enzyme có khả năng nhận biết những đoạn trình tự DNA nhất định và cắt DNA ở ngay thời điểm này hay ở điểm kế cận Tùy theo phương thức cắt

và nguồn gốc của enzyme giới hạn mà người ta phân loại và đặt tên cho các enzyme giới hạn đó

 Phân loại enzyme giới hạn

Các enzyme giới hạn được phân thành 3 kiểu I, II và III Các enzyme giới hạn thường dùng phổ biến trong công nghệ DNA tái tổ hợp, công nghệ di truyền thuộc kiểu II Các enzyme này cắt bên trong mạch DNA (không phân hủy từ 2 đầu của DNA) nên còn được gọi là enzyme endonuclease Enzyme giới hạn kiểu II thực chất là endonuclease giới hạn kiểu II

Các enzyme giới hạn kiểu II: Cách gọi tên các enzyme giới hạn kiểu II cũng như các enzyme giới hạn khác dựa trên quy ước chung Tên enzyme giới hạn được ghép bởi chữ cái đầu tiên là tên chi và hai chữ tiếp theo là hai chữ cái tên loài của vi sinh vật

mà enzyme được tách chiết Những chữ và số La Mã tiếp theo là tên của chủng và dòng của loài sinh vật cụ thể đã tách chiết enzyme:

Ví dụ: E.coRI (thuộc chi Escherichia, loài coli, chủng Ry 13) Một số loại khác như E coRV, BamHI, HaeIII, Smal…

1.2.4.2 Các enzyme polymerase

Các enzyme polymerase xúc tác cho quá trình sao chép các acid nucleic (DNA, hoặc RNA) được sử dụng nhiều trong công nghệ di truyền

Các DNA polymerase (Enzyme DNA polymerase I, enzyme T4 DNA polymerase,

enzyme Taq polymerase…) Hiện nay còn có nhiều loại DNA polymerase khác lưu

hành trên thị trường như T7 DNA polymerase, Vent DNA polymerase…

Các enzyme RNA polymerase: có ba loại enzyme RNA polymerase thường được dùng trong thực tế: SP6 RNA polymerase, T3 RNA polymerase và T7 RNA polymerase Enzyme phiên mã ngược (Reverse transcriptase): có khả năng tổng hợp DNA một mạch gọi là DNA bổ trợ (cDNA) từ khuôn mRNA, hoặc từ một đoạn polynucleotite được tổng hợp bằng con đường hóa học Nhờ có con đường phiên mã ngược này mà

có thể tổng hợp được hầu hết các gene riêng biệt nào đó nếu như có mặt mRNA của gene đó Các cDNA mạch đơn có thể biến thành mạch kép nhờ DNA polymerase và được gọi là cDNA mạch kép (c-DNA duplex) Đoạn cDNA mạch kép có thể gắn vào plasmid rồi biến nạp vào vi khuẩn, từ đó tạo dòng c-DNA Nếu cDNA có nguồn gốc từ một gene thì ta tạo được dòng gene Trong trường hợp mRNA trưởng thành khi đã ở ngoài nhân thì ta sẽ thu được dòng gene chỉ chứa những đoạn mã hóa (exon) Không

có đoạn không mã hóa (intron)

1.2.4.3 Các enzyme nối (Ligase)

Enzyme ligase là enzyme nối quan trọng trong tế bào Các enzyme này xúc tác hình thành các liên kết phosphodiester để nối các đoạn acid nucleic với nhau DNA ligase xúc tác nối hai đoạn DNA với nhau, RNA ligase là enzyme chủ yếu được sử dụng rộng rãi Có một số loại enzyme nối khác nhau, nhưng enzyme T4 DNA ligase là enzyme chủ yếu được sử dụng rộng rãi nhất trong các phòng thí nghiệm về công nghệ

di truyền

Có 3 loại enzyme nối thường dùng trong công nghệ di truyền Enzyme E coli DNA ligase được tách chiết từ vi khuẩn E coli, xúc tác phản ứng nối hai đoạn trình tự

DNA có đầu so le Enzyme T4 DNA ligase được tách chiết từ phage T4 xâm nhiễm vào

E coli, có chức năng giống như E coli DNA ligase nhưng lại có khả năng nối hai

đoạn trình tự DNA có đầu bằng và là enzyme nối được ưa chuộng nhất hiện nay Enzyme T4 RNA ligase tách chiết từ phage T4 xâm nhiễm E coli, có khả năng nối hai

trình tự RNA bằng các liên kết phosphodiester

Ngoài các loại enzyme nối kể trên, hiện nay người ta còn sử dụng các đoạn nối (đầu dính–adaptor) cho các enzyme cắt đầu bằng Adaptor xúc tác nối các đoạn DNA

do có các enzyme giới hạn cắt đầu bằng từ đó tạo nên đầu so le Mỗi đoạn enzyme cắt đầu bằng đều có các loại adaptor đặc trưng riêng

1.2.4.4 Các nuclease

Các enzyme nuclease phân hủy các acid nucleic bằng cách làm đứt các liên kết phosphodieste là liên kết nối các nucleotit cùng một mạch với nhau Ngoài các enzyme giới hạn đã nêu ở trên còn có các loại nuclease chủ yếu sau:

Enzyme DNAase I (endonuclease) tách chiết từ tụy của bò, xúc tác phản ứng thủy phân các liên kết ngay sau một bazơ nitơ ở cả mạch đơn và mạch kép hoàn toàn ngẫu nhiên

Enzyme S1 nuclease (endonuclease) là enzyme tách chiết từ nấm mốc Aspegillus oryzae S1 nuclease BAL 3 (endonuclease) phân cắt cả 2 đầu 5’ và 3’ của DNA và

không có khả năng cắt nội liên kết

Enzyme exonuclease III là một 3’ exonuclease cắt đầu 3’ của mạch đơn và tạo thành các đoạn DNA có đầu 5’ nhô ra

Enzyme ARNase tách chiết từ tụy bò Enzyme này thường được sử dụng để loại

bỏ RNA trong hỗn hợp DNA và RNA

Enzyme ARNase H dùng để loại bỏ RNA trong các phân tử lai DNA-RNA, nhất

là sau phản ứng phiên mã ngược để hình thành mạch thứ hai của cDNA, từ đó tạo nên phân tử cDNA kép

1.2.5 Các vector sử dụng trong DNA tái tổ hợp

Muốn chuyển được gene mong muốn từ thể cho sang vật chủ nhận (thể nhận), hoặc tách dòng gene, điều cơ bản là cần phải có vật chuyển gene (vector chuyển gene) Vector chuyển gene là phân tử DNA nhỏ có khả năng mang được gene cần thiết Vector chuyển gene phải có các đặc điểm quan trọng cần thiết sau:

- Có điểm khởi đầu sao chép (origin of replication – ori) để tự sao chép mà tồn tại độc lập trong tế bào

- Có các đoạn trình tự nhận biết cho enzyme giới hạn cắt rồi để hở tạo nơi lắp ráp các đoạn gene lạ

- Có trình tự khởi điểm (promoter)

- Có dấu chuẩn chọn lọc cho phép dễ dàng phát hiện nhận biết chúng trong tế bào chủ nhận Thông thường dấu chuẩn chọn lọc là các gene kháng chất kháng sinh, hoặc gene tổng hợp chất màu

Để đảm bảo cho được tính bền vững của DNA tái tổ hợp, ngoài các đặc điểm trên vector chuyển gene cũng cần có những đặc tính khác để cho việc tạo, tách dòng dễ thực hiện như:

- Chứa các gene vô hiệu hóa các đoạn DNA không mong muốn bị gắn nhầm vào

- Có khả năng tạo nhiều bản sao để khi tách khỏi tế bào được số lượng lớn, đảm bảo sự khuếch đại của gene lạ mong muốn được gắn vào

Giá trị của các vector chuyển gene ở chỗ nó được cấu tạo thuận tiện cho mục đích

sử dụng Hiện tại chưa có loại vector chuyển gene toàn năng, mà cần phải lựa chọn vector chuyển gene cho từng đối tượng và tùy thuộc và kích thước của đoạn gene cần được chuyển

Các vector chuyển gene có các ứng dụng chủ yếu:

 Tạo dòng, nhân dòng các đoạn trình tự, hoặc gene để tạo nhiều bản sao giống nhau

 Nghiên cứu sự biểu hiện của một đoạn trình tự DNA hoặc một gene

 Chuyển gene vào tế bào vi sinh vật khác (vật chủ nhận)

