Thực hành hóa sinh trao đổi chất

Yêu cầu Sau khi thực hiện bài thực hành này, sinh viên nắm rõ nguyên tắc và sử dụng thành thạo các loại máy móc, thiết bị cần thiết dùng trong thí nghiệm hóa sinh: cân điện tử, cân phân

Trang 1

TS NGUYỄN NHƯ NGỌC

ThùC HµNH HãA SINH TRAO §æi chÊt

Trang 2

TS NGUYỄN NHƯ NGỌC

THỰC HÀNH

HÓA SINH TRAO ĐỔI CHẤT

TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP - 2020

Trang 4

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

BẢNG CÁC KÝ HIỆU CẢNH BÁO HÓA CHẤT iv

LỜI NÓI ĐẦU 1

NỘI QUY PHÒNG THÍ NGHIỆM 2

GIỚI THIỆU MÔN HỌC 4

Bài 1 NGUYÊN TẮC SỬ DỤNG THIẾT BỊ - CÁCH PHA CHẾ DUNG DỊCH CÓ NỒNG ĐỘ XÁC ĐỊNH VÀ DUNG DỊCH ĐỆM 9

1.1 Mục tiêu 9

1.2 Yêu cầu 9

1.3 Nội dung thực hành 9

1.3.1 Nguyên tắc, cách sử dụng thiết bị trong phòng thí nghiệm hóa sinh 9

1.3.2 Cách pha chế dung dịch có nồng độ xác định và dung dịch đệm 12

1.4 Kết quả thực hành 20

1.5 Đánh giá kết quả, chấm điểm 20

1.5.1 Đánh giá sinh viên trực tiếp 20

1.5.2 Đánh giá báo cáo thực hành 20

Bài 2 CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN VÀ AXÍT AMIN 22

2.1 Mục tiêu 22

2.2 Yêu cầu 22

2.3 Nội dung 22

2.3.1 Tóm tắt lý thuyết 22

2.3.2 Nội dung thực hành 25

Bài 3 PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN MỘT SỐ SẢN PHẨM TRAO ĐỔI AXÍT AMIN, PROTEIN 36

3.1 Mục đích 36

3.2 Yêu cầu 36

3.3 Nội Dung thực hành 36

3.3.1 Phản ứng phát hiện urê 36

Trang 5

3.3.2 Phát hiện axít amin, protein trong mồ hôi và nước tiểu 37

3.3.3 Phản ứng phát hiện creatin, creatinin 39

3.5 Đánh giá kết quả, chấm điểm: 40

3.5.1 Đánh giá trực tiếp sinh viên 40

Bài 4 TÍNH CHẤT CỦA AXÍT NUCLEIC 42

4.1 Mục đích 42

4.2 Yêu cầu 42

4.3 Nội dung 42

Bài 5 ENZYM 47

5.1 Mục đích 47

5.2 Yêu cầu 47

5.3 Nội dung 47

Bài 6 XACARIT 55

6.1 Mục đích 55

6.2 Yêu cầu 55

6.3 Nội dung 55

Trang 6

Bài 7 LIPIT 61

7.1 Mục đích 61

7.2 Yêu cầu 61

7.3 Nội dung 61

Bài 8 VITAMIN 68

8.1 Mục đích 68

8.2 Yêu cầu 68

8.3 Nội dung 68

TÀI LIỆU THAM KHẢO 72

PHỤ LỤC……… 73

Trang 7

BẢNG CÁC KÝ HIỆU CẢNH BÁO HÓA CHẤT

Trang 8

LỜI NÓI ĐẦU

Hóa sinh trao đổi chất là môn học cơ sở quan trọng trong quá trình đào tạo kỹ sư ngành công nghệ sinh học và một số ngành có liên quan (Lâm sinh, Thú y ) Môn học này cung cấp những kiến thức về lý thuyết và thực tế của các cơ sở phân tử sự sống: Thành phần cấu tạo hóa học, quá trình chuyển hóa các chất trong tế bào cơ thể sống và trong tự nhiên, là tiền đề để tiếp thu kiến thức của các môn chuyên ngành Công nghệ sinh học và Lâm sinh

Thực hành là một phần quan trọng không thể thiếu đối với các môn học thuộc khối ngành kỹ thuật, đặc biệt là với các ngành nghiên cứu thực nghiệm như Công nghệ sinh học Phần thực hành sẽ giúp người học củng cố sâu hơn về kiến thức lý thuyết đã được học Thực hành vừa là cầu nối, vừa là sự kiểm nghiệm và so sánh giữa lý thuyết

và các ứng dụng trong thực tế Ngoài ra, việc rèn lyện kỹ năng thực hành trong các môn học nói chung và môn học hóa sinh trao đổi chất nói riêng còn giúp sinh viên rèn luyện thành thạo các kỹ năng về bố trí, sắp xếp và tiến hành thí nghiệm, nâng cao trình

độ và giúp người học tự tin trong nghiên cứu để tiếp cận với công việc chuyên ngành trong tương lai

Mặt khác, ngành Công nghệ sinh học của Trường Đại học Lâm nghiệp là ngành mới, do đó kho giáo trình và bài giảng phù hợp để phục vụ cho sinh viên của trường còn chưa nhiều Để đáp ứng với chủ trương Nhà trường đề ra: Các ngành học lấy kỹ năng thực hành làm mục tiêu chính để dạy cho sinh viên nhằm trang bị cho sinh viên

có tay nghề vững vàng khi ra trường, thì việc biên soạn tài liệu hướng dẫn thực hành cho mỗi môn học là hết sức cần thiết

Do đó, tác giả đã biên soạn bài giảng “Thực hành hóa sinh trao đổi chất”

Trong quá trình biên soạn không tránh khỏi thiếu sót, rất mong mọi ý kiến đóng góp để giúp tài liệu ngày càng hoàn thiện hơn

