So sánh trình tự nucleotide của đoạn SSR có liên quan đến protein thực hiện chức năng trao đổi chất ở một số mẫu chè tại Thái Nguyên

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC HÀ THỊ THANH HOÀN SO SÁNH TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE CỦA ĐOẠN SSR CÓ LIÊN QUAN ĐẾN P

Trang 1

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

HÀ THỊ THANH HOÀN

SO SÁNH TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE CỦA ĐOẠN SSR CÓ LIÊN QUAN ĐẾN PROTEIN THỰC HIỆN CHỨC NĂNG TRAO ĐỔI CHẤT

Ở MỘT SỐ MẪU CHÈ TẠI THÁI NGUYÊN

Chuyên nghành: Công nghệ Sinh học

Mã số: 60 42 02 01

LUẬN VĂN THẠC SỸ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS Hoàng Thị Thu Yến

Thái Nguyên, 2015

Trang 2

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chƣa đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc

Tác giả

Hà Thị Thanh Hoàn

Trang 3

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Hoàng Thị Thu Yến -

Giảng viên, phó trưởng khoa - Khoa Khoa học Sự sống - Trường Đại học Khoa học - người đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý báu để tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin cảm ơn các thầy cô và tập thể cán bộ phòng thí nghiệm Khoa Khoa học Sự sống, cảm ơn lãnh đạo Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn tới các cán bộ công tác tại Viện Nghiên cứu

hệ gen - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã nhiệt tình hướng dẫn tôi trong quá trình làm đề tài

Nhân dịp này tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới tập thể cán bộ, Công ty chè Sông Cầu - Huyện Đồng Hỷ - Thành Phố Thái Nguyên, nhân dân vùng chè Trại Cài - Minh Lập - Đồng Hỷ và Vùng chè Tân Cương -Thành Phố Thái Nguyên đã giúp đỡ tôi trong thời gian tôi thu thập vật liệu nghiên cứu làm đề tài

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới toàn thể gia đình, cảm ơn bạn

bè, đồng nghiệp và nhóm nghiên cứu di truyền đã luôn cổ vũ, động viên tôi trong suốt thời gian qua

Tác giả

Hà Thị Thanh Hoàn

Trang 4

DANH MỤC NHỮNG TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT

AFLP Amplified Fragment Length Polymorphic (đa hình chiều dài

các đoạn cắt khuếch đại)

DNA Deoxyribonucleic acid

dNTP Deoxynucleoside triphosphate

đtg Đồng tác giả

EDTA Ethyen Diamin Tetraacetic Acid

EtBr Ethidium Bromide

PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase) Primer F Primer Forward (mồi xuôi)

Primer R Primer Reverse (mồi ngược)

RAPD Random Amplify Polymorphic DNA (phân tích đa dạng DNA

khuếch đại ngẫu nhiên) RNA Ribonucleic Acid

RFLP Restriction Fragment Length Polymorphic (đa hình chiều dài

đoạn cắt giới hạn) SSR Simple Sequence Repeat (đoạn lặp lại trình tự đơn giản)

TAE Tris acetat EDTA

VNTR Variable Number of Tandem Repeat (DNA lặp lại nối tiếp có

kích thước khác nhau)

Trang 5

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN ii

LỜI CẢM ƠN iii

DANH MỤC NHỮNG TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT iv

MỤC LỤC v

DANH MỤC CÁC HÌNH TRONG LUẬN VĂN vii

DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN VĂN viii

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu chung về cây chè 3

1.1.1 Nguồn gốc và phân loại cây chè 3

1.1.2 Đặc điểm sinh học của cây chè 5

1.1.3 Giá trị của cây chè 7

1.1.4 Đặc điểm một số giống chè tại Thái Nguyên 9

1.2 Tình hình nghiên cứu hệ gen chè trên thế giới và ở Việt Nam 10

1.2.1 Tình hình nghiên cứu hệ gen chè trên thế giới 10

1.2.2 Tình hình nghiên cứu hệ gen chè ở Việt Nam 13

1.3 Chỉ thị SSR và những ứng dụng trong nghiên cứu protein thực hiện chức năng trao đổi chất 14

1.3.1 Khát quát về chỉ thị SSR 14

1.3.2 Chỉ thị SSR liên quan đến protein thực hiện chức năng trao đổi chất17 CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 Vật liệu nghiên cứu 22

2.1.1 Nguyên liệu 22

2.1.2 Hóa chất 22

Trang 6

2.1.3 Thiết bị 22

2.2 Phương pháp nghiên cứu 23

2.2.1 Phương pháp thu mẫu lá chè 23

2.2.2 Phương pháp tách chiết DNA tổng số từ lá chè 23

2.2.3 Phương pháp điện di 25

2.2.4 Phương pháp xác định hàm lượng và kiểm tra độ tinh sạch DNA tổng số 27 2.2.5 Kỹ thuật PCR-SSR 27

2.2.6 Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR 29

2.2.7 Phương pháp xác định và phân tích trình tự 30

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31

3.1 Tách DNA tổng số từ các mẫu chè nghiên cứu 31

3.2 Phân tích chỉ thị SSR ở các mẫu chè nghiên cứu 32

3.2.1 Phân tích một số chỉ thị SSR ở các mẫu chè nghiên cứu bằng kỹ thuật PCR - SSR 32

3.2.2 Đánh giá mối quan hệ di truyền giữa các mẫu chè dựa trên phân tích chỉ thị SSR 38

3.3 Phân tích trình tự nucleotide các đoạn SSR liên quan đến protein thực hiện chức năng trao đổi chất 41

3.3.1 Phân tích trình tự nucleotid đoạn SSR liên quan đến glyoxalase 42

3.3.2 Phân tích trình tự nucleotid đoạn SSR liên quan đến sucrose 43

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45

TÀI LIỆU THAM KHẢO 46

PHỤ LỤC 1

Trang 7

DANH MỤC CÁC HÌNH TRONG LUẬN VĂN Hình 1.1 Một số giống chè trồng tại Công ty chè Sông Cầu tỉnh Thái Nguyên 10

Hình 1.2 Chu trình sinh tổng hợp sucrose với sự tham gia của các enzyme chính 18

Hình 1.3 Sơ đồ hệ thống enzyme glyoxilase 20 Hình 3.1 Kết quả điện di DNA tổng số của 18 mẫu chè nghiên cứu 31

Hình 3.2 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR - SSR của 18 mẫu chè với mồi YS27 32

Hình 3.3 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR - SSR của 18 mẫu chè với mồi YTS46 33

Hình 3.6 Sơ đồ quan hệ di truyền của 18 mẫu chè nghiên cứu 40

Hình 3.7 So sánh trình tự nucleotide đoạn SSR của bốn mẫu nghiên cứu với các trình tự đã công bố 43

Hình 3.8 So sánh trình tự nucleotide đoạn SSR của bốn mẫu nghiên cứu với các trình tự đã công bố 44

Trang 8

DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN VĂN

Bảng 2.1 Danh mục các thiết bị, dụng cụ được sử dụng 23

Bảng 2.2 Thành phần gel polyacrylamide 8% 27

Bảng 2.3 Danh sách 14 cặp mồi SSR được sử dụng trong nghiên cứu 28

Bảng 2.4 Thành phần của phản ứng PCR - SSR 29

Bảng 2.5 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR – SSR 29

Bảng 3.1 Số phân đoạn DNA xuất hiện và số phân đoạn DNA đa hình đối với mỗi chỉ thị 37

Bảng 3.2 Bảng hệ số tương đồng di truyền của 18 mẫu chè nghiên cứu 39

Trang 9

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Chè là một loại cây công nghiệp dài ngày, được tìm thấy đầu tiên ở Trung Quốc, ngoài tự nhiên cây chè phân bố rộng rãi toàn bộ châu Á Lá chè được chế biến không chỉ để phục vụ đời sống con người, sản phẩm chè từ lâu

đã trở thành một trong những nét văn hóa đặc trưng của nhiều quốc gia, đặc biệt là các quốc gia vùng Đông Nam Á Trong chè chứa nhiều vitamin có giá trị dinh dưỡng và bảo vệ sức khỏe, có tác dụng giải khát, bổ dưỡng và kích thích hệ thần kinh trung ương, giúp tiêu hóa chất mỡ và ngăn ngừa sự phát triển của một số tế bào ung thư [43] Ngoài ra, cây chè còn mang lại nhiều lợi ích kinh tế xã hội như: giải quyết công ăn việc làm, đem lại nguồn thu nhập ổn định cho người dân, thúc đẩy quá trình công nghiệp hóa và hiện đại hóa nông thôn [15] Cây chè giữ tầm quan trọng đối với sức khỏe, tinh thần và nền kinh tế của xã hội Tuy nhiên, sự hiểu biết các quá trình sinh học ở mức

độ phân tử ở Việt Nam cũng như trên thế giới vẫn còn hạn chế

Kích thước hệ gen chè là rất lớn (khoảng 4 Gb) nên việc giải mã toàn

bộ hê gen đòi hỏi thời gian nhiều năm và chi phí ước tính hàng chục triệu đôla Ngày nay, để làm sáng tỏ các quá trình sinh học ở chè, các nhà khoa học cũng bắt đầu tập trung nghiên cứu cây chè ở mức độ phân tử.

Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về hệ gen chè ở mức độ phân tử, thông qua các chỉ thị: AFLP, RADP, RFLP, SSR Trong đó SSR là đoạn DNA vệ tinh có trình tự lặp lại đơn giản của trình tự nucleotide nào đó, nó phổ biến ở sinh vật và đặc biệt là các loài sinh vật nhân chuẩn Chỉ thị SSR với nhiều đặc tính như độ chính xác cao, phân bố rộng rãi trong hệ gen, tuân theo định luật Menden

Trong những năm gần đây, người ta tập trung nghiên cứu cây chè ở mức độ phân tử, đặc biệt việc phân tích cDNA/EST chè đã đem lại nguồn

Trang 10

thông tin khá lớn Khi so sánh các đoạn EST ở chè và các gen đã biết từ các loài khác cho thấy rằng chỉ thị SSR-EST được nghiên cứu cho tới nay được cho rằng có liên quan đến các quá trình sinh học

Trao đổi chất là những quá trình sinh hoá xảy ra trong cơ thể sinh vật với mục đích sản sinh nguồn năng lượng nuôi sống tế bào hoặc tổng hợp những vật chất cấu thành nên tế bào, đó là nền tảng của mọi hiện tượng sinh học Đối với thực vật nói chung và cây chè nói riêng thì quá trình trao đổi chất do nhân tố nào điều khiển đang được sự quan tâm của các nhà khoa học trên thế giới

Xuất phát từ những thực tế trên, chúng tôi đã thực hiện đề tài: “So s nh

tr nh tự nuc eotide của đo n SSR iên quan tới protein thực hiện chức năng trao đổi chất ở t số ẫu ch t i Th i Nguyên”

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Đánh giá được mối quan hệ di truyền của 18 mẫu giống chè nghiên cứu

- Xác định được sự khác biệt trình tự nucleotide của đoạn SSR có liên quan đến protein thực hiện chức năng trao đổi chất ở một số mẫu chè tại Thái Nguyên

3 N i dung nghiên cứu

Để đạt được mục tiêu đề tài chúng tôi tiến hành những nội dung nghiên cứu sau:

- Phân tích chỉ thị phân tử dựa vào kỹ thuật PCR-SSR và nghiên cứu quan hệ di truyền giữa các mẫu chè nghiên cứu

- Nghiên cứu và so sánh trình tự nucleotide của đoạn SSR có liên quan đến protein tham gia vào con đường trao đổi chất ở một số mẫu chè tại Thái Nguyên

Trang 11

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung về cây chè

1.1.1 Nguồn gốc và phân loại cây chè

Cây chè có tên khoa học là Camellia sinnesis (L) O Kumtze và thuộc

hệ thống phân loại sau [10] :

Chi chè (Camellia hoặc Thea)

Loài (Camellia sinensis)

Họ chè có 29 chi và khoảng 550 loài phân bố chủ yếu ở các nước nhiệt đới và cận nhiệt ở cả hai bán cầu, đặc biệt ở Đông và Đông Nam Á Ở Việt Nam có khoảng 11 chi với trên 200 loài

Nguồn gốc cây chè là vấn đề phức tạp, cho đến nay có nhiều quan điểm khác nhau về nguồn gốc cây chè, dựa trên những cơ sơ về lịch sử, khảo cổ học và thực vật học Một số quan điểm được nhiều nhà khoa học công nhận nhất là:

+ Cây chè có nguồn gốc ở Vân Nam Trung Quốc:

Nhiều công trình nghiên cứu, khảo sát trước đây cho rằng nguồn gốc của cây chè là ở Vân Nam – Trung Quốc, nơi có khí hậu ẩm ướt và ấm Theo các tài liệu Trung Quốc thì cách đây trên 4000 năm người Trung Quốc đã biết dùng chè làm dược liệu và sau đó là để uống [44] Năm 1753, Carl Van Linnacus, nhà thực vật học lần đầu tiên trên thế giới đã xác định Trung Quốc

Trang 12

là vùng nguyên sản của cây chè và định tên khoa học của cây chè là Thea sinensis, phân thành 2 thứ: Thea bohea và Thea viridis [17]

Theo Daraselia Gruzia (1989) thì các nhà khoa học Trung Quốc như: Schenpen, Jaiding, …đã giải thích cây chè mẹ ở Trung Quốc như sau: Tỉnh Vân Nam là nơi bắt đầu hàng loạt các con sông lớn đổ về các con sông ở Việt Nam, Lào, Campuchia, Mianma Đầu tiên cây chè mọc ở Vân Nam, sau đó hạt chè di chuyển theo đường nước đến các nước nói trên và sau đó lan dần ra các nơi khác, dọc theo cao nguyên Tây Tạng 11 , 16]

+ Cây chè có nguồn gốc ở vùng Atxam (Ấn Độ):

Năm 1823, Bruce đã phát hiện được cây chè dại lá to ở vùng Atxam (Ấn Độ), từ đó các học giả người Anh cho rằng: Nguyên sản của cây chè là ở vùng Atxam chứ không phải ở Vân Nam – Trung Quốc [11]

+ Cây chè có nguồn gốc ở Việt Nam:

Những công trình nghiên cứu của Djemukhatze (1961 – 1976) về phức catechin của lá chè từ các nguồn gốc khác nhau, so sánh về thành phần các chất catechin giữa các loại chè được trồng trọt và chè mọc hoang dại đã nêu lên luận điểm về sự tiến hóa sinh hóa của cây chè, trên cơ sở đó xác minh nguồn gốc của cây chè Djemukhatze đã kết luận rằng những cây chè mọc hoang dại từ cổ xưa, tổng hợp chủ yếu là (-) – epicatechin galat, ở chúng có khả năng tổng hợp (-) - epigalocatechin và các galat của nó để tạo (+) galocatechin chậm hơn Nghiên cứu các cây chè dại ở Việt Nam cho thấy chủ yếu là tổng hợp (-) – epicatechin và (-) – epicatechin galat (chiếm 70 % tổng các loại catechin) Khi

di thực các cây chè dại này lên phía Bắc với các điều kiện khí hậu khắc nghiệt hơn, chúng sẽ thích hợp dần với các điều kiện sinh thái bằng cách có thành phần catechin phức tạp hơn, cùng với tạo thành (-) epigalocatechin và các galat của nó Điều đó có nghĩa là trao đổi chất ở đây hướng về phía tăng cường quá trình hidroxil hóa và galil hóa Từ những biến đổi hóa sinh này của các cây chè

Trang 13

dại và cây chè được trồng trọt, chăm sóc cho phép đi tới một kết luận mới là

“Nguồn gốc cây chè chính là ở Việt Nam” Từ đó có sơ đồ tiến hóa cây chè thế

giới sau đây: Camellia Chè Việt Nam Chè Vân Nam lá to Chè Trung Quốc Chè Assam (Ấn Độ) [11], [16]

Tuy có sự khác nhau nhưng quan điểm nêu trên đều có sự thống nhất rằng: Cây chè có nguồn gốc từ Châu Á, nơi có điều kiện khí hậu nóng, ẩm