 Sản xuất các RNA

 Sản xuất protein được tổng hợp từ gene đã được tạo dòng Do tính chất quan trọng và nhiều ứng dụng nên các vector chuyển gene ngày càng được khám phá, hoàn thiện không ngừng Từ những vector chuyển gene sẵn có trong tự nhiên như plasmid ở

vi khuẩn, ngày nay người ta đã tạo ra nhiều loại vector phức tạp ứng dụng vào nhiều mục đích khác nhau, thậm chí tạo ra cả nhiễm sắc thể nhân tạo

hệ, thuận tiện cho công nghệ DNA tái tổ hợp Plasmid thế hệ thứ nhất là những plasmid đầu tiên được sử dụng để tách dòng như pSC1001, ColE1…

Plasmid thế hệ thứ 2 được tạo ra bằng cách kết hợp các đặc tính quý của nhiều plasmid tự nhiên, gắn thêm gene chỉ thị để tạo nên một plasmid mới Điển hình cho plasmid thế hệ thứ hai và cũng là một trong những plasmid được sử dụng rộng rãi nhất trong công nghệ di truyền, đó là plasmid pBR322

Plasmid nhân tạo thế hệ thứ 3 rất mạnh, có kích thước nhỏ và có một đoạn đa liên kết (polylinker), hoặc điểm đa tách dòng (multiple cloning site) Đoạn đa liên kết là

đoạn polynucleotite tổng hợp, mang một chuỗi các vị trí nhận biết của nhiều loại enzyme giới hạn Nhóm plasmid này là các plasmid pUC và điển hình là pUC18 Plasmid pUC18 được cải tiến từ pBR322 có kích thước là 2688 bp Plasmid pUC18 có điểm khởi đầu sao chép (ori) mang gene kháng sinh ampicilline (Ampr) Ngoài ra nó còn có gene ức chế lac (lacI), đoạn đa liên kết (MCS) và gene lacZ’ Đoạn

đa liên kết gồm nhiều vị trí nhận biết của các enzyme giới hạn

gene, có kích thước khoảng 6400 bp, chỉ xâm nhiễm vào E coli

1.2.5.3 Cosmid vector

Cosmid vector được thiết kế để nhân dòng những đoạn DNA lớn (khoảng 40-45 kb) Đây là loại vector nhân tạo kết hợp các thuộc tính của plasmid với phage Cosmid vector có chứa đầu cos (đầu dính) của phage giúp DNA của phage từ dạng thẳng nối lại thành vòng tròn nên có thể gói bọc dễ dàng trong phần đầu của phage Mặt khác cosmid vector lại có phần gốc plasmid Do vậy, chúng có khả năng tự nhân đôi như những plasmid của vi khuẩn Do hầu như toàn bộ phần DNA của phage đã được cắt

bỏ, nên chúng có khả năng mang đoạn DNA ngoại lai có kích thước lớn Khi đoạn DNA ngoại lai được ghép nối, các cosmid tái tổ hợp sẽ được gói bọc trong phage

Hình 1.2 Vector chuyển gene (Nguồn http://www.slideshare.net)

Phage mang DNA tái tổ hợp không tự nhân lên được vì phần DNA phage đã bị loại bỏ nhưng chúng vẫn có khả năng lây nhiễm vào vi khuẩn Tuy nhiên sau khi vào vi khuẩn, chúng lại có khả năng tự nhân lên do bản thân trong vi khuẩn đã có plasmid bình thường Cosmid mang đoạn gene lạ có thể dài đến 45 kb dùng để lập thư viện gene ở ruồi giấm, chuột, thậm chí cả ở người

1.2.5.4 Các vector khác

 Plasmid Ti

Được sử dụng rộng dãi trong việc chuyển gene ở thực vật Plasmid Ti bắt nguồn

từ vi khuẩn trong đất, loài Agrobacterium tumifaciens gây bệnh tạo khối u (tumor) ở

thực vật

 Vector nhiễm sắc thể nhân tạo của nấm men YAC

Nấm men là đối tượng quan trọng trong công nghệ di truyền Các plasmid có nguồn gốc từ vi khuẩn đưa vào nấm men hoạt động thường không hiệu quả Ngược lại plasmid có nguồn gốc nấm men đưa vào tế bào vi khuẩn lại không hoạt động Cho tới nay ở vi sinh vật nhân chuẩn (eukaryote) mới chỉ tìm được một loại plasmid duy nhất,

đó là plasmid hình vòng có kích thước khoảng 2 micromet, có nhiều trong tế bào nấm

men Sacchromyces cerevisiae

 Vector là virus của tế bào eukaryote

Các vector virus thường được sử dụng là các loại virus SV40 (Smian virus) adenovirus, retrovirus, baculovirus, virus herpes,… Các vector nhóm này được sử dụng trong tách dòng gene và chuyển gene ở tế bào động thực vật bậc cao Nhìn chung

có nhiều loại vector khác nhau được dùng trong công nghệ di truyền Mỗi loại vector

có tế bào chủ đặc trưng và khả năng xen đoạn DNA có kích thước khác nhau

 Dùng để sản xuất protein tái tổ hợp

 Tùy theo mục đích sử dụng mà chọn một tế bào chủ thích hợp Các tế bào chủ

có thể chia làm hai hệ thống chính, đó là tế bào chủ nhân sơ và tế bào chủ nhân chuẩn

1.2.6.1 Tế bào chủ nhân sơ

Một loại tế bào chủ lý tưởng là tế bào cần phải dễ nuôi cấy, dễ giữ và nhân giống,

lại chấp nhận được nhiều loại vector Vi khuẩn E coli đáp ứng các yêu cầu của tế bào

chủ lý tưởng và được sử dụng nhiều trong kỹ thuật tạo và tách dòng gene Do tính chất

đặc biệt của tế bào chủ lý tưởng nên E coli được nghiên cứu tỉ mỉ về cơ chế di truyền,

phân lập và tạo nên nhiều chủng khác nhau Các nghiên cứu đó là cơ sở cho kỹ thuật DNA tái tổ hợp và công nghệ di truyền

Ngoài E coli một số vi khuẩn khác cũng được dùng làm tế bào chủ cho các thí nghiệm tách dòng gene như: Bacillus, Pseudomonas và Streptomyces… tuy nhiên

những tế bào chủ này có những hạn chế nhất định Những tế bào chủ này cần đòi hỏi những vector thích hợp, nên việc đưa các DNA tái tổ hợp vào chúng gặp nhiều khó khăn

1.2.6.2 Tế bào chủ nhân chuẩn

Một trong những nhược điểm cơ bản khi sử dụng E coli làm tế bào chủ để tách

dòng gene vì nó là sinh vật nhân sơ không có màng nhân bao bọc nhiễm sắc thể Do

vậy các gene ở sinh vật nhân chuẩn không thể được biểu hiện được trong E coli vì

môi trường khác với môi trường bình thường của sinh vật nhân chuẩn Như vậy, nếu chúng ta muốn sản xuất một loại protein nhân chuẩn trong một thí nghiệm tách dòng

thì khó có thể tin rằng E coli mang DNA tái tổ hợp có thể sản sinh ra protein có chức

năng đầy đủ như protein nhân chuẩn mong muốn

Các tế bào chủ nhân chuẩn có phổ tồn tại rất rộng từ các vi sinh vật nhân chuẩn bậc thấp như nấm men, nấm mốc, tảo cho đến các tế bào sinh vật đa bào phức tạp như động vật, thực vật

 Tế bào nấm men (Saccharomyces cerevisiae)

Nấm men S cerevisiae là vi sinh vật nhân chuẩn đơn bào (kích thước khoảng 5

micromet) dễ nuôi cấy với quy mô lớn, có điểm khởi đầu (promotor) mạnh và có

plasmid dùng làm vector YAC biểu hiện gene,… Loài S cerevisiae có rất nhiều đặc

điểm phù hợp để người ta chọn làm tế bào chủ phù hợp nhất

Ngoài ra các nấm men khác cũng được dùng làm tế bào chủ trong các thí nghiệm

tạo dòng gene như nấm mốc Aspergillus nidulans, Neurospora crassa hoặc Pechia pastoris

 Tế bào thực vật

Một số loại tế bào thực vật được sử dụng làm tế bào chủ thực vật trong các phòng

thí nghiệm thao tác gene Tảo đơn bào, ví dụ như loài Chramydomonas rainhardii có

tất cả những đặc tính ưu việt của vi sinh vật cộng với cấu trúc và chức năng của tế bào thực vật Do vậy tảo đơn bào được sử dụng ngày càng nhiều trong các thí nghiệm thao tác di truyền, trong công nghệ di truyền Tuy nhiên, người ta cũng còn dùng các tế bào thực vật nuôi cấy trong những môi trường thích hợp có thể dùng làm tế bào chủ

 Các tế bào chủ động vật

Các tế bào động vật nuôi rất phức tạp, nhưng trong những điều kiện cần thiết cho

sự biểu hiện ra các protein có hoạt tính sinh học, người ta vẫn sử dụng tế bào chủ động vật Các loại tế bào chủ động vật bao gồm:

 Tế bào thận của khỉ xanh châu Phi

 Tế bào thận chuột đồng nhỏ

 Tế bào thận phôi người

 Tế bào tử cung chuột bạch

 Tế bào côn trùng để nuôi Baculovirus biểu hiện protein người

 Tế bào tuyến côn trùng Caenorhabditis elegans

1.2.7 Tạo, tách và chọn lọc dòng rDNA

Hai yếu tố quan trọng trong công nghệ DNA tái tổ hợp là: khả năng sử dụng các

enzyme để cắt nối các phân tử DNA in vitro và hệ thống các tế bào vật chủ để đưa

DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ nhằm nhân lên với một số lượng lớn bản sao trong tế bào chủ Mỗi tế bào chủ khi phân bào tạo nên một dòng tế bào chứa bản sao của một gene cần thiết, đó là tách dòng gene (gene cloning)

1.2.7.1 Tạo plasmid tái tổ hợp

 Tạo nguồn gene

Bước đầu của việc tạo plasmid tái tổ hợp là cần phải thu được nguồn gene Có ba phương pháp khác nhau để thu nhận gene:

 Thu nhận DNA từ hệ gene (thư viện DNA)

 Tổng hợp gene bằng phương pháp hóa học

 Lập ngân hàng DNA bổ trợ (cDNA)

 Tạo plasmid tái tổ hợp

Khi có các đoạn DNA hay cDNA mong muốn Bước tiếp theo là gắn chúng vào vector chuyển gene để tạo ra plasmid tái tổ hợp Có nhiều phương pháp gắn các đoạn DNA, hoặc cDNA vào plasmid, hoặc các vector chuyển gene khác

 Phương pháp dùng đầu dính

 Phương pháp dùng đoạn nối (linkers)

 Phương pháp dùng enzyme terminal transferase

1.2.7.2 Tách dòng DNA tái tổ hợp

Sau khi plasmid tái tổ hợp hoặc vector tái tổ hợp được tạo thành, bước tiếp theo là

biến nạp chúng vào tế bào chưa mang plasmid chứa gene lạ, ví dụ biến nạp vào E coli

Biến nạp được thực hiện bằng nhiều phương pháp khác nhau

 Xử lý tế bào chủ nhận bằng hóa chất

 Phương pháp xung điện

 Phương pháp vi tiêm

 Phương pháp dùng súng bắn DNA

1.2.7.3 Chọn lọc dòng DNA đặc hiệu và biểu hiện gene

Sau khi biến nạp DNA (gene) vào tế bào chủ nhận thì ở trong tế bào nhận, DNA biến nạp được nhân bản, từ đó chúng tạo ra được dòng DNA (gene) Bước tiếp theo chúng ta cần kiểm tra, chọn lọc đúng dòng gene mong muốn và sau đó tạo điều kiện cho gene biểu hiện

 Chọn lọc dòng DNA tái tổ hợp đặc hiệu

Trong nhiều trường hợp, do sử dụng các loại enzyme giới hạn khác nhau nên tạo ra

số lượng dòng DNA rất lớn, hoặc một loại enzyme giới hạn có thể cắt ra những đoạn gene không mong muốn Trong khi đó nhà nguyên cứu lại chỉ muốn tách một dòng DNA

cụ thể đặc hiệu Có 3 hướng chính để chọn lọc dòng DNA là: lai acid nucleic dùng mẫu RNA dò đặc hiệu, phát hiện bằng kiểu hình, hoặc phát hiện bằng phản ứng miễn nhiễm tùy theo tính chất của dòng gene

 Biểu hiện của gene mong muốn

Muốn gene đã tạo dòng biểu hiện ra các protein cần phải có vector biểu hiện mang đầy đủ yếu tố phiên mã và dịch mã Đối với các dòng gene ở động vật có vú tạo

ra sản phẩm là các protein có hoạt tính sinh học, chúng ta cần với số lượng lớn và có

giá trị thương mại Sự biểu hiện của các gene này trong tế bào E coli cần lưu ý một số

nhân tố sau:

 Số lượng bản sao của plasmid tái tổ hợp trong tế bào E coli cần hợp lý

 Phải có khởi điểm (promotor) phiên mã mạnh

 Có trình tự thuận lợi cho ribosome bám khi khởi đầu dịch mã

 DNA tái tổ hợp có sự ổn định lâu dài trong E coli

 Không có sự phân giải protein đích của các enzyme trong tế bào chủ

1.3 Một số ứng dụng của công nghệ DNA tái tổ hợp và cloning gene trong điều chế sản phẩm y sinh học

1.3.1 Human alpha antitrypsin

1.3.1.1 Sơ lược về bệnh thiếu men Alpha -1- Antitrypsin (AAT)

Thiếu men AAT là một tình trạng di truyền làm tăng nguy cơ phát triển bệnh phổi

và gan

Thiếu men AAT, cũng gọi là thiếu chất ức chế 1-proteinase hay đơn giản hơn là một bệnh di truyền làm tăng nguy cơ phát triển một loạt các bệnh như khí thũng phổi

và bệnh xơ gan Đó là do đột biến ở gene mã hóa cho glycoprotein 52 kD alpha antitrypsin (AAT)

1-Hầu hết các men AAT trong cơ thể được gan sản xuất Do đó khi thiếu men này gan cũng có thể bị tổn thương giống phổi

Bệnh thiếu men AAT được cho là một trong những bệnh di truyền thường gặp nhất ở cộng đồng người da trắng

Năm 1988, Ian Wilmut và các đồng nghiệp, Viện Roslin-Scotland, đã tạo ra cừu biến đổi gene “Tracy” sản xuất với các gene của con người đối với AAT được biểu hiện trong sữa Mục đích là để thu hoạch các AAT để điều trị bệnh khí thũng con người

1.3.1.2 Sản xuất AAT bằng cách sử dụng cừu biến đổi gene

Theo Bio Factsheet, số 51 đăng vào tháng 9/1999 thì quy trình sản xuất AAT bằng cách sử dụng cừu biến đổi gene được thực hiện như sau:

Trích mRNA từ tế bào người

Ly trích mRNA và xử lý với enzyme phiên mã ngược thu được bản sao DNA

Kiểm tra cDNA với đầu dò phóng xạ để xác định các đoạn có gene AAT bình thường

Điện di phân lập

Xử lý những đoạn gene với enzyme cắt giới hạn để tạo ra cDNA kết dính

Ly trích DNA từ tế bào cừu khỏe mạnh và xử lý với enzyme cắt giới hạn để tạo ra

DNA kết dính bổ sung

Trộn cDNA từ người và DNA kết dính bổ sung từ cừu và thêm những đoạn DNA mà

có chứa gene đề kháng với neomycin

Xử lý với enzyme nối DNA ligase để gắn kết chúng lại như là DNA tái tổ hợp

Khuếch đại DNA tái tổ hợp (rDNA) bằng kỹ thuật PCR

Trộn rDNA với tế bào cừu (tế bào gan) trong nuôi cấy mô, sốc nhiệt và calcium

phosphate, sau đó kết hợp nó vào hệ gene của chúng

Tiếp tục nuôi cấy tế bào cừu và xử lý với neomycin Khi đó sẽ giết chết những tế bào

mà không kết hợp được với rDNA Những tế bào còn lại sẽ chứa AAT

Cấy ghép các tế bào này trở lại cho cừu bằng cách tiêm tĩnh mạch, trực tiếp vào gan

Trong vòng một vài ngày có thể trích AAT từ huyết tương trong máu hoặc trong sữa

cừu

1.3.2 rBST (recombinant Bovine somatotrobin)/ rBGH (recombinant bovine growth hormone)

1.3.2.1 Giới thiệu về rBGH/rBST

rBGH/rBST là hocmon tăng trưởng tái tổ hợp trên bò được tạo ra từ công nghệ DNA tái tổ hợp, là sản phẩm biến đổi gene được sản xuất tự nhiên từ thùy trước tuyến yên của bò Ra đời bởi nhà sản xuất Monsanto, với tên thương hiệu là Posilac Hormone rBGH và rBST đã được Cơ quan Quản lý Thực phẩm– Dược phẩm Mỹ (FDA) phê duyệt năm 1997

rBST làm tăng sản lượng sữa trên bò (từ 10 – 15%, có 1 vài trường hợp tăng lên đến 40%) và tạo ra những giống bò sữa cao sản, được tiêm vào bò lúc 60 – 80 ngày sau khi sinh con, kích thích bò ăn nhiều hơn