Trang 10

NỘI QUY PHÕNG THÍ NGHIỆM

Mọi người đến làm việc tại phòng thí nghiệm hóa sinh trao đổi chất phải chấp hành nghiêm túc các nội quy sau:

1 Làm việc dưới sự hướng dẫn của người có trách nhiệm;

2 Sinh viên phải có mặt ở phòng thí nghiệm đúng giờ quy định Sinh viên đến trễ quá 10 phút nếu không có lý do chính đáng sẽ không được vào làm thí nghiệm;

3 Sinh viên phải xem trước nội dung lý thuyết của bài thực hành trước khi vào thí nghiệm;

4 Khi bố trí sắp xếp thí nghiệm phải tuân theo sự bố trí của người hướng dẫn;

5 Khi làm việc phải mặc áo bảo hộ lao động (áo blu trắng), kính đeo mắt (nếu cần thiết);

6 Phải tuân thủ các thao tác về an toàn lao động và phòng chống cháy nổ khi sử dụng các thiết bị;

7 Các hóa chất, chất thải độc hại hoặc có mùi - sử dụng theo hướng dẫn và để đúng nơi quy định;

8 Không mang các dụng cụ, mẫu vật, hóa chất, thiết bị, tài liệu… ra khỏi nơi quy định khi chưa có sự đồng ý của người có trách nhiệm;

9 Khi có sự đổ, vỡ, cháy nổ phải lập tức báo cáo cho người có trách nhiệm để giải quyết khắc phục;

10 Khi kết thúc thí nghiệm, sinh viên phải báo cáo kết quả với giáo viên hướng dẫn và dọn dẹp đồ đạc, dụng cụ đã sử dụng của nhóm mình trước khi ra về;

11 Mỗi nhóm thực hành phải chịu trách nhiệm về: Trật tự, an toàn thí nghiệm, dụng cụ, hóa chất và kết quả thí nghiệm cho bài thực hành của mình;

12 Mỗi sinh viên phải làm một bản báo cáo thực hành về các nội dung đã được tiến hành thí nghiệm và nộp về bộ môn sau khi kết thúc thí nghiệm trong vòng 1 tuần

Trang 12

GIỚI THIỆU MÔN HỌC

1 Các thông tin chung

Tên: Thực hành Hóa sinh trao đổi chất

Thời lượng: 15 Tiết (30 tiết thực tế)

Địa điểm: Phòng 216 - Nhà A3

Giáo viên hướng dẫn: TS Nguyễn Như Ngọc

- Sử dụng thành thạo một số máy móc, thiết bị liên quan trong phòng thí nghiệm;

- Có thái độ chủ động, nghiêm túc, khoa học và tự tin khi làm việc trong phòng thí nghiệm;

- Tăng cường kỹ năng nghiên cứu thực nghiệm và ứng dụng của sinh viên chuyên ngành Công nghệ sinh học

Thành thạo, độc lập và khoa học trong cách bố trí, tiến hành, thu thập kết quả và

Trang 13

5 Nội dung thực hành: 15 tiết (30 tiết thực tế)

Bài 1 Nguyên tắc sử dụng thiết bị và cách pha chế dung dịch

có nồng độ xác định và dung dịch đệm

1 Nguyên tắc, cách sử dụng thiết bị trong phòng thí nghiệm hóa sinh

2 Cách pha chế các dung dịch có nồng độ xác định và dung dịch đệm

2

1

Bài 2 Các phương pháp định tính, định lượng protein, axít amin

1 Tính chất dung dịch keo protein

2 Phản ứng màu của axít amin và protein

3 Xác định nitơ amin bằng phương pháp chuẩn độ foocmol

4 Các phương pháp định lượng protein

Bài 3 Phương pháp định tính, định lượng một số sản phẩm trao đổi

axít amin, protein

1 Phản ứng phát hiện urê

2 Phát hiện axít amin trong mồ hôi và nước tiểu

3 Phát hiện protein trong nước tiểu

4 Phản ứng phát hiện creatin và creatinin

Trang 14

Tên bài Số tiết Bài 4 Axít nucleic

1 Chuẩn bị mẫu axít nucleic từ nấm men

2 Một số tính chất của axít nucleic và sản phẩm trao đổi axít nucleic

2 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt độ amylaza

3 Ảnh hưởng của chất kìm hãm và kích hoạt tới hoạt độ amylaza

4 Xác định hoạt độ alpha - amylaza theo phương pháp Wohlgemuth

5 Xác định hoạt độ amylaza bằng phương pháp DNS

2 Sự thủy phân tinh bột

3 Định lượng đường khử theo phương pháp vi lượng của Rodzevich

4 Xác định pectin bằng phương pháp canxi pectat

Trang 15

6 Phương pháp đánh giá

Kết quả thực hành của từng sinh viên phải được đánh giá, cho điểm căn cứ vào:

- Ý thức tổ chức kỷ luật thực hiện các nội dung thực hành trong phòng thí nghiệm: 20%;

- Kiểm tra kết quả cuối buổi thực hành: 40%;

- Báo cáo thực hành: 40%

Trang 16

Bài 1 NGUYÊN TẮC SỬ DỤNG THIẾT BỊ - CÁCH PHA CHẾ DUNG DỊCH CÓ

NỒNG ĐỘ XÁC ĐỊNH VÀ DUNG DỊCH ĐỆM

1.1 Mục tiêu

Giúp sinh viên nắm và hiểu được nguyên lý hoạt động của các loại máy móc,

thiết bị cần thiết dùng trong phòng thí nghiệm hóa sinh: cân điện tử, cân phân tích, máy chỉnh pH, pipet mant, bếp từ, bể ổn nhiệt

Nắm được các phương pháp pha và sử dụng các loại dung dịch có nồng độ xác định, dung dịch đệm