1.1.2 Đặc điểm sinh học của cây chè

Cây chè có bộ nhi m sắc thể lưỡng bội 2n 30, thuộc loại thân gỗ hoặc thân bụi và được trồng để thu lá làm nguyên liệu cho công nghiệp chế biến và mang một số đặc điểm sinh học sau đây 16]:

Đặc điểm hình thái

Thân: Thẳng và tròn, phân nhánh liên tục thành một hệ thống cành và

chồi Trên thân có mấu chia thành nhiều lóng

Cành: Do mầm dinh dưỡng biến đổi thành Trên cành chia ra làm nhiều

đốt, chiều dài đốt cành biến đổi từ 1 – 10 cm tùy theo giống và điều kiện sinh trưởng Tùy theo lứa tuổi mà màu sắc cành chè biến đổi từ màu xanh thẫm, xanh nhạt, màu đỏ, màu nâu và khi cành già có màu xám

Chồi: Mọc ra từ nách lá, chia theo sự biệt hóa của chồi có chồi dinh

dưỡng mọc ra lá và chồi sinh thực mọc ra nụ, hoa, quả Chia theo vị trí trên cành có: Chồi ngọn (đỉnh), chồi nách, chồi ngủ (trong cành)

Lá: Lá chè là loại lá hình đơn nguyên, có hệ gân lá rất rõ, rìa lá có răng

cưa, chiều dài từ 4 – 15 cm, rộng từ 2 – 5 cm Mặt phiến lá có thể nhẵn, lồi lõm, láng bóng Hệ gân lá hình mạng lông chim Lá chè có thể có hình thuôn, mũi mác, ô van, trứng gà, gần tròn Gốc lá nhọn, tròn đến tù; chóp lá nhọn tù

Lá chè thường thay đổi về hình dạng, màu sắc và kích thước tùy theo giống, điều kiện tự nhiên và điều kiện canh tác Các độ tuổi khác nhau của lá chè tạo

Trang 14

ra các các sản phẩm chè có chất lượng khác nhau do thành phần hóa học trong các lá này khác nhau

Hoa: Hoa chè là loại hoa lưỡng tính, trong hoa có 5 - 8 cánh màu trắng,

có khi lại hơi phớt hồng Tràng có 5 - 9 cánh màu trắng hay phớt hồng, bộ nhị đực trung bình có 200 - 300 cái; bao phấn có hai nửa bao, chia 4 túi phấn, hạt phấn hình tam giác màu vàng nhạt (khi chín màu hoàng kim) Bầu nhị cái có

3 - 4 ô, chứa 3 - 4 noãn, ngoài phủ lớp lông tơ, núm nhị cái chẻ ba Ở gốc bầu nhụy có tuyến mật làm thành một vòng tròn gọi là đĩa

Quả: Quả chè là một loại quả nang có từ 1- 4 hạt Quả chè có dạng hình

tròn, tam giác, vuông tùy theo số hạt Khi còn non quả chè có màu xanh, khi chín chuyển sang màu xanh thẫm hoặc nâu Khi quả chín vỏ nứt ra giải phóng các hạt chè Kích thước của hạt phụ thuộc vào giống, kỹ thuật canh tác Hạt chè có khối lượng từ 0,6 – 2g thường từ 1- 1,6g

Hạt: Hình cầu, bán cầu, tam giác tùy giống chè; vỏ sành thường màu

nâu, cứng, bên trong là lớp vỏ mỏng

Hệ rễ: Gồm r cọc (trụ), r dẫn (hay r nhánh, r bên) màu nâu hay nâu

đỏ và r hút hay r hấp thụ màu vàng ngà

Đặc t nh sinh sinh thái củ c ch

Nhiệt độ không khí thuận lợi cho sự sinh trưởng và phát triển của chè là

22 - 28oC, độ ẩm không khí tương đối thích hợp là 80 - 85 % Hàm lượng nước cần thiết cho cây chè biến động tùy từng giống chè Loại đất thích hợp cho trồng chè dày 60 – 100 cm; mực nước ngầm dưới 100 cm; độ chua pH: 4,5 - 5,5; tỷ lệ mùn 3 - 4 %

inh tr n v phát triển củ c ch

Sự phát triển của cây chè chia làm hai chu kỳ: Chu kì phát triển lớn gồm suốt đời sống cây chè từ khi hạt nảy mầm đến khi cây chết và chu kì phát

Trang 15

triển nhỏ bao gồm các giai đoạn sinh trưởng, phát triển lặp lại nhiều lần trong một năm

h nh ph n h học củ á ch

Thành phần hóa học có trong chè rất đa dạng bao gồm lượng lớn nước

và các thành phần hữu cơ và vô cơ khác như: nước; Flavanol (Epigallocatechin gallate (EGCG), Epicatechin gallate (ECG), Epigallo catechin (EGC), Epicatechin (EC), Catechin (C)); Cafein; Axit hữu cơ (citric, malic,…); Axit hữu cơ (citric, malic,…); xơ (cellulose, hemicellulose); protein và axit amin; lipid; khoáng; chất màu (carotenoid, chlorophyll) [42]

Đặc điểm di tru ền củ c ch

Chè là loại cây trồng quan trọng ở nhiều nơi trên thế giới nhưng cho đến nay, vẫn chưa có nhiều thông tin về hệ gen của cây chè Những nghiên cứu trước đây đã cho ra những kết quả rất khác nhau Năm 2001, nghiên cứu

của Hanson cho thấy kích thước bộ gen của cây chè Camellia sinensis vào

khoảng 15.298 Mbp [34] Tuy nhiên gần đây, nghiên cứu của Tanaka và Taniguchi (năm 2007) trên các giống chè Nhật Bản lại cho thấy kích thước bộ gen của cây chè được ước tính khoảng 4 Gbase [37] Nghiên cứu tế bào học các giống chè của Kondo (1979) đã xác định cây chè là loài thực vật lưỡng bội (2n = 30, số nhi m sắc thể cơ sở là 15) và kiểu nhân (karotype) biến đổi khác nhau giữa các giống chè [29]

Nói chung, các nhi m sắc thể của chè có kích thước nhỏ và có xu

hướng kết lại với nhau thành khối Giá trị r (tỷ lệ chiều dài giữa cánh dài và

cánh ngắn của nhi m sắc thể) của 15 cặp nhi m sắc thể trong khoảng 1,00 đến 1,9 Sự đồng nhất của các nhi m sắc thể lưỡng bội cho thấy đặc

điểm cùng nguồn (monophyletic) tất cả các loài thuộc chi Camellia

1.1.3 Giá trị của cây chè

Cây chè là loại cây công nghiệp lâu năm, mau cho sản phẩm, cho hiệu

Trang 16

quả kinh tế cao, có đời sống kinh tế lâu dài Chè trồng một lần, có thể thu hoạch 30 - 40 năm hoặc lâu hơn nữa Chè được dùng làm nước uống từ thời

xa xưa, đến nay đã trở thành một thức uống lý tưởng được nhân dân trên thế giới ưa dùng Có giá trị về nhiều mặt như: Thực phẩm, dược liệu, kinh tế xã hội, văn hóa…

iá tr v m t th c ph m: Trong chè có các thành phần hóa học giàu

chất dinh dưỡng, có tác dụng tốt đối với cơ thể con người như hỗn hợp tanin chè có khả năng giải khát, chữa một số bệnh đường ruột (tả l , thương hàn), các loại protein, vitamin, muối khoáng… Cafein và một số alkanoit khác là chất có thể kích thích hệ thần kinh trung ương, vỏ cầu đại não, giúp tăng

cường sự hoạt động của cơ thể, giảm mệt nhọc [43]

iá tr y học Nước chè tươi còn giảm được các quá trình viêm như

viêm khớp, viêm gan mãn tính, tăng cường tính đàn hồi của thành mạch máu Uống chè giảm nguy cơ tim mạch, chống lão hóa, chống nhi m độc Mới đây nhất, các nhà khoa học còn phát hiện ra chè còn có tác dụng chống khả năng gây ung thư của các chất phóng xạ Người ta đã trích ly các chất trong chè để điều chế các thuốc trợ tim, cầm máu, lợi tiểu… Những giá trị tiềm ẩn của cây

chè vẫn còn đang được quan tâm nghiên cứu [43]

iá tr v m t inh t h i Cây chè giữ vai trò quan trọng trong cơ

cấu cây trồng nông nghiệp, sản phẩm chè là mặt hàng xuất khẩu quan trọng của ngành nông nghiệp Việt Nam Sản xuất chè đã góp phần tạo công ăn việc làm, xóa đói giảm nghèo, tạo nguồn thu nhập ổn định cho người dân và thúc đẩy quá trình công nghiệp hóa, hiện đại hóa nông thôn, nhất là vùng Trung du

và miền núi [43]

