Luận văn khảo sát đặc tính sinh học phân tử của một số chủng virus viêm gan vịt cường độc phân lập được trên đàn vịt ở một số địa phương và so sánh với chủng virus vacxin DH EG 2000

luận văn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-
-

LÊ VĂN BIÊN

KHẢO SÁT ðẶC TÍNH SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA MỘT SỐ CHỦNG VIRUS VIÊM GAN VỊT CƯỜNG ðỘC PHÂN LẬP ðƯỢC TRÊN ðÀN VỊT Ở MỘT SỐ ðỊA PHƯƠNG VÀ SO SÁNH VỚI CHỦNG VIRUS VACXIN DH – EG – 2000

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

Chuyên ngành : Thú y

Mã số : 60.62.50

Người hướng dẫn khoa học : TS NGUYỄN BÁ HIÊN

HÀ NỘI – 2011

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu nêu trong luận văn là trung thực, do chính tôi thực hiện và chưa từng ñược công bố hay bảo vệ trong một học vị nào

Tôi xin cam ñoan rằng, mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn này ñã ñược cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñã ñược ghi rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày 8 tháng 9 năm 2011

Tác giả luận văn

Lê Văn Biên

LỜI CẢM ƠN

Sau thời gian học tập và nghiên cứu, ñến nay tôi ñã hoàn thành khóa học Nhân dịp hoàn thành luận văn thạc sỹ nông nghiệp chuyên ngành Thú y cho phép tôi ñược bày tỏ lòng biết ơn chân thành, sâu sắc tới các Thầy, Cô giáo

Xin ñược gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất ñến Thầy TS Nguyễn Bá Hiên,

Bộ môn Vi sinh vật – Truyền nhiễm – Khoa Thú y – Trường ðH Nông Nghiệp

Hà Nội, người thầy ñã tận tình hướng dẫn trực tiếp và tạo mọi ñiều kiện thuận lợi cho tôi ñược học tập, thực hành thí nghiệm và giúp ñỡ tôi hoàn thành ñề tài nghiên cứu này

ðồng thời tôi cũng bày tỏ sự biết ơn ñến các Thầy, Cô trong bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm - Khoa Thú y – Trường ðH Nông Nghiệp Hà Nội và các anh chị phòng Thí nghiệm trung tâm Khoa Thú y (B213 & B214) ñã nhiệt tình giúp ñỡ và tạo mọi ñiều kiện giúp tôi hoàn thành ñề tài một cách tốt nhất

Cuối cùng tôi muốn bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc ñến cơ quan, những người thân trong gia ñình, bạn bè ñã luôn ñộng viên, giúp ñỡ tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện ñề tài nghiên cứu

Xin trân trọng cảm ơn!

Hà nội, ngày 8 tháng 09 năm 2011

Học viên

Lê Văn Biên

2.6 Tình hình nghiên cứu bệnh viêm gan vịt trên thế giới và việt nam 24

3 NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

4.1.2 Nghiên cứu biến ñổi bệnh lý của phôi vịt khi phân lập virus 50

4.2 Kết quả tách chiết rna tổng số 52

4.5 Kết quả giải trình tự nucleotide và axit amin của gen kháng

nguyên vp1 ở các chủng virus viêm gan vịt phân lập ñược và

4.6 So sánh sự ñồng nhất nucleotide, sự tương ñồng amino acid của

vùng gen vp1 giữa các chủng virus viêm gan vịt cường ñộc nb,

CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT

DHV Duck Hepartitis Virus

DNA Acid Deoxyribonucleic

RNA Acid Ribonucleic

VP Viral Protein

PCR Polymerase Chain Reaction

RT-PCR Revese Transcription- Polymerase Chain Reaction

EDTA Ethylen Dimine Tetra Acetic Acid

dNTP Deoxy Nucleotide Triphosphate

ddNTP Dideoxy Nucleotide Triphosphate

X-gal 5-Bromo- 4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside Taq Polymerase Thermus aquaticus polymerase

LB Luria Bertani-agar

UTR Untranslated Region

cs Cộng sự

tr Trang

4.3 Tỷ lệ (%) ñồng nhất về nucleotide (trên ñường chéo) và tương

ñồng axit amin (dưới ñường chéo) giữa các chủng virus viêm gan vịt cường ñộc NB, DN1, NC và chủng virus vacxin DH-EG-

DANH MỤC HÌNH

2.1 Tư thế chết ñiển hình của vịt khi bị nhiễm virus viêm gan vịt (a)

gen VP1 (714bp) và chiến lược giải mã gen VP1 của virus viêm

3.2 Sơ ñồ qui trình nghiên cứu, lưu giữ và giải mã vùng gen VP1 của

cường ñộc viêm gan vịt DN1, DN2 và NB trên thạch agarose

4.4 Kết quả nuôi cấy vi khuẩn tái tổ hợp trên ñĩa thạch (LB-agar

1,5%) có chứa kháng sinh Kanamycin và X-gal, bao gồm các

4.5 Kết quả tách dòng vùng gen VP1 của virus viêm gan vịt ñược

ñiện di kiểm tra trên thạch agarose 1,2%, các sản phẩm DNA

4.6 Giản ñồ giải trình tự (chromatogram) thành phần nucleotide của

vùng gen VP1 virus viêm gan vịt của các chủng lần lượt là DN2, DN1,

NB, HY, DH-EG-2000 và NC Các nucleotide tiếp nhận thuốc nhuộm huỳnh quang (fluorescent dye), khi ñọc bằng tia laze cho hiển thị Adenine có màu ñỏ (red), Thymine có màu xanh nước biển (blue), Guanine có màu xanh lá cây (green) và Cystosine có

4.7 Trình tự Nucleotit và axit amin tương ứng của vùng gen VP1 của

các chủng virus viêm gan vịt lần lượt là DN2, DN1, NB, HY,

1 MỞ ðẦU

1.1 ðặt vấn ñề

Việt Nam là một nước ñang phát triển với ngành nông nghiệp luôn giữ vai trò then chốt nhằm cung cấp lương thực - thực phẩm cho người tiêu dùng trong nước và từng bước xuất khẩu Trong ñó ngành chăn nuôi gia cầm, ñặc biệt ngành chăn nuôi vịt trở thành ngành sản xuất hàng hóa quan trọng góp phần vào chương trình xóa ñói giảm nghèo cho bà con nông dân

Xuất phát từ những ñặc ñiểm riêng biệt về ñịa hình và tập quán canh tác ñiều kiện thuận lợi cho việc chăn thả tự nhiên nên vịt là loài thủy cầm ñược người nông dân ưa chuộng vì chúng dễ nuôi, qui mô ñàn ña dạng phù hợp với tập quán chăn nuôi nhỏ lẻ Tuy nhiên song song với việc phát triển của ñàn vịt thì dịch bệnh xảy ra ngày càng nhiều và diễn biến rất phức tạp Một trong những bệnh thường gặp và gây thiệt hại kinh tế cho người chăn nuôi phải kể ñến bệnh viêm gan vịt, bệnh chỉ xẩy ra ở vịt con dưới 6 tuần tuổi nhưng thường thấy ở vịt con từ 1 – 3 tuần tuổi mà nặng nhất lại ở vịt con từ 1 – 7 ngày tuổi với tỷ lệ ốm, chết lên tới 95 - 100%

Tuy vậy những nghiên cứu về bệnh viêm gan vịt do virus ở nước ta chưa nhiều, ñặc biệt là nghiên cứu về hệ gen của các chủng virus thuộc các vùng khác nhau ở nước ta Các nghiên cứu chỉ ra rằng hệ gen của virus gây bệnh viêm gan vịt chứa axit ribonucleic (RNA), sợi ñơn dương có ñộ dài khoảng 7600 – 7700 Nucleotide Trong hệ gen của virus viêm gan vịt thì vùng ñược quan tâm nhiều nhất là vùng gen mã hóa cho protein cấu trúc VP1 Vùng gen này ñã ñược chứng minh là gen kháng nguyên thiết yếu, nó vừa quyết ñịnh tính kháng nguyên, vừa quyết ñịnh tính gây bệnh của virus (Mulder và cs 2000)

Mặt khác, các nghiên cứu gần ñây về hệ gen và sinh học phân tử phân loại virus ñều cho thấy virus viêm gan vịt thuộc về một nhóm mới trong họ

Picornaviridae; hơn nữa, ñã có biến ñổi ñể tạo nên những genotype và serotype khác biệt ðồng thời, các nghiên cứu này cũng xác ñịnh virus viêm

gan vịt không còn thuộc chi Enterovirus hoặc ít nhất ñã có những biến chủng,

khiến cho virus không còn có những ñặc tính vốn có trước ñây như virus viêm gan vịt cổ ñiển Tại Việt Nam, rất có thể virus viêm gan vịt cũng bị biến ñổi tạo nên genotype, serotype thuộc nhóm mới như các nghiên cứu nước ngoài