1.2 Yêu cầu

Sau khi thực hiện bài thực hành này, sinh viên nắm rõ nguyên tắc và sử dụng thành thạo các loại máy móc, thiết bị cần thiết dùng trong thí nghiệm hóa sinh: cân điện tử, cân phân tích, máy chỉnh pH, pipet mant, bếp từ, bể ổn nhiệt, tủ hút

Pha chế được một số dung dịch có nồng độ xác định và dung dịch đệm với độ chính xác cao

- Trước khi cân cần chỉnh cho cân về trạng thái cân bằng;

- Mở khóa cân ở phía dưới bằng cách xoay núm khóa ngược chiều kim đồng hồ;

- Bấm nút ON/OFF (màu đỏ) bên trái cân;

- Đợi vài giây cho cân thật ổn định Các thông số trên cân sẽ là: OK 0,00 g;

- Đặt giấy cân (gập viền xung quanh) lên vị trí đặt mẫu vật cần cân;

- Đợi vài giây Chữ số hiện lên là trọng lượng của giấy cân;

Trang 17

- Bấm nút ZERO (màu xanh) bên phải cân để cân tự trừ đi trọng lượng của giấy cân, màn hình cân lại hiện lên: OK 0,00 g;

- Dùng thìa cân lấy hóa chất cho vào giấy cân đến trọng lượng cần cân;

- Lấy giấy cân có hóa chất ra khỏi cân;

- Bấm nút ON/OFF để tắt cân;

- Khóa cân lại bằng cách xoay núm dưới theo chiều kim đồng hồ;

- Vệ sinh cân: Lau sạch hóa chất rơi vãi trên đĩa cân và mặt cân…

1.3.1.2 Máy đo pH

Là thiết bị dùng để xác định pH của dung dịch, trên cơ sở đó điều chỉnh pH của dung dịch

Cách sử dụng:

- Rửa cực đo pH với nước cất 2 lần, thấm khô nhẹ nhàng cực đo với giấy thấm mềm;

- Mở nút đẩy Filler Port trên cực để cực sẵn sàng cho việc đo pH;

- Nhúng phần đầu cực đo pH vào dung dịch môi trường sao cho phần cực đo pH ngập trong dung dịch nhiều hơn 3 cm tính từ đỉnh cực;

- Nhấn nút ON/OFF để bật máy (màn hình của máy sẽ sáng lên);

Trang 18

- Nếu giá trị pH của dịch chưa đạt đến hoặc vượt quá giá trị pH phù hợp với giá trị pH cần thì điều chỉnh bằng cách bổ sung thêm HCl (nếu pH dung dịch lớn hơn pH cần) hoặc NaOH (nếu pH dung dịch nhỏ hơn pH cần) Sau đó, nhấn nút MEAS để máy tiếp tục đo như trên;

- Khi giá trị pH của dung dịch đạt tới giá trị cần đo, nhấn nút ESC để thoát khỏi chương trình đo;

- Kiểm tra hệ thống điện, bật công tắc quạt hút và đèn chiếu sáng;

- Pha hoặc lấy hóa chất dễ bay hơi trong tủ;

- Kết thúc: Đóng nắp các chai, lọ đựng hóa chất, để gọn vào nơi qui định;

- Để 10 - 20 phút, sau đó tắt công tắc đèn, quạt hút

1.3.1.4 Bể ổn nhiệt

Là thiết bị được sử dụng để giữ nhiệt độ ổn định trong khoảng thời gian cần thiết

- Kiểm tra hệ thống điện vào bể;

- Cho khoảng 2 - 4 lít nước sạch vào trong bể (tùy thể tích bể), thể tích nước thường chiếm ½ thể tích bể;

- Đạy nắp bể;

- Đặt giá trị nhiệt độ cần ổn định;

- Bật nút START để bắt đầu nâng nhiệt độ;

- Kiểm tra thông số nhiệt độ, khi đạt tới giá trị cần thiết thì đưa mẫu vào và bấm nút cài đặt thời gian;

- Khi thời gian ổn nhiệt đủ theo yêu cầu, lấy mẫu ra khỏi bể;

- Điều chỉnh giá trị nhiệt độ về nhiệt độ phòng;

Trang 19

- Tắt công tắc điện, đổ bỏ nước trong bể;

- Vệ sinh trong và ngoài bể

a Khái niệm dung dịch

Dung dịch là hỗn hợp của hai hay nhiều chất tác động tương hỗ với nhau về mặt vật lý và hóa học Trong dung dịch gồm có chất hòa tan và dung môi Nếu chất hòa tan

ở dạng rắn thì gọi là chất tan, nếu là chất lỏng thì gọi là dung chất

b Định nghĩa nồng độ

Nồng độ là một đại lượng biểu thị cho mức độ đậm đặc của một hệ có thể ở dạng rắn, lỏng hay khí

 Nồng độ phần trăm (C%)

Có 3 cách biểu diễn nồng độ phần trăm như sau:

Cách 1: Nồng độ % (w/w): Biểu diễn số gam chất tan có trong 100 g dung dịch

Ví dụ: Nồng độ H2SO4 20% nghĩa là trong 100 gam dung dịch H2SO4 20% có 20 gam H2SO4 tinh khiết

Công thức tính:

Trang 20

Cách 2: Nồng độ % (w/v): Biểu diễn số gam chất tan có trong 100 ml dung dịch

- mct: Khối lượng chất tan (g);

- mdd: Khối lượng dung dịch (g);

Trang 21

- M là khối lượng của phân tử gam hay nguyên tử gam chất tan;

- Vdd là thể tích dung dịch (ml);

- 1.000 là thể tích dung dịch (ml)

 Nồng độ đương lượng (CN hay N)

Biểu thị số đương lượng gam chất tan có trong 1 lít dung dịch

Công thức tính:

Trong đó:

- a là số gam chất tan (gam);

- D là khối lượng của 1 đương lượng gam chất tan;

Đơn vị đo hiện nay được sử dụng thông dụng nhất là ppm, ppb, g/kg, g/lít

 Nồng độ phần triệu ppm (part per million)

