Bài giảng thực hành công nghệ vi sinh

Các bài thực hành nhằm minh họa, chứng minh lý thuyết của các quá trình: Lên men thu nhận sinh khối vi sinh vật, lên men nhờ vi sinh vật tạo sản phẩm trong công nghệ thực phẩm, ứng dụng

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

MỞ ĐẦU 1

GIỚI THIỆU MÔN HỌC 2

Bài 1 NHÂN SINH KHỐI NẤM MEN SACCHAROMYCES CEREVISIAE 5

1.1 Mục tiêu và yêu cầu 5

1.2 Kiến thức lý thuyết 5

1.3 Nội dung thực hành 6

1.3.1 Chuẩn bị nguyên vật liệu 6

1.3.2 Thực hiện thí nghiệm 6

1.4 Kiểm tra, đánh giá 10

Bài 2 ỨNG DỤNG NẤM MEN ĐỂ LÀM TRƯƠNG NỞ BỘT MÌ 13

2.1 Mục tiêu và yêu cầu 13

2.2 Kiến thức lý thuyết 13

2.3 Nội dung thực hành 14

2.3.1 Chuẩn bị nguyên vật liệu 14

2.3.2 Thực hiện thí nghiệm 14

2.4 Kiểm tra, đánh giá 16

Bài 3 QUÁ TRÌNH LÊN MEN ETHANOL 17

3.1 Mục tiêu và yêu cầu 17

3.2 Kiến thức lý thuyết 17

3.3 Nội dung thực hành 18

3.3.1 Chuẩn bị nguyên vật liệu 18

3.3.2 Thực hiện thí nghiệm 19

3.4 Kiểm tra, đánh giá 25

Bài 4 QUÁ TRÌNH LÊN MEN LACTIC 28

4.1 Mục tiêu và yêu cầu 28

4.2 Kiến thức lý thuyết 28

4.3 Nội dung thực hành 29

4.3.1 Chuẩn bị nguyên vật liệu 29

4.3.2 Thực hiện thí nghiệm 30

4.4 Kiểm tra, đánh giá 35

Bài 5 QUÁ TRÌNH LÊN MEN ACETIC 38

5.1 Mục tiêu và yêu cầu 38

5.2 Kiến thức lý thuyết 38

5.3 Nội dung thực hành 39

5.3.1 Chuẩn bị nguyên vật liệu 39

5.3.2 Thực hiện thí nghiệm 39

5.4 Kiểm tra, đánh giá 40

Bài 6 QUÁ TRÌNH PHÂN GIẢI CELLULOSE NHỜ VI SINH VẬT 42

6.1 Mục tiêu và yêu cầu 42

6.2 Kiến thức lý thuyết 42

6.3 Nội dung thực hành 42

6.3.1 Chuẩn bị nguyên vật liệu 42

6.3.2 Thực hiện thí nghiệm 43

6.4 Kiểm tra, đánh giá 43

Bài 7 XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYME CỦA VI SINH VẬT 45

7.1 Mục tiêu và yêu cầu 45

7.2 Kiến thức lý thuyết 45

7.3 Nội dung thực hành 45

7.3.1 Chuẩn bị nguyên vật liệu 45

7.3.2 Thực hiện thí nghiệm 46

7.4 Kiểm tra, đánh giá 47

8.3.1 Chuẩn bị nguyên vật liệu 48

8.3.2 Thực hiện thí nghiệm 50

8.4 Kiểm tra, đánh giá 51

Bài 9 ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ VI SINH TRONG QUÁ TRÌNH PHÂN HỦY RÁC HỮU CƠ 53

9.1 Mục tiêu và yêu cầu 53

9.2 Kiến thức lý thuyết 53

9.3 Nội dung thực hành 54

9.3.1 Chuẩn bị nguyên vật liệu 54

9.3.2 Thực hiện thí nghiệm 54

9.4 Kiểm tra, đánh giá 54

Bài 10 THUỐC TRỪ SÂU SINH HỌC TỪ VI KHUẨN BACILLUS THURINGIENSIS 56

10.1 Mục tiêu và yêu cầu 56

10.2 Kiến thức lý thuyết 56

10.3 Nội dung thực hành 57

10.3.1 Chuẩn bị nguyên vật liệu 57

10.3.2 Thực hiện thí nghiệm 58

10.4 Kiểm tra, đánh giá 60

TÀI LIỆU THAM KHẢO 62

MỞ ĐẦU

Bài giảng “Thực hành Công nghệ Vi sinh” là tài liệu học tập chính cho sinh viên năm thứ ba ngành Công nghệ sinh học, là tài liệu tham khảo cho sinh viên ngành Thú y và các ngành học liên quan của Trường Đại học Lâm nghiệp

Bài giảng gồm 10 bài thực hành, được viết theo trình tự với các mục: Mục tiêu

và yêu cầu, kiến thức lý thuyết, nội dung thực hành (trình bày chi tiết các bước trong thí nghiệm thực hành), kiểm tra và đánh giá Các bài thực hành nhằm minh họa, chứng minh lý thuyết của các quá trình: Lên men thu nhận sinh khối vi sinh vật, lên men nhờ vi sinh vật tạo sản phẩm trong công nghệ thực phẩm, ứng dụng công nghệ

vi sinh trong giải quyết ô nhiễm môi trường Do vậy, thông qua thực hiện các bài thực hành, người học nắm vững, củng cố nhận thức, hiểu sâu sắc vai trò và tầm quan trọng của vi sinh vật trong các quá trình chuyển hóa vật chất, từ đó biết cách định hướng và ứng dụng vi sinh vật trong quá trình tác nghiệp sau khi ra trường