ñã xác ñịnh Tuy có rất nhiều nghiên cứu về dịch tễ học và có rất nhiều chủng virus viêm gan vịt ñược phân lập nhưng chưa có nhiều nghiên cứu sâu sắc về ñặc tính sinh học phân tử gen kháng nguyên VP1 và hệ gen virus viêm gan vịt Hiện nay bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm trường ñại học nông nghiệp – Hà Nội ñang có chủng virus nhược ñộc viêm gan vịt DH – EG – 2000 Chủng virus trên ñã ñược sử dụng ñể bước ñầu sản xuất vacxin bước ñầu vacxin ñã ñược nghiên cứu về hiệu lực bảo hộ và cho kết quả tốt Vì vậy ñể ñưa vacxin viêm gan vịt chế từ chủng DH – EG – 2000 vào phòng bệnh ở nước ta thì việc xác ñịnh sự tương ñồng của gen kháng nguyên giữa chủng virus vacxin và các chủng virus cường ñộc gây bệnh ở Việt Nam có ý nghĩa thực tiễn rất lớn

Xuất phát từ thực tế trên chúng tôi tiến hành ñề tài:

“Khảo sát ñặc tính sinh học phân tử của một số chủng virus viêm

gan vịt cường ñộc phân lập ñược trên ñàn vịt ở một số ñịa phương và so sánh với chủng virus vacxin DH – EG – 2000”

1.2 Mục tiêu nghiên cứu của ñề tài

- Phân lập ñược một số chủng virus cường ñộc viêm gan vịt trên ñàn vịt tại một số ñịa phương

- Giải trình tự sắp xếp nucleotide của phân ñoạn gen VP1 của chủng virus vacxin DH-EG-2000 và các chủng viêm gan vịt cường ñộc phân lập ñược

- So sánh các ñặc tính sinh học phân tử của một số chủng virus viêm gan vịt cường ñộc với chủng virus vacxin DH – EG – 2000

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Bệnh viêm gan virus ở vịt

Bệnh viêm gan vịt do virus (Duck Virus Hepatitis - DVH) là một bệnh

truyền nhiễm cấp tính xảy ra ở vịt con 1- 6 tuần tuổi, mẫn cảm nhất là vịt con dưới 3 tuần tuổi Bệnh lây lan rất nhanh với tỷ lệ chết cao, có khi lên ñến 95 – 100% toàn ñàn Bệnh do một loại virus viêm gan vịt nhóm A, thuộc họ Picornaviridae gây ra Trước ñây, virus viêm gan vịt ñược xếp loại dựa vào mối quan hệ về huyết thanh học, bao gồm 3 type khác nhau là: virus viêm gan vịt type I (DHV-1), type II(DHV-2) và type III(DHV-3) Phổ biến hơn cả là virus viêm gan vịt type I, virus viêm gan vịt type II và type III mới ñược tìm thấy ở Anh và Mỹ, gây tỷ lệ chết không ñáng kể (Woolcock, 2003)

Hiện nay, với sự phát triển của sinh học phân tử, các nghiên cứu sâu về gen/hệ gen, cũng như nguồn gốc phả hệ của các chủng virus ñã xác ñịnh virus gây bệnh viêm gan vịt trên thế giới hiện nay gồm có 3 genotype khác nhau là genotype I (DHAV-1), genotype II (DHAV-2), genotype III (DHAV-3) (Stanway và cs, 2005; Tseng và cs, 2007; Ding và Zhang, 2007)

Bệnh có biểu hiện ñặc trưng: Vịt chết nhanh với tỷ lệ chết rất cao và chết ở trạng thái ñặc biệt ñầu ngoẹo về một bên, 2 chân duỗi thẳng Mổ khám thấy gan sưng, xuất huyết lốm ñốm trên gan (Nguyễn ðường, 1990)

2.1.1 Sơ lược về lịch sử phân bố bệnh

Bệnh viêm gan do virus ở vịt ñược Levine và Hofstad phát hiện lần ñầu tiên vào mùa xuân năm 1945 tại Mỹ, bệnh xảy ra trên ñàn vịt con một tuần tuổi nhưng chưa phân lập ñược mầm bệnh (Levine, Hofstad, 1945) Năm

1949 Levine và Fabricant theo dõi ñược bệnh này trên ñàn vịt trắng Bắc Kinh ñược nuôi tại ñảo Long (Mỹ) và vào năm 1950 ñã phân lập ñược virus gây bệnh này bằng phương pháp nuôi cấy trên phôi gà (Levine, Fabricant, 1950)

Năm 1956, bệnh ựược phát hiện ở bang Massachusetts, Ilinois và Michigan, sau ựó bệnh xảy ra trên khắp nước Mỹ

Năm 1965, bệnh viêm gan vịt xảy ra ở Norfolk Ờ Anh trên những ựàn vịt con ựã ựược tiêm phòng vacxin nhược ựộc viêm gan vịt type I Bằng phương pháp bảo hộ chéo trên ựàn vịt ựã phân lập ựược virus viêm gan vịt type II khác hẳn với virus viêm gan vịt type I Virus type II chỉ gây bệnh ở Anh Năm 1968 virus viêm gan vịt type I ựã gây bệnh trên khắp thế giới trong

ựó có một số nước Châu Á như Trung Quốc, Hàn QuốcẦ(Hwang J, 1965)

Trên ựảo Long ( Mỹ), bệnh viêm gan vịt ựã xảy ra trên ựàn vịt con ựược dùng vacxin nhược ựộc type I, bệnh xảy ra nhẹ hơn so với bệnh viêm gan vịt của virus type I, tỷ lệ chết của vịt con hiếm khi vượt quá 30% Haider

và Calnek ựã ựặt virus viêm gan vịt type III (Haider, Calneck, 1979)

Ở Việt Nam, Trần Minh Châu và cộng sự ựã ghi nhận có bệnh viêm gan vịt do virus vào năm 1978 nhưng chưa phân lập ựược Từ năm 1979 ựến năm 1983, bệnh xẩy ra ựã ựược ghi nhận làm chết nhiều vịt ở các ựịa phương như ở đông Anh Ờ Hà Nội ( 1979 Ờ 1980), Gia Lâm Ờ Hà Nội ( 1983) ựã làm chết hàng ngàn vịt (Trần Minh Châu, Lê Thu Hồng, 1985)

Năm 2004, Nguyễn Phục Hưng qua ựiều tra 10 huyện thuộc 4 tỉnh và thành phố Hà Nội, Hưng Yên, Bắc Ninh và Hà Tây, thấy bệnh xảy ra ở vịt con dưới 40 ngày tuổi, ựặc biệt bệnh xẩy ra nhiều và có tỷ lệ chết cao ở lứa tuổi 1- 7 ngày tuổi Hằng năm, bệnh viêm gan vịt vẫn xảy ra thường xuyên Tùy từng thời ựiểm mà bệnh xuất hiện ở các vùng ựịa lý khác nhau (Nguyễn Phục Hưng, 2004)

2.1.2 Loài mắc bệnh

Trong tự nhiên virus viêm gan vịt type I chỉ gây bệnh cho vịt con Vịt trưởng thành bị nhiễm virus không có triệu trứng lâm sàng, không ảnh hưởng ựến sản lượng trứng Gà, gà tây và các ựộng vật khác không mắc bệnh Gia cầm non một vài ngày tuổi hay vài tuần tuổi vẫn có thể bị nhiễm bệnh và con

vật có biểu hiện triệu trứng, bệnh tích và có kháng thể trung hòa trong máu

Gà con có thể bị nhiễm bệnh, bệnh thể hiện không ñiển hình và có thể truyền virus cho con khác (Nguyễn ðức Lưu, Vũ Như Quán, 2002)

Trong phòng thí nghiệm, dùng virus viêm gan vịt type I gây bệnh cho vịt con bằng cách cho uống hoặc tiêm phúc mạc, vịt có bệnh tích như gan sưng, xuất huyết lốm ñốm trên gan, túi mật sưng, lách sưng và có thể phân lập ñược virus từ gan vịt 17 ngày sau khi cho uống

Các loài khác như thỏ, chuột lang, chuột nhắt trắng, chó…ñều không cảm thụ ñược bệnh (Nguyễn Vĩnh Phước và cs, 1997)

2.1.3 ðường xâm nhập và cách lây lan

Virus viêm gan vịt lây lan rất nhanh từ con bệnh sang con lành, tỷ lệ nhiễm bệnh rất cao (100%) Virus xâm nhập vào cơ thể qua ñường tiêu hoá,

hô hấp hoặc qua vết thương (Levine, Fabricant, 1950) ðường lây nhiễm qua không khí của bệnh viêm gan vịt giống với bệnh dịch tả vịt và bệnh viêm phế quản truyền nhiễm ở gà con Có sự xâm nhập của virus qua vùng da bị tổn thương, nhưng ít gặp Những vịt chưa bị nhiễm virus, nếu cho chúng sống cùng ñàn vịt bệnh, chúng sẽ mắc bệnh và chết sau ñó ít ngày

Bệnh viêm gan vịt không lây truyền qua ñường trứng, vịt con nở ra

từ trứng của vịt mẹ bị nhiễm bệnh vẫn phát triển tốt (Asplin, 1958) Ở những vịt khỏi bệnh, virus ñược bài xuất ra ngoài theo phân sau 8 tuần Các loài chim hoang dã mang virus viêm gan vịt từ vùng này sang vùng khác theo phương thức cơ học, ñây chính là nguyên nhân gây ra các vụ dịch mới ở nơi xa (Asplin, 1961)