Là nồng độ biểu thị số mg chất tan có trong 1.000 mL dung dịch nếu hệ ở dạng lỏng hay số mg chất tan có trong 1 kg chất, nếu hệ ở dạng rắn

Công thức tính:

Ví dụ: Hàm lượng chì trong thịt là 20 ppm nghĩa là trong 1 kg thịt có 20 mg chì

 Nồng độ phần tỉ ppb (part per billion)

Là nồng độ biểu thị số mg chất tan có trong 1.000.000 mL (1.000 lít) dung dịch

(N)

Trang 22

nếu hệ ở dạng lỏng hay số mg chất tan có trong 1.000 kg nếu hệ ở dạng rắn

 Đơn vị g/kg

Là đơn vị biểu thị số g chất tan có trong 1 kg chất mà nó tồn tại

Ví dụ: Hàm lượng NaCl trong cá là 30 g/kg nghĩa là trong 1 kg cá có 30 g NaCl

 Đơn vị g/lít

Là đơn vị biểu thị số g chất tan có trong 1 lít chất mà nó tồn tại

Ví dụ: Hàm lượng NaCl trong nước mắm là 30 g/lít nghĩa là trong 1 lít nước mắm có 30 g NaCl

 Biểu thức liên hệ giữa các loại nồng độ

- C2 %: Nồng độ phần trăm theo khối lượng (w/w);

- ddd: Khối lượng riêng của dung dịch (g/ml)

Trang 23

- d: Khối lượng riêng của dung dịch (g/ml);

- C%: Nồng độ phần trăm của dung dịch;

- M: Khối lượng phân tử của chất (g)

Khi pha một thể tích dung dịch từ một dung dịch có nồng độ cao hơn:

Biểu thức:

Trong đó:

- C1: Nồng độ mol ban đầu của dung dịch (mol/l);

- C2: Nồng độ sau của dung dịch (mol/l);

- V1: Thể tích ban đầu của dung dịch (lít);

- V2: Thể tích sau của dung dịch (lít)

1.3.2.2 Một số bài toán pha hóa chất thường gặp

a Tính toán pha dung dịch có nồng độ C% từ hóa chất rắn

Ví dụ 1: Pha 100 ml NaOH 30% từ NaOH rắn (độ tinh khiết p = 96%)

Đây là pha dung dịch có nồng độ C% (w/v) từ hóa chất rắn có nồng độ C% (w/w)

Trang 24

m’ct = (mct x 100) : 96 ≈ 41,597 (gam)

b Pha dung dịch có nồng độ C% từ hóa chất rắn ngậm nước

Ví dụ: Pha 250 ml CuSO4 1% từ CuSO4.5H2O (p = 98%)

e Pha loãng dung dịch

Ví dụ: Pha 250 ml NaOH 0,1N từ NaOH 1N

Áp dụng công thức: N1V1 = N2V2 có được:

→V1 = N2 x V2 / N1 = 0,1 x 250 / 1 = 25 ml

Vậy cần lấy 25 ml NaOH 1N để pha dung dịch NaOH 0,1N

1.3.2.3 Thực hành pha dung dịch có nồng độ xác định

a Pha 100 g dung dịch NaOH 40%

 Hóa chất - dụng cụ: NaOH rắn, nước cất sạch, cốc thủy tính 250 ml, đũa khuấy,

cân kỹ thuật, bình định mức 100 ml

Trang 25

 Tiến hành:

- Xác định chính xác lượng NaOH cần để pha X = (gam);

- Lượng nước cần để pha: N = ml;

- Dùng cốc thủy tinh 250 ml có chứa 50 ml nước cất;

- Cân g NaOH rắn, cho vào cốc thủy tinh từ từ từng ít một;

- Dùng đũa thủy tinh khuấy nhẹ nhàng cho tan từ từ đến hết;

- Dùng phễu thủy tinh và chuyển dịch sang bình định mức 100 ml;

- Dùng 10 ml nước cất còn lại để chuẩn đến vạch mức

b Pha 1 lít dung dịch HCl 1M từ HCl 37%

 Hóa chất - dụng cụ: HCl; nước cất, ống đong; bình định mức; tủ hút

 Tiến hành:

- Phân tử lượng HCl: MHCl = 1 + 35,5 = 36,5;

- Lượng HCl 37% để pha dung dịch 1M là: X = g;

- Như vậy: Số ml HCl 37% cần lấy để pha là V = X : 1,19 = ml;

- Vậy, đong V ml HCl 37% cho vào bình định mức 1.000 có sẵn 1 ít nước;

Việc pha dung dịch đệm tuân theo nguyên tắc chọn cặp axít - bazơ có hằng số phân ly pK A/B gần với pH đệm muốn pha và phối trộn chúng với số mol bằng nhau

b Pha dung dịch đệm Citrat (pH = 3,0 - 6,0)

 Hóa chất - dụng cụ: Axít Citric, natricitrat, bình định mức 100 ml, đũa thủy

tinh, cốc thủy tinh 250 ml, cân kỹ thuật

Trang 26

 Tiến hành:

- Cân 2,1 gam C6H8O7.H2O;

- Hòa tan và định mức đến 100 ml (dung dịch a);

- Cân 2,94 g C6H5O7Na3.2H2O;

- Hòa tan và định mức đến 100 ml (dung dịch b);

- Dung dịch đệm Citrat có giá trị pH khác nhau, phụ thuộc số ml dung dịch a và dung dịch b theo bảng sau:

- Trộn dung dịch a và b theo tỷ lệ ở bảng để thu được pH đệm là: 3,4; 3,8 và 5,4;

- Kiểm tra pH của các dung dịch vừa pha bằng máy đo pH

c Pha dung dịch đệm Glycin

 Hóa chất - dụng cụ: Glycin, NaOH

 Dụng cụ: Nước cất, bình định mức; đũa thủy tinh; máy đo pH; cân kỹ thuật

 Tiến hành:

- Cân 3,0 gam Glycin, hòa tan và định mức tới 200 ml (dung dịch a);

- Cân 1,6 gam NaOH, hòa tan và định mức tới 200 ml (dung dịch b);

Trang 27

- Pha các dung dịch đệm Glycin có giá trị pH: 9,0; 10;

- Kiểm tra pH của dịch đệm vừa pha bằng máy đo pH

1.4 Kết quả thực hành

Sinh viên ghi chép lại hiện tượng và giá trị xác định được trong quá trình của các thí nghiệm

1.5 Đánh giá kết quả, chấm điểm

1.5.1 Đánh giá sinh viên trực tiếp

- Trả lời được các câu hỏi về nguyên tắc sử dụng các loại thiết bị đã được thực hành

- Thao tác thành thạo đối với một số loại thiết bị được thực hành

1.5.2 Đánh giá báo cáo thực hành

Sinh viên viết báo cáo kết quả thực hành và giải thích về kết quả thu được khi pha một số loại dung dịch có nồng độ xác định và dung dịch đệm

Trang 28

1 200 ml đệm Citrat pH 6 Axít citric: g Natri citrat g

2 250 ml đệm Glycin pH 9 Glycin g NaOH g

3 150 ml đệm Phosphat

pH 8 NaH2PO4……….g Na2HPO4 g

Trang 29

Bài 2 CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG

PROTEIN VÀ AXÍT AMIN

Sau khi thực hiện xong bài thực hành, sinh viên phải:

- Hiểu và nắm được các nguyên tắc của một số phương pháp định tính và định lượng axít amin và protein;

- Thực hiện các thí nghiệm và định lượng chính xác một lượng axít amin và protein

Hình dạng: Protein có dạng cầu (hình hạt, hình bầu dục) hoặc dạng sợi

a Tính chất dung dịch keo và kết tủa protein

Khi hòa tan protein tạo dung dịch keo, các phân tử keo có kích thước lớn, không

đi qua màng bán thấm Sử dụng tính chất này, có thể tinh sạch protein khỏi các chất phân tử thấp bằng phương pháp thẩm tích

Trang 30

Độ bền dung dịch keo phụ thuộc vào: sự tích điện, mức độ hidrat hóa, nhiệt độ… Khi thay đổi các yếu tố này (làm trung hòa điện của phân tử protein, loại bỏ lớp vỏ nước…) thì các phân tử protein sẽ kết tụ lại với nhau tạo thành những khối lớn, tách khỏi dung dịch, gọi là kết tủa protein

Kết tủa thuận nghịch: Sau khi protein bị kết tủa, nếu loại bỏ các yếu tố gây kết tủa, protein lại tạo thành dung dịch keo bền như trước

Kết tủa không thuận nghịch (biến tính): Sau khi protein kết tủa, loại bỏ các yếu tố gây kết tủa thì protein không trở lại dung dịch keo bền như trước, protein thay đổi (tính tan, hoạt tính sinh học, phản ứng hóa học…) gọi là sự biến tính protein

Ứng dụng tính chất kết tủa protein

Các yếu tố gây kết tủa thuận nghịch protein được dùng để thu nhận chế phẩm protein Thường dùng muối trung hòa: (NH4)2SO4, dung môi hữu cơ: axeton, etanol kết tủa ở nhiệt độ thấp, dưới 00C

Các yếu tố gây kết tủa không thuận nghịch protein (biến tính) được sử dụng để loại bỏ protein khỏi dung dịch, làm ngừng phản ứng enzym (như: Đun sôi dung dịch protein, sử dụng axít, bazơ, kiềm ở nồng độ cao: axít tricloaxetic, axít vonframic, axít picric, axít sunfoxalisilic… Ngoài ra, có thể dùng các kim loại nặng: Fe, Cu, Hg, Pb )

b Tính chất hấp phụ ánh sáng tia tử ngoại của protein

Dung dịch pr có khả năng hấp thụ ánh sáng tử ngoại ở hai vùng ánh sáng:

- Vùng 1: Bước sóng ánh sáng: 180 - 220 nm, do hấp thụ của liên kết peptit;

- Vùng 2: Bước sóng sánh sáng: 250 - 300 nm, do hấp thụ của các axít amin thơm Các phương pháp đo độ hấp thụ ánh sáng ở vùng tử ngoại thường được dùng để định lượng protein đã tinh sạch

2.3.1.2 Tính chất hóa học của protein, axít amin

a Tính chất lưỡng tính của protein và axít amin

Với axít amin

Trong phân tử axít amin có nhóm -COOH nên có khả năng nhường (H+), mặt khác có nhóm amin- NH2 nên có khả năng nhận (H+) vì vậy axít amin có tính lưỡng tính

Trang 31

đổi pH của một dung dịch axít amin, phân tử axít amin sẽ tích điện âm (-) hoặc dương (+)

Trong môi trường axít, axít amin ở dạng cation (tích điện dương), nếu tăng dần

pH, axít amin lần lượt nhường proton để thay đổi điện tích và khi tăng đến giá trị pH nào đó, axít amin sẽ chuyển thành dạng anion (tích điện âm)

Tại giá trị pH nào đó axít amin sẽ trung hòa về điện Giá trị pH đó được gọi là điểm đẳng điện của axít amin (isoelectric point) và được ký hiệu là pHi Giá trị đẳng điện của axít amin phụ thuộc vào số lượng nhóm amin và carboxyl có trong phân tử axít amin

Với protein

Protein là chất điện li lưỡng tính vì trong phân tử có nhiều nhóm phân cực mạnh (bên gốc R) của axít amin Trạng thái tích điện của các nhóm này phụ thuộc vào pH của môi trường Ở một pH nào đó mà tổng điện tích (+) và điện tích (-) của protein bằng không Phân tử protein không di chuyển trong điện trường gọi là pHi (isoelectric - điểm đẳng điện) của protein