Ngoài ra, trồng chè còn giúp phủ xanh đất trống đồi trọc, chống sói mòn đất, bảo vệ môi trường…

iá tr v m t v n hóa Lá chè được sử dụng không chỉ để chế biến

thức uống phục vụ nhu cầu của con người, mà từ lâu chè thành phẩm đã trở

Trang 17

thành nét văn hóa đặc trưng của nhiều quốc gia Uống chè là nét văn hóa lâu

đời của người Việt Nam, mang một giá trị thiêng liêng, cao quý trong đời

sống tinh thần của con người Thưởng thức chè là một thú vui tao nhã, tạo

được cảm hứng trong văn thơ, hội họa… Ở Việt Nam chè không thể thiếu

trong l nghi giao tiếp, giáo dục, cưới xin, ma chay, hội hè [5]

1.1.4 Đặc điểm một số giống chè tại Thái Nguyên

Thái Nguyên là một tỉnh Trung du miền núi, địa hình chủ yếu là đồi bát

úp, có độ dốc không lớn Với dạng địa hình này Thái Nguyên rất thuận lợi cho việc phát triển sản xuất chè Trước đây, vùng chủ yếu tập trung trồng các giống chè địa phương như Trung Du, nhưng năng suất không cao Vì vậy vài năm gần đây vùng đã nhập một số giống chè mới cho năng suất và sản lượng cao hơn, đồng thời có thể lai tạo một số giống mới… Dưới đây là một số

giống chè hiện trồng nhiều ở Thái Nguyên:

Hiện nay 60% diện tích trồng chè ở Thái Nguyên là giống Trung du Giống chè Trung du (hay còn gọi là chè ta) có đặc điểm búp nhỏ nên năng suất không cao Nhưng nếu biết cách chế biến, chè Trung du sẽ cho ra sản phẩm có chất lượng cao hơn hẳn các loại chè được làm từ các giống khác, để chế biến loại chè thượng hạng tôm nõn thì nhất thiết nên dùng búp chè Trung

du Chè Trung du thường rất đậm đà, cánh nhỏ đều, nước chè sánh, và hậu vị ngọt đậm, hương trà lưu lại lâu [14]

Chè Bát Tiên có nguồn gốc từ Đài Loan được nhập nội và trồng thành công ở một số tỉnh trung du miền núi phía Bắc Đặc điểm của chè Bát Tiên là cây to trung bình, tán đứng, mật độ cành hơi thưa, lá màu xanh nhạt, răng cưa

rõ, chóp lá hơi nhọn Do phù hợp với điều kiện thổ nhưỡng khí hậu, người dân lại có kinh nghiệm trồng chè nhiều năm nên khi đưa vào trồng chè Bát Tiên có tỷ lệ sống cao, cây sinh trưởng và phát triển tốt nhanh cho thu hoạch, năng suất khá [46]

Trang 18

Giống chè LDP1 và LDP2 là hai dòng chè được tạo ra từ phép lai hữu tính giữa cây mẹ là Đại Bạch Trà và cây bố là giống PH1 Qua quá trình chọn lọc, hai dòng này biểu hiện nhiều ưu điểm như lá to, búp có màu xanh và mật

độ búp dày, cây sinh trưởng khỏe và cho năng suất cao

Giống chè TRI777 có nguồn gốc từ Srilanka, được chọn lọc từ chè Shan Mộc Châu – Srilanka, có đặc điểm phân cành thấp, d giâm cành, hệ số nhân giống cao, chịu hạn tốt, chống chịu sâu bệnh trung bình Búp 1 tôm 2 lá:

60 – 75 gram, tanin 30,5 % Dùng để chế biến chè xanh Trồng thích hợp nhất

ở vùng núi thấp 100 – 500 m so với mực nước biển [15]

Hình 1.1 Một số giống chè trồng tại Công ty chè Sông Cầu tỉnh Thái Nguyên 1.2 Tình hình nghiên cứu hệ gen chè trên thế giới và ở Việt Nam

1.2.1 Tình hình nghiên cứu hệ gen chè trên thế giới

Việc nghiên cứu các giống cây được coi là tiền đề, là nguồn tư liệu tiên quyết không thể thay thế trong sản xuất nông nghiệp Trong quá trình sản xuất chè, giống có vai trò rất quan trọng trong việc nâng cao năng suất, sản lượng

và chất lượng sản phẩm Do đó các giống chè tốt không ngừng được quan tâm

Trang 19

nghiên cứu và triển khai vào trồng trên quy mô lớn

Ấn Độ là quốc gia đứng đầu thế giới về sản lượng chè do rất quan tâm nghiên cứu triển khai các giống tốt cho năng suất cao vào sản xuất Từ những năm 50 của thế kỷ XX Ấn Độ đã thành công trong việc chọn ra 110 giống chè tốt Công tác chọn dòng chè, kết hợp chọn dòng có sản lượng cao và có khả năng chống hạn, chống bệnh rất được chú ý ở Srilanca Nhờ đó đã tạo được các giống nổi tiếng như TRI777, TRI2043 Cũng theo Đỗ Ngọc Quỹ (2000) thì Ấn Độ, Nhật Bản, Srilanca, Trung Quốc, Liên Xô cũ…đã sử dụng công nghệ sinh học trong chọn giống chè tốt, sử dụng ưu thế lai để tạo ra giống chất lượng cao phục vụ cho sản xuất [17]

Trung Quốc là quốc gia sản xuất chè hàng đầu thế giới, các nhà khoa học Trung Quốc đã nghiên cứu và sử dụng giống chè tốt trong sản xuất từ rất sớm Ngoài những giống chè nổi tiếng từ lâu đời, hiện nay Trung Quốc có nhiều giống chè cho năng suất cao, chất lượng tốt để chế biến cả chè xanh và chè đen như: Phúc Vân Tiên, Hoa Nhật Kim, Hùng Đỉnh Bạch (Phúc Kiến), Phú Thọ 10 [14]

Nhật Bản đặc biệt quan tâm chú ý đến nghiên cứu chọn dòng, nhiều giống chè mới và cho năng suất cao đã được đưa vào sản xuất Trong đó có giống Yabukita được trồng phổ biến nhất chiếm tới 70% diện tích chè ở Nhật Bản [17]

Ngày nay, để có được các giống chè cho năng suất cao thì việc áp dụng các tiến bộ khoa học kỹ thuật vào quá trình sản xuất chè luôn được chú trọng đầu tư Bên cạnh đó, các nhà khoa học cũng bắt đầu tập trung nghiên cứu sâu hơn về cây chè ở mức độ phân tử Kích thước hệ gen của chè lớn, khoảng 4

Gb Do thiếu sự hiểu biết về nuôi cấy mô cũng như quá trình dịch mã xảy ra

ở chè nên rất ít các thông tin về trình tự hệ gen được biết đến Đến năm 2010, chỉ có 819 trình tự nucleotide, 12.664 đoạn trình tự biểu hiện (Expressed Sequence Tags - EST), và 478 protein từ chè được công bố trên ngân hàng gen Các nghiên cứu về chè chủ yếu tập trung vào các gen liên quan đến quá

Trang 20

trình trao đổi chất thứ cấp, hầu hết được phát hiện qua trình tự EST [32]

Trong nghiên cứu đa dạng di truyền, chỉ thị SSR được sử dụng rất phổ biến Tuy nhiên cho tới nay, số lượng chỉ thị SSR đặc hiệu cho cây chè còn rất ít, do đó các nghiên cứu ứng dụng chỉ thị SSR trong phân tích di truyền hỗ trợ công tác chọn giống chè còn khiêm tốn Sự đa dạng di truyền sẽ chỉ ra được mức độ sai khác giữa các giống chè nghiên cứu ở mức độ phân tử, đồng thời giải thích được tính đa dạng nguồn gen của cây chè

