Sinh hoc phan tu

bảo quản ở -20o C để sử dụng cho các bước sau này... Kết quả điện di sản phẩm PCR của các mẫu cà chua bị bệnh xoăn vàng lá thu thập được. A ) PCR với cặp mồi chung đặc hiệu DNA-A của be[r]

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP

Đề tài:

ơ

Giảng viên hướng dẫn: TS.Hà Viết Cường

Bộ môn: Bệnh cây - khoa Nông học

Sinh viên thực hiện: Lê Văn Hải Lớp: Công nghệ sinh học – khóa 50

Phần I Mở đầu

1.1 Đặt vấn đề.

 Họ Geminiviridae là một trong những họ thực vật lớn nhất (289 loài) Họ virus này có 4 chi trong đó chi Begomovirus là chi quan trọng nhất về số lượng loài (185 loài) (Fauquet et al., 2008), cũng như các bệnh mà chúng gây ra trên cây trồng.

 Nhiều bệnh nghiêm trọng trên cây trồng được xác định là do begomovirus gây ra.

 Begomovirus gây bệnh tạo ra các triệu chứng giống nhau trên cây trồng, danh tính của chúng chỉ được xác định dựa trên phân tích phân tử.

 Begomovirus là các virus có bộ gien DNA sợi vòng đơn, kích thước khoảng 2.6 – 2.8 kb Begomovirus có thể có bộ gien đơn (gồm một phân

tử DNA-A) hoặc có bộ gen kép (gồm hai phân tử DNA-A và DNA-B).

Triệu chứng của bệnh xoăn vàng lá cà chua và

vector truyền bệnh

Hình 1 Triệu chứng bệnh xoăn

vàng lá cà chua (msucares.com)

Hình 2 Vector truyền bệnh là Bọ phấn (tabaci) (www.aaas.org)

Hình 3: triệu chứng do begomovirus gây ra trên một số đối tượng cây trồng và

cây dại (1) Cotton leaf curl virus (www.padil.gov.au), (2) Ludwigia yellow vein

Vietnam virus & Ludwigia yellow vein; (3) African cassava mosaic virus

(eastafrica.usaid.gov); (4) Siegesbeckia yellow vein Guangxi virus (www.bspp.org.uk); (5) Dolichos yellow mosaic virus (www.bspp.org.uk); (6) Okra yellow crinkle Mali virus (www.bspp.org.uk).

6 5

4

Hình 4 Tổ chức bộ gen phân tử DNA-A của begomovirus

CR = common region

DNA-A 2.6-2.8kb

• Tương tác với protein ký

chủ điều khiển chu kỳ tế

bào

• Tăng cường tái bản

• Tương tác với protein ký chủ

điều khiển chu kỳ tế bào

• Hoạt hóa phiên mã

• Lan truyền qua vector

• Xâm nhập nhân tế bào

 Trên thế giới đã có 50 loài begomovirus được xác định gây hại trên cà chua.

 Tại Việt Nam, bệnh xoăn vàng lá được xem là bệnh virus quan trọng nhất trên cà chua Có 3 begomovirus được phát hiện gây ra bệnh xoăn vàng lá

cà chua ở Việt Nam gồm tomato yellow leaf curl Kanchanaburi virus (TYLCKaV) và 2 virus được phát hiện ở miền Bắc là tomato leaf curl Vietnam virus (ToLCVV), tomato yellow leaf curl Vietnam virus (TYLCVNV).

 Việt Nam dường như là trung tâm đa dạng của begomovirus Nhưng hiện tại số lượng begomovirus phát hiện được mới 19 loài, trong đó chủ yếu là các loài cây dại Điều đó gợi ý rằng có nhiều loài begomovirus đang gây hại trên cà chua và các cây khác của Việt nam cần phải được xác định Chính vì vậy chúng tôi tiến hành đề tài:

“Xác định các virus thuộc chi Begomovirus (họ Geminiviridae) trên

cây cà chua và cây khác khu vực Hà Nội và vùng phụ cận”

Claude Fauquet, 2006

Hình 6: Tám trung tâm đa dạng của geminivirus Trung tâm

Đông Nam Á là vòng tròn C (Nawaz-ul-Rehman & Fauquet, 2009).