Ở pH < pHi, Pr là một cation, số điện tích dương lớn hơn số điện tích âm

Ở pH > pHi, Pr là một anion, số điện tích âm lớn hơn số điện tích dương

Ở pH = pHi, Pr có xu hướng kết tụ với nhau tạo kết tủa Pr

Bảng 2.1 Giá trị pH đẳng điện của một số protein

Trang 32

Ứng dụng tính chất dung dịch keo và kết tủa protein:

Trong môi trường có pH = pHi, protein dễ dàng kết tụ lại với nhau do đó, lợi dụng tính chất này để xác định pHi của protein cũng như để kết tủa protein

Mặt khác, do sự khác nhau về pHi giữa các protein mà có thể điều chỉnh pH của môi trường để tách riêng các protein ra khỏi hỗn hợp của chúng

b Phản ứng màu của axít amin, protein

 Phản ứng Biurê

Là phản ứng đặc trưng của liên kết peptid, sử dụng để phát hiện và định lượng protein Tất cả các chất chứa từ 2 liên kết peptid trở lên đều cho phản ứng này

Trong môi trường kiềm mạnh, liên kết peptid trong protein phản ứng với CuSO4

tạo thành phức chất màu tím đỏ Phức này có cực đại hấp thụ ở bước sóng 540 nm

 Phản ứng của nhóm amin (phản ứng với formaldehyde)

Formadehyde có thể phản ứng với nhóm amin của axít amin ở nhiệt độ thường và

pH trung tính để tạo dẫn xuất dihydroxymethyl Trong dẫn xuất này, nhóm amin bị khóa, người ta có thể dùng một bazơ để trung hòa gốc –COOH Lượng kiềm tiêu tốn hết được cùng để xác định hàm lượng formol hay nitơ formol Phản ứng này cũng được dùng để xác định hàm lượng formol trong dung dịch

2.3.2 Nội dung thực hành

2.3.2.1 Tính chất dung dịch keo protein

Dung dịch protein là keo ưa nước, chúng bền vững là nhờ màng nước bao quanh phân tử Các yếu tố vật lý hay hóa học có khả năng tác dụng lên phá hủy màng nước xung quanh phân tử protein sẽ ảnh hưởng đến protein có thể làm chúng kết tủa

Kết tủa có thể là thuận nghịch hoặc không thuận nghịch Ứng dụng các phương pháp kết tủa thuận nghịch protein để tách protein và enzym ở dạng tinh khiết

Trang 33

a Kết tủa bằng muối trung tính

- Cho vào ống nghiệm 5 ml lòng trắng trứng;

- Thêm vào 5 ml (NH4)2SO4 bão hòa, lắc đều;

- Quan sát sự tạo thành kết tủa thứ nhất (1);

- Để yên 5 phút, lọc thu dịch lọc sang ống nghiệm khác;

- Cho vào dịch lọc 3 gam tinh thể (NH4)2SO4, lắc đều;

- Quan sát sự tạo thành kết tủa, lọc thu kết tủa thứ hai (2);

- Cho các kết tủa 1 và 2 vào 2 ống nghiệm khác;

- Thêm vào mỗi ống 2 - 3 ml nước cất, lắc đều;

- Quan sát sự hòa tan kết tủa

b Kết tủa protein bằng dung môi hữu cơ ở nhiệt độ thấp

 Nguyên tắc:

Dung môi hữu cơ (ethanol; ete; axeton ) có tác dụng khử nước của phân tử keo protein, làm phá hủy màng nước, dẫn đến kết tủa protein Quá trình kết tủa protein diễn ra nhanh, trong môi trường trung tính hoặc axít yếu với sự có mặt của các chất điện ly (NaCl)

Nếu thời gian tác dụng của dung môi hữu cơ ngắn, nhiệt độ thấp (≤ 4oC), protein kết tủa thuận nghịch Ngược lại, thời gian tác dụng lâu dài, trong điều kiện nhiệt độ thường (20 - 30oC), protein biến tính hoàn thoàn, tạo thành kết tủa không thuận nghịch

 Hóa chất - dụng cụ: Lòng trắng trứng nguyên chất; NaCl (bột); cồn (axeton),

ống nghiệm, đũa thủy tinh, giấy lọc

 Tiến hành:

- Cho vào ống nghiệm 1 ml lòng trắng và 0,2 gam bột NaCl, khuấy từ từ đến tan;

Trang 34

- Thêm vào 2 ml cồn 96oC (hoặc axeton), lắc mạnh trong 3 phút thu được tủa protein;

- Gạn bỏ dịch trong, thu tủa, thêm 2 ml nước cất vào làm giảm nồng độ dung môi trong dung dịch;

- Hòa tan hoàn toàn kết tủa protein;

- Quan sát và giải thích kết quả thí nghiệm

c Kết tủa protein bằng muối kim loại nặng

Những muối kim loại nặng (Cu2+; Fe3+; Pb2+ ) tác dụng với protein tạo thành kết tủa không tan Nếu dư muối, kết tủa lại tan do những phần tử keo hấp thụ ion kim loại nặng, trở nên tích điện Ion có hóa trị càng cao, kết tủa càng dễ tan trở lại

 Hóa chất - dụng cụ: Dung dịch lòng trắng trứng 5%, FeCl3 5%, CuSO4 7%, [(CH3COO)2Pb] 5%, ống nghiệm, đũa thủy tinh

 Tiến hành:

- Lấy 3 ống nghiệm sạch, khô;

- Cho vào mỗi ống 2 ml dung dịch lòng trắng trứng 5%;

- Thêm vào ống 1: 1 giọt dung dịch FeCl3 5%

+ Ống 2: 1 giọt chì axetat 5%;