1.3.2.2 Ứng dụng công nghệ sinh học trong sản xuất rBST

 Quá trình sản xuất rBST tái tổ hợp

Với sự phát triển của công nghệ sinh học Các nhà khoa học đã ứng dụng công nghệ DNA tái tổ hợp để tạo ra rBST bằng cách chuyển gene rBST từ nhân tế bào của

bò vào một tế bào vi khuẩn Để chuyển gene rBST của bò thành rBST trong tế bào vi khuẩn ta cần:

 Tạo ra nhiều bản sao của gene rBST bò

 Cắt gene rBST với enzyme giới hạn

 Chèn gene rBST bò vào DNA của vi khuẩn cho ra rBST

Tiêm DNA của vi khuẩn có chứa rBST vào vi khuẩn qua quá trình lên men tạo ra những vi khuẩn biến đổi di truyền sau đó tinh chế cho ra rBST cần tìm

 Quá trình sản xuất rBST tự nhiên từ bò

Hình 1.3 Quy trình sản xuất rBST

(Nguồn:

http://www.biochem.arizona.edu/classes/bioc471/pages/Lecture20/Lecture20.html)

 Quá trình sản xuất rBGH bằng cách tạo dòng gene sử dụng vi khuẩn

Tạo ra nhiều bản sao gene rBGH bằng kỹ thuật PCR

Chèn gene rBGH của bò vào DNA của vi khuẩn bằng enzyme cắt giới hạn

Hình 1.4 Kỹ thuật chèn gene rBGH (Nguồn: http://www.science.anth.org.uk/ifgene/history.htm)

Chèn gene rBGH của bò vào vi khuẩn nhờ vector plasmid để kết dính tạo ra DNA tái tổ hợp

Đưa các plasmid tái tổ hợp có chứa các rBGH vào tế bào vi khuẩn để tạo thành rBGH tổ hợp

1.3.2.4 Ảnh hưởng của rBST đến khả năng sản xuất sữa ở bò

Sản lượng sữa gia tăng một cách đáng kể khi tiêm rBST vào cơ thể bò Lưu lượng chảy của máu đến tuyến vú bò mạnh hơn, dẫn đến việc gia tăng lượng chất dinh dưỡng

có trong sữa, điều này đã ảnh hưởng đến việc cải thiện năng suất sữa của bò Ngoài ra hiệu quả của việc cho ăn được cải thiện, giúp bò sản xuất được nhiều sữa Theo Peel, những bò được tiêm BST tăng sản lượng sữa từ 4,8 – 11,2 cân/ngày, hiệu quả của việc cho ăn được cải thiện từ 2,7 – 9,3%

Hiện nay, nhiều nhà nghiên cứu đã làm một vài thử nghiệm về BST, kết quả sản lượng sữa gia tăng 8,4 kg/ngày (Bauman, 1989) Họ đã đưa ra nhận định khi tiêm BST trên đàn bò sữa thì sản lượng sữa gia tăng trong khoảng từ 8,5 – 17,6% Tuy nhiên cũng có một số thông tin của một vài nhóm nghiên cứu đưa ra nhận định không khả quan về tính chất sinh học của somatotrobin (Bauman, 1989)

Thật khó để đánh giá mỗi cá thể bò sẽ đáp ứng với BST như thế nào Đáp ứng cao được thấy khi ta bắt đầu tiêm BST cho bò, sau khi bò sản xuất sữa khoảng 101 ngày, khá hơn khi bắt đầu tiêm vào ngày 57 – 100 sau khi bò đẻ Phản ứng của những bò được

tiêm BST sớm trong thời kỳ cho sữa sẽ kém hơn (Bauman, 1989) Những bò sinh nhiều hơn một bê sẽ cho sữa nhiều hơn so với những bò cái lần đầu tiên cho sữa (Peel, 1989) Sản lượng sữa thường gia tăng trong những ngày đầu tiên sau khi ta bắt đầu tiêm BST

và tăng lên mức tối đa trong khoảng 6 ngày

1.3.2.5 Lợi ích và rủi ro khi sử dụng BST

Việc sử dụng BST trên bò sữa đang gây tranh luận nóng bỏng giữa các nhà sản xuất, các nhóm nghiên cứu và cả những người tiêu dùng

 Tác động lên sức khỏe bò

Theo Ferguson và Skidmore, khi tiêm một hàm lượng lớn BST trên bò sẽ làm tăng tỷ lệ tử vong của phôi, ảnh hưởng lên khả năng sinh sản của bò làm giảm tỷ lệ thụ thai so với những bò không tiêm BST

Một vài nghiên cứu cho thấy BST làm tăng tỷ lệ viêm vú bò Tuy nhiên theo nghiên cứu của Ferguson và Skidmore (1989) cho rằng không có sự liên quan giữa nhiễm trùng

và viêm vú trên bò

 Ảnh hưởng BST lên thành phần và chất lượng sữa

Một số nghiên cứu chỉ ra rằng cả hai BST tự nhiên được sản xuất bởi bò và BST sản xuất bằng các kỹ thuật DNA tái tổ hợp là ngay lập tức được chia nhỏ thành các acid amin và peptide không hoạt động trong đường tiêu hóa khi chúng được sử dụng bởi con người Ngược lại, các kích thích tố steroid như estrogene, progesterone, các anabolic steroid, giống như cấu trúc được hấp thu qua đường tiêu hóa và có hoạt tính sinh học ở người Đây không phải là trường hợp với BST trong sữa, cho dù đó là sản phẩm tự nhiên của bò hoặc bằng công nghệ DNA tái tổ hợp (Barbano và Lynch, 1989)

Thành phần sữa từ bò BST-điều trị đã được điều tra kỹ lưỡng (Barbano và Lynch, 1989) Các đặc tính của sữa từ bò BST-xử lý được trong phạm vi bình thường của biến thể của sữa bò không được điều trị Trong 28 ngày đầu điều trị, chất béo trong sữa bò tăng và protein sữa giảm nhẹ Sau khi điều trị lâu hơn, sữa bò điều chỉnh lượng chất dinh dưỡng và cân đối bình thường, tăng lượng whey protein và giảm casein, sự khác biệt này không có ý nghĩa và không có sự khác biệt về các axít béo tự do đã được quan sát Cholesterol trong phạm vi cho phép Yếu tố tăng trưởng insulin tăng lên đến hai lần trong sữa từ bò được điều trị, nhưng nó vẫn nằm trong phạm vi cho phép Không

có sự khác biệt về hương vị giữa sữa bò được tiêm BST và tự nhiên

Viện Y tế Quốc gia đã kết luận rằng sữa từ bò BST-điều trị căn bản giống như từ sữa bò không được điều trị, và không có sự khác biệt trong an toàn của sản phẩm

PHẦN 3 Kết luận

Công nghệ tái tổ hợp DNA hay tạo dòng gene ra đời đã dẫn tới những tiến bộ vượt bậc trong thực tiễn y khoa và trong nông nghiệp Nhờ công nghệ tái tổ hợp DNA người ta đã và đang tạo ra các giống cây trồng, vật nuôi biến đổi gene nhằm cung cấp

lương thực phẩm một cách dồi dào và đa dạng; tạo ra các loại thuốc chữa bệnh, năng cao sức khỏe và đời sống của con người…

Công nghệ tái tổ hợp DNA cho phép các nhà sinh học lấy gene từ tế bào này và chuyển vào một tế bào khác Khi được chuyển và ghép vào một tế bào mới, gene có thể biến đổi chức năng của tế bào nhận theo hướng có lợi cho con người, vật nuôi và cây trồng

Alpha 1 antitrypsin được sản xuất nhờ công nghệ DNA tái tổ hợp từ cừu biến đổi gene có thể điều trị bệnh khí thủng và xơ hóa gan cho người

Kích thích tố BST tái tổ hợp được sản xuất nhằm làm tăng sản lượng sữa mang lại hiệu quả kinh tế cho người chăn nuôi

Tuy nhiên vẫn còn những tranh luận về tính an toàn cho người sử dụng sản phẩm sữa bởi những bò có tiêm hocmon này

TÀI LIỆU THAM KHẢO

the Dairy Industry: bST Cornell University Nov 10-11

2 Bauman, Dale E., 1989 "Biology of Bovine Somatotropin." Advanced

Technologies Facing the Dairy Industry: BST Cornell University Nov 10-11,

p 18

3 Ferguson, James D., and Andrew Skidmore, 1989 "Bovine Somatotropin Reproduction and Health." Advanced Technologies Facing the Dairy Industry:

-BST Cornell University Nov 10-11, p 57-66

4 Peel, C J.; D L Hurd; K S Madsen; and G de Kerchove, 1989 Monsanto

Agricultural Company In Proceedings, Monsanto Technical Symposium, Oct

24, 1989 The Monsanto Company, St Louis, Missouri

5 Seungwook Kim Chem, 2004 Gene Cloning Bio Eng

Tài liệu internet

1 Giáo trình Công nghệ sinh học Công nghệ DNA tái tổ hợp

ngh-dna-tai-t-hp

http://thuviensinhhoc.com/ebook/sinh-hoc/1273-giao-trinh-cnsh chng-8 cong-2 http://www.vcn.vnn.vn/Main.aspx?MNU=1080&Style=1&ChiTiet=4698&search=XX_SEARCH_XX

3 Transgernic liverstock and animal cloning

6 The center for food safety rBGH/rBST

http://www.centerforfoodsafety.org/rbgh2.cfm

là tế bào gốc của da

Tế bào gốc có khả năng kỳ diệu là tự duy trì chính nó và cũng tạo ra những cơ quan, nội tạng phục vụ trong y khoa Nghiên cứu tế bào gốc da là một việc làm có nhiều thuận lợi: không có hiện tượng loại thải của cơ thể, vật liệu dễ tìm, thao tác kỹ thuật đơn giản hơn chuyển nhân, không vướng phải rào cản đạo đức,

PHẦN 2 Nội dung

2.1 Các lớp tế bào ở da

Da là một trong những cơ quan lớn nhất và hoạt động nhiều nhất ở cơ thể người

Là một hệ thuộc biểu mô, cấu trúc của da chuyên biệt bao bọc và ngăn cách toàn bộ bề mặt của cơ thể người với môi trường tự nhiên bên ngoài, gồm có ba lớp cấu trúc chính:

 Lớp biểu bì (epidermis)

 Lớp bì (dermis)

 Lớp hạ bì (hypodermis, subcutaneous tissue)

 Ở da còn có các tổ chức tuyến tiết, lông, móng và các thụ quan

Ở người trưởng thành, diện tích bề mặt có tiếp xúc với môi trường ngoài của da khoảng 2,3 m2, chiếm khoảng 16% tổng trọng lượng cơ thể Da có chiều dày khoảng 0,07 – 2,5 mm, dày nhất ở vùng bàn tay, bàn chân và mỏng nhất ở vùng mi mắt, môi

Sự dày mỏng khác nhau của da được giải thích bởi các lực tác động khác nhau của môi trường vào từng vùng riêng rẽ trên cơ thể

2.1.1 Lớp biểu bì

Biểu bì là lớp ngoài cùng của da, tiếp xúc trực tiếp với môi trường ngoài Đây là hàng rào đầu tiên bảo vệ cơ thể, chia thành năm lớp nhỏ:

 Lớp đáy (stratum basale) hay lớp mầm (stratum germinativum)

 Lớp gai (stratum spinosum)

2.1.1.1 Lớp đáy (stratum basale) hay lớp mầm (stratum germinativum)

Lớp đáy bao gồm một hàng tế bào vuông hay trụ đơn, bắt màu bazơ và ở trên màng đáy nằm giữa biểu bì và bì, có khả năng phân chia liên tục và di chuyển ra bề

Hình 2.1 Cấu tạo của lớp biểu bì

(Nguồn http://www.physioweb.org/integumentary/skin)

mặt để thay thế dần các tế bào già bên trên bong ra, đó là các tế bào sừng (chứa nhiều sừng)

Tế bào sừng là những tế bào có nguồn gốc từ ngoại phôi bì và phân bố khắp biểu

bì (chiếm 95% tổng số tế bào của lớp biểu bì), có hoạt động phân bào như những tế bào gốc của tủy xương Trong quá trình biệt hóa chúng di chuyển lên phía trên thay cho các tế bào ở trên bị bong ra, nhờ đó lớp biểu bì luôn được thay mới Quá trình di chuyển lên trên của những tế bào thường xảy ra khoảng 25 - 50 ngày

Thông thường ở lớp đáy chỉ có khoảng 10% là tế bào sừng, 50% các tế bào khác đang ở thời điểm giao thời của sinh trưởng, 40% còn lại là các tế bào ở hậu kỳ của giảm phân Các tế bào của lớp đáy được gắn kết trên màng cơ bản nhờ các phân tử dính fibronectin do nguyên bào sợi của lớp trung bì tiết ra

Ngoài ra, nằm rải rác trên lớp đáy còn có các loại tế bào khác: hắc tố bào (tổng hợp các protein hắc tố da), tế bào Langerhans và Merkel

2.1.1.2 Lớp gai (stratum spinosum)

Lớp gai còn được gọi là lớp Malpighi, ở trên lớp đáy, chúng là tập hợp của 5 - 20 tầng tế bào đa diện liên kết chặt chẽ với nhau nhờ các cầu nối liên bào phân nhánh, khi quan sát vi mẫu, thấy nhiều sợi nối giữa các tế bào, do vậy còn được gọi là lớp sợi Các

tế bào này tương đối đặc trưng bởi hình đa diện và nhân hình cầu ở trung tâm và các nhánh bào tương có nhiều siêu sợi keratin Nhân tế bào thường có hình tròn nằm giữa tế bào và bắt màu bazơ khi nhuộm

2.1.1.3 Lớp hạt (Stratum granulosum)

Lớp hạt bao gồm từ 3 - 5 lớp tế bào đa diện dẹp, ở trên lớp gai Các tế bào này chứa nhiều hạt sắc tố và nhân phân thùy, chúng tự chết theo chương trình để chuyển thành dạng tế bào sừng hóa Lớp hạt gồm các hàng tế bào hình thoi, trong bào tương

có chứa rất nhiều các hạt keratohyalin bắt màu bazơ khá đậm

2.1.1.4 Lớp bóng (Stratum lucidum)

Lớp bóng nằm phía trên lớp hạt là một lớp mỏng và các tế bào của chúng đã có sự biến đổi sâu sắc về bản chất Tế bào trở nên dài hơn, dẹt hơn, nhân và tất cả các bào quan bị phân giải, tiêu biến dần Nhìn chung, chúng đã thoái hóa không còn hình dạng

tế bào Toàn bộ lớp bóng hoặc bắt màu vàng cam hoặc không bắt màu

2.1.1.5 Lớp sừng (Stratum corneum)

Ở mặt trên biểu bì, tế bào biến thành những lá sừng mỏng, trong bào tương chứa rất nhiều sừng nhằm ngăn cản sự thoát hơi nước, cách nhiệt và những nhân tố bất lợi khác từ phía môi trường ngoài xâm nhập vào cơ thể Những lá sừng từ những tế bào đã thoái hóa tạo nên, bắt màu không đồng nhất Sự đổi mới hoàn toàn của lớp biểu bì tính

từ khi sản sinh ra một tế bào gốc mới đến khi rụng thành vảy vào khoảng 45 – 75 ngày Tuy nhiên quá trình này còn phụ thuộc vào môi trường nội tại của mô có thuận lợi hay không bao gồm các tín hiệu tiếp xúc để tế bào sao chép và di chuyển cùng các kích thích hóa học của các nhân tố tăng trưởng Có nhiều tín hiệu xuất phát từ các

nhân tố của lớp trung bì, đặc biệt là các protein fibronectin nền và các hợp chất nền khác như hyaluronic acid

2.1.2 Lớp bì

Bì là mô liên kết nâng đỡ biểu bì và gắn kết biểu bì vào hạ bì Bề dày của bì khác nhau, tùy vùng cơ thể và dày tối đa là 4 mm ở da lưng Bề mặt của bì không đều, có nhiều chỗ nhú lên (nhú bì) xen giữa các chỗ nhú xuống (nhú biểu bì) Các nhú có nhiều ở vùng da thường xuyên bị đè nén, có vai trò củng cố sự kết gắn biểu bì với bì

Bì có hai lớp khó phân biệt rõ ranh giới: lớp nhú bên trên và lớp lưới ở bên dưới Lớp nhú (papillary layer) mỏng là mô liên kết thưa với các nguyên bào sợi và các tế bào mô liên kết khác như masto bào, đại thực bào và các bạch cầu ở bên ngoài mạch máu Lớp lưới (reticular layer) dày hơn, là mô liên kết đặc không đồng nhất, do vậy có

tỉ lệ sợi collagene nhiều hơn và tế bào ít hơn so với lớp nhú

Bì có lưới mạch máu và mạch bạch huyết Mạch máu cung cấp dinh dưỡng để phân chia tế bào và loại bỏ những chất thải, chúng cũng giúp duy trì nhiệt độ cơ thể bởi việc giãn nở và mang nhiều máu hơn khi cơ thể cần thoát nhiệt Ngược lại, khi cơ thể cần giữ nhiệt, chúng sẽ co lại và mang ít máu hơn

Ngoài các thành phần kể trên, bì còn có các cấu trúc có nguồn gốc từ biểu bì như dây thần kinh, nang, lông, tuyến mồ hôi và tuyến bã