Trong quá trình biên soạn, mặc dù có nhiều cố gắng, tuy nhiên chắc chắn không tránh khỏi có những thiếu sót Tác giả mong nhận được ý kiến đóng góp của người đọc

Tác giả

GIỚI THIỆU MÔN HỌC

1 Mục tiêu môn học

Sau khi hoàn tất môn học Thực hành Công nghệ vi sinh, sinh viên:

- Biết vận dụng kiến thức, kỹ thuật về vi sinh vật vào các lĩnh vực: công nghiệp

thực phẩm (cải thiện chất lượng, chế biến, bảo quản thực phẩm), nông nghiệp, chăn nuôi, bảo vệ môi trường, bảo vệ thực vật…;

- Biết kết hợp giữa lý thuyết, thực hành, viết báo cáo, nhận xét, cách tra cứu tài

liệu và làm ra được một số sản phẩm lên men từ chủng vi sinh vật thuần khiết hoặc vi sinh vật phân bố trong tự nhiên

2 Yêu cầu của môn học

 Kiến thức căn bản cần biết trước

- Lý thuyết về Vi sinh vật học

- Lý thuyết về Vi sinh vật ứng dụng

- Lý thuyết về Quá trình và thiết bị công nghệ

 Sau khi kết thúc thực hành, sinh viên nắm vững kiến thức lý thuyết và thực hiện thành thạo, đúng kỹ thuật

- Cách làm môi trường, cấy và giữ giống vi sinh vật

- Phân lập và tinh sạch vi sinh vật

- Sàng lọc chủng vi sinh vật có ích (vi khuẩn, nấm men, nấm mốc), có hoạt tính

sinh học để ứng dụng trong công nghiệp

- Phân tích và đánh giá kết quả của các quá trình lên men do vi sinh vật

3 Các bài thực hành

Bài 1 Nhân sinh khối nấm men Saccharomyces cerevisiae

Bài 2 Ứng dụng nấm men để làm trương nở bột mì

Bài 3 Quá trình lên men ethanol

Bài 4 Quá trình lên men lactic

Bài 5 Quá trình lên men acetic

Bài 6 Quá trình phân giải cellulose nhờ vi sinh vật

Bài 7 Xác định hoạt tính enzyme của vi sinh vật

Bài 8 Xác định hoạt tính kháng sinh của vi sinh vật

Bài 9 Ứng dụng công nghệ vi sinh trong quá trình phân hủy rác hữu cơ

Bài 10 Thuốc trừ sâu sinh học từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis

4 Cách thức tổ chức thực hiện

- Trước khi đi thực hành, sinh viên phải đọc, nắm vững kiến thức lý thuyết và

nội dung của bài thực hành

- Sinh viên thực hiện thao tác thực hành dưới sự hướng dẫn trực tiếp của giảng

viên/trợ giảng

- Sinh viên ghi các kết quả thực hành, xử lý số liệu và viết báo cáo kết quả theo

hướng dẫn của giảng viên/trợ giảng

5 Cách thức kiểm tra, đánh giá

- Điểm chuyên cần: 20%

- Kết quả thực hiện và báo cáo kết quả thí nghiệm của từng bài thực hành:

40%

- Bài thi thực hành: 40%

Bài 1

NHÂN SINH KHỐI NẤM MEN SACCHAROMYCES CEREVISIAE

1.1 Mục tiêu và yêu cầu

 Mục tiêu

Sinh viên hiểu rõ nguyên lý của quá trình lên men sản xuất chủng, giống vi sinh vật đảm bảo chất lượng và có thể ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm; làm nguồn dinh dưỡng bổ sung cho con người, vật nuôi, cây trồng…

 Yêu cầu

- Củng cố và khắc sâu các kiến thức:

+ Sinh khối vi sinh vật chứa hàm lượng rất cao protein;

+ Công việc sản xuất sinh khối vi sinh vật có thể thực hiện tốt trong diện tích nhỏ, sản phẩm dễ thu hoạch với hiệu suất thu hồi cao, việc sản xuất không phụ thuộc thời tiết, khí hậu và sử dụng những nguyên liệu rẻ tiền, dễ kiếm

- Thực hành và rèn luyện các kỹ năng:

+ Chuẩn bị môi trường lên men sản xuất sinh khối nấm men;

+ Chuẩn bị giống nấm men, hoạt hóa giống, cấy giống vào môi trường lên men, thực hiện quá trình lên men nhân giống nấm men ở qui mô phòng thí nghiệm; + Thu nhận sinh khối nấm men;

+ Xác định hiệu suất của quá trình lên men

1.2 Kiến thức lý thuyết

Công nghệ sản xuất protein đơn bào (Sing - Cell Protein - SCP) hay công nghệ nhân sinh khối vi sinh vật nhằm tạo chế phẩm có hàm lượng cao protein từ vi sinh vật (tế bào vi sinh vật chứa nhiều protein) Công nghệ sản xuất protein qua nuôi cấy vi sinh vật có nhiều ưu điểm: Có thể được thực hiện chỉ trong diện tích nhỏ; sản phẩm

dễ thu hoạch với hiệu suất thu hồi cao; trong thời gian ngắn có thể tạo lượng lớn sinh khối vi sinh vật chứa nồng độ protein cao; việc nuôi cấy vi sinh vật không phụ thuộc vào khí hậu, thời tiết của từng địa phương do điều kiện của môi trường nuôi cấy có thể điều chỉnh được khá dễ dàng; có thể phân lập và lựa chọn các chủng vi sinh vật thích hợp cho từng quy trình công nghệ, cho từng loại nguyên liệu; nồng độ protein

và thành phần dinh dưỡng chứa trong sinh khối vi sinh vật có thể được điều chỉnh

bằng thay đổi thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy, hoặc bằng thay đổi di truyền của chủng giống vi sinh vật; môi trường lên men sản xuất sinh khối có thể tận dụng nguồn nguyên liệu phi protein, rẻ tiền (phế liệu, phụ phẩm của một số ngành công nghiệp và nông nghiệp như rỉ đường, dịch đường khi thủy phân gỗ tạp, rơm rạ,

bã mía…) góp phần làm giảm giá thành sản phẩm và giải quyết vấn đề ô nhiễm môi trường do chất thải và nước thải