Chỉ thị RFLP đã được sử dụng trong phân tích quan hệ di truyền giữa các giống cây trồng và họ hàng hoang dại của chúng từ năm 1989 Ở cây chè, ít có những báo cáo về sử dụng chỉ thị RFLP trong nghiên cứu đa dạng di truyền Phần lớn các nghiên cứu sử dụng RFLP đến nay đều được thực hiện ở Nhật Bản [14]

Năm 1997, Viện tài nguyên di truyền thực vật quốc tế (IPGRI) đã công bố tiêu chuẩn đánh giá đặc điểm hình thái chè Dựa theo tiêu chuẩn này, một số nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền các giống chè bằng chỉ thị hình thái đã được thực hiện Chen và đtg (2005) đã sử dụng 33 chỉ tiêu hình thái để đánh giá

sự đa dạng di truyền của 87 giống chè ở tỉnh Vân Nam - Trung Quốc Kết quả cho thấy sự đa dạng rất cao giữa các giống chè, đặc biệt các đặc điểm của lá và hoa cho thấy sự đa dạng cao hơn so với các chỉ tiêu khác

Chỉ thị AFLP lần đầu tiên được áp dụng với cây chè Kết quả nghiên cứu với 32 dòng chè Kenia cho thấy sự phân nhóm của ba thứ chè Assam, Trung Quốc và Cambod, trong đó quần thể chè Trung Quốc có mức độ đa dạng di truyền cao hơn cả Các nghiên cứu sau này của Lee (2003) và Mishra (2004, 2009), cũng cho kết quả tương tự [19], [20]

Năm 2004, Saravanan và đtg đã công bố sự đa dạng di truyền của 26 dòng chè UPASI hoàn toàn dựa trên cơ sở catechin và các phân đoạn của chúng tại Ấn Độ

Trang 21

Singh và đtg vào năm 2006 đã sử dụng chỉ thị lặp trên đoạn 5S rDNA

để phân tích di truyền 28 dòng chè thuộc ba thứ chè Assam, Trung Quốc và Cambod, qua đó đã xác định được một số chỉ thị có thể phân biệt được các giống chè thuộc ba thứ chè này [30]

Năm 2008, Yao và đtg đã sử dụng chỉ thị ISSR nghiên cứu đa dạng di truyền 48 giống chè có nguồn gốc từ Trung Quốc, Nhật Bản, Kenia và ứng dụng trong phân tích quan hệ di truyền các cây chè lai (xác định bố mẹ), hỗ trợ công tác lai tạo giống chè tại Trung Quốc [41]

Ujihara và đtg (2009) cũng sử dụng một số cặp mồi SSR thiết kế cho

cây chè hoa Camellia japonica để nhận dạng di truyền các giống chè bản địa,

phục vụ yêu cầu dán nhãn các sản phẩm chè lưu hành trên thị trường Nhật Bản [38]

Năm 2009, Mishra và đtg đã sử dụng 8 tổ hợp mồi AFLP để phân tích

đa dạng di truyền của 29 giống chè chính của vùng Darjeeling (Ấn Độ) [30]

1.2.2 Tình hình nghiên cứu hệ gen chè Việt Nam

Ở nước ta, cây chè đang được coi là cây trồng chủ lực góp phần xóa đói giảm nghèo cho vùng sâu, vùng xa, vùng núi cao Qua nhập nội, lai tạo, trong những năm gần đây nước đã tạo được nhiều giống chè mới đem lại hiệu quả kinh tế cao

Qua nhiều năm nghiên cứu, Viện nghiên cứu chè đã ứng dụng thống kê sinh học qua phân tích tương quan dựa vào đặc trưng hình thái kết hợp với xem xét các đặc điểm phát triển bộ r , sinh trưởng sinh, màu sắc lá, sâu bệnh, khả năng giâm cành… để chọn nhanh các loại chè có triển vọng khi cây chè 2

- 3 tuổi Tại trung tâm nghiên cứu phát triển chè – Viện KHKT nông lâm nghiệp miền núi phía Bắc, bằng phương pháp gây đột biến bằng bức xạ đã chọn được một số cá thể chè sinh trưởng và phát triển tốt Ngoài ra, Viện còn

sử dụng consixin xử lý trên mầm chè giống PH1 trong thời gian 24 – 48h với

Trang 22

nồng độ 0,2 % cũng đã thu được kết quả bước đầu Ngoài ra, các nhà khoa học đã tiến hành nghiên cứu nhân giống bằng phương pháp nhân vô tính từ rất sớm như ghép, giâm cành và đã thu được những kết quả tốt [5]

Ngày nay, nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học trong chọn giống cây trồng đã được nhiều nhà khoa học quan tâm Việc sử dụng các chỉ thị phân

tử khác nhau được nghiên cứu và phát triển đã trở thành công cụ mạnh mẽ để phân tích đa dạng di truyền và xác định các mối quan hệ giữa các giống cây trồng, vật nuôi như RAPD, SSR, RFLP, AFLP Trong đó, chỉ thị SSR (Simple Sequence Repeats) là một loại chỉ thị được sử dụng khá phổ biến, chính xác và hữu hiệu trong nghiên cứu đa dạng di truyền, xây dựng bản đồ liên kết, phân lập gen, xác định quan hệ di truyền giữa các giống, dòng cây trồng [18]

Ở Việt Nam, việc ứng dụng các kĩ thuật sinh học phân tử vào việc đánh giá hệ gen của cây chè trong chọn tạo giống cây trồng còn là vấn đề mới mẻ Năm 2004, nhóm tác giả Nguy n Minh Hùng, Đinh Thị Phòng đã sử dụng kỹ thuật RAPD để nghiên cứu tính đa hình của một số dòng chè đột biến Năm

2010, Nguy n Thị Thu Hương và đtg đã sử dụng kỹ thuật này để phân tích sự

đa dạng trình tự hệ gen ở các dòng chè Shan [9] Một số giống chè trồng ở xã Tân Cương - vùng chè đặc sản chè nổi tiếng của Tỉnh Thái Nguyên cũng được phân tích bằng kỹ thuật RAPD bởi Hoàng Thị Thu Yến và đtg [19] Năm

2009, Trần Đức Trung và đtg đã nghiên cứu đánh giá sự đa dạng di truyền 96 giống/dòng chè trồng ở Việt Nam bằng kỹ thuật PCR-SSR [18] Với mục đích nhằm tìm kiếm chỉ thị phân tử có tiềm năng ứng dụng trong chọn giống chè, chúng tôi tiến hành phân tích chỉ thị SSR ở một số giống/dòng chè trồng ở các địa phương của tỉnh Thái Nguyên

1.3 Chỉ thị SSR và những ứng dụng trong nghiên cứu protein thực hiện chức năng trao đổi chất

1.3.1 Khát quát về chỉ thị SSR

Kỹ thuật PCR-SSR còn được gọi là kỹ thuật microsatellies (vi vệ tinh) Kĩ

Trang 23

thuật này được Litt và Luty phát triển năm 1989 dựa trên nguyên tắc của PCR [29]

Trong hệ gen sinh vật bậc cao, ngoài các đoạn trình tự (gen) mã hóa protein còn có các yếu tố DNA lặp lại, phân bố trên mọi nhi m sắc thể và có kích thước khác nhau Tùy thuộc vào sự phân bố trên hệ gen, các yếu tố DNA lặp lại được chia thành hai nhóm: Trình tự DNA lặp lại rải rác (ví dụ như các DNA transposon) và trình tự DNA lặp lại nối tiếp có kích thước khác nhau (VNTR-Variable Number of Tandem Repeat) [25] VNTR bao gồm hàng loạt các đơn vị trình tự (motif) lặp lại nối tiếp nhau và có mặt trên các nhi m sắc thể (kể cả nhi m sắc thể giới tính) Các VNTR được phân chia thành các nhóm khác nhau dựa trên chiều dài motif, số lần lặp lại của các motif cũng như vị trí của chúng trên các nhi m sắc thể [37], bao gồm DNA vệ tinh (Satellite DNA- các đoạn lặp dài từ 100 đến 300 bp), minisatellite (các đoạn lặp dài từ 10 đến 60 bp) và DNA vi vệ tinh (Microsatellite- các đoạn lặp ngắn

từ 1 đến 6 bp)