1 Điều tra, thu mẫu và xử lý mẫu, bệnh virus với triệu chứng điển hình do nhóm

begomovirus gây ra trên cây cà chua và một một số cây khác

2 Xác định sự có mặt của các begomovirus bằng PCR dùng mồi chung DNA-A BegoAFor1

& BegoAReV1

3 Xác định thành phần loài đã tìm ra ở miền Bắc Việt Nam sử dụng hai cặp mồi đặc hiệu

ToLCVV (ToLCVV-sp-F2 & ToLCVV-sp-R2) và TYLCVNV(TYLCVNV-sp-F1 & TYLCVNV-sp-R1).

4 Xác định sự có mặt của vệ tinh DNA-β virus bằng cặp mồi đặc hiệu BetaFor2 & BetaRev2.

5 Giải trình tự sản phẩm PCR của 1 - 2 mẫu cây cà chua.

6 Giải trình tự sản phẩm của 1 cây khác.

7 Phân tích trình tự có được sau giải trình tự.

Phần II: Vật liệu và phương pháp

nghiên cứu

2.1 Vật liệu nghiên cứu

 Các mẫu cà chua, các mẫu cây khác có triệu chứng nhiễm Các mẫu cà chua, các mẫu cây khác có triệu chứng nhiễm

bệnh xoăn vàng lá thu thập tại khu vực Hà Nội và vùng phụ cận.

 Các thiết bị và hóa chất cần thiết.

 Sử dụng các cặp mồi đặc hiệu cho begomovirus, tomato

yellow leaf curl Vietnam virus (TYLCVNV), tomato leaf curl Vietnam virus (ToLCVV) (Bảng 1).

 Sử dụng cặp mồi đặc hiệu DNA-β Sử dụng cặp mồi đặc hiệu DNA- là BetaFor2 & BetaRev2 là

Bảng 1: Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu (trên phân tử DNA-A)

Mồi Trình tự (5’ – 3’) Vị trí Kích thước

(bp) Tham khảo TYLCVNV-Sp-F1 TGTGTTACATATTCTGTGTTTTCC 1094-1117 1386 Mã Genebank

DQ641697 TYLCVNV-Sp-R1 AAATACATCAAAATCTGCAGAGAGC 2456-2480

ToLCVV-Sp-F2 GACCAGTCTGAAGGTGTGAGTTC 1254-1276 454 Mã Genebank

DQ641705 ToLCVV-Sp-R2 ACTCAAGCTATAAAGAATACCTAGAC 1683-1708

BegoAFor1 TGYGARGGiCCiTGYAARGTYCARTC* Xem hình 4 ~1200 Ha et al ., 2006 BegoARev1 ATHCCMDCHATCKTBCTiTGCAATCC*

(CEGPCKVQS) (IPT/A/SIF/VLCNP)

AV1

AV2

AC 3

AC 2

AC 1

AC 4

BegoAFor1 ~ 1.2 kb BegoARev1

DNA-A

Hình 7 Sơ đồ tổ chức bộ gien DNA-A (biểu diễn dưới dạng mạch thẳng) của begomovirus và vị trí

tương đối của cặp mồi BegoAFor1 và BegoARev1 Mũi tên dạng hộp biểu diễn vị trí và hướng của các

ORF Dãy chữ trong 2 ngoặc kép là các chuỗi axit amin bảo thủ tương ứng với 2 mồi BegoAFor1 và BegoARev1

* Y (C / T), R (G / A), H (A / C / T), M (A / C), B (C / G / T), D (A / G / T), K (G / T) và i = inosine

2.2 Phương pháp nghiên cứu.

NaOH (Wang et al., 1993), Phương pháp chiết dùng CTAB

(Doyle & Doyle (1987))

thập được, sử dụng các cặp mồi trong bảng 1, cặp mồi đặc

1.83, BioEdit 7.0.0, MEGA 4.0 và gói phần mềm thương mại DNASTAR.