Trong số các vi sinh vật hữu ích cho sản xuất protein đơn bào, nấm men thường được ứng dụng Nấm men thuộc nhóm vi sinh vật có cấu tạo đơn bào, sinh sản theo lối nảy chồi và có khả năng sinh sản nhanh Tế bào nấm men chứa hàm lượng cao chất dinh dưỡng: Hàm lượng protein có thể lên đến 40 - 60%, trong đó có nhiều loại axit amin không thay thế; hàm lượng vitamin khá cao với hoạt tính hơn gấp 2 - 3 lần vitamin tổng hợp Hiện nay, có khá nhiều loài nấm men được sử dụng làm giống

cho sản xuất thu nhận protein như: Endomyces fibuligera, Torulopsis utilis, Candida

tropicalis, Saccharomyces cerevisiae, Hansenula capsulata, Monilia candida, Mycotorula japonica…, trong đó các chủng nấm men thuộc giống Torulopsis, Candida, Saccharomyces được sử dụng phổ biến

1.3 Nội dung thực hành

1.3.1 Chuẩn bị nguyên vật liệu

- Giống vi sinh vật: Các ống giống nấm men Saccharomyces cerevisiae

- Hóa chất: Các hóa chất sử dụng trong nuôi cấy vi sinh vật như: peptone,

glucose, K2HPO4, MgSO4.7H2O, các vitamin như Thiamine HCl…

- Dụng cụ: ống nghiệm, bình tam giác, pipet, que cấy vi sinh vật đầu tròn,

cuvet, lam kính, lamen…

- Thiết bị: box cấy vô trùng, nồi hấp khử trùng, tủ định ôn nuôi cấy vi sinh vật,

máy so màu quang phổ, kính hiển vi quang học, máy li tâm, cân phân tích…

1.3.2 Thực hiện thí nghiệm

1.3.2.1 Pha chế môi trường nhân sinh khối nấm men

- Thực hiện pha chế 1 lít môi trường dinh dưỡng lỏng nhân sinh khối nấm men

Lưu ý: Cân, đong chính xác từng chất rồi hòa tan vào nước cất Sau khi cân

đủ hóa chất thì dẫn nước cất đến đủ định mức và điều chỉnh pH môi trường bằng máy đo pH

- Môi trường sau khi pha chế được phân phối vào các bình tam giác 250 ml (50 ml/bình) và 500 ml (100 ml/bình) Dán nhãn ghi tên môi trường, ngày pha chế môi trường, người pha môi trường lên từng bình môi trường Làm nút bông và nút giấy cho các bình môi trường

- Khử trùng môi trường ở 118ºC trong 30 phút

- Sau khi khử trùng, môi trường được bảo quản và làm nguội trong tủ đựng môi trường ở nhiệt độ phòng

1.3.2.2 Cấy và hoạt hóa giống nấm men

- Dùng que cấy đầu tròn lấy giống nấm men Saccharomyces cerevisiae

trong ống giống

- Cấy giống vào bình môi trường dung tích 250 ml đã chuẩn bị Lắc đều Ghi ký hiệu giống, thời điểm cấy giống và người cấy giống lên thành bình

- Nuôi hoạt hóa nấm men trên máy lắc ở 28ºC, chế độ lắc 200 vòng/phút trong 12h

1.3.2.3 Nhân sinh khối và thu nhận sinh khối nấm men

- Cấy giống nấm men đã hoạt hóa sang bình tam giác dung tích 500 ml chứa môi trường nhân sinh khối nấm men đã chuẩn bị

- Nuôi cấy nấm men trong máy lắc ổn nhiệt ở 28ºC, chế độ lắc 200 vòng/phút

và thu hồi sinh khối nấm men tạo thành ở các thời điểm: Sau 0h, 0,5h, 1h, 3h, 6h, 9h, 12h, 15h, 18h, 24h, 36h, 48h, 60h và 72h lên men

Lưu ý: Ở mỗi thời điểm thu nhận sinh khối nấm men, các bình lên men chứa

sinh khối nấm men được mang vào box cấy vô trùng Dùng pipet vô trùng hút 3 - 5

ml dịch nấm men từ bình lên men sang một ống nghiệm vô trùng để kiểm tra lượng sinh khối nấm men tạo thành Tiếp theo đậy nắp bình nhân giống nấm men và tiếp tục nuôi cấy trong tủ định ôn cho thu hồi sinh khối ở các thời điểm tiếp theo

1.3.2.4 Xác định các đặc trưng của quá trình lên men

a Xác định lượng sinh khối nấm men tạo thành

Xác định lượng sinh khối tạo thành để vẽ đường cong sinh trưởng của nấm men bằng một trong hai phương pháp sau:

Phương pháp đo độ đục nhờ tán xạ ánh sáng

- Nguyên tắc: Mức độ tán xạ ánh sáng tỷ lệ thuận với nồng độ tế bào Có thể đo

độ tán xạ ánh sáng bằng máy so màu quang phổ (spectrophotometer) Nồng độ nấm men càng tăng thì độ đục của canh trường nuôi cấy cũng tăng theo và làm cản trở ánh sáng đi qua dịch nuôi

- Các bước thực hiện:

+ Hút 1 ml dịch lên men chứa sinh khối nấm men, cho vào cuvet, đặt vào vị trí của mẫu cần đo độ đục của máy so màu quang phổ (mặt trong của cuvet phải đặt vào

vị trí ánh sáng tán xạ chiếu qua);

Phương pháp xác định trọng lượng khô của tế bào

- Nguyên tắc: Sấy khô tế bào nấm men, sau đó xác định khối lượng khô của sinh khối nấm men thu nhận ở các thời điểm khác nhau bằng cân trên cân phân tích

- Các bước thực hiện:

+ Sấy khô và cân xác định trọng lượng của ống li tâm trên cân phân tích;

+ Hút dịch nấm men vào ống li tâm, tiến hành li tâm thu nhận sinh khối tế bào nấm men ở 6.000 vòng/phút trong 15 phút;

+ Loại bỏ dịch nổi, thu nhận sinh khối nấm men ở dưới đáy ống li tâm;

+ Rửa tế bào nấm men với nước cất vô trùng;

+ Ly tâm lần 2, thu hồi sinh khối ở đáy ống li tâm;

+ Sấy khô sinh khối nấm men trong tủ sấy ở 50ºC;

+ Cân xác định trọng lượng khô của sinh khối nấm men được tạo thành (trọng lượng khô của sinh khối nấm men bằng trọng lượng của ống li tâm chứa sinh khối khô của nấm men trừ trọng lượng của ống li tâm khi không chứa tế bào nấm men)

b Kiểm tra chất lượng nấm men bằng phương pháp quan sát dưới kính hiển vi quang học

Làm tiêu bản nhuộm đơn nấm men cấy trong môi trường dịch thể với Xanh methylen Loeffler Quan sát trên kính hiển vi ở vật kính x40 và x100

Cách thực hiện:

+ Nhỏ 1 giọt thuốc nhuộm xanh methylen Loeffler lên phiến kính;

+ Nhỏ 1 giọt canh trường nấm men lên thuốc nhuộm;

+ Đặt lá kính lên giọt dịch thật nhẹ nhàng tránh không tạo thành bọt khí (để một mép lá kính tiếp xúc với phiến kính rồi từ từ hạ lá kính xuống) Nếu giọt dịch nhiều quá tràn ra ngoài phần tiếp xúc của lá kính và phiến kính thì dùng giấy thấm bớt nước đi; + Đưa tiêu bản lên quan sát dưới kính hiển vi

- Chỉ tiêu quan sát, thống kê: Thống kê các chỉ số: tỷ lệ tế bào nấm men sống; tỷ

lệ tế bào nấm men nảy chồi; tỷ lệ tế bào nấm men chết Các tỷ lệ này được xác định theo công thức:

Lưu ý: Tế bào nấm men chết là tế bào bắt màu xanh của thuốc nhuộm; tế bào

sống không cho thuốc nhuộm thấm qua thành và màng tế bào nên không bắt màu

xanh của thuốc nhuộm; tế bào nảy chồi là các tế bào đang phát triển và có nhiều chồi

- Báo cáo kết quả thí nghiệm (thực hiện tại lớp, 1 bài báo cáo/1 nhóm) tuần tự theo các nội dung như sau:

(i) Xác định lượng sinh khối nấm men tạo thành ở các thời điểm khác nhau sau lên men và thống kê kết quả vào bảng:

Thu nhận sinh khối nấm men ở

các thời gian sau lên men (h) tạo thành (ODLượng sinh khối nấm men 600nm hoặc g/L)

0 0,5

(iii) Đánh giá chất lượng nấm men bằng phương pháp làm tiêu bản và quan sát dưới kính hiển vi khi giống đang ở pha phát triển, thống kê kết quả vào bảng:

Tiêu

bản

Tổng

số TB quan sát

Số TB sống Tỷ lệ TB sống (%)

Số TB nảy chồi

Tỷ lệ TB nảy chồi (%)

Số TB chết

Tỷ lệ

TB chết (%)

1

2

3

Lưu ý: Giống nấm men đạt yêu cầu để sử dụng làm giống trong các quá trình

lên men phải có chất lượng: tỷ lệ tế bào nảy chồi > 10%; tỷ lệ tế bào chết ≤ 4%

- Trả lời các câu hỏi sau:

+ Trong điều kiện nhân sinh khối nấm men đã thực hiện, thu nhận sinh khối nấm men ở thời điểm nào cho phép thu nhận được nhiều sinh khối nấm men nhất? Giải thích?

+ Thời điểm thích hợp nhất cho thu nhận nấm men để làm giống trong các quá trình lên men (lên men ethanol, làm trương nở bột mì…) sử dụng nấm men làm vật liệu vi sinh vật? Giải thích?

Bài 2 ỨNG DỤNG NẤM MEN ĐỂ LÀM TRƯƠNG NỞ BỘT MÌ

2.1 Mục tiêu và yêu cầu

+ Bố trí nguồn nguyên liệu bột mì;

+ Phối trộn bột mì, một số chất phụ gia, nấm men;

+ Tạo điều kiện thích hợp để nấm men hoạt động làm trương nở bột mì hiệu quả nhất

2.2 Kiến thức lý thuyết

Hiện nay, giống để sản xuất trong công nghệ làm bánh thường sử dụng các

chủng Saccharomyces cerevisiae Trong khối bột mì, nấm men Saccharomyces

cerevisiae trước hết sử dụng nguồn carbon là glucose, tiếp theo sử dụng các đường

khác như maltose, sucrose và fructose có sẵn trong bột để lên men Để hoạt động của nấm men tốt hơn, loại enzyme phân giải tinh bột thành đường làm nguồn cơ chất cho lên men như α-amylase bền nhiệt thường được bổ sung vào vật liệu lên men Quá trình lên men làm trương nở bột mì dưới hoạt động của nấm men sẽ sản sinh CO2 tạo các lỗ hổng trong bột Bên cạnh đó, quá trình lên men diễn ra sẽ tạo khoảng 0,5% - 1,4% ethanol trong khối bột mì