 Dây thần kinh chuyên biệt trong lớp bì giúp cơ thể phát hiện nóng, lạnh, đau, áp lực và sự va chạm,… rồi truyền đến não Ở đây, cơ thể cảm giác những thay đổi của môi trường gây thiệt hại cho cơ thể

 Nang lông gắn vào trong lớp bì và vượt ra ngoài cơ thể Sự phân chia tế bào của nang lông cũng giống như sự phân chia tế bào trong lớp biểu bì Màu sắc của lông được xác định bởi số lượng và loại hắc tố trong lớp ngoài của cọng lông

 Một tuyến chất nhờn ở mỗi nang lông và tiết ra sebum, một chất nhờn (tinh dầu) giúp lông và da chống lại nước, hóa chất và vi sinh vật

 Tuyến mồ hôi nằm trên da – mỗi người có khoảng hơn 2 triệu tuyến Khi cơ thể cần giảm nhiệt những tuyến này sẽ tiết ra mồ hôi (gồm hỗn hợp nước, muối và một vài chất thải)

2.1.3 Lớp hạ bì

Hạ bì là mô liên kết thưa gắn kết da vào các cơ quan kế cận một cách lỏng lẻo, giúp cho hạ bì có thể trượt bên trên các cơ quan đó Hạ bì thường có khối tế bào mỡ có kích thước thay đổi khác nhau tùy theo vị trí cơ thể và có khối lượng tùy thuộc tình trạng dinh dưỡng Hạ bì còn được gọi là mạc nông, có mô mỡ dưới da

2.2 Tế bào gốc da

Trong lớp biểu bì, các tế bào đáy phân chia liên tục tạo nên một cơ chế cân bằng động với số lượng tế bào chết đi Mặc dù có nhiều công trình nghiên cứu về vấn đề

này trong nhiều thập niên nhưng cơ chế kiểm soát mối quan hệ giữa sự phân chia và biệt hóa tế bào vẫn chưa thật sự rõ ràng (Cotsarelis, 1999) Tuy nhiên, vẫn có những chứng cứ về sự tồn tại của tế bào gốc ở lớp biểu bì của da:

- Dòng vô tính của tế bào đã được hình thành từ những tế bào biểu bì chống lại phóng xạ để phục hồi da sau khi làm suy yếu bằng phóng xạ (Withers, 1967; Potten, 1973)

- Đã cấy ghép thành công tế bào keratinocytes cơ bản của lớp biểu bì để chữa trị cho bệnh nhân bị bỏng, mặc dù không có sự hình thành nang lông và tuyến mồ hôi

- Đã khám phá được tính không đồng nhất trong chu kỳ sống của tế bào đáy

- Đã xác định được 2 đặc điểm chính của tế bào gốc: đời sống của tế bào dài (slowly-cycling nature) và khả năng sinh sản (phân chia) nhanh (high proliferative potential)

- Đời sống của tế bào được xác định bằng cách đánh dấu với 3H-TdR (tritiated [3H] thymidine) hay BrdUrd (bromodeoxyuridine) trước khi nuôi cấy Trong thời gian nuôi cấy, tế bào gốc phân chia nhanh chóng, sau 4 - 6 tuần không đánh dấu, chỉ có những tế bào có chu kỳ sống dài mới giữ được yếu tố đánh dấu và được phát hiện bằng phương pháp chụp phóng xạ tự động (autoradiography) hay mô học miễn dịch (immunohistology)

- Tiềm năng sinh sản cao của tế bào gốc được xác định bởi đặc điểm của tế bào sừng (keratinocytes) là có khả năng khác nhau trong việc hình thành những cụm trong hệ thống nuôi cấy Do đó, có thể đếm những cụm được sinh ra và tính toán hiệu quả hình thành những cụm này Giá trị này có thể được sử dụng như một chỉ định về số lượng tế bào gốc trong một vùng riêng biệt của biểu

tố phiên mã Theo chu kỳ, những tế bào này rời khỏi chu kỳ tế bào, đảm nhận sự biệt hóa cuối cùng, di chuyển ra ngoài và cuối cùng tróc ra khỏi bề mặt da Cấu trúc này cho phép biểu bì tạo ra hàng rào tự bảo vệ không cho vi trùng gây hại đi vào và các dịch cơ thể thiết yếu đi ra

Nhờ vào sự biệt hóa cuối cùng tế bào sừng (keratinocyte) trải qua ba tầng biệt hóa

rõ rệt: lớp gai (spinous), lớp hạt (granular) và lớp sừng (corneum) (hình 2.3) Những

thay đổi chủ yếu trong phiên mã, hình thái và chức năng xảy ra ở giai đoạn chuyển tiếp giữa lớp gai và lớp đáy và lập lại ở giai đoạn chuyển tiếp giữa lớp hạt và lớp sừng như thể những tế bào biệt hóa vươn tới bề mặt da là những bộ xương tế bào đã rút nhân được bao bọc bằng những sợi keratin có lớp vỏ protein sừng liên kết chéo  - glutamyl

-  - lysine Bước cuối cùng trong quá trình biệt hóa là đẩy lớp lipid ra ngoài để tạo lớp

vỏ bọc giống như chất keo dính chặt vào bề mặt cơ thể Quá trình này thực hiện liên tục về mặt chức năng để các tế bào bề mặt tiếp tục bị tróc ra và được thay bằng những

tế bào bên trong được biệt hóa và di chuyển ra bên ngoài Trong biểu bì của người, khả năng tự trẻ hóa của tế bào gốc ở biểu bì là khổng lồ và trong bốn tuần, tế bào đáy (a basal cell) đã biệt hóa và đi vào bề mặt da Ở chuột, biểu bì trên thân mình của con mới sinh trở nên mỏng hơn và sự tăng sinh về căn bản là chậm vì bộ lông phát triển và trở thành hàng rào bảo vệ sơ cấp

Chương trình biệt hóa biểu bì được thể hiện, màng đáy đôi ở đáy, lớp đáy tăng sinh và ba tầng biệt hóa: lớp gai, lớp hạt và lớp sừng ở ngoài cùng nhất Ở bên phải, là những marker phân tử chính

Mặc dù trong nhiều năm các nhà nghiên cứu đã biết rằng tế bào gốc tồn tại trong lớp đáy của biểu bì ở người trưởng thành, nhưng vẫn chưa rõ rằng tất cả tế bào trong lớp đáy là tế bào gốc hay chỉ một lượng nhỏ tế bào gốc tồn tại trong lớp này Đơn vị tăng sinh biểu bì (epidermal proliferative unit - EPU) được xác định về mặt cấu trúc là một nhóm 10 tế bào đáy dính chặt nhau tạo ra cụm tế bào lớn hơn và bằng phẳng hơn

mà lên đến cực điểm với một tế bào bề mặt sáu cạnh Điều này đã dẫn đến giả thuyết rằng có một tế bào gốc tự làm trẻ hóa trên 1 đơn vị tăng sinh và những tế bào đáy khác được gọi là transit-amplifying (TA) cells (tế bào trung gian) (ví dụ tế bào trung gian (commited cell) phân chia vài lần và sau đó đi vào lớp đáy và biệt hóa cuối cùng) Hỗ

trợ cho khái niệm này là những nghiên cứu in vitro cho thấy tế bào biểu bì của người

có mức 1 integrin bề mặt cao nhất sẽ mọc những colony lớn nhất holoclones có thể di chuyển trong thời gian dài, trong khi đó các tế bào có mức 1 integrin thấp tạo ra các meroclone nhỏ hơn không di chuyển 1 Integrins là các thành phần bám chặt vào trung tâm lõi xuyên màng (transmembrane core components of focal adhesions (FAs)) cần cho sự kết hợp màng đáy đôi, kết dính các lớp tế bào và sự tăng sinh/tồn tại của tế bào

Dựa vào những quan sát in vitro, đã phỏng đoán rằng các tế bào biểu bì ở lớp đáy

phân chia đối xứng và tạo ra các tế bào con bằng nhau Trong trường hợp này, tế bào đáy sẽ từng bước giảm bớt sự dính chặt vào màng đáy đôi nằm ở dưới, sau đó phân lớp

và đảm nhận sự biệt hóa cuối cùng

Trong nghiên cứu đầu tiên báo cáo về sự phân chia không đối xứng, khi phân tầng, các tế bào đáy của phôi chuột di chuyển lên trên từ phần bên đến hướng thẳng đứng để trải qua sự phân chia không đối xứng Sự phân chia không đối xứng sớm được giải thích cho khoảng 70% sự phân bào của tế bào đáy, trong khi đó khoảng 30% còn lại là đối xứng Sự phân chia không đối xứng cung cấp điều kiện tự nhiên để duy trì

một tế bào con ở lớp đáy tăng sinh (proliferative basal daughter cell) chứa nhiều tyrosine kinases thụ thể điều khiển sự phát triển (growth-promoting receptor tyrosine kinases (RTKs), các integrin và một tế bào con ở lớp dưới đáy (suprabasal daughter) thì có mức độ RTKs và integrin giảm (hình 2.3) Hơn thế nữa, những thí nghiệm bất hoạt chức năng (loss of function expirements) đã chứng minh vai trò của -1 integrin

và -catenin (thành phần cốt lõi của tế bào – những chất liên kết giữa các tế bào) trong việc điều chỉnh tính phân cực của tế bào để định hướng cực hướng lên thích hợp và duy trì sự ổn định môi trường bên trong cơ thể (Lechler và Fuchs, 2005)