Theo Litt và Lutty (1989), vi vệ tinh có nhiều motif khác nhau, thường

có mức độ lặp lại thấp và biến đổi ở một locus nhất định, chính vì vậy số lượng alen ở mỗi locus vi vệ tinh là rất nhiều Các vi vệ tinh có thể được tìm thấy khắp nơi, ở vùng mang mã (exon) và không mang mã (intron) trên hệ gen nhân và cả hệ gen ngoài nhân (ti thể, lục lạp) Có nhiều danh pháp khác nhau được dùng để chỉ vi vệ tinh: Trình tự lặp đơn giản – SRS (Simple Repetitive Sequences), đoạn lặp trình tự đơn giản - SSR (Simple Sequence Repeats) hay đoạn lặp nối tiếp đơn giản - STR (Simple Tandem Repeat), trong số này, SSR là danh pháp được sử dụng phổ biến nhất [12]

Vi vệ tinh - SSR có số lượng motif rất phong phú, phân tán đều khắp

hệ gen và có mức độ đa hình rất cao Theo Jurka và Pethiyagoda (1995), với bốn loại base nitơ A-T-G-C, số lượng các motif SSR trên cấu trúc sợi đôi DNA

có thể lên đến 501 loại khác nhau, từ motif có một nucleotide (monomeric) đến motif có sáu nucleotide (hexameric) Motif phổ biến nhất ở hệ gen thực vật là

Trang 24

(A)n, (AT)n, (GA)n và (GAA)n Bên cạnh đa dạng về số lượng, sự sắp xếp các motif trong đoạn trình tự lặp cũng góp phần làm phong phú SSR trong hệ gen Dựa trên mức độ hoàn chỉnh của các motif lặp lại, đã phân chia các SSR thành ba nhóm khác nhau, bao gồm: (i) SSR lặp lại hoàn chỉnh (perfect repeats), có chứa một motif lặp lại liên tục không bị ngắt quãng; (ii) SSR lặp lại không hoàn chỉnh (imperfect repeat), chuỗi motif lặp lại bị gián đoạn bởi một hay một vài base không thuộc cấu trúc motif; (iii) SSR lặp lại phức hợp (compound repeat), là sự kết hợp xen kẽ có hoặc không có quy luật của hơn hai motif khác nhau [31]

Tính đặc hiệu cao: Các đoạn mồi SSR được thiết kế dựa trên vùng trình tự sườn có tính bảo thủ cao của các đoạn lặp SSR, do đó sản phẩm nhân gen của phản ứng SSR-PCR đặc hiệu và ổn định hơn các chỉ thị DNA ngẫu nhiên Bên cạnh đó, nhờ tính chất bảo thủ của vùng trình tự sườn mà các mồi SSR có thể được sử dụng chéo giữa các loài có quan hệ di truyền gần gũi [18]

Di truyền đồng trội và mức độ đa hình cao: Trải qua tiến hóa và các biến đổi di truyền, số lần lặp lại các motif SSR thay đổi rất nhiều và làm cho các đoạn SSR có chiều dài khác nhau Bởi vậy phản ứng SSR- PCR có thể phát hiện các alen khác nhau trong một locus SSR, qua đó phát hiện được các

cá thể đồng hợp tử/ dị hợp tử ở locus đó (chỉ thị đồng trội) [18]

Với nhiều ưu điểm, chỉ thị SSR được ưa chuộng nhất trong nghiên cứu đánh giá đa dạng hệ gen cũng như phân tích sự đa hình các gen chức năng ở chè Đến nay rất ít chỉ thị SSR được phát triển dựa vào hệ gen Chỉ thị SSR được xác định chủ yếu tập trung vào trình tự EST của các gen đơn bản Zhao

và đtg là nhóm nghiên cứu đầu tiên xác định được 24 chỉ thị SSR từ 2119 EST Năm 2009, nhóm nghiên cứu của Sharma đã thống kê có 2181 EST từ cơ sở dữ liệu NCBI, trong đó có 1223 gen có trình tự SSR từ 2 – 34 nuleotide Trong

109 gen phân tích nghiên cứu có chứa 120 SSR được xác định, 61 SSR lặp lại 2 nucleotide (50,8%), 37 lặp lại 3 nucleotide (30,8%), 8 lặp lại 4 nucleotide

Trang 25

(6,67%), 9 lặp lại 5 nucleotide (7,5%), 5 lặp lại 6 nucleotide (4,61%) [28] Theo thống kê của Ma và đtg (2010), ở chè có 6899 đoạn EST được công bố trên ngân hàng gen và có thêm 74 chỉ thị SSR-EST đượn nghiên cứu thực nghiêm [33] Năm 2012, nhóm tác giả Sahu thống kê được 12852 đoạn EST ở chè, theo tính toán lý thuyết có 1636 đoạn EST chứa 2371 SSR Nhóm nghiên cứu này cho rằng loại trình tự SSR lặp1nucleotide là phổ biến nhất (65,9%), tiếp theo là lặp 2 nucleotide (24,6%), lặp 3 nucleotide (7,8%), lặp 4 nucleotide (0,8%), lặp 5 nucleotide và 6 nucleotide (0,8%) Khi so sánh các đoạn EST ở chè với các gen đã biết chức năng từ các loài khác cho thấy hầu hết các chỉ thị SSR-EST liên quan đến các quá trình sinh học, thành phần cấu tạo tế bào và chức năng phân tử của gen ở chè Các EST-SSR cung cấp thông tin liên quan đến nhiều gen mã hóa các sản phẩm trao đổi, sự dịch mã, vận chuyển lipit, đáp ứng lại stress, protein bám GTP, Fe, S và nhiều chức năng khác Tuy nhiên, mối liên quan của các chỉ thị SSR-EST với các gen thực hiện các chức năng này ở chè vẫn chưa được nghiên cứu

1.3.2 Chỉ thị R iên qu n đến protein thực hiện chức năn tr o đổi chất

Nghiên cứu của Sharman (2009), Ma và đtg (2010) khi so sánh các đoạn EST ở chè với các gen đã biết trước từ các loài khác cho thấy hầu hết các chỉ thị SSR-EST được nghiên cứu cho đến nay được cho rằng có liên quan đến các quá trình sinh học, thành phần tế bào và chức năng phân tử ở chè Các chỉ thị SSR-EST liên quan đến quá trình sinh học ở chè bao gồm: quá trình trao đổi chất, protein đáp ứng lại stress, tổ chức tế bào Có 3 dạng chỉ thị SSR-EST liên quan đến thành phần tế bào là các đoạn SSR mã hóa protein tham gia cấu tạo màng tế bào, nội bào và ngoại bào Khi phân tích dưới dạng chức năng phân tử, các chỉ thị SSR-EST biểu hiện dưới các đoạn DNA mã hóa protein cấu trúc, protein bám, protein xúc tác Những chỉ thị SSR liên quan tới các protein thực hiện chức năng glyoxalase, tổng hợp sucrose, … [28], [33]

Trang 26

Sucrose là một disaccharide của glucose và fructose có công thức phân

tử là C12H22O11 Đây là sản phẩm chính của quá trình quang hợp, có vai trò bổ sung năng lượng cho sự sinh trưởng và phát triển của thực vật cũng như các sinh vật sống Sucrose tích lũy phần lớn ở các mô thực vật, giúp cho thực vật thích nghi tốt với các điều kiện bất lợi của môi trường như: Hạn, lạnh, mặn, và cường độ ánh sáng mạnh Sinh tổng hợp sucrose là một chu trình phức tạp

di n ra ở cytosol trong lá của cây trồng với sự tham gia của nhiều enzyme khác nhau, trong đó một một số enzyme chính có ảnh hưởng tới lượng sucrose được tổng hợp Các enzyme này có các dạng phản ứng: (1) tổng hợp sucrose như sucrose 6-phosphatephosphatase (SPS) hoặc sucrosesynthase (SS), (2) thủy phân sucrose như β- fructofuranosidase (Invertase), (3) vận chuyển các hexose tới tế bào chất và chuyển hóa lại thành sucrose như pyrophosphate fructose 6-phosphate 1-phosphatetransferase (PFP) Dưới đây là hình ảnh chu trình sinh tổng hợp sucrose với sự tham gia của các enzyme chính 3