Phương trình tổng quát của quá trình lên men:

C6H12O6 → 2CH3CH2OH + 2CO2 + 2ATP

Các chủng nấm men sử dụng cho sản xuất bánh mì phải là các chủng bền nhiệt,

có khả năng sinh sản nhanh và có hoạt tính enzyme α-amylase bền nhiệt Hoạt lực làm trương nở bột mì của nấm men là chỉ số chất lượng quan trọng của nấm men ứng dụng trong công nghệ làm bánh mì Bên cạnh đó, thời gian nấm men làm cho khối

bột trương nở càng ngắn thì chất lượng nấm men càng tốt (nấm men chất lượng tốt thường làm nở bột sau 60 - 65 phút)

Hình 2.1 Kết quả làm trương nở khối bột mì nhờ hoạt động của nấm men 2.3 Nội dung thực hành

2.3.1 Chuẩn bị nguyên vật liệu

- Giống vi sinh vật: Sinh khối nấm men Saccharomyces cerevisiae đã thu nhận sau khi thực hành bài 1 (Nhân sinh khối nấm men Saccharomyces cerevisiae) được

thu hồi bằng phương pháp li tâm và sấy khô ở nhiệt độ 40ºC

- Dụng cụ: cốc thủy tinh, thước kẻ chia vạch

- Thiết bị: tủ ấm, cân phân tích, cân kỹ thuật

2.3.2 Thực hiện thí nghiệm

2.3.2.1 Kiểm tra sức sống của nấm men

- Cân 10 g bột mì bằng cân phân tích vào cốc thủy tinh

kính 1 cm, sau đó thả đồng loạt các viên vào cốc nước đã được làm ấm đến 35ºC

- Quan sát sẽ thấy ban đầu các viên nấm men trộn bột mì (viên bột men) nặng hơn nước lên nhanh chóng lắng xuống đáy cốc Sau một khoảng thời gian, viên bột men sẽ di chuyển từ đáy cốc lên bề mặt nước Xác định khoảng thời gian cần thiết để các viên bột men nổi lên trên bề mặt cốc nước ấm

Lưu ý: Trong các viên nấm men trộn bột mì, dưới hoạt động lên men của nấm

men, các bọt khí CO2 tạo thành và thoát khỏi viên bột men đi lên mặt nước, qua đó tạo lực đẩy các viên bột men nổi lên bề mặt nước Thời gian cần thiết để các viên bột men nổi lên càng ngắn thì nấm men càng có sức sống tốt và có khả năng làm trương

nở bột mì mạnh và ngược lại Mặt khác, nấm men không hoạt động sẽ không tạo ra bọt khí CO2 trong khối bột men và không tạo lực đẩy khối bột men nổi lên mà vẫn nằm dưới đáy cốc và dần tan ra hòa vào cốc nước

2.3.2.2 Hoạt hóa giống nấm men

- Cân 10 g nấm men khô, cho vào cốc chứa sẵn 100 ml nước, đặt vào tủ định ôn

ở 35ºC trong 30 phút

- Thêm vào cốc 50 g bột mì, trộn đều, tiếp tục đặt vào tủ 35ºC trong 30 phút

2.3.2.3 Sử dụng nấm men để làm trương nở bột mì

- Cân 850 g bột mì, 15 g NaCl cho vào cốc thủy tinh dung tích lớn

- Bổ sung dịch nấm men đã hoạt hóa vào cốc bột mì, thêm 450 ml nước đã được làm ấm đến 35ºC

- Nhào trộn đều khối nấm men + bột mì + NaCl + nước bằng tay cho đến khi bột được hòa tan thật đều với nước và men sữa (bột không còn dính vào tay là được)

- Nặn bột thành hình 1 chiếc bánh lớn và cho vào khuôn đã đặt sẵn thước có thang chia vạch Xác định chiều cao của khối bột lúc ban đầu và tính thể tích của khối bột khi chưa ủ

- Đặt khuôn chứa bột nhào trộn nấm men vào tủ ấm ở 35ºC trong 1h

- Sau thời gian ủ, lấy khối bột ra khỏi tủ ấm, đo chiều cao của khối bột men sau

ủ và xác định thể tích của khối bột men sau lên men

- Tính mức độ làm trương nở 1 kg bột mì của nấm men thông qua độ chênh lệch

về thể tích của khối bột sau và trước khi lên men (mức độ làm trương nở = thể tích khối bột sau lên men - thể tích khối bột trước lên men)

- Song song làm công thức đối chứng với đầy đủ các bước như công thức thí nghiệm nhưng không bổ sung sinh khối nấm men khô vào nguyên liệu bột mì

- Kiểm tra chất lượng bánh sau khi nướng (trong quá trình nướng, khi nhiệt độ trong lò nướng đạt 50 - 60ºC thì nấm men bị giết chết), hoặc sau khi hấp cách thủy bằng cảm quan

2.4 Kiểm tra, đánh giá

- Mỗi nhóm sinh sinh viên (3 - 5 sinh viên/nhóm) phải tiến hành nhào trộn, ủ và

sử dụng nấm men để làm trương nở được 1 kg bột mì

- Viết bài báo cáo kết quả thí nghiệm (thực hiện tại lớp) tuần tự theo các nội dung: (i) Xác định năng lực làm trương nở 1 kg bột mì của nấm men sau 1h ủ ở 35ºC,

số liệu thống kê ở Bảng sau:

(sử dụng nấm men)

(ii) Kết quả đánh giá bằng cảm quan chất lượng khối bột mì (sau khi nướng) đã được làm trương nở nhờ hoạt động của nấm men: độ xốp nở, màu sắc, mùi, vị

Bài 3 QUÁ TRÌNH LÊN MEN ETHANOL 3.1 Mục tiêu và yêu cầu

- Thực hành và rèn luyện kỹ năng: chuẩn bị nguyên liệu, các điều kiện cho lên men ethanol; sử dụng chủng nấm men thuần chủng để lên men, theo dõi quá trình lên men và xác định các đặc trưng của quá trình

tỷ lệ 90 - 95% so với lý thuyết, do một phần chất dinh dưỡng đã được sử dụng để tổng hợp sinh khối tế bào nấm men và cho các phản ứng liên quan tới sự duy trì tế bào Bên cạnh đó, các phản ứng phụ xảy ra (thường dẫn tới tạo thành glycerol và succinate) cũng tiêu thụ tới 4 - 5% cơ chất tổng số trong môi trường dinh dưỡng Mặc dù lên men rượu là một quá trình yếm khí nhưng nhất thiết trong giai đoạn đầu phải được cung cấp một nồng độ nhỏ ôxi cho sự tổng hợp các chất béo chưa bão

hoà Thông thường oxi được giữ trong dịch lên men ở nồng độ 0,05 - 0,1 mmHg tính theo áp suất oxi Bất cứ nồng độ nào nằm trên giới hạn đó cũng sẽ kích thích sinh trưởng, vi phạm đến sự tạo thành ethanol

Các chủng nấm men sử dụng cho lên men ethanol qui mô công nghiệp phải có khả năng lên men tạo hiệu suất ethanol cao, chịu cồn, chịu nhiệt và chịu axit Các loài nấm men thường được ứng dụng trong công nghiệp sản xuất ethanol gồm:

Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces uvarum (carbergensis),

Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces

3.3 Nội dung thực hành

3.3.1 Chuẩn bị nguyên vật liệu

- Giống vi sinh vật: Dịch nấm men Saccharomyces cerevisiae đang sinh trưởng

ở pha logarit trong môi trường lỏng thu nhận sau khi thực hành bài 1 (Nhân sinh khối

nấm men Saccharomyces cerevisiae)

- Nguyên liệu, hóa chất:

+ Đường glucose, quả cam tươi, (NH4)2SO4, axit xitric, dung dịch NaOH 10%, dug dịch Ca(OH)2 10%;

+ Thuốc nhuộm Xanh methylene Loeffer

Thuốc thử Fehling A: CuSO4 tinh thể 40 g

Hòa tan hoàn toàn CuSO4 vào nước

Thuốc thử Fehling B: Kali natri tartrat 200 g

3.3.2.1 Kiểm tra chất lượng giống nấm men

Men giống Saccharomyces cerevisiae đang sinh trưởng ở pha logarit (nuôi cấy

trong môi trường dinh dưỡng lỏng ở 28ºC trong 14 - 16h) được kiểm tra chất lượng bằng phương pháp làm tiêu bản nhuộm đơn tế bào với thuốc nhuộm Xanh methylene Loeffer

Tiến hành:

- Nhỏ 1 giọt thuốc nhuộm xanh methylen Loeffler lên phiến kính;

- Nhỏ 1 giọt canh trường nấm men lên thuốc nhuộm;

- Đặt lá kính lên giọt dịch;

- Đưa tiêu bản lên quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính x40

Lưu ý: Men giống đủ tiêu chuẩn sử dụng cho lên men ethanol có đặc điểm:

Không bị nhiễm vi sinh vật lạ, tỷ lệ tế bào nảy chồi > 10%, tỷ lệ tế bào chết ≤ 4%

3.3.2.2 Pha chế môi trường lên men

Thành phần dinh dưỡng của môi trường lên men gồm các chất dinh dưỡng từ đường glucose, nước cam, đạm sunphat và axit xitric

Pha chế 2 công thức môi trường dinh dưỡng cho lên men ethanol, mỗi công thức pha 1 lít với thành phần dinh dưỡng gồm:

Công thức 1: Glucose 20% (w/v) + (NH4)2SO4 0,02% (w/v) + axit xitric 0,2% (w/v)

Công thức 2: Glucose 20% (w/v) + (NH4)2SO4 0,02% (w/v) + axit xitric 0,2% (w/v) + nước cam 50% (v/v)

(Dịch nước cam được chuẩn bị như sau: Rửa sạch quả cam tươi dưới vòi nước,

để khô tự nhiên, vắt lấy nước, loại bỏ hạt và lọc qua giấy lọc)

Lưu ý: Điều chỉnh pH môi trường đến pH 3 - 3,5 Dán nhãn ghi tên công thức

thí nghiệm, ngày pha chế môi trường dinh dưỡng, nhóm sinh viên thực hiện; môi trường lên men sau khi pha chế được khử trùng theo phương pháp Pasteur (đun nóng môi trường lên 80ºC trong 15 - 30 phút)

3.3.2.3 Cấy giống nấm men và lên men ethanol

Thao tác cấy giống nấm men được thực hiện trong box cấy vô trùng

- Rót 475 ml môi trường dinh dưỡng tương ứng với 2 công thức môi trường lên men đã chuẩn bị ở mục 3.3.2.2 vào 2 bình lên men dung tích 500 ml (mỗi môi trường dinh dưỡng được rót vào 1 bình) Dán nhãn ghi ký hiệu môi trường lên thành bình

- Tiếp 25 ml men giống Saccharomyces cerevisiae vào 2 công thức môi trường

với tỷ lệ 5% (v/v)