Trong một nghiên cứu gần đây về truy suất nòi giống của da ở đuôi chuột trưởng thành (một vùng da khác đã làm giảm bớt nang lông) cũng cung cấp bằng chứng rằng

sự phân chia ở lớp đáy là phân cực và không phân cực nhưng trong trường hợp này, chỉ khoảng 30% xảy ra ở gốc Trong trường hợp này, nó được đề xuất rằng sự phân chia không đối xứng có thể cho phép hai tế bào con dính chặt vào lớp dưới (substratum) của chúng một cách tự nhiên nhưng tế bào con trung gian (commited daughter cell) thì thừa hưởng một cách không đối xứng một tín hiệu Notch mạnh hơn, yếu tố quyết định phiên mã chính về chức năng của tế bào gai Trong mô hình này, tế bào con thừa hưởng tín hiệu Notch sẽ biệt hóa, tách khỏi màng đáy đôi nằm ở dưới và

đi vào lớp gai, trong khi tế bào con không truyền tín hiệu Notch sẽ duy trì ở dạng tế bào gốc

Những tế bào gốc tự làm mới (SCs) tồn tại trong lớp đáy của biểu bì Sự phân chia đối xứng tạo ra hai tế bào gốc, quá trình này có thể bổ sung các khoảng trống trong lớp đáy Trong mô hình ba bước, phát sinh tế bào trung gian (transit-amplifying (TA)) phân chia 4 – 5 lần trước khi phân lớp và đi vào chương trình biệt hóa cuối cùng Trong mô hình hai bước, tế bào gốc ưu tiên chia các yếu tố liên quan đến sự tăng sinh cho tế bào gốc con trong khi đó nó cung cấp các thành phần kích thích sự biệt hóa cho tế bào con khác để đảm nhận chức năng trở thành tế bào gai (SP) Phụ thuộc vào

sự định hướng đi lên, sự phân chia có thể hoặc làm cho tế bào SP tách khỏi màng đáy đôi, hoặc nếu về phía bên thì sau đó cần phải có sự phân lớp của tế bào con SP trung gian (committed SP daughter) Tế bào gai vào chương trình biệt hóa khi chúng di chuyển ra bên ngoài và được tách ra khỏi bề mặt da Tế bào biệt hóa được thay thế tiếp tục bằng dòng chảy của những tế bào bên trong đảm nhận sự biệt hóa sau cùng và di chuyển ra bên ngoài

Mặc dù cần những nghiên cứu tiếp theo để giải quyết hai mô hình khác nhau về

sự phân chia tế bào đáy, nhưng chúng dẫn đến hàm ý rõ rệt về số lượng tế bào gốc ở biểu bì và vị trí của các hốc tế bào gốc ở biểu bì Mô hình EPU cho thấy sự tồn tại chỉ một lượng nhỏ tế bào gốc đáy và đề nghị rằng trong lớp đáy được tổ chức về mặt không gian các vi môi trường để đóng góp một hốc nhỏ (mini-nitch) cho một tế bào gốc Ngược lại, mô hình phân chia không đối xứng đề nghị rằng một quần thể nguyên thủy trong lớp đáy có thể gia tăng các tế bào trung gian (committed cell) bằng việc phân chia một cách khác nhau các protein cho tế bào con Mô hình phân chia không đối xứng theo chiều ngang ngụ ý rằng sự phân chia không đối xứng là bản chất bên

trong của tế bào gốc biểu mô, làm giảm bớt sự cần thiết đối với thay đổi vi môi trường

để khởi phát (trigger) cho sự chuyển giao (commitment) Mô hình phân chia không đối xứng theo chiều dọc cho thấy rằng màng đáy đôi bản thân nó có thể tạo ra hốc tế bào gốc biểu mô, đặt tế bào trung gian (committed cell) vào trong lớp gai một cách tự nhiên Sự phân chia đối xứng theo chiều ngang tạo ra hai tế bào gốc có thể cho cơ chế thay thế tế bào gốc đáy già hoặc bị hư hại (trong trường hợp của sự phân chia không đối xứng theo chiều dọc) hoặc tế bào gai (sau khi phân lớp trong trường hợp phân chia không đối xứng theo chiều ngang) Mô hình phân chia không đối xứng theo chiều dọc

thì tương tự với mô hình phát triển tế bào mầm của Drosophila melanogaster giúp duy

trì sự tiếp xúc với hốc chứa khả năng tạo gốc (stemness), trong khi đó sự phân chia không đối xứng theo chiều dọc xác định chức năng của tế bào con, rời khỏi hốc

2.2.1.1 Các yếu tố quyết định sự phân chia tế bào gốc biểu bì

Không kể đến chức năng của tế bào biểu mô, màng đáy đôi phân ranh giới giữa biểu bì và bì đóng vai trò then chốt trong việc kiểm soát khả năng tăng sinh của biểu

bì Mặc dù các thuộc tính cơ học-sinh lý của nó có khả năng thúc đẩy các thuộc tính tăng sinh của tế bào đáy, màng đáy đôi cũng chứa nhiều yếu tố quyết định sự phân chia tế bào gốc

 TGF/EGFs

Màng đáy đôi giàu proteoglycan và những protein khác hoạt động như phân tử đàn áp các yếu tố phát triển như TGFs làm hạn chế sự tăng sinh biểu bì,

TGF/EGFs và các yếu tố phát triển insulin thúc đẩy sự tăng sinh biểu bì Một nghiên

cứu gần đây cho thấy rằng khi tín hiệu TGF bị tổn hại do mất thể nhận TRII thì sự

ổn định môi trường bên trong của biểu bì được duy trì nhưng lớp đáy biểu hiện sự tăng sinh mạnh mẽ do quá trình apotosis tăng lên Mặc dù sự ổn định môi trường bên trong

có thể được duy trì nhưng không chắc chắn: vết thương sẽ lành nhanh hơn và có thêm đột biến gây ung thư (oncogeneic mutation), mô này nhanh chóng chuyển thành khối ung thư của tế bào vảy ở da Thật thú vị, sự truyền tín hiệu FAK/integrin tăng và sự di trú nhanh thêm khi sự truyền tín hiệu TGF bị tổn hại (compromise) trong biểu bì Ngược lại, sự truyền tín hiệu integrin nâng cao đàn áp sự truyền tín hiệu TGF và con đường phân tử này có thể là con đường hai chiều

Mặc dù sự truyền tín hiệu TGF kiềm hãm sự tăng sinh và di trú của biểu bì, sự truyền tín hiệu của thể nhận EGF (EGFR) làm tăng khả năng tăng sinh và di trú trong biểu bì

 Lrig1

Lrig1 nằm trong biểu bì của người, là một ligan ức chế sự truyền tín hiệu EGFR,

được biểu hiện trong tập hợp tế bào ít tăng sinh và giàu 1 Nghiên cứu gần đây cho

thấy biểu bì của chuột thiếu Lrig1 sẽ tăng sinh quá mức (hyperproliferate) và tế bào sừng của người được xử lý bằng Lrig1 thì đoạn RNA dạng kẹp tóc ngắn (short hairpin

RNA) sẽ tạo ra các colony lớn hơn bình thường Những quan sát này đã dẫn đến giả

thuyết rằng Lrig1 đóng vai trò trong pha nghỉ của tế bào gốc đáy (basal stem cell)

 Mitogene-inducible genee 6

Mitogene - inducible genee 6 cũng là chất ức chế sự truyền tín hiệu EGFR và chuột thiếu mitogene - inducible genee 6 cũng cho thấy sự tăng sinh quá mức ở biểu bì

và tăng độ nhạy cảm với ung thư Việc truyền tín hiệu EGFR thúc đẩy không chỉ sự tăng sinh mà còn sự di trú của tế bào Một cơ chế có thể thực hiện là thông qua khả năng hoạt hóa của EGFR để phosphoryl hóa 4 integrin và thúc đẩy thể bán liên kết (hemidesmosome) không tập hợp lại

 p63

p63 là yếu tố phiên mã có khả năng đóng vai trò then chốt trong việc điều hòa khả năng tự làm mới và khả năng tăng sinh lâu dài của tế bào gốc và là thành viên của họ protooncogenee p53 Tầm quan trọng của p63 trong sinh học về biểu bì được phát hiện khi hai nhóm nghiên cứu bất ngờ khám phá ra rằng chuột thiếu p63 thì bị suy yếu nghiêm trọng về khả năng tạo ra lớp biểu bì