Hình 1.2 Chu trình sinh tổng hợp sucrose với sự tham gia

của các enzyme chính Các enzyme liên quan đến quá trình sinh tổng hợp sucrose ở thực vật đã được nghiên cứu trên nhiều đối tượng gồm cả thực vật hai lá mầm và một lá mầm Gen mã hóa cho enzyme tổng hợp sucrose đã được phân lập từ nhiều

Trang 27

loại thực vật khác nhau và cho đến nay ngân hàng NCBI đã có thông tin về vài trăm trình tự có liên quan tới enzym tổng hợp sucrose của thự vật hai lá mầm như khoai tây, thuốc lá, củ cải đường, arabidopsis; cây một lá mầm như lúa, ngô, mía…[3] Ở chè, gen mã hóa cho enzyme tổng hợp sucrose đã được phân lập bởi Ma và đtg (2010) bằng chỉ thị SSR Nghiên cứu này chỉ ra rằng hàm lượng sucrose trong lá chè có ảnh hưởng tới chất lượng thực phẩm chè như hương thơm, độ ngậy 28] Ở Việt Nam chưa có nghiên cứu nào về gen

mã hóa cho protein có hoạt tính enzyme tổng hợp sucrose ở cây chè

Glyoxalase là một hệ thống bao gồm hai enzyme, lactoylglutathione lyase (glyoxalase I, GLX1) và hydroxyacylglutathione hydrolase (glyoxalase

II, GLX2), hai enzyme đồng giữ vai trò chuyển đổi các aldehyde α-keto vào hydroxyacids với sự có mặt của glutathione Glyoxalase được hình thành theo chuỗi phản ứng sau [24]:

Glutathione + Methylglyoxal Adduct hemithioacetal (R) lactoylglutathione

-S-Hệ thống này hình thành và phát triển để khử MG (methylglyoxal); đây

là một chất độc có khả năng gây đột biến, được hình thành từ sản phẩm phụ của quá trình chuyển hóa carbohydrate và lipid

Trang 28

Hình 1.3 Sơ đồ hệ thống enzyme glyoxilase

Glyoxalase đóng vai trò quan trọng và nhận tín hiệu tích cực như một chất chống ung thư GLX1 và 2 có thể ức chế sự hình thành các sản phẩm glycation do quá trình tăng đường huyết gây nên, do đó các enzyme này đóng vai trò ngăn ngừa bệnh đái tháo đường; đồng thời GLX2 được xác định như

gen đích của p63 và p73, và kích thích sự hoạt hóa phiên mã của p53 Hiện

nay hệ thống glyoxalase được nghiên cứu rộng rãi trong giới sinh vật, từ vi

sinh vật, động – thực vật và con người [24] Ở Plasmodium falciparum và các sinh vật đơn bào như Leishmania donovani, việc chống lại methyglyoxal

được thực hiện bằng cách tăng mức độ hoạt động của GLX1 Ở Người, gen

mã hóa cho GLX2 nằm trong ty thể Có năm giả định về gen GLX2 trong hệ

gen của cây Arabidopsis thaliana bao gồm: GLX2-1, GLX2-4, GLX2-5 được

dự đoán có nguồn gốc từ ty thể; sự hiện diện của GLX2 trong ty thể rất đáng

ngạc nhiên bởi GLX1 của cây Arabidopsis thaliana chỉ quan sát thấy trong

bào tương Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng GLX2 (GLX2-2) có trong ty thể

của cây Arabidopsis thaliana có cấu trúc và vai trò giống với GLX2 có trong

ty thể của tế bào chất con người [35] Do đó có thể ứng dụng những sản phẩm trao đổi chất từ GLX2 ở loài cây này để sản xuất thực phẩm chức năng phục

Trang 29

vụ sức khỏe con người Năm 2010 Ma và đtg đã chứng minh được trong hệ gen của chè có đoạn gen liên quan đến sự trao đổi glyoxalase [28] Ở chè, việc nghiên cứu hệ thống glyoxalase còn hạn chế; Trung Quốc là nước đầu tiên công bố trình tự gen mã hóa glyoxalase trên ngân hàng gen; Việt Nam chưa có nghiên cứu nào về gen mã hóa cho glyoxalase

Trang 30

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Nguyên liệu

Lá của 18 mẫu chè đặc sản đang được trồng tại một số vùng trồng chè ở Thái Nguyên được thu hái làm vật liệu nghiên cứu Danh sách tên và nguồn gốc các mẫu lá chè nghiên cứu được trình bày ở bảng 1 phụ lục 1

- Bộ kit dùng cho phản ứng PCR của hãng QIAGEN

- Bộ kit tinh sạch sản phẩm PCR (binding buffer, washing buffer, elusion buffer) – GeneJET Gel Extraction Kit của hãng Thermo Scientific

- Các hóa chất thông dụng khác như: Nước khử ion, ethanol, IPTG, TAE (Tris base, Axit acetic (CH3COOH), EDTA 0,5 M), nito lỏng…

2.1.3 Thiết bị

Các thiết bị, dụng cụ dùng trong nghiên cứu sinh học phân tử thuộc Khoa Khoa học Sự sống – Trường Đại học Khoa học, Viện Nghiên cứu hệ gen – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Trang 31

Bảng 2.1 Danh mục các thiết bị, dụng cụ được sử dụng

1 Máy soi gel với tia UV (USA) 1 Bình đá

2 Bể ổn nhiệt (Jeio Tech – Hàn

Quốc)

2 Bình tam giác các cỡ

3 Máy đo quang phổ (Thermo

4 Bể điện di ngang và bể điện di

đứng

4 Đầu côn các cỡ

5 Cân điện tử (Satorius – Đức) 5 Găng tay cao su

6 Lò vi sóng (Sharp, Malaysia) 6 Micropipet: 1 - 5 μl

7 Máy đo pH (Japan) 7 Micropipet: 5 - 10 μl

8 Máy PCR (Singapore) 8 Micropipet: 20 - 100 μl

10 Nồi hấp khử trùng (Đài Loan) 10 Micropipet: 100 - 1000 μl

11 Tủ lạnh nhiệt độ 4 0

C, - 20 0C (Italia)

11 Bình đựng nito lỏng

12 Máy ly tâm lạnh (eppendorf –

Đức)

12 Giấy bạc, parafilm…

2.2 Phương ph p nghiên cứu

2.2.1 Ph ơn pháp thu mẫu lá chè

Các mẫu lá chè tươi với phần búp non có 1 – 2 lá bánh tẻ (một tôm hai lá) được thu hái trực tiếp ngay tại các địa điểm lấy mẫu Các mẫu lá chè được rửa sạch, và tiến hành tách chiết DNA tổng số ngay

2.2.2 Ph ơn pháp tách chiết DNA tổng số từ lá chè

DNA tổng số từ lá chè được tách chiết theo kít GeneJET ™ Plant DNA

Trang 32

Genomic Purification Mini Kit của hãng Thermo

Lá chè tươi thu về rửa sạch sau đó tiến hành tách chiết ngay, quy trình

tách chiết DNA tổng số bằng kít bao gồm các bước cơ bản sau:

Bước 1: Dùng pipet hút 350 l lysis buffer A vào ống 1,5 ml vô trùng (dung dịch A bổ sung PVP đến nồng độ cuối cùng là 2 %) Lấy 100 mg mô lá tươi nghiền trong cối chày sứ với nitơ lỏng Chuyển nhanh bột mô đã nghiền mịn vào ống ép 1.5 có chứa 350 l lysis buffer A Vortex 10 – 20s để trộn đều

Chú ý : Chuyển mô đã nghiền nhanh chóng để tránh DNA bị biến tính Đảm bảo tất cả mô được trộn đều với đệm lysis buffer A, biến tính có thể xảy

ra với nguyên liệu còn sót trên thành ống Mô có thể sử dụng ngay để tách

DNA hoặc bảo quản ở - 70 C đến khi dùng

Bước 2: Bổ sung 50 l lysis buffer B và 20 µl Rnase A Trộn bằng vortex hoặc pipet Để mô có thể kháng lại với sự gián đoạn của cơ học, thêm

cát thủy tinh và vortex trong 1 phút

Bước 3: Ủ mẫu ở 65 C trong 10 phút, thỉnh thoảng đảo đều

Bước 4: Thêm 130 l dịch tủa đảo ngược ống 2 - 3 lần rồi đặt lên đá trong 5 phút

Bước 8: Bổ sung 500 l đệm rửa I (ethanol phải được bổ sung vào buffer I) vào cột ly tâm 10000v/p trong 1 phút, loại bỏ dịch và đặt cột trở lại ống