2.1.4 Cơ chế sinh học

Virus xâm nhập vào cơ thể qua niêm mạc ñường tiêu hóa, hô hấp hoặc qua vết thương rồi vào máu Theo máu, virus ñến các cơ quan nội tạng ñặc biệt là gan, ñây là cơ quan thích hợp ñối với virus Quá trình ñược biểu hiện qua hai giai ñoạn:

+ Giai ñoạn ñầu: Virus gây rối loạn trao ñổi chất ở gan, do quá trình

trao ñổi mở ở gan ñặc biệt là quá trình trao ñổi cholesterol bị ñình trệ làm cho lượng glycogen trong gan giảm thấp nhưng lượng lipit lại tăng cao Vì thế vịt con ở thời ñiểm kỳ cuối của bào thai thiếu năng lượng dẫn ñến sức ñề kháng

bị giảm sút

+ Giai ñoạn 2: Là giai ñoạn virus trực tiếp phá hoại tế bào gan, tế bào

nội mô huyết quản, gây ra xuất huyết ñặc trưng Virus nhân lên trong tế bào gan, nhất là tế bào thuộc hệ võng mạc nội mô như tế bào Kuffer Khi kiểm tra thấy tổ chức gan bị phá hoại, cơ thể không ñược giải ñộc làm con vật chết do ngộ ñộc (Bùi Thanh Khiết, 2007)

2.1.5 Triệu chứng lâm sàng và bệnh tích

2.1.5.1 Triệu chứng lâm sàng

Thời gian nung bệnh từ 1 ñến 5 ngày, ñôi khi kéo dài 8 – 13 ngày Thời gian nung bệnh phụ thuộc vào ñộc lực của virus, liều lượng và phương pháp gây bệnh cũng như tình trạng của cơ thể

Triệu chứng ñầu tiên xuất hiện sau 1- 2 giờ mắc bệnh, gây chứng xanh tím niêm mạc, rối loạn vận ñộng, co giật, vịt chỉ ngồi, sau ñó nằm la liệt, nghiêng sườn và nằm ngửa, chân thẳng dọc theo thân, ñầu quặt ngửa lên lưng hoặc ngẹo sang bên sườn và vịt con thường chết ở tư thế này ðây là một trong những dấu hiệu ñặc trưng của bệnh Một số trường hợp thấy vịt

bị ỉa chảy, phân loãng, triệu chứng này không phải xuất hiện ở tất cả vịt Bệnh kéo dài 2 – 3 ngày và có thể kéo dài hơn Khi ñã xuất hiện triệu chứng thì vịt ốm ít khi khỏi và phần lớn là bị chết Những con ốm không có triệu chứng lâm sàng sau khi khỏi bệnh sẽ hình thành kháng thể trong máu ( Lê Minh Chí và cs, 1999)

Bệnh viêm gan vịt truyền nhiễm do virus có tỷ chết biến ñộng từ vài phần trăm ñến 90% Vịt mắc bệnh do virus viêm gan vịt type I gây ra thường xẩy ra ñột ngột, thời gian nung bệnh ngắn trong vòng 24 h Vịt chết tập trung

vào ngày thứ 2 -3 -4 sau khi mắc bệnh, tỷ lệ chết rất cao có khi lên ñến 100% (Lê Minh Chí và cs, 1999)

(a) (b)

Hình 2.1 Tư thế chết ñiển hình của vịt khi bị nhiễm virus viêm gan vịt

(a) Gan vịt xuất huyết (b)

2.1.5.2 Bệnh tích

+ Bệnh tích ñại thể

Bệnh tích tập trung chủ yếu ở gan Gan thường sưng, nhũn, dễ bị nát khi ấn nhẹ Một số trường hợp gan bị nhũn có hình thái như gelatin Bề mặt loang lổ do có nhiều ñiểm xuất huyết, xuất huyết lan rộng không có ranh giới, kích thước và hình dạng to nhỏ khác nhau Hiện tượng xuất huyết trên bề mặt gan có ở tất cả vịt chết Khi nhỏ bệnh phẩm vào niêm mạc mũi thì xuất huyết rất rõ ở gan Khi tiêm bệnh phẩm vào phúc mạc, các cơ quan khác ít bị tổn thương và càng ít hơn qua ñường miệng Trong gan có thể gặp các ổ hoại tử

do bệnh viêm gan bị biến chứng sang bệnh phó thương hàn Lách có thể sưng, thận tụ máu hoặc lấm tấm xuất huyết (Nguyễn Văn Cảm và cs, 2001)

Tiêm chủng DH – EG – 2000 cho phôi gà 10 ngày tuổi thấy hiện tượng xuất huyết trên da Hiện tượng xuất huyết gan và phù phôi xuất hiện gần như ñồng thời trên tất cả các phôi Ở những phôi có biểu hiện xuất huyết trên da

thường xuất hiện kèm theo hiện tượng phù phôi, bệnh tích xuất huyết gan có lúc xuất hiện cùng với xuất huyết trên da và phù Một số phôi khi mổ khám không thấy bệnh tích nào khác ngoài hiện tượng gan xuất huyết (Nguyễn Bá Hiên, Trần Thị Lan Hương, 2004)

+ Bệnh tích vi thể

Biến ñổi vi thể của bệnh thường xuất hiện ở gan và ñại não Gan có những ñám tế bào bị hoại tử, ống mật, viêm tăng sinh quanh mạch và viêm tăng sinh mô thần kinh ñệm, lúc ñầu là những bạch cầu có hạt sau ñó là tế bào lympho và các tương bào Ở vịt con không chết có sự tái sinh của các tế bào nhu mô gan Sự tổn thương của tế bào gan ở vịt con mắc bệnh viêm gan virus giống những tổn thương như ở viêm gan của người (Bùi Thị Cúc, 2002) Quan sát biến ñổi vi thể ở phôi gà 10 ngày tuổi chết do nhiễm virus viêm gan vịt type I chủng DH – EG -2000 thấy tế bào hạt của nhiều cơ quan tăng sinh, gan có các ñiểm hoại tử, tăng sinh ống mật, phù dưới da không quan sát thấy các thể bao hàm trong tế bào Khi tiến hành làm tiêu bản vi thể thấy tế bào gan bị biến ñổi, bè gan và các tế bào gan sắp xếp lộn xộn, các vi huyết quản xuyên tâm giãn rộng chứa hồng cầu và tế bào viêm Có hiện tượng xuất huyết lan tràn trong nhu mô gan Tế bào lympho tăng sinh mạnh, có thể tập trung thành từng ñám lớn hoặc rải rác xen kẽ với những tế bào gan Một số tế bào gan mất ñi phần nguyên sinh chất, chỉ còn lại nhân, một số tế bào bị thoái hóa mỡ và thoái hóa không bào (Nguyễn Bá Hiên, Trần Thị Lan Hương, 2004)

Tiêm virus viêm gan vịt type I vào xoang niệu mô phôi vịt 10 – 14 ngày tuổi Sau khi tiêm 24 -72 h phôi chết có biểu hiện xuất huyết dưới da, gan xuất huyết và có nhiều ñiểm hoại tử Trong trường hợp vịt bị bệnh ở thể cấp tính , sau khi nhiễm virus 24 h thấy tế bào gan thoái hóa, hoại tử, trong tế bào có các tiểu phần virus

2.1.6 Chẩn đốn bệnh viêm gan vịt do virus

2.1.6.1 Chẩn đốn lâm sàng và bệnh tích

- Bệnh xảy ra trên đàn vịt con, xuất hiện đột ngột, tỷ lệ nhiễm cao.Vịt ủ rũ cao độ, rối loạn vận động, chết ở tư thế đặc trưng, hai chân duỗi thẳng, đầu ngoẹo sang một bên

- Mổ khám thấy gan bị sưng, xuất huyết, tim nhợt nhạt như tim luộc (Nguyễn Vĩnh Phước và cs,1978)

2.1.6.2 Chẩn đốn virus học

Bệnh phẩm dùng chẩn đốn là gan của vịt mắc bệnh pha với nước sinh lí,

xử lí kháng sinh đem ly tâm lấy nước trong rồi tiến hành tiêm cho phơi vịt

10-13 ngày tuổi, phơi gà 8-10 ngày tuổi Mổ phơi thấy cĩ các bệnh tích đặc trưng như phơi cịi cọc, phù phơi, xuất huyết trên da, gan sưng, xuất huyết Khi tiêm cho vịt con 1-7 ngày tuổi với liều 0,5ml/ con dưới da Sau một thời gian ngắn

vịt sẽ chết với bệnh tích đặc trưng của bệnh viêm gan vịt

2.1.6.3 Chẩn đốn phân biệt

- Bệnh dịch tả vịt (Duck plague): Bệnh dịch tả vịt thường xảy ra ở mọi lứa

tuổi với các triệu chứng điển hình như: sưng đầu, đau mắt, liệt chân, liệt cánh, tiêu chảy phân trắng, tốc độ vịt chết chậm hơn Mổ khám thấy hiện tượng viêm loét xuất huyết đường ruột Virus dịch tả rất mẫn cảm với chloroform