Việc ủng hộ cho vai trò của Np63 trong việc tự làm mới của tế bào gốc là phân tích dòng hóa trên tế bào biểu bì và những tế bào biểu mô được nuôi cấy, khi p63 mRNA bị hạ gục (knock down) bởi các RNA nhỏ có dạng kẹp tóc (small hairpin RNAs), các tế bào này hình thành các colony nhỏ hơn bằng việc giảm tốc độ tăng sinh Thí nghiệm nuôi cấy số lượng lớn biểu bì của người để làm rõ chức năng của p63 trong các tế bào đáy là gián tiếp ức chế p53 thuộc nhóm của nó, do đó thúc đẩy tế bào sống sót và trường thọ, trong khi đó những ảnh hưởng của nó lên sự biệt hóa thì độc lập với p53 Phù hợp với quan điểm này, những thí nghiệm loại bỏ (knockdown) p63

(Senoo và ctv, 2007), biểu hiện của sự biệt hóa cuối cùng và những apotosis markers tăng lên Ngược lại, nghiên cứu của Koster và ctv (2007), vai trò của p63 là thúc đẩy

tế bào đáy chuyển từ tăng sinh sang biệt hóa cuối cùng thông qua việc giảm IB kinase-, một chất điều hòa sự biệt hóa Do đó cần những nghiên cứu tiếp theo để giải quyết tranh luận này

 Sự truyền tín hiệu Notch

Hình 2.2 Vai trò dự đoán của sự truyền tín hiệu Notch theo ba dòng khác nhau của biểu bì (Mô hình – A-B) (Nguồn: sciencedaily.com/releases/2006/10/061006072432.htm)

Những nghiên cứu gần đây của Lee và ctv (2007) cho rằng sự tăng sinh quá mức

ở biểu bì thể hiện khi da bị tổn thương đặc biệt trong việc truyền tín hiệu Notch có thể

tăng lên từ những thay đổi tự trị không phải của tế bào (noncell autonomous changes) trong lớp bì ở dưới Mặc dù những ảnh hưởng của Notch lên sự tăng sinh có vẻ phức tạp, nhưng quan điểm chung từ các nghiên cứu gần đây là sự truyền tín hiệu Notch đóng vai trò chủ chốt trong việc chuyển giữa tế bào đáy (basal) và tế bào trên đáy (suprabasal)

ở biểu bì, nơi mà nó thực hiện chức năng trong việc hoạt hóa chức năng bật tắt ở lớp đáy

(basal) đến trên đáy (suprabasal) (hình 2.3)

Ở da, các thể dính Notch (Notch ligands) thường ở đáy, trong khi đó các thể nhận Notch (Notch receptors) thì ở lớp trên đáy (suprabasal) Sự truyền tín hiệu Notch sẽ phóng thích vùng nội bào Notch (Notch intracellular domain), hoạt động như yếu tố phụ phiên mã (transcription cofactor) đối với RBPj protein liên kết DNA (the DNA-binding protein RBPj) Đích xuôi dòng của vùng nội bào Notch/RBPj bao gồm Hes1

và Hey1 liên kết DNA và thực hiện chức năng như chất ức chế phiên mã (transcriptional repressor) Ở các dòng chuyển hóa da (skin lineages), sự truyền tín hiệu Notch được biểu thị bởi sự biểu hiện của vùng nội bào Notch, gene đích của Notch như Hes1 và Hey thì đặc biệt nổi bật ở việc chuyển tiếp nhiệm vụ từ tăng sinh sang biệt hóa Mũi tên biểu thị các bước phân tử của con đường truyền tín hiệu Notch cho mỗi loại trong ba dòng chuyển hóa chính của da Những mũi tên cho thấy các

bước ở thời điểm truyền tín hiệu Notch hoạt động Mô hình (B) Miễn dịch huỳnh quang (Immunofluorescence) Kính hiển vi miễn dịch huỳnh quang được sử dụng

trên tiêu bản E18.5 của da chuột đông lạnh (biểu bì) và gốc nang lông 28 ngày sau khi sinh để minh họa vị trí của Notch3, Hes1 và Hey1 Tất cả mẫu được nhuộm bằng DAPI (màu xanh dương) để đánh dấu nhân Nơi chỉ ra kháng thể đối với 4 integrin (Int) được sử dụng để đánh dấu ranh giới giữa biểu bì, bì và keratin 14 (Ker14) được

sử dụng để biểu thị lớp đáy của ORS Hai ô hình phía trên minh họa sự đồng biểu hiện (coexpression) của Notch3 và Hes1, đặc biệt biểu hiện mạnh ở sự chuyển tiếp giữa đáy

và dưới đáy của biểu bì Hai ô phía dưới cho thấy Hes1 nổi bật trong các tế bào biệt hóa của IRS (bên trái), trong khi Hey1 thì được biểu hiện rộng rãi hơn trong cả vỏ trước (precotex) và IRS (bên phải) Việc ghép hình ảnh vào khung bên phải phía dưới cho thấy cận ảnh của tế bào tiền thân của lông, được đánh dấu bằng kháng thể kháng với keratin của lông có màu xanh lá cây và Hey1 màu đỏ cho thấy nhân Hey1 đồng khu biệt với các tế bào tạo ra lông Chú ý rằng tế bào matrix tăng sinh mạnh mẽ ở đáy của chân lông thì âm tính đối với dấu hiệu biểu hiện của tín hiệu Notch

Nhìn chung, sự biểu hiện ở lớp đáy (the basal expression) của thể dính Notch như Delta1 và sự biểu hiện ở lớp trên đáy (the suprabasal expression) của thể nhận Notch (Notch receptors) và các gene đích quy định Notch (Notch downstream target genees) như Hes1 thì phù hợp với vai trò truyền tín hiệu Notch trong việc kiểm soát bật tắt tín hiệu này

 Protein C/EBPs

Theo Hình 2.4 ở da bình thường (bên trái), tế bào gốc đáy có màu xanh lá cây biệt hóa thành tế bào màu đỏ Ở da chuột (ở giữa) không có C/EBP-beta và alpha, sự biệt hóa bị ngăn cản: tế bào gốc có màu xanh lá cây xuất hiện ở lớp trên của da, và không có những tế bào da đã biệt hóa (không có màu đỏ) Điều này cũng xảy ra ở giai đoạn bắt đầu ung thư biểu mô của tế bào đáy Ở da (bên phải) có sự hiện diện của C/EBP-beta nhưng mất khả năng tương tác với E2F là phân tử điều hòa chu kỳ tế bào,

tế bào da bắt đầu biệt hóa không bình thường, trước khi chúng thoát khỏi chương trình

tế bào gốc (màu vàng/cam) Điều này giống với những gì quan sát được ở tế bào vảy ở giai đoạn bắt đầu ung thư biểu mô, khối u da tấn công và xâm lấn nhiều hơn (Claus

và C/EBPβ

Người ta đã sử dụng kỹ thuật công nghệ di truyền để loại bỏ các gene mã hóa C/EBPα và C/EBPβ ở da của phôi chuột và thấy rằng không có những protein này, da chuột không được hình thành một cách thích hợp

“Chuột không có C/EBPα hoặc C/EBPβ thì da bị căng và bóng làm cho nó không thể giữ nước bên trong cơ thể Theo Nerlov là do chúng thiếu nhiều protein làm cho da dai, chắc khỏe và bị chết do mất nước sau khi được sinh ra

Tuy nhiên, chỉ cần một trong hai chất trên là đủ để đảm bảo cho da phát triển thích hợp Điều này có nghĩa là hai protein này thực hiện cùng chức năng trong tế bào gốc da – sự phong phú không mong muốn có thể gia tăng bởi vì có quá nhiều tế bào gốc ở da mà kiểm soát chặt chẽ sự tăng sinh là cần thiết để tránh những vấn đề giống như ung thư Hoặc đơn giản là sản phẩm phụ của hai protein này có những chức năng khác nhau ở những trường hợp khác nhau như chữa lành vết thương hoặc sữa chữa những tổn hại cho da do ánh nắng mặt trời

Hình 2.3 Các dạng biệt hóa tế bào ở da

(Nguồn:

http://www.sciencedaily.com/releases/2007/05/0 70503125719.htm)