Phần III Kết quả nghiên cứu

3.1 Kết quả điều tra thu mẫu

3.1.1 Kết quả điều tra bệnh trên cà chua

Bảng 2: Kết quả điều tra tỉ lệ bệnh xoăn vàng lá trên cây cà chua

TT Thời gian Địa điểm sinh trưởng Giai đoạn Tỉ lệ bệnh

1 18/09/2008 Nam Hồng – Đông Anh – Hà Nội Ra quả non 1.00%

2 21/09/2008 Cổ Bi – Gia Lâm – Hà Nội Ra hoa đợt 1 3.96%

3 24/09/2008 Tiên Sơn – Bắc Ninh Ra hoa đợt 1 0.52%

4 27/09/2008 Đa Tốn – Gia Lâm – Hà Nội Ra hoa đợt 1 0.77%

6 05/10/2008 Duyên Hà – Thanh Trì – Hà Nội Ra hoa đợt 1 0.50%

7 05/10/2008 Yên Mỹ – Thanh Trì – Hà Nội Ra hoa đợt 1 1.30%

Hình 8: triệu chứng điển hình cà chua mắc bệnh xoăn vàng lá thu thập được

Thanh Trì – Hà Nội Yên Mỹ - Hưng Yên

Thanh Trì – Hà Nội

Đa Tốn – Gia Lâm – Hà Nội

3.1.2 Kết quả thu thập và xử lý mẫu

 Đối với cà chua:

 Thu được 50 mẫu thông tin đầy đủ của các mẫu được trình bày ở (phụ lục 1).

 Đối với các cây khác:

 Thu được 64 mẫu có triệu chứng điển hình của bệnh do begomovirus gây ra.

 Đặc biệt chúng tôi thu được mẫu đu đủ có triệu chứng cuốn lá, cuống lá xoắn vặn.

 Tất cả các mẫu thu thập được đều được bảo quản cẩn thận Các mẫu này sau đó được chiết tách DNA tổng số bằng hai phương pháp và được bảo quản ở -20o C để sử dụng cho các bước sau này.

Hình 9:Triệu chứng xoăn lá trên mẫu đu đủ ((Yên Phú – Yên Mỹ - Hưng Yên(1, 2, 3)) và triệu chứng cây đu dủ nhiễm begomovirus của Trung Quốc (4)

1

2

3.2 Kết quả kiểm tra PCR các mẫu cây dại và đu đủ

 Sử dụng cặp mồi BegoAFor1 & BegoAReV1 để phát hiện sự có mặt của begomovirus nhiễm mẫu đu đủ và các cây dại.

1200bp

M 2 3 4

Hình 10: : Kết quả điện di sản phẩm PCR của đu đủ và các mẫu cây dại thu được M: Là

thang DNA (GeneRuler 1 kb, Fermentas) 1: Đu đủ; 2: rau mương; 3: Lữ Đằng; 4: Ké hoa vàng.

 Các mẫu kiểm tra đều nhiễm begomovirus trong đó 3 các virus nhiễm 3 mẫu rau mương, lữ đằng, ké hoa vàng đã được phát hiện tại Việt Nam (Cuong

Ha et al., 2008)

 Đặc biệt begomovirus nhiễm mẫu đu đủ lần đầu tiên được phát hiện ở Việt Nam sẽ được giải trình tự để làm rõ nguồn gốc phân loại virus này.

1

Hình 11 Kết quả điện di sản phẩm PCR của các mẫu cà chua bị bệnh xoăn vàng lá thu thập được A) PCR với cặp mồi chung đặc hiệu DNA-A của begomovirus B) PCR với cặp mồi

đặc hiệu DNA-A của ToLCVV C) PCR với cặp mồi đặc hiệu DNA-A của TYLCVNV M là

thang DNA (GeneRuler 1 kb, Fermentas) Các số từ 1 đến 19 là các mẫu cà chua (danh tính mẫu được trình bày ở bảng 3) Kích thước sản phẩm PCR cũng được chỉ rõ.