Bước 9: Thêm 500 l đệm rửa II, ly tâm 12000 v/p trong 6 phút, đổ

Trang 33

dịch (mở nắp 5 phút) Đặt cột trở lại ống, ly tâm 12.000 v/3 phút Chuyển cột vào ống 1.5 ml vô trùng

Bước 10: Để thu nhận DNA thêm 50 l Elution Buffer (hoặc H2O 2x

vô trùng), ủ trong khoảng 10 - 15 phút ở nhiệt độ phòng, sau đó ly tâm 10.000v/p trong 3 phút Thu dịch trong ống, đậy nắp, ghi nhãn

Bước 11: Thực hiện thu DNA lần thứ hai, thêm 50 l Elution Buffer (hoặc H2O 2x vô trùng) vào cột và đặt lên 1 ống 1,5 ml vô trùng khác

Bước 12: DNA tinh sạch có thể sử dụng hoặc bảo quản ở – 20 ºC

2.2.3 Ph ơn pháp điện di

2.2.3.1 Phương pháp điện di trên gel agarose

Nguyên tắc của phương pháp điện di là dựa vào đặc tính cấu trúc của axit nucleic Axit nucleic là các đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp

bề mặt nên khi chịu tác động của dòng điện một chiều chúng sẽ di chuyển từ cực âm về cực dương trong điện trường

Chúng tôi sử dụng phương pháp này để xác định DNA tổng số của 18 mẫu chè nghiên cứu DNA tổng số được điện di trên gel agarose 0,8 % ở điều kiện 110V/30 phút, chạy với đệm TAE 1X Sau khi điện di, bản gel agarose được nhuộm 10 phút trong dung dịch EthBr 0,5ng/ml, sau đó soi chụp bằng máy MultiDoc-It của hãng UVP

2.2.3.2 Phương pháp điện di trên gel polyacrylamide

Để phân tích đặc điểm di truyền các giống/dòng chè, sản phẩm PCR sẽ được điện di trên gel polyacrylamide 8% ở điều kiện 80V/90 phút, với đệm chạy là TBE 1X Sau khi điện di, bản gel polyacrilamide được nhuộm 10 phút trong dung dịch EthBr 0,5 ng/ml, sau đó soi chụp bằng máy MultiDoc-It của hãng UVP Thành phần gel polyacrylamide 8% (cho 2 bản gel kích thước 8cm x 7,3cm) được chuẩn bị như bảng 2.2

Trang 34

SSR-Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Trang 35

2.2.4 Phương pháp xác định hàm lượng và kiểm tra độ tinh sạch DNA tổng số

Tiến hành định lượng và kiểm tra độ tinh sạch của DNA tách chiết

được bằng cách đo quang phổ hấp thụ

Nguyên tắc: Dựa vào sự hấp thụ mạnh ánh sáng tử ngoại ở bước sóng

260 nm của các base purin và pyrimidin Giá trị mật độ quang của bước sóng

260 nm (OD260) của các mẫu cho phép xác định hàm lượng axit nucleic trong mẫu dựa vào mối tương quan: Một đơn vị OD260 tương ứng với nồng độ 50 ng/ l cho dung dịch chứa DNA sợi đôi

Nồng độ DNA (ng/ l) OD260 x 50 x hệ số pha loãng

Để kiểm tra độ tinh sạch của mẫu DNA tách chiết được, chúng tôi tiến hành đo thêm giá trị mật độ quang ở bước sóng 280 nm

Độ tinh sạch DNA OD260/OD280

dạng đặc tính và nguồn gốc của chè (Camellia sinensis) bằng chỉ thị SSR

Trang 36

Sử dụng cặp mồi SSR đƣợc tổng hợp tại hãng QIAGEN, thông tin về trình tự cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu đƣợc trình bày trong bảng 2.3

Bảng 2.3 Danh sách 14 cặp mồi SSR đƣợc sử dụng trong nghiên cứu

1 YS17 F: 5'- GGGGAATTTCAGACAGACAC -3'

R: 5' – GCCGTTCAGTGTAGTAGATCG -3'

(TC)25 [33]

2 YS27 F: 5’- GGGGATAGTACAAACACACAAC - 3’

R: 5’-GCTCCTCTTTCTTCACCACTT -3’

(GA)20 [33]

3 YS28 F: 5' - GTCCCCATTGCTCTTAGTTT - 3'

R: 5' - GACAATCATTGCCACCACAT- 3'

(TG)12(GA)13 [33]

4 YS34 F: 5'- GCCAAAATTCCATCTAGGG - 3'

R: 5' - TGCAACTCGTATGTGGACC - 3'

(TTC)18(GA)10 [33]

5 YTS46 F: 5’ - AACACCATAAGCTCATCTAC -3’

R: 5’ - ACTCCATTCACCGCTACTAT -3’

(GA)12 [28]

6 YS52 F: 5'- GAACCAACCCAGTCTATACTCC - 3'

R: 5' - AGCACACGCCATCCAATC - 3'

(GA)18 [33]

7 YTS64 F: 5’ - AGTTGGCTGAATCAGTCCCTT -3’

R: 5’ - GCTTAAATCACAATTCAAAGC -3’

(TTGTT)5 [28]

8 YS73 F: 5'- GTCAAGACGCCCACTACAGT -3'

R: 5' - GACTGTGTAACCTGCCAAGAC -3'

(ATG)12 [33]

9 YS78 F: 5'- CACCGCTTGACTAAAATGG - 3'

R: 5'- AAACTATCAACCGTATGGGC - 3'

(TTC)13 [33]

10 YS83 F: 5'- GAGGATTTGGGTTTGTGAAC -3'

R: 5' - TCATTCTCTCTGGCATCACC -3’

(TGG)9 [33]

11 YTS98 F: 5’ – TCACCACCTTCCCTTGATAG - 3’

R: 5’ - GCATTGGCAATATGAACATG - 3’

(AAAT)5 [28]

12 YTS104 F: 5’- AGTGAATATCCGTGGACAGC -3’

R: 5’ - ATGATAGCAAATCTCCAAAC -3’

(TC)10 [28]

13 YTS110 F: 5’ - TGCAGAAATGGCGTCGAGTA- 3’

R: 5’ - CTTGGAAAGGAACAGGCGTA -3’

(AG)11 [28]

14 YTS119 F: 5’- CACAAATAATCCACTCTTCC - 3’

R: 5’ - ACTATGATCGTAACGCACAG - 3’

(AG)10 [28]

Trang 37

Phản ứng PCR - SSR ở 18 mẫu chè nghiên cứu đƣợc thực hiện với thành phần đƣợc thể hiện ở bảng 2.4 với tổng thể tích mỗi phản ứng PCR là 12,5 l và chu trình nhiệt trong bảng 2.5

Bảng 2.4 Thành phần của phản ứng PCR - SSR Thành phần phản ứng Th t ch (l )

Trang 38

Dịch chứa DNA quan tâm (ví dụ, sản phẩm PCR) được điện di trên agarose 1 % và cắt lấy băng quan tâm Gel được làm sạch theo hướng dẫn của

bộ kit thôi gel do hãng Thermo cung cấp Sau đó, điện di trên gel agarose 0,8

% trong TAE 1X để kiểm tra sản phẩm

2.2.7 Ph ơn pháp xác định và phân tích trình tự

Trình tự nucleotide của đoạn SSR được xác định trên máy đọc trình tự nucleotide tự động ABI PRISM@ 3100 Advant Genetic Analyzer của hãng Ampplied Biosystem tại Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học

và Công nghệ Việt Nam Sử dụng bộ kit BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit - AppliedBiosystems (Mỹ) Kết quả đọc trình tự gen được phân tích bằng phần mềm Blast và Bioedit

Định dạng
Số trang	76
Dung lượng	1,94 MB