- Bệnh phĩ thương hàn vịt (Duck Salmonellosis): Vịt con thường cĩ

biểu hiện gầy, đi ngồi phân trắng, gan cĩ điểm hoại tử Vịt đẻ bị viêm buồng trứng, trứng non teo, dị hình, vịt giảm đẻ, vỏ trứng mỏng dễ vỡ Quan sát bệnh tích thấy chưa tiêu hết lịng đỏ trứng ở vịt con, gan, lách, thận sưng, xung huyết, bệnh cĩ thể chứa khỏi bằng kháng sinh (Nguyễn Vĩnh Phước, 1978) Vi khuẩn salmonella cĩ thể nuơi cấy phân lập được trong phịng thí nghiệm trên các mơi trường thạch thơng thường: mơi trường thạch máu, thạch thường

- Chứng nhiễm ñộc aflatoxin (Aflatoxicosis): không có hiện tượng lây lan

trong ñàn, vịt chết nhanh ở mọi lứa tuổi Bệnh tích chủ yếu là: xoang bụng và xoang bao tim tích nước, gan sưng có màu nhợt nhạt, thận và lách xuất huyết Kiểm tra tổ chức học thấy tổ chức nhu mô gan và thận bị phá huỷ nghiêm trọng

2.1.6.4 Phương pháp huyết thanh học

- Phản ứng trung hòa ñược sử dụng ñể ñịnh type viêm gan vịt type I, (Woolcock, 1998): dùng vịt con 1 - 7 ngày tuổi, mỗi con tiêm 1 - 2ml huyết thanh miễn dịch hoặc kháng thể ñặc hiệu chế từ lòng ñỏ vào dưới da Sau 24 giờ tiến hành tiêm virus cường ñộc với liều 103LD50 Kết quả 80 - 100 % vịt ñối chứng chết, 80 - 100% vịt thí nghiệm sống sót

- Dùng phản ứng bảo hộ chéo ñể phân biệt virus viêm gan vịt type I, type II, type III: tiêm huyết thanh miễn dịch viêm gan vịt type I, type II, typIII cho vịt 2 - 4 ngày tuổi Sau 3 ngày tiến hành công cường ñộc bằng virus phân lập ñược (Gough và cs, 1985)

2.1.7 Phòng chống bệnh

+Phòng bệnh bằng vệ sinh thú y:

Trước hết phải áp dụng biện pháp vệ sinh thú y với các cơ sở chăn nuôi vịt Cách ly nghiêm ngặt ñối với vịt con, nhất là trong 4 - 5 tuần ñầu Tiêu ñộc chuồng trại, dụng cụ chăn nuôi trước khi thả vịt bằng foocmon 1%, Crecyl 3%, nước vôi 20%, thức ăn và nước uống phải ñảm bảo tốt, tiêu diệt chuột, thường xuyên tẩy ký sinh trùng cho vịt

Những nơi ñang an toàn dịch thì tốt nhất nên tự túc con giống Tủ ấp

nở thường xuyên phải sát trùng trước và sau ấp nở (Nguyễn ðức Lưu, Vũ

Như Quán, 2002)

+ Vacxin phòng bệnh

Biện pháp quan trọng nhất ñể khống chế dịch bệnh là dùng vacxin tạo miễn dịch cho ñàn vịt (Davis D, Hannant D , 1987)

Vacxin phòng bệnh viêm gan vịt có 2 loại: vacxin nhược ñộc và vacxin vô hoạt

- Vacxin nhược ñộc:

Virus cường ñộc dưới tác ñộng của các yếu tố sinh học: tiêm truyền nhiều lần qua ñộng vật ít cảm thụ, qua phôi, thì ñộc lực của virus giảm ñi Virus vẫn có khả năng nhân lên trong cơ thể vật chủ nhưng không gây bệnh nên ñược dùng ñể làm vacxin Nhiều nghiên cứu ñã cho thấy các chủng virus viêm gan vịt cường ñộc sau khi ñã cấy truyền qua phôi gà không còn khả năng gây bệnh cho vịt con nhưng virus vẫn nhân lên trong tế bào các mô, so với chủng virus viêm gan vịt cường ñộc thì mức ñộ nhân lên của virus này là thấp hơn (Hwang, 1965)

Bằng phương pháp giảm ñộc trên phôi ñã tạo ra nhiều chủng virus viêm gan vịt nhược ñộc Hiện nay vacxin viêm gan vịt nhược ñộc type I - loại dùng chủ yếu ở Châu Âu là loại ñã ñược giảm ñộc sau 53 - 55 lần truyền ñời qua phôi gà 8 -10 ngày tuổi, ở Mỹ là loại giảm ñộc sau 84 - 89 lần cấy truyền Vacxin ñược bảo quản ở nhiệt ñộ -700C trong vài năm

- Vacxin vô hoạt:

Ngoài vacxin nhược ñộc còn có vacxin vô hoạt Vacxin viêm gan vịt vô hoạt ñược sản xuất từ virus viêm gan vịt type I bằng cách nuôi cấy virus trên phôi gà, thu hoạch dịch phôi, vô hoạt virus bằng BEI (Binary Ethylenimine),

dùng bổ trợ dạng nhũ dầu (ES - STA (Lipid Emulsion System - Salmonella

typehimurium) và có lympho B phân bào (Woolcok, 2003) Bảo quản ở 40C trong thời gian 20 tháng vẫn giữ ñược hiệu lực của vacxin

Nghiên cứu hiệu lực của vacxin viêm gan vịt vô hoạt, các tác giả ñều cho biết vacxin có khả năng tạo miễn dịch cao cho ñàn vịt (Gough, 1981) Sử dụng 3 lần vacxin viêm gan vịt type I vô hoạt nhũ dầu cho ñàn vịt giống sẽ tạo ñược miễn dịch thụ ñộng cho ñàn vịt con Hiện nay, trên thế giới mới có vacxin viêm gan vịt nhược ñộc và vô hoạt type I

Trên thị trường Việt Nam ñang sử dụng rộng rãi một loại vacxin nhược ñộc viêm gan vịt do Xí nghiệp thuốc thú y Trung ương sản xuất Qua khảo sát sinh học phân tử hệ gen bước ñầu cho thấy, chủng virus ñược sử dụng làm vacxin có nguồn gốc từ Hàn Quốc Ngoài ra, một chủng virus vacxin nhược ñộc khác của Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội cũng ñã ñược nghiên cứu ñầy ñủ về ñặc tính sinh học (Nguyễn Phục Hưng, 2004; Nguyễn Bá Hiên, 2007), qui trình sản xuất (Bùi Thanh Khiết, 2007; Nguyễn Bá Hiên, 2007), ñặc tính phân tử và ñã bước ñầu ñược ứng dụng vào thực tế Kết quả nghiên cứu về sinh học phân tử của chúng tôi cho thấy các loại vacxin sử dụng tại Việt Nam ñều thuộc genotype I

2.2 Một số ñặc tính của virus viêm gan vịt

2.2.1 ðặc tính nuôi cấy của virus

Virus viêm gan vịt là loại kí sinh nội bào tuyệt ñối ðể gây bệnh, cần sử dụng huyễn dịch các cơ quan của vịt con chết do viêm gan vịt (gan, phổi, thận…) ñã ñược xử lý bằng kháng sinh Có thể cấy chuyển viêm gan vịt trên ñộng vật cảm thụ, trên phôi trứng và trên môi trường tế bào (Trần Thị Lan Hương,2007)

2.2.1.1 Nuôi cấy trên phôi trứng

- Trên phôi vịt: Tiêm virus viêm gan vịt vào xoang niệu mô của phôi vịt

10 – 14 ngày tuổi Sau khi gây nhiễm 24 -72 h, phôi chết với bệnh tích như phôi còi cọc, xuất huyết dưới da ñặc biệt là ở vùng ñầu, bụng, chân, phôi phù, gan sưng có màu ñỏ hoặc hơi vàng, có thể có ñiểm hoại tử Những phôi chết muộn, nước xoang niệu mô có màu xanh nhạt và có bệnh tích rõ hơn Ở phôi vịt bị nhiễm virus viêm gan thường thấy nước ối có màu xanh và gan bị xanh – ñen, những bệnh tích này ít thấy ở phôi gà (Trần Thị Lan Hương, 2007)

- Trên phôi ngỗng: Virus viêm gan vịt cũng có khả năng nhân lên trên

phôi ngỗng Phôi chết sau khi cấy virus vào xoang niệu mô 2 -3 ngày (Nguyễn ðường, 1990)

- Trên phơi gà: Tiêm virus viêm gan vịt vào xoang niệu mơ của phơi gà

9 -10 ngày tuổi Với lần cấy chuyển đầu tiên, virus cho tỷ lệ chết phơi 10 - 60

% sau khi gây nhiễm 5 - 6 ngày Phơi cĩ bệnh tích cịi cọc, phù phơi, xuất huyết dưới da Nuơi cấy liên tục trong 68 đời, hiệu giá virus duy trì ở mức độ

10-4 – 10-6 Như vậy, gây bệnh cho bào thai cĩ thể được sử dụng để chẩn đốn viêm gan do virus (Phạm Văn Ty, 2007)

2.2.1.2 Nuơi cấy trên mơi trường tế bào

Sau khi gây nhiễm thấy hàm lượng virus tăng dần và sau một vài lần hoặc nhiều lần cấy truyền trên tế bào thì thấy virus huỷ hoại tế bào S (CPE: Cytopathogen effect) với biểu hiện nhân bị co trịn, nguyên sinh chất đặc lại tạo khơng bào, tế bào vỡ ra rồi chết Căn cứ vào đĩ ta cĩ thể đánh giá hiệu giá virus (Lê Thanh Hồ, 2002)

2.2.1.3 Nuơi cấy trên động vật cảm thụ

Virus viêm gan vịt chỉ cĩ thể phát triển tốt trên vịt con dưới 7 ngày tuổi Sau 2- 4 ngày nung bệnh, vịt cĩ biểu hiện đặc trưng: con vật mệt mỏi nghiêm trọng, nằm một chỗ, đầu ngoẹo ra đằng sau hay về một bên, co giật tồn thân rồi chết

Khi mổ khám quan sát bệnh tích đặc trưng ở gan thấy: gan sưng nhũn, dễ bị nát khi ấn nhẹ, trên mặt gan cĩ những điểm xuất huyết, đơi khi cĩ những điểm hoại tử màu trắng xen kẽ

Quan sát những biến đổi vi thể trên gan thấy tổ chức gan bị viêm tụ máu, tăng sinh ống mật, các mạch máu bị sưng, các tế bào gan bị tích mỡ (Trần Thị Lan Hương, 2007)

2.2.2 Sức đề kháng của của virus viêm gan vịt

Virus viêm gan vịt thuộc loại virus khơng cĩ vỏ bọc ngồi nên mẫn cảm với formalin, đề kháng cao với ete và chloroform Trong điều kiện mơi trường khắc nghiệt, virus cĩ khả năng sống sĩt trong thời gian dài Virus cĩ khả năng tồn tại lâu bên ngồi mơi trường: trong rơm lĩt chuồng, trong thức ăn, nước uống, virus cĩ khả năng tồn tại từ 15 đến 40 ngày Virus tương đối ổn định ở

nhiệt ñộ thấp, nhưng bị bất hoạt nhanh chóng ở nhiệt ñộ cao Ở nhiệt ñộ 40C virus tồn tại ñược khoảng 2 năm Ở 500C trong 1 h không ảnh hưởng ñến chuẩn ñộ virus, nhưng phần lớn virus bị vô hoạt ở 560C trong 30 phút Ở nhiệt

ñộ 370C, virus viêm gan vịt tồn tại ñược 21 ngày, khi cho virus tác dụng với dung dịch formalin 0,01% thì virus viêm gan vịt vẫn tồn tại ñược trong 8 h Ở nhiệt ñộ 150C – 200C, virus vô hoạt hoàn toàn bởi formaldehyde 1% hay NaOH 1% trong 3 h chloramin 3% trong thời gian 5 h Virus mất ñộc lực trong ñiều kiện nhiệt ñộ phòng từ 48 – 96 h Trong tủ lạnh, sức hoạt ñộng của virus tồn tại 120h Ở nhiệt ñộ -200C virus tồn tại ñược khoảng 9 năm Làm lạnh ñến -380C, giữ ñược khả năng lây lan của virus trong 8 tháng hoặc lâu hơn ( Reuss, 1959)

Ở nhiệt ñộ 560C và 600C, tuy virus kháng với tác dụng của ion Mg++ 1M nhưng khi không có mặt của cation này thì virus nhạy cảm với các nhiệt ñộ trên Virus viêm gan vịt có khả năng kháng trypsin và ammonium sulphate Tế bào chứa virus có thể tồn tại ở PH = 3 trong 9 h Virus không bị vô hoạt ở Lysol 2%, creolin 15%, naphthalysol, xyonaphtha hay anhydrous sodium carbonat 20% Ở ñiều kiện có 5% phenol virus bị vô hoạt hoàn toàn Trong tự nhiên, khi ñiều kiện tự nhiên kém virus có thể tồn tại ñược 10 tuần Trong phân ẩm virus có khả năng sống ñược 37 ngày (Haider,1979)

2.2.3 ðặc tính kháng nguyên của virus viêm gan vịt

Theo Aplin (1965), tính kháng nguyên của virus luôn thay ñổi, virus viêm gan vịt không làm ngưng kết hồng cầu gà, vịt, thỏ, cừu nên ñã cho phép phân biệt với virus Newcastle Huyết thanh của vịt nhiễm virus khỏi bệnh có khả năng trung hòa virus viêm gan vịt

2.3 Sinh học phân tử của virus viêm gan vịt

2.3.1 Hình thái và cấu tạo virus viêm gan vịt

Virus viêm gan vịt thuộc họ Picornaviridae, có kích thước rất nhỏ, xuyên qua ñược màng lọc Beckefeld và Seitz (Levine và Fabricant, 1950); Theo

Reuss (1959) dưới kính hiển vi ñiện tử virus là những hạt tròn bề mặt xù xì, không có vỏ bọc, kích thước từ 20-40nm, có 32 capxome

Hệ gen của virus viêm gan vịt chứa acid ribonucleic (RNA) sợi ñơn dương có ñộ dài khoàng 7600 – 7700 nucleotide và ñuôi poly A gồm 18 nucleotide ở ñầu 3’, chứa duy nhất một khung ñọc mở ORF (open reading frame) mã hóa cho một protein chung (polyprotein) Protein này, sau khi tổng hợp trải qua nhiều lần phân cắt ñể tạo nên các protein sản phẩm ñộc lập (Tseng và cs, 2007a)

(http://expasy.org/viralzone/all_by_species/33.html)

Hình 2.2 Cấu trúc không gian của picornavirus

Các protein VP1, VP2 và VP3 nằm ngay trên bề mặt vỏ kháng nguyên; còn protein VP4 lặn vào sâu bên trong

Sắp xếp hệ gen của virus viêm gan vịt, bao gồm:

- Tại ñầu 5’ có một vùng gen có ñộ dài khoảng 625 nucleotide không mã hóa gọi là vùng không mã hóa ñầu 5’ (untranslate region, 5’UTR) nhưng có vai trò quan trọng trong sao mã, tăng cường ñộc lực, tạo khung vỏ capsid DHV-1 bị thiếu cấu trúc mũ ở ñầu 5’ mà thay vào ñó là một protein nhỏ gọi là VPg Ở ñầu 5’ của hệ gen DHV-1 có bộ mã khởi ñầu ñể bắt ñầu cho quá trình dịch mã, bộ mã này ñược ñặt ở vị trí nucleotide thứ 627 của hệ gen Vùng ñầu

5’UTR cuốn lại tạo nên một gấp khúc có cấu trúc bậc 2 trông giống như hình

lá sồi (clover leaf), chứa vùng gen làm vị trí cho ribosome ñi vào dịch mã nội bào gọi là cấu trúc IRES (Internal Ribosome Entry Site)

- Tại ñầu 3’, tương tự, cũng có một vùng gen không mã hóa có ñộ dài 314 nucleotide gọi là 3’UTR (Ding, Zhang, 2007) Vùng 3’UTR có vai trò rất quan trọng trong quá trình nhân lên, trung chuyển qua giai ñoạn tạo nên sợi RNA sợi âm trung gian

- ðầu tận cùng 5’ của sợi ARN hệ gen có dính một mẩu protein gọi là protein dẫn (L) (30 amino acid) Trong họ Picornaviridae, protein L xuất hiện trong 5 chi là Teschovirus, Aphthovirus, Erbovirus, Cadiovirus và Kobuvirus Protein L này sở hữu một motif GxCG, có chức năng như enzyme protease – trypsin (Tseng, Tsai, 2007b)

- Giữa hai vùng không mã hóa 5’UTR và 3’UTR là vùng gen mã hóa tống hợp protein Vùng này bao gồm ba tổ hợp gen: tổ hợp gen P1 mã hóa cho ba loại protein cấu trúc là VP0, VP3 và VP1; tiếp theo là tổ hợp gen P2 mã hóa cho các protein không cấu trúc là 2A, 2B, 2C; nằm cuối cùng là tổ hợp gen P3

mã hóa cho các loại protein không cấu trúc là 3A, 3B, 3C, 3D (Hình 2.2)

- Protein 2A: Protein này có 3 phân ñoạn protein là protein 2A1, 2A2, 2A3 ðây là một trong những ñặc ñiểm ñặc trưng của DHV-1 (Johanson và

cs, 2003 ; Tseng, Tsai, 2007b)

- Protein cấu trúc:

Có 3 protein cấu trúc gồm protein VP0, Vp3 và protein VP1 Trong ñó, vùng VP1 có tính ổn ñịnh cao và có tính sinh miễn dịch, nằm trên bề mặt ngoài cùng của các picornavirus, chứa ñựng hầu hết những motif mà có chức năng tương tác với thụ thể của tế bào và kháng thể trung hòa ñơn dòng Trình

tự protein VP1 này là khác nhau trong giữa các chi virus (Tseng, Tsai, 2007)

- Protein phi cấu trúc :

Một số protein phi cấu trúc như protein 2C, 3C và 3D, chứa ñựng những motif ñặc trưng khác hẳn với những motif trong các protein ñã biết ở các picornavirus khác, gồm có motif GxxGxGK (S/T) - kéo dài từ amino acid thứ 145 ñến 152 và motif DDLxQ – từ amino acid thứ 192 ñến 196 trong

protein 2C, những motif này có chức năng như enzyme helicase (Ghazi và cs,

1998) Motif GxxGxGK cũng xuất hiện trong protein 2A2 (GksGsGKS; amino acid thứ 6 – 13) Trong motif DDLxQ ở protein 2C, leucine ñược thay thế bởi phenyalamine

- Trong cấu trúc hệ gen viêm gan vịt, ñược quan tâm nghiên cứu nhiều nhất là vùng gen mã hóa cho protein VP1 Vùng gen VP1 có ñộ dài 714 nucleotide Gen này ñã ñược chứng minh là gen kháng nguyên, nó quyết ñịnh tính kháng nguyên và tính ñộc lực của virus ðột biến trong gen VP1 dễ dẫn ñến thay ñổi thành phần amino acid, thay ñổi tính kháng nguyên và tính ñộc lực của virus, từ ñó có thể hình thành nên các biến chủng mới

2.3.2 Xếp loại virus viêm gan vịt

Ngày nay, với các phương pháp nghiên cứu sâu về sinh học phân tử, toàn bộ hệ gen của một số chủng virus viêm gan vịt trên thế giới ñã ñược xác

ựịnh Tất cả các nghiên cứu ựều thống nhất chỉ ra rằng virus viêm gan vịt thuộc họ Picornaviridae

Trước ựây, dựa vào một số ựặc tắnh của chúng mà virus viêm gan vịt ựược xếp vào chi Enterovirus trong họ Picornaviridae (Woolcock, 2003) Tuy nhiên, những nghiên cứu trong những năm gần ựây về sinh học phân tử ựã chỉ

ra rằng sự xếp loại ựó là chưa phù hợp và việc xếp loại virus viêm gan vịt vào chi nào trong họ Picornaviridae ựã gây rất nhiều tranh cãi

Các phân tắch trình tự hệ gen của virus viêm gan vịt type 1 (DHV-1) cho thấy virus có quan hệ gần gũi với các thành viên của chi Parechovirus hơn là chi Enterovirus (Ding C, Zhang D, 2007) Nhánh mới ựược tạo ra ựã chia những Picornaviridae thành 12 chi Trong ựó, DHV-1 tạo thành một nhánh riêng biệt nằm ở giữa Parechovirus và Hepatovirus trong cây phả hệ (http://www.picornaviridae.com/)

Hệ thống phân loại thế giới ICTV ựã thống nhất xếp virus viêm gan vịt type 1 (DHV-1) thuộc vào chi mới trong họ Picornaviridae, ựặt tên chi là Avihepatovirus, ựổi tên DHV-1 (Duck hepatitis virus type 1) thành DHAV (Duck hepatitis A virus)

(http://www.Picornaviridae.com/avihepatovirus/dhav.com;http://www.picornastudygroup.com) bao gồm genotype 1 (DHAV-1), genotype 2 (DHAV-2) và genotype 3 (DHAV-3) (Kim và cs, 2007), với cùng một cấu trúc hệ gen ựặc trưng như sau:

5ỖUTR/VP0/VP3/VP1/2A1/2A2/2A3/2B/2C/3A/3B/3C/3D/3ỖUTR Chiếm tỷ lệ cao nhất là DHAV-1, bao gồm 80 chủng virus viêm gan vịt type 1 ựã ựược phân lập trước ựây (trong ựó, 48 chủng ựã ựược giải mã toàn

bộ hệ gen và 39 chủng ựã giải mã gen kháng nguyên VP1 cũng như các vùng gen quan trọng khác) Hầu hết các chủng DHAV-1ựược phân lập ở Trung Quốc Ngoài ra có 1 chủng ựược phân lập ở đài Loan, 1 chủng phân lập ở

Anh, 3 chủng phân lập ở Mỹ và 2 chủng phân lập ở Hàn Quốc

DHAV-2 bao gồm 2 chủng mới ựược phân lập ở đài Loan là chủng 90D

2.4 Miễn dịch chống virus viêm gan vịt

Khi ựưa virus vào cơ thể kháng thể chưa hình thành ngay lập tức mà phải sau một thời gian tiềm tàng, dài hay ngắn phụ thuộc vào kháng nguyên chứa trong vacxin và sự xâm nhập của kháng nguyên vacxin lần ựầu hay lần 2, 3Ầhàm lượng kháng thể tăng dần, ựạt mức cao nhất sau 2-3 tuần rồi giảm dần và mất ựi sau vài tháng hoặc vài năm

Khi một kháng nguyên xâm nhập vào cơ thể trước hết cơ thể bảo vệ mình bằng cơ chế ựáp ứng miễn dịch không ựặc hiệu Tham gia vào cơ chế này có vai trò của da, niêm mạc, dịch tiết của các tuyến, ựặc biệt là có vai trò của các tế bào làm nhiệm vụ thực bào Sau ựó, cơ thể bảo vệ mình bằng cơ chế ựáp ứng miễn dịch ựặc hiệu với hoạt ựộng của các cơ quan, tế bào có thẩm quyền miễn dịch, tạo kháng thể ựặc hiệu ựể loại trừ kháng nguyên (Nguyễn Bá Hiên, Trần Thị Lan Hương, 2004)

2.4.1 Miễn dịch thụ ựộng

Ở gia cầm non hệ thống miễn dịch chưa phát triển hoàn thiện Ngay từ lúc mới sinh cơ thể chúng hoàn toàn không có khả năng chống lại các tác nhân gây bệnh một cách ựặc hiệu Trạng thái miễn dịch chỉ có ựược sau khi

cơ thể vịt mẹ có miễn dịch và truyền kháng thể ựặc hiệu cho con non qua lòng

ựỏ trứng (Nguyễn Bá Hiên, Trần Thị Lan Hương, 2004)

Trong bệnh viêm gan vịt, miễn dịch thụ ựộng của vịt con ựược nhận từ

mẹ ựã ựược nghiên cứu nhiều Việc tiêm nhắc lại vacxin cho vịt mẹ sẽ tạo

ñược kháng thể thụ ñộng tốt hơn cho vịt con Theo Asplin (1958) dùng virus viêm gan vịt type I nhược ñộc qua phôi gà, tiêm bắp cho vịt giống vào thời ñiểm 2 – 4 tuần trước khi lấy trứng ñem ấp sẽ tạo ñược miễn dịch thụ ñộng cho vịt con Ở vịt con hàm lượng kháng thể thụ ñộng sẽ giảm dần trong hai tuần ñầu sau khi nở Ở vịt mẹ hàm lượng kháng thể phải ñạt hiệu giá 1/64 trong phản ứng ngưng kết hồng cầu thụ ñộng hoặc 1/32 trong phản ứng trung hòa mới có thể bảo hộ cho vịt con khỏi mắc bệnh (Asplin, 1958)

2.4.2 Miễn dịch chủ ñộng

Là loại miễn dịch thu ñược khi con vật bị mắc bệnh nhưng có ñủ sức ñể chống lại bệnh và khỏi bệnh hoặc là miễn dịch mà vịt có ñược sau khi tiêm vacxin Những vịt sống sót sau khi mắc bệnh ñều có miễn dịch chắc chắn với virus của type gây bệnh Tạo miễn dịch chủ ñộng cho ñàn vịt bằng cách sử dụng các loại vacxin nhược ñộc và vacxin vô hoạt Vacxin sau khi vào cơ thể

sẽ ñi ñến các cơ quan miễn dịch như hạch, lách, tổ chức lympho dưới niêm mạc và kích thích cơ thể sinh ra kháng thể ñặc hiệu

Trong kháng thể dịch thể chống virus viêm gan vịt type I thì kháng thể 7S nhiều hơn kháng thể 19S Vịt ñược tiêm vacxin có thể tạo ñược miễn dịch chủ ñộng chống lại bệnh Sử dụng vacxin nhược ñộc viêm gan vịt tiêm cho vịt lúc 2 -3 ngày tuổi và tiêm nhắc lại bằng vacxin vô hoạt vào thời ñiểm 22 tuần tuổi sẽ tạo ñược lượng lớn kháng thể trung hòa (Nguyễn Bá Hiên, Trần Thị Lan Hương, 2004)

2.5 Các kỹ thuật sinh học phân tử

2.5.1 Phản ứng PCR

PCR là phản ứng sinh hóa phụ thuộc nhiệt ñộ, sử dụng ñặc ñiểm của quá trình sao chép DNA với sự tham gia của của một loại enzyme DNA – polymerase chịu nhiệt, có hai ñoạn ngắn DNA làm mồi và dùng các ñoạn DNA mạch ñơn làm khuân ñể tổng hợp lên sợi mới bổ sung Vì vậy, ñể khởi ñầu quá trình tổng hợp DNA cần cung cấp ñoạn mồi oligonucleotide có ñộ dài

từ 6 – 30 nucleotit ðoạn này gắn kết với DNA khuân tại thời ñiểm sao chép

và ñược DNA – polymerase ñiều khiển tổng hợp một ñoạn DNA ñặc thù Các sợi DNA mạch ñơn làm khuân ñược tạo ra theo cách ñơn giản và nâng nhiệt

ñộ lên trên 900C cho mạch xoắn kép bung ra

Hình 2.4 Mô hình các bước của phản ứng PCR

Cả hai sợi DNA ñều ñược dùng làm khuân cho quá trình tổng hợp nếu các ñoạn mồi ñược cung cấp ñể bám vào vị trí tương ứng cho cả hai sợi Trong kỹ thuật PCR các ñoạn mồi ñược chọn nằm ở hai ñầu ñoạn DNA cần nhân lên sao cho các sợi DNA tổng hợp mới ñược bắt ñầu tại mỗi ñoạn mồi

và kéo dài về phía ñoạn mồi nằm trên sợi kia, cho sản phẩm có ñộ dài giới hạn giữa hai ñoạn mồi này ðộ dài sản phẩm PCR có thể vài trăm cho ñến hàng ngàn thậm chí vài ngàn nucleotit Như vậy, sau mỗi chu kỳ các ñiểm bám cho các ñoạn mồi lại xuất hiện trên mỗi sợi DNA mới ñược tổng hợp Hỗn hợp phản ứng lại ñược nâng nhiệt lên thích hợp sao cho các sợi ban ñầu tách khỏi sợi mới tổng hợp, các sợi này sau ñó ñược dùng tiếp cho chu trình tiếp theo bao gồm các bước: gắn ñoạn mồi, tổng hợp DNA và tách rời các ñoạn

Kết quả cuối cùng của phản ứng PCR là sau n chu kì của phản ứng tính theo lý thuyết sẽ có 2n bản sao các phân tử DNA mạch kép nằm giữa ñoạn mồi (Lê Thanh Hoà, 2006)

2.5.2 Phản ứng RT – PCR

Kỹ thuật RT – PCR hay còn gọi là phản ứng PCR ngược là một phản ứng nhân một ñoạn giới hạn của khuân RNA, theo nguyên lý của phản ứng PCR bao gồm hai giai ñoạn: giai ñoạn thứ nhất là chuyển ñổi một sợi RNA làm khuân thành cDNA, sau ñó qua giai ñoạn thứ hai dùng DNA hai sợi này làm khuân ñể tiếp tục thực hiện phản ứng PCR

Hình 2.5 Mô hình nguyên lý của phản ứng RT-PCR

RNA là một sợi bao gồm 4 nucleotit liên kết với nhau, trong ñó có Adenine, Guanine, Cystein, Uracil Chuỗi nucleotit này phải ñược chuyển ñổi thành DNA hai sợi mà thành phần Uracil ñược thay thế bằng Thyamine Phản ứng tạo cDNA từ RNA hệ gen phải nhờ ñến vai trò của enzyme phiên mã ngược

Do vậy giai ñoạn này ñược gọi là giai ñoạn chuyển ngược Khi ñã có DNA phản ứng tiếp theo sẽ là PCR Toàn bộ phản ứng nhân một ñoạn DNA từ khuân RNA qua hai giai ñoạn nói trên ñược gọi là phản ứng RT- PCR hay phản ứng PCR ngược Thay ñổi nhiệt ñộ ñể phù hợp cho mỗi chu kỳ (Lê Thanh Hoà, 2006)

2.5.3 Kỹ thuật ñiện di

Kỹ thuật ñiện di trên thạch agarose là hết sức quan trọng ñối với người làm kỹ thuật di truyền và sinh học phân tử, ñó là cách chủ yếu làm cho các

ñoạn axit nucleic hiển thị trực tiếp Phương pháp này dựa trên một ñặc tính là các phân tử axit nucleic ở pH trung tính chúng tích ñiện âm nhờ các nhóm phosphate nằm trên khung photphodieste của các sợi nucleic Khi ñặt chúng vào một ñiện trường, các phân tử axit nucleic sẽ chuyển dịch về cực dương Khi tiến hành trên môi trường thạch agarose hay các loại thạch ñặc biệt khác, các phân tử axit nucleic tùy theo kích thước sẽ dịch chuyển với tốc ñộ khác nhau, loại có phân tử lượng lớn dịch chuyển chậm và ngược lại loại có phân

tử lượng bé sẽ dịch chuyển nhanh hơn

Có hai loại thạch agarose ñược sử dụng phổ biến trong kỹ thuật ñiện di là thạch agarose và thạch polyacrylamid Thạch agarose ñược dùng ñể thực hiện ñiện di trong máy ñiện di, gel polyacrylamid thường ñược dùng ñể phân tách các phân tử axit nucleic có kích thước nhỏ trong các ứng dụng như xác ñịnh trình tự DNA

ðiện di ñược thực hiện bằng cách ñưa các mẫu axit nucleic có trộn chỉ thị màu bromphenol vào các giếng của bản thạch và ñặt một ñiện áp vào ñó Các axit nucleic ở trên thạch thường hiển thị khi nhuộm bằng Ethidium Bromide và ñược quan sát dưới ánh sáng tử ngoại Các axit nucleic hiện lên ở các dạng băng màu trắng có thể chụp ảnh và ghi nhận lại ñược Kích thước các băng DNA ñược so sánh với chỉ thị di truyền (DNA marker) DNA marker thường ñược dùng nhất là DNA của thực khuẩn thể Lamda, có chiều dài 43kb, ñược cắt bằng enzyme giới hạn HindIII, tạo 8 phân ñoạn với các chiều dài bao gồm 23,1 kb, 9,4 kb, 6,5kb, 4,3 kb, 2,3kb, 2 kb, 0,564kb, 0,125kb Nhờ chỉ thị di truyền này mà có thể xác ñịnh ñược ñộ dài của ñoạn axit nucleic cần phân tích (Lê Thanh Hoà, 2006)

2.5.4 Nguyên lý tách dòng và lưu giữ nguồn gen

Nguyên lý của việc dòng hóa là gắn nối sản phẩm PCR hoặc RT- PCR vào vector tách dòng và chuyển nạp vào tế bào chủ tạo dòng cái tổ hợp

Theo nguyên tắc một ựoạn DNA ngoại lai (sản phẩm của PCR hoặc RT- PCR) sẽ ựược cài vào trong hệ gen DNA ựã ựược thiết kế sẵn gọi là plasmid mang Ờ vector dẫn truyền ( thường dùng vector pCR 2.1 Ờ TOPO) tạo thành vector tái tổ hợp Sau ựó, vector tái tổ hợp này sẽ ựược chuyển nạp vào tế bào chủ thắch ứng, thông thường là tế bào E coli, ựể nhân lên với số lượng lớn các bản sao của DNA ngoại lai Sau khi chuyển nạp, tiến hành chọn lọc tái tổ theo 2 cơ chế: Cơ chế X-gal và cơ chế kháng sinh nhằm loại trừ các vi khuẩn không tái tổ hợp Tách chiết các khuẩn lạc ựơn dòng ựể thu ựược lượng DNA tái tổ hợp và kiểm tra xem ựoạn DNA ngoại lai có ựược nối vào vector hay không bằng phản ứng cắt với enzyme giới hạn (Lê Thanh Hoà, 2006)

2.6 Tình hình nghiên cứu bệnh viêm gan vịt trên thế giới và việt nam

2.6.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Từ khi Levine và Hofstad lần ựầu tiên phát hiện ra bệnh viêm gan vịt vào năm 1945, cho ựến nay trên thế giới ựã có rất nhiều nghiên cứu về bệnh Trước ựây các công trình nghiên cứu tập trung chủ yếu về ựặc ựiểm dịch tễ, triệu chứng lâm sàng, bệnh tắch, ựặc tắnh sinh học của virus, chế tạo vacxinẦ sao cho việc phòng chống bệnh ựạt hiệu quả cao nhất mà chưa nghiên cứu sâu sắc về ựặc tắnh sinh học phân tử của hệ gen virus Gần ựây, bệnh viêm gan vịt

do virus ựược nhiều tác giả quan tâm, ựặc biệt là virus viêm gan vịt type I Năm 2007 Tseng và Tsai ựã xác ựịnh ựược ựầy ựủ và gần như ựầy ựủ hệ gen của ba chủng virus DHV -1, gồm một chủng ựược phân lập ngoài tự nhiên ở đài Loan: 03D, Anh: chủng H, một chủng vacxin nhược ựộc Mỹ chủng 5886 Cho ựến nay 2008, hệ gen của hàng chục chủng virus viêm gan vịt kể cả cường ựộc cũng như vacxin ựã ựược giải mã và phân tắch Qua phân tắch sự tiến hóa và phát sinh loài của DHV- 1 thì DHV- 1 ựược phân loại lại vào trong một chi mới trong họ Picornaviridae, tương tự DHV- 2, DHV- 3 ựược phân loại lại vào trong họ Astroviridae và ựược ựặt tên lại là Duck Astrovirus Dựa vào những ựặc ựiểm riêng biệt của hệ gen như: Gen VP0 không bị phân

cách, ba protein 2A không liên quan với nhau; sự tương ựồng thấp về trình tự axt amin với tất cả những Picornavirus khác và những kết quả của việc phân tắch phát sinh loài mà DHV- 1 ựược xếp vào chi Picornarvirus tách biệt và ựược coi là mẫu ựầu tiên của một chi mới (Jin và cs, 2008) Một sự phân tắch khác của Ding và Zhang trên chủng DHV- C80 (là một chủng vacxin thắch ứng trên phôi gà ở Trung Quốc) cũng ựề nghị lên xếp DHV- 1 vào một chi riêng biệt trong họ Picornaviridae ( Ding, Zhang, 2007)

2.6.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

Ở nước ta có rất nhiều công trình nghiên cứu về bệnh viêm gan vịt và ựặc tắnh sinh học virus viêm gan vịt nhưng vẫn chưa có nhiều công trình nghiên cứu về ựặc tắnh sinh học phân tử của virus viêm gan vịt Bệnh viêm gan vịt ựược phát hiện lần ựầu tiên vào năm 1978 khi mà một số giống vịt ngoại ựược nhập vào nước ta ồ ạt và ựược nuôi rộng rãi trong dân Vào thời ựiểm này, Trần Minh Châu và cs ựã ghi nhận bệnh ở đông Anh Ờ Hà Nội, nhưng lúc ựó vẫn chưa phân lập ựược mầm bệnh

Từ năm 1979 ựến 1983, bệnh xẩy ra ở nhiều ựịa phương và làm chết rất nhiều vịt con Năm 1983, Trần Minh Châu và cs ựã phân lập ựược một chủng virus cường ựộc tại một trại nuôi vịt ở Phú Xuyên Ờ Hà Nội (chủng TT) Khi nuôi cấy virus này trên phôi vịt 12 ngày tuổi, virus gây chết phôi 100%, thời gian chết phôi từ 48 Ờ 96 giờ, phôi có bệnh tắch xuất huyết Qua nuôi cấy trên phôi gà, chủng virus này yếu ựi, không gây bệnh cho vịt con (Trần Minh Châu và cs, 1985)

Năm 1985, các tác giả Trần Minh Châu, Lê Thu Hồng ựã xây dựng qui trình sản xuất vacxin từ 3 chủng virus vacxin viêm gan vịt nhược ựộc: TN (Hunggari), E32 ( Pháp), và VN (Việt Nam) Cả ba chủng virus vacxin ựề an toàn và có hiệu lực khi sử dụng Khi miễn dịch cho vịt con rồi thử thách với cường ựộc thì bảo hộ ựược 70 Ờ 100% vịt con (Trần Minh Châu và cs, 1985)

Theo Nguyễn Văn Cảm và cs (2001), cho biết từ 1 – 6 năm 2001, qua điều tra 12 ổ dịch tại các địa phương là Hưng Yên, Hà Tây, Hà Nam, Hà Nội, Tuyên Quang, đã đi đến kết luận đây là những ổ dịch do virus viêm ga vịt gây

ra Ổ dịch cĩ tỷ lệ nhiễm trong đàn lên đến gần 100%, tỷ lệ chết từ 48 - 90% Theo Nguyễn ðức Lưu và Vũ Như Quán (2002), bệnh viêm gan vịt cĩ cơ hội xẩy ra nhiều hơn trên các giống vịt, ngan cao sản nhập vào nước ta ở các địa phương như Hà Tây, Hà Nam, Thái Bình, các tỉnh đồng bằng sơng Cửu Long, gây tổn thất rất lớn cho các địa phương này

Năm 2001, Nguyễn Văn Cảm và cộng sự đã nghiên cứu biến đổi bệnh lý bệnh viêm gan vịt do virus nhằm đưa ra một phương pháp chẩn đốn nhanh

Năm 2004, Nguyễn Phục Hưng đã nghiên cứu đặc tính sinh học của chủng virus nhược độc viêm gan vịt DH- EG – 2000, để cĩ thể sản xuất vacxin phịng bệnh ðến năm 2007, Bùi Thanh Khiết đã nghiên cứu qui trình sản xuất vacxin viêm gan vịt từ chủng virus vacxin nhược độc trên và ứng dụng phịng – can thiệp vào thực tế sản xuất

Ở nước ta tuy cĩ nhiều biện pháp phịng bệnh nhưng hiệu quả phịng bệnh vẫn chưa cao, hiệu quả khi sử dụng vacxin nhược độc và vơ hoạt cịn nhiều bất cập Một trong những nguyên nhân ảnh hưởng tới hiệu quả của việc phịng bệnh bằng vacxin cĩ thể là những loại vacxin này đơn chủng lại chứa phần kháng nguyên của các chủng nước ngồi nên khơng phù hợp lắm với những chủng virus tại Việt Nam Do vậy để cĩ những loại vacxin hiệu quả cao, phù hợp với những chủng virus ở nước ta thì cần cĩ yêu cầu đặt ra là phải

có những nghiên cứu về sinh học phân tử hệ gen của virus viêm gan vịt ở Việt Nam, ñể tìm hiểu về cấu trúc hệ gen, ñặc biệt là tìm hiểu về cấu trúc của gen kháng nguyên VP1 ñể từ ñó có thể tìm ra biện pháp chữa bệnh tốt nhất phù hợp với chủng virus tại Việt Nam

3 NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Nội dung nghiên cứu

ðể thực hiện đề tài này chúng tơi tiến hành nghiên cứu các nội dung sau:

1 Phân lập virus cường độc viêm gan vịt trên đàn vịt tại một số địa phương

2 Giám định chủng virus cường độc viêm gan vịt phân lập được bằng kĩ thuật RT-PCR

3 Thu nhận vùng gen VP1 của virus viêm gan vịt phân lập được

4 Giải trình tự vùng gen VP1 của virus viêm gan vịt phân lập và vùng gen VP1 của virus vacxin nhược độc viêm gan vịt DH-EG-2000

5 So sánh sự đồng nhất về Nucleotide và sự tương đồng amino acid của vùng gen VP1 của các chủng virus viêm gan vịt cường độc phân lập được với chủng virus vacxin DH-EG-2000

3.2 Vật liệu nghiên cứu

3.2.1 Nguyên liệu

Mẫu bệnh phẩm: Mẫu bệnh phẩm làm nguyên liệu nghiên cứu là gan của

vịt mắc bệnh viêm gan vịt, đã được chẩn đốn bằng các triệu chứng lâm sàng và

mổ khám kiểm tra bệnh tích, thu thập từ đàn bệnh tại các tỉnh của miền Bắc và miền Nam của Việt Nam (Bảng 3.1) Bệnh phẩm gan được bảo quản ở -20oC Huyễn dịch gan của vịt mắc bệnh sau khi xử lý được tiêm vào xoang niệu mơ của phơi vịt mẫn cảm 13 ngày tuổi Ở những phơi vịt chết ở 48 giờ

và 72 giờ sau khi tiêm, tiến hành thu nước trứng chứa virus để làm nguyên

liệu cho nghiên cứu giải mã hệ gen

Ngồi ra, chủng virus vaccine nhược độc hiện đang sử dụng tại Việt Nam cũng được sử dụng làm nguyên liệu nghiên cứu, đĩ là: chủng virus nhược độc viêm gan vịt do Bộ mơn Vi sinh vật truyền nhiễm - Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội cung cấp kí hiệu DH- EG- 2000

Bảng 3.1 Danh sách các mẫu bệnh phẩm viêm gan vịt

sử dụng trong nghiên cứu

STT Ký hiệu mẫu Thời gian

lấy mẫu ðịa ñiểm lấy mẫu

1 DH-EG-2000 Virus viêm gan vịt nhược ñộc chủng Ai Cập

Bảng 3.2 Các ñoạn mồi sử dụng trong phản ứng RT-PCR

Tên mồi Ký hiệu

mồi Trình tự mồi (5

’

→ 3’)

Mồi xuôi DH3F 5’ GCCCCACTCTATGGAAATTTG 3’

Mồi ngược DH4R 5’ ATTTGGTCAGATTCAATTTCC 3’

Mồi xuôi DHAV3F 5’-ATGCGAGTTGGTAAGGATTTTCAG-3’ Mồi ngược DHAV3R 5’- GATCCTGATTTACCAACAACCAT-3’

Cặp mồi dùng ñể nhân ñoạn DNA chứa gen VP1 ñược thiết kế dựa trên trình tự gen ñặc hiệu của vùng biên xung quanh gen VP1 ở các chủng virus

viêm gan vịt có trong Ngân hàng gen Quốc tế Phản ứng RT-PCR ñược thực hiện ñặc hiệu với cặp mồi DH3F - DH4R ñể thu nhận ñoạn gen kháng nguyên VP1, có ñộ dài 714 nucleotide từ vị trí nucleotide thứ 2106 ñến 2819 (hình 3.1) của các chủng virus viêm gan vịt thuộc genotype I (DHAV-1) Và cặp mồi DHAV3F – DHAV3R ñể thu nhận gen VP1 của các chủng virus viêm gan vịt thuộc genotype III (DHAV-3), tạo nguyên liệu cho quá trình giải trình

tự chuỗi gen VP1 Các ñoạn mồi sẽ liên kết bổ sung tại các vị trí cần thiết trên

hệ gen virus Vị trí vùng gen VP1 và vị trí bám mồi ñược thể hiện theo sơ ñồ sau:

Hình 3.1 Sơ ñồ vị trí bám của mồi ñể thu nhận ñoạn DNA (~0,8kb) chứa gen VP1 (714bp) và chiến lược giải mã gen VP1 của virus viêm gan vịt

bằng cặp mồi DH3F-DH4R (ảnh minh hoạ)

20oC, -86oC Buồng cấy vô trùng đèn soi trứng, khay ựựng trứng

- Máy ly tâm, máy PCR, máy ựiện di, máy chụp ảnh gel

- Máy nuôi lắc tế bào, máy ổn nhiệt, máy giải trình tự tự ựộng ABI Avant Genetic Analyzer 