+ Ống 3: 1 giọt CuSO4 7%

- Quan sát kỹ, sau đó cho thêm vào lượng muối kim loại tương ứng vào từng ống

và so sánh sự hòa tan kết tủa ở các ống

2.3.2.2 Phản ứng màu của axít amin và protein

Trang 35

- Để ống nguội, thêm vào 2 ml NaOH 10%, lắc cho tan;

- Thêm vài giọt CuSO4 1%, quan sát màu

Phản ứng với protein:

- Cho vào ống nghiệm thứ hai 3 ml dung dịch lòng trắng trứng 5%;

- Thêm vào 1 ml NaOH 10% và 1 - 2 giọt dung dịch CuSO4 1%, lắc kỹ;

- Quan sát màu tạo thành;

- So sánh phức màu của hai ống nghiệm 1 và 2 và giải thích kết quả

b Phản ứng Xantoprotein của axít amin vòng

Các axít amin vòng như phenylalanin, tirozin, triptophan khi tác dụng với HNO3 đặc tạo dẫn xuất nitro màu vàng Khi thêm dung dịch kiềm vào sẽ tạo thành muối có màu da cam Các axít amin không vòng, protein không chứa axít amin vòng không cho phản ứng này

 Hóa chất - dụng cụ: Lòng trắng trứng 5%, dung dịch gelatin 1%, HNO3 đặc,

NH4OH đặc, ống nghiệm, tủ hút, bếp từ, nồi inox, pipet

 Tiến hành:

- Lấy 2 ống nghiệm sạch, khô, đánh dấu;

- Cho vào ống 1: 3 ml lòng trắng trứng 5%;

- Cho vào ống 2: 3 ml gelatin 1%;

- Thêm vào mỗi ống nghiệm 1 ml HNO3 đặc;

- Đun sôi cách thủy hỗn hợp phản ứng 1 phút;

- Làm nguội, thêm từ từ vài giọt NH4OH đặc;

- Quan sát sự chuyển màu trong 2 ống nghiệm và so sánh, giải thích kết quả

c Phản ứng của axít amin chứa lưu huỳnh (phản ứng Folia)

Các axít amin chứa lưu huỳnh như: xistein; xistin; metionin dưới tác dụng của

kiềm bị phân hủy tạo thành natri sunfua:

Thêm chì axetat vào Na2S sẽ phản ứng tạo thành kết tủa nâu đen của chì sunfua (PbS)

Trang 36

Na 2 S + Pb(CH 3 COO) 2 2 (CH 3 COO)Na + PbS

 Hóa chất - dụng cụ: Lòng trắng trứng 1%, NaOH 10%, chì axetat 1%, xistein

1%, ống nghiệm, pipet, bếp từ, nồi inox

 Tiến hành:

- Lấy 3 ống nghiệm khô, sạch;

- Cho vào ống 1: 2 ml nước cất;

- Cho vào ống 2: 2 ml lòng trắng trứng 1%;

- Cho vào ống 3: 2 ml xistein 1%;

- Cho vào mỗi ống 2 ml NaOH 10%;

- Đun sôi 3 phút;

- Lắc đều, thêm vào vài giọt Pb(CH3COO)2 1% vào mỗi ống;

- Quan sát sự tạo thành kết tủa và giải thích kết quả

có độ nhạy cao, nên được dùng để định tính và định lượng axít amin Phản ứng này là

cơ sở của phương pháp sắc ký axít amin

 Hóa chất - dụng cụ: Glixin 0,02%, albumin 1%, ninhydrin 0,1%, ống nghiệm, nồi

- Thêm vào mỗi ống 5 giọt ninhydrin 0,1%;

- Đun nóng cả hai ống nghiệm trong 1 phút;

- Quan sát sự xuất hiện màu, giải thích kết quả

Trang 37

2.3.2.3 Xác định nitơ amin (N-amin) bằng phương pháp chuẩn độ foocmol

Các axít amin có thể phản ứng với focmol trung tính để tạo thành metyl - axít amin Focmol đã bao vây nhóm amin mang tính kiềm nên có thể chuẩn độ nhóm cacboxyl trong phân tử axít amin bằng kiềm Dựa vào lượng kiềm đã dùng để chuẩn

độ sẽ tính được lượng nitơ của axít amin

 Hóa chất - dụng cụ: Dịch mẫu có chứa axít amin cần xác định, NaOH 0,1N,

H2SO4 0,1N, phenolphtalein 0,5%, etanol, hỗn hợp focmol (Phụ lục 1), bình tam giác

100 ml, burêt, pipet, tủ hút

 Tiến hành:

- Lấy 2 bình tam giác, đánh số bình 1 (đối chứng); bình 2 (thí nghiệm);

- Cho vào bình 1: 10 ml nước cất vô đạm, bổ sung 5 ml dung dịch hỗn hợp focmol và 5 ml dung dịch NaOH 0,1N;

- Dùng H2SO4 0,1N để điều chỉnh màu trong bình cho đến khi chỉ còn màu hồng nhạt;

- Thêm 2 giọt NaOH 0,1N, màu đỏ tươi xuất hiện, ứng với pH = 8,8;

- Cho vào bình 2: 10 ml dịch mẫu (đã cân và ghi khối lượng dịch mẫu (gam));

- Thêm 5 ml hỗn hợp focmol và chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1N đến khi có màu đỏ tươi;

- Chuẩn bằng H2SO4 0,1N đến khi màu của bình còn hồng nhạt;

- Thêm vài giọt NaOH 0,1N đến màu đỏ tươi, tương đương màu của bình 1;

- Thêm vào bình 1: 4 giọt NaOH 0,1N, xuất hiện màu đỏ tươi, pH = 9,1;

- Thêm vào bình 2: Vài giọt NaOH 0,1N cho đến khi xuất hiện màu đỏ tươi giống bình 1, pH = 9,1;

- Tính kết quả: Cộng toàn bộ lượng kiềm và axít đã cho vào mỗi bình trong quá trình thí nghiệm và kết quả tính theo công thức:

(mg %)

Trang 38

Trong đó:

- V1: Tổng lượng kiềm dùng chuẩn bình 1;

- v1 : Tổng lượng axít dùng chuẩn bình 1;

- V2: Tổng lượng kiềm dùng chuẩn bình 1;

- v2: Tổng lượng axít dùng chuẩn bình 2;

- a: Lượng mẫu ứng với 10 ml dung dịch mẫu (gam);

- 1,4: Hệ số chuyển thành nitơ, cứ 1 ml NaOH 0,1N dùng chuẩn độ ứng với 1,4 mg nitơ

2.3.2.4 Các phương pháp định lượng protein

a Định lượng protein theo phương pháp Lowry

 Hóa chất - dụng cụ:

- Dung dịch protein nghiên cứu (chứa 50 - 300 µg protein/ml); albumin chuẩn;

- Dung dịch A: Na2CO3 2% hòa trong NaOH 0,1N;

- Dung dịch B: CuSO4.5H2O 0,5% pha trong dung dịch natri xitrat 1%;

- Dung dịch C: Trộn 1 thể tích dung dịch B với 49 thể tích dung dịch A;

- Dung dịch Folin (phụ lục 2), pha loãng 2 lần;

- Máy so màu quang điện, ống nghiệm, pipet

 Tiến hành:

- Hút vào ống nghiệm sạch, khô 0,5 ml dung dịch cần xác định;

- Thêm vào 2,5 ml dung dịch C, lắc đều và để ở nhiệt độ phòng 10 phút;

Trang 39

- Thêm chính xác 0,25 ml dung dịch Folin đã pha loãng, lắc đều, để 30 phút;

- So màu trên máy ở bước sóng 750 nm;

- Song song với mẫu thí nghiệm, làm ống đối chứng trong đó thay dung dịch protein bằng nước cất và tiến hành giống như ống thí nghiệm;

- Lập đồ thị chuẩn protein:

+ Chuẩn bị các dung dịch protein chuẩn của albumin với các nồng độ pha loãng khác nhau chứa một lượng protein tương ứng là: 20, 50, 100, 150, 200, 300 và 400 µg/ml protein từ dịch gốc ban đầu có nồng độ 1 mg/ml;

+ Tiến hành làm phản ứng màu với các dịch chuẩn theo thứ tự;

+ Dựng đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa mật độ quang học và nồng độ protein;

+ Từ kết quả đọc được của các mẫu thí nghiệm, đối chiếu với đồ thị chuẩn để tính ra hàm lượng protein có trong 1 ml dịch mẫu nghiên cứu, từ đó tính ra hàm lượng

% protein trong nguyên liệu

b Xác định điểm đẳng điện của protein

Tại điểm pH nhất định, các phân tử protein có số điện tích âm bằng với điện tích

âm, tổng số điện tích của phân tử bằng không Protein biểu hiện tính chất của một chất lưỡng tính gọi là điểm đẳng điện của protein (pHi)

Tại pHi, các protein không di động trong điện trường, các phân tử protein dễ dàng kết tụ lại với nhau tạo thành kết tủa protein

Phản ứng kết tủa protein ở điểm đẳng điện diễn ra nhanh chóng khi môi trường phản ứng được bổ sung thêm dung môi hữu cơ (cồn, axeton )

Điểm đẳng điện đặc trưng cho từng loại protein, ví dụ: Albumin trứng có pHi = 4,6; cazein có pHi = 4,7; gelatin có pHi = 4,9

 Hóa chất - dụng cụ: Albumin trứng, Na2HPO4 0,2 M, axít citric 0,1 M, cồn 96o, ống nghiệm, đũa thủy tinh

 Tiến hành:

- Lấy 3 ống nghiệm, cho vào mỗi ống các dung dịch đệm theo bảng sau:

Trang 40

Bảng 2.2 Xác định điểm đẳng điện của albumin trứng

pH

ứng

Albumin trứng 1%

- Thêm vào mỗi ống 1 ml cồn 96o, lắc đều, để yên 5 phút;

- Quan sát, so sánh mức độ kết tủa trong 3 ống nghiệm, xác định điểm đẳng điện của albumin trứng Giải thích kết quả

c Định lượng protein theo phương pháp Biurê

Trong môi trường kiềm, protein kết hợp với Cu2+ tạo thành phức chất màu xanh tím có độ hấp thu cực đại ở bước sóng 540 nm Cường độ màu của phản ứng tỉ lệ với

số lượng liên kết peptit trong chuỗi polipeptit

Phương pháp Biurê được sử dụng đối với các mẫu nghiên cứu có khối lượng protein tương đối lớn ( ≥ mg/ml) Việc cải tiến phương pháp Biurê làm tăng độ nhạy của phản ứng biurê lên hàng chục lần gọi là phương pháp microbiurê

 Hóa chất - dụng cụ: Albumin tiêu chuẩn 1%; dung dịch protein (trứng, sữa, đậu

tương); thuốc thử biurê (phụ lục 3), ống nghiệm, đũa thủy tinh, máy đo quang

 Tiến hành:

- Cho vào ống nghiệm 1 ml dung dịch mẫu nghiên cứu và 4 ml thuốc thử biurê;

- Lắc đều, để yên 30 phút ở nhiệt độ phòng, dung dịch có màu xanh So màu ở bước sóng 540 nm, xác định được mật độ quang học E của dung dịch nghiên cứu;

- Lập đồ thị chuẩn;

- Lấy 6 ống nghiệm, đánh số thứ tự từ 1 đến 6, cho các chất tham gia phản ứng

Tiêu đề	Thực Hành Hóa Sinh Trao Đổi Chất
Tác giả	TS. Nguyễn Như Ngọc
Trường học	Trường Đại Học Lâm Nghiệp
Chuyên ngành	Hóa Sinh
Thể loại	Thực hành
Năm xuất bản	2020
Thành phố	Hà Nội

Định dạng
Số trang	81
Dung lượng	1 MB