3.3 Kết quả kiểm tra PCR các mẫu cà chua

Bảng 3: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR

* Số thứ tự trong bảng này cũng là số thứ tự các mẫu ở Hình 11

1 Cặp mồi chung begomovirus phát hiện cả 19 mẫu đều nhiễm

4 Mẫu số 12 nhiễm cả 2 virus ToLCVV và TYLCVNV

5 Tìm ra 2 mẫu là mẫu số 9 và mẫu số 14 Không nhiễm cả hai

virus ToLCVV và TYLCVNV Tuy nhiên danh tính của các virus này chỉ có thể được xác định dựa trên phân tích trình

tự chuỗi gen của chúng

Hình 12: Kết quả điện di sản phẩm PCR của cặp mồi DNA-β

M: Maker; Giếng số 1 đến giếng số 19 tương ứng là các mẫu từ mẫu

số 1 đến mẫu số 19

sản phẩm có kích thước xấp xỉ 1375 bp đối với 6/19 mẫu nhiễm begomovirus.

đối với tính gây bệnh của begomovirus là hoàn toàn chính xác

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19

1375 bp

3.4 Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR từ gel agarose

Hình 13: Ước lượng hàm lượng sản phẩm PCR tinh chiết 3 giếng maker là

giếng M1: 12 µl, giếng M2: 6 µl, giếng M3: 3 µl các giếng 1, 2, 3 lần lượt là DNA của Mẫu số 9, Mẫu số 14, và Đu đủ (2 µl mỗi mẫu).

M1 M2 M3 1 2 3

1200 bp

này đủ để thực hiện phản ướng giải trình tự trực tiếp.

Mẫu số 9 (Đa Tốn – Gia Lâm – Hà Nội)

5’CACAGGATTTTGGTCAGGTGTTTAACATGTATGATAACGAGCCAAGTACAGCCACAGTGAAGAACGATAACAGAGATCGCTTTCAAGTTCTACGGC GTTTTCAGGCGACTGTTACTGGTGGTCAGTATGCAAGTAAGGAGCAAGCAATAGTTAGGAAGTTTATGAAGGTGAACAACCATGTGACGTATAATCAT CAAGAAGCTGCGAAGTATGACAATCACACAGAGAATGCTCTTTTGTTGTATATGGCATGTACTCATGCTAGTAATCCTGTGTATGCTACTTTGAAAAT

ATACATGATCACATGCTCTAATTACATTGTTAATACTAATTACACCCAAATTATCTAAATATTTCATACATTGAACCCTAAATACTCTTAAGAAACGC CAAGTCTGAGGACGTAAACGAGTCCAGATTTGGAATATTAGAAAACATTGGTGTATTCCCAACGCTTTCCTCAGGTTGTAATTGAATTGGACTTGTAT TGTGATGATGTCGTTGTTCATCAGAAATGGTCTCTCGTCGTGGCTGATTATCTTGAAATATAGGGGATTTTTGACCGTCCAGATATATACGCCACTCT

CCGTCTCCTCGTTGCTTTCTTGGCGTTGCGGTGTTGC 3’

Mẫu số 14 (Yên Mỹ - Thanh Trì – Hà Nội)

5’CCCAGGATTTTGGCCAGGTGTTTAACATGTATGATAATGAGCCGAGTACAGCTACTGTGAAGAATGACAACAGGGATCGTTTTCAAGTTCTCCGCC GTTTTCAAGCCACTGTTACTGGTGGCCAGTATGCAAGTAAGGAGCAAGCAATAGTCAGGAAATTCATGAAGGTGAATAACCATGTAACTTATAACCAT CAAGAGGCTGCGAAGTATGATAACCACACAGAAAATGCTTTGTTATTGTATATGGCATGTACTCATGCTAGTAATCCAGTGTATGCTACTTTGAAGAT