- Song song bố trí 2 công thức đối chứng tương ứng với 2 loại môi trường dinh dưỡng (công thức đối chứng không tiếp giống nấm men và thay thế dịch men giống bằng nước cất vô trùng với tỷ lệ 5%)

- Cân xác định trọng lượng bình lên men

- Đậy kín nắp bình lên men sao cho khí CO2 tạo thành (sản phẩm của quá trình lên men không bị bay ra ngoài

- Đặt các bình lên men trong tủ điều nhiệt ở 28 - 30ºC trong 14 ngày

- Quan sát động thái của quá trình lên men sau 48 giờ/1 lần cho đến khi quá trình lên men kết thúc (bọt khí không còn đi từ đáy bình lên, CO2 không tiếp tục tạo

3.3.2.4 Xác định các đặc trưng của quá trình lên men ethanol

a Đánh giá theo cảm quan

Kết quả của quá trình lên men được đánh giá theo cảm quan bằng phương pháp ngửi, nếm

b Phân tích ethanol bằng phương pháp định tính

Định tính sự có mặt của ethanol trong bình lên theo 2 thí nghiệm:

Thí nghiệm 1: Dựa vào phản ứng tạo thành indoform của ethanol

Cho vào ống nghiệm: 5 ml dịch lên men, 5 ml NaOH 10%, 0,1 g Iốt tinh thể dạng bột Đun nóng ống nghiệm hay ngâm ống nghiệm trong nồi cách thủy ở 60ºC

cho đến khi Iốt tan hết và mất màu Để nguội sẽ thấy xuất hiện tinh thể indoform màu

vàng (CHI3) Phương trình phản ứng:

CH3CH2OH + I2 → CH3CHO + 2H

CH3CHO + 3I → CI3CHO + 3HI

CI3CHO + NaOH → CHI3 + HCOONa

Thí nghiệm 2: Cho CO2 đi qua dung dịch Ba(OH)2 hoặc nước vôi trong sẽ làm

cho dung dịch này bị đục

Cho vào ống nghiệm: 5 ml dịch lên men; 1 ml Ba(OH)2 10% Dùng kẹp gỗ kẹp ống nghiệm và đun nhẹ trên ngọn đèn cồn Để lắng thấy có kết tủa trắng do BaCO3

được tạo thành theo phản ứng:

CO2 + Ba(OH)2 → BaCO3 + H2O

c Phân tích ethanol bằng phương pháp định lượng

Xác định lượng ethanol tạo thành trong dịch lên men bằng thực hiện các thí nghiệm:

Thí nghiệm 1: Đo độ cồn trong dịch lên men bằng cồn kế

Cồn kế (hay rượu kế) là dụng cụ dùng để đo độ cồn trong nước Cồn kế thường được cấu tạo bởi một ống thủy tinh có bầu chân không với mục đích giữ cho cồn kế nổi trong nước Phía trên của bầu là vạch chia độ và phía dưới đáy của bầu là các hạt chì để giữ cho bầu có độ chìm

Dựa trên nguyên lý tỷ trọng của nước càng thấp thì độ cồn trong nước càng cao

Độ chìm của cồn kế trong dung dịch sẽ cho biết độ cồn của dung dịch

Cách thực hiện: Lấy cồn kế thả vào dịch lên men ethanol Căn cứ vào độ chìm/nổi của cồn kế, đọc chỉ số trên vạch tương ứng với độ cồn trong dịch lên men

Thí nghiệm 2: Tính lượng rượu tạo thành, lượng đường lên men và cường độ

lên men từ lượng CO2 tạo thành (tính theo lý thuyết)

Để tính lượng CO2, cân khối lượng bình lên men trước và sau khi lên men (đã

mở nắp bình cho CO2 bay đi) Hiệu số của 2 khối lượng, tức là lượng CO2 đã tạo thành

Ví dụ: Gọi lượng CO2 bay ra trong quá trình lên men là X gam Vậy:

- Lượng rượu được tạo thành là:

Theo phương trình tổng quát của lên men ethanol thì 88 g CO2 tương ứng với

92 g rượu Vậy X(g) CO2 tương ứng với Y(g) rượu Khi đó:

- Lượng đường lên men là:

180 g C6H12O6 cho 88 g CO2

Z (g) C6H12O6 cho X (g) CO2

- Xác định cường độ lên men: Cường độ lên men có đơn vị là %; được tính theo lượng đường lên men đã xác định được từ lượng CO2 tạo thành

Ví dụ: Nếu trong 100 ml môi trường có chứa 15 g đường, mà trong 15 g ấy có

12 g sử dụng cho lên men Gọi cường độ lên men là A% Khi đó: A (%) = 12 x 180/15 = 82% Vậy cường độ lên men ethanol là 82%

sung vào môi trường lên men và hàm lượng đường khử còn lại (đường sót) sau quá trình lên men Hàm lượng đường khử có trong dịch lên men trước và sau lên men được xác định bằng phương pháp vi lượng của Rodzevich Từ hàm lượng đường khử trước và sau quá trình lên men có thể tính được cường độ của quá trình lên men Nguyên tắc của phương pháp xác định hàm lượng đường khử theo Rodzevich: Phương pháp dựa trên cơ sở trong môi trường kiềm các đường khử (glucose, fructose, mantose) có thể khử dễ dàng đồng (II) oxit thành đồng (I) oxit (Cu2+ →

Cu1+) dưới dạng kết tủa màu đỏ và qua lượng CuSO4 dư (không tham gia phản ứng) tính được lượng đường khử Cơ chế của quá trình xảy ra với các giai đoạn sau:

Khi trộn hai dung dịch Fehling A và Fehling B với nhau thì xảy ra phản ứng giữa chúng theo hai giai đoạn:

Đầu tiên tạo thành kết tủa đồng hidroxit màu xanh da trời:

CuSO4 + 2NaOH = Cu(OH) 2 + Na2SO4

Sau đó Cu(OH)2 tác dụng với muối Kali natri tartrat tạo thành muối hòa tan có dung dịch màu xanh thẫm Phương trình phản ứng:

Muối trên là một hợp chất không bền, vì thế các đường khử có nhóm andehit hoặc xeton dễ dàng khử đồng (II) oxit tạo thành kết tủa đồng (I) oxit có màu đỏ, bản thân đường bị oxi hóa khi tác dụng với dung dịch Fehling

Lượng CuSO4 dư (không tham gia phản ứng) cho tác dụng với KI trong môi trường H2SO4 sẽ giải phóng ra Iot tự do

CuSO4 + 4KI +H2SO4 → I2 + CuI2 + 2K2SO4

Chuẩn độ lượng Iôt tạo thành bằng natri thiosunfat (Na2S2O3) chuẩn, qua đó tính được lượng đường khử có trong dung dịch

I2 + 2Na2S2O3 = Na2S4O6 + 2NaI Tiến hành:

Bước 1: Cho vào bình nón dung tích 50:1 ml dung dịch đã lên men, 2 ml nước

cất, 1 ml dung dịch Fehling A và 1 ml dung dịch Fehling B

Bước 2: Đun sôi hai phút (kể từ lúc xuất hiên bọt sôi đầu tiên) Sau khi đun sôi,

dung dịch phản ứng phải còn màu xanh đặc trưng và ở dưới có một kết tủa đồng (I) oxit màu đỏ gạch Trong trường hợp dịch phản ứng mất màu hoàn toàn chứng tỏ lượng dung dịch Fehling cho vào không đủ để oxi hóa hoàn toàn lượng đường có trong dung dịch mẫu thí nghiệm, khi đó phải pha loãng dịch lên men (pha loãng dịch đường) và làm lại thí nghiệm Trường hợp dịch phản ứng chỉ có màu xanh của Cu2+

và không có kết tủa màu đỏ gạch của đồng (I) oxit thì phải tăng lượng dung dịch lên men (tăng lượng đường trong dịch phản ứng), giảm nước cất để luôn đảm bảo thể tích là 5 ml

Bước 3: Làm nguội, cho thêm vào hỗn hợp 1 ml H2SO4 25% và 1 ml KI 30%, lắc đều và giữ trong 20 phút

Bước 4: Chuẩn độ I2 tạo thành bằng Na2S2O3 0,1N Song song làm thí nghiệm đối chứng bằng cách thay dung dịch đường bằng nước cất

Hàm lượng đường khử được tính theo công thức sau:

X = (a - b) x f x 3,3 Trong đó:

- X: Hàm lượng đường khử (mg);

- a: Số ml Na2S2O3 0,1N dùng để chuẩn độ mẫu đối chứng (nước cất);

d Đánh giá chất lượng nấm men sau lên men

Làm tiêu bản quan sát chất lượng nấm men dưới kính hiển vi: Nhuộm nấm men với thuốc nhuộm xanh metylen Loeffer Quan sát nấm men dưới kính hiển vi ở vật kính x40 theo các tiêu chí sau:

+ Hình thái tế bào;

+ Số lượng tế bào sống, chết;

+ Hình thức sinh sản của nấm men;

+ Khả năng di động

3.4 Kiểm tra, đánh giá

- Mỗi nhóm sinh viên (3 - 5 sinh viên/nhóm) phải chuẩn bị đạt yêu cầu 2 công thức môi trường lên men, tiến hành lên men tạo ethanol thành công Ngoài

ra, sinh viên còn phải viết báo cáo mô tả động thái của quá trình lên men quan sát được và các kết quả nhận được sau khi kiểm tra chất lượng của quá trình lên men

- Viết bài thu hoạch (làm tại lớp, 1 nhóm/1 bài) trình bày kết quả của các thí nghiệm:

(i) Đánh giá quá trình lên men ethanol theo cảm quan: Kết quả thống kê vào bảng sau:

Giải thích

Màu sắc

Mùi

Sự chuyển động của dịch lên men (CO2)

Lượng sinh khối nấm men

Mùi đường

Mùi ethanol

1

2

(ii) Chưng cất thu hồi ethanol

Thể tích ethanol thu được: ml

(iii) Định tính sự có mặt của ethanol trong dịch lên men: Kết quả thống kê vào Bảng sau:

Ống nghiệm Thành phần

phản ứng

Kết quả phản ứng

Kết luận về sự

có mặt của ethanol trong dịch lên men

Giải thích kết quả

(iv) Xác định hiệu suất của quá trình lên men theo lý thuyết và theo thực tế: Kết quả xử lý và thống kê vào bảng:

CO2

tạo thành (g)

Lượngethanoltạo thành (g)

Hiệu suất lên men theo

Sau lên men

Lượng đường lên men (%)

Cường

độ lên men (%)

Lượng đường lên men (%)

Cường

độ lên men (%)

- Hoàn thành các câu hỏi sau:

+ So sánh và kết luận về công thức môi trường dinh dưỡng cho hiệu suất lên men cao trong 2 công thức môi trường lên men đã chuẩn bị?

+ Tại sao để quá trình lên men diễn ra hiệu quả, môi trường dinh dưỡng cho lên men phải chứa hàm lượng đường cao?

+ Tại sao trong giai đoạn đầu của quá trình lên men cần cung cấp một lượng nhỏ oxi trong bình lên men, và trong giai đoạn sau của quá trình lên men cần tạo điều kiện yếm khí?