ATACATGAGACATTGCTCTAATTACATTATTGATGCTAATAACTCCTAAATTGTCTAAATACTTAATACATTGATATTTAAATACTCTTAAGAAACGC GAGGTCTGAGGATGTAAACGAGTCCAAACTCGGCAGATTAGAAAACATTGGTGTATCCCCAATGCTTTCCTCAGGTTGTAATTGAATTGGACTTGTAT TGTGATGATGTCGTGGTTCGTCAGAAATGGTCTCTCGTCGTGGCTGGTTATCTTGAAATATAGGGGATTTTTGACCGTCCAGATATATACGCCACTCT

CCGTCTCCTCGTAGCTTTCTTGGCGTTGCGGTGTTGC 3’

Đu đủ (Yên Phú – Yên Mỹ - Hưng Yên)

5’CACAGGATTTTGGTCAGGTGTTTAACATGTATGATAACGAGCCAAGTACAGCCACTGTGAAGAACGACAACAGAGATCGCTTTCAAGTTCTACGGC GTTTCCAGGCGACTGTTACTGGTGGTCAGTATGCAAGTAAGGAGCAAGCAATAGTTAGGAAGTTTATGAAGGTGAACAACCATGTGACGTATAATCAT CAAGAAGCTGCGAAGTATGACAATCACACAGAGAATGCTCTTTTGTTGTATATGGCATGTACTCATGCTAGTAATCCTGTGTATGCTACTTTGAAAAT

ATACATGATCACATGCTCTAATTACATTGTTAATACTAATTACACCCAAATTATCTAAATATTTCATACATTGAACCCTAAATACTCTTAAGAAACGC CAAGTCTGAGGACGTAAACGAGTCCAGATCTGGAAGATTAGAAAACATTGGTGTATTCCCAACGCTTTCCTCAGGTTGTAATTGAATTGGACTTGTAT TGTGATGATGTCGTGGTTCATCAGAAATGGTCTCTCGTCGTGGTTGGTTATCTTGAAATATAGGGGATTTTTGACCGTCCAGATATATACGCCACTCT

CCGTCTCCTCGTTGCTTTCTTGGCGTTGCGGTGTTGC 3’

3.5 Kết quả giải trình tự mẫu PCR

Hình 14 Trình tự nucleotide của sản phẩm PCR dùng mồi BegoAFor1/BegoARev1

Đoạn ORF AC3 mã hóa protein REn được bôi đậm với vị trí khởi đầu dịch mã cũng như hướng dịch mã được chỉ bằng mũi tên vuông

3.6 Kết quả tìm kiếm các trình tự tương đồng.

Tên

Max score

*

Query Coverage

†

Max Identity

‡

Mẫu số

9

Đu đủ

Mẫu số

14

AJ851005 Ageratum leaf curl virus -[G52] 1370 99% 97%

DQ641698 Erectites yellow mosaic virus 982 99% 86%

AY602166 Tomato yellow leaf curl Guangdong virus [G3] 975 95% 87%

AY602165 Tomato leaf curl Guangdong virus isolate [G2] 942 96% 86%

DQ641700 Papaya leaf curl China virus 935 96% 86%

Bảng 4: : Kết quả tìm kiếm các trình tự tương đồng dựa trên trình tự 819 nucleotide của 3 kết quả giải trình tự.

* Các điểm tìm kiếm blast (càng cao càng tương đồng), † phần trăm chiều dài đoạn chuỗi hỏi được tính điểm, ‡ mức tương đồng của chuỗi hỏi với các chuỗi trên Genbank

Bảng 5: Kết quả tìm kiếm các trình tự tương đồng dựa trên trình tự của 3 gen AC3 của 3 kết quả giải trình tự

Query Coverage

†

Max Identity

‡

AC3

Mẫu số 9

AC3

Đu đủ

AC3

Mẫu số 14

AJ851005 Ageratum leaf curl virus -[G52] 681 100% 97% EU365686 Tomato yellow leaf curl China virus-Dali198, 515 100% 89% AM260703 Tomato yellow leaf curl China virus Y295 502 100% 88% AJ319674 Tomato yellow leaf curl China virus-Tb[Y5], isolate Y5 500 100% 88% EF011559 Tomato yellow leaf curl China virus-[YN72], 499 91% 90%

* Các điểm tìm kiếm blast (càng cao càng tương đồng), † phần trăm chiều dài đoạn chuỗi hỏi được tính điểm, ‡ mức tương đồng của chuỗi hỏi với các chuỗi trên Genbank

3.7 Kết quả phân tích trình tự nucleotide

Bảng 6: Mức tương đồng nucleotide dựa trên so sánh đoạn 819 nts của 3 mẫu begomovirus từ nghiên cứu này với đoạn tương ứng của 41 chuỗi virus trên GenBank

Tiếp Bảng 6

Bảng 7: Mức tương đồng nucleotide dựa trên so sánh đoạn trình tự gen AC3 của 3 mẫu

begomovirus từ nghiên cứu này với đoạn tương ứng của 41 chuỗi virus trên Genbank

Kết quả so sánh mức tương đồng của các gen AC3

Tiếp Bảng 7

Isolate 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 PaLCuCNV.FQ1.TQ [1] ID

Ghi chú: Số thứ tự từ 1 đến 10 ở hàng trên cùng tương ứng với số thứ tự isolate (số trong ngoặc vuông) ở cột isolate ID là identical (giá trị tương đồng của một isolate với chính nó và luôn bằng 1)

Bảng 8: Mức tương đồng nucleotide của 11 isolate PaLCuCNV (dựa trên đoạn 819 nts)

3.8 Kết quả so sánh mức tương đồng nucleotide của 11 isolate PaLCuCNV (dựa trên đoạn 819 nts)

Hình 15: Cây phả hệ dựa trên phân tích đoạn 819 nts của 3 mẫu virus phân lập từ nghiên cứu này và đoạn tương ứng của 41 chuỗi virus trên GenBank Các chuỗi được

nắn bằng phần mềm Clustal X Khoảng cách di truyền và cây phả hệ được xây dựng dùng phần mềm MEGA 4.0 Giá trị bootraps (%) với 1000 lần lặp lại được chỉ rõ ở gốc các nhánh Thanh (bar) thể hiện khoảng cách di truyền bằng 0.05 Danh tính virus được trình bày ở Bảng 6

3.9 Kết quả xây dựng và phân tích cây phả hệ

Hình 16: Cây phả hệ dựa trên phân tích trình tự nts của các gen AC3 của

3 mẫu virus phân lập từ nghiên cứu này và đoạn tương ứng của 41 chuỗi virus trên GenBank Các

chuỗi được nắn bằng phần mềm Clustal X Khoảng cách di truyền và cây phả

hệ được xây dựng dùng phần mềm MEGA 4.0 Giá trị bootraps (%) với 1000 lần lặp lại được chỉ rõ ở gốc các nhánh Thanh (bar) thể hiện khoảng cách

di truyền bằng 0.05 Danh tính virus được trình bày ở Bảng 7

Phần IV: Kết luận và kiến nghị

1 Điều tra tỉ lệ bệnh.

đông là không cao và tại các vùng có sử dụng giống kháng có tỉ

lệ bệnh thấp hơn so với vùng không sử dụng giống kháng.

2.Tính đặc hiệu của cặp mồi chung cho phân tử DNA-A của begomovirus

khả năng phát hiện ra begomovirus trên cây cà chua cũng như các cây khác.

3.Tính đặc hiệu của cặp mồi đặc hiệu ToLCVV và TYLCVV

và phân biệt 2 virus ToLCVV và TYLCVNV

4.1 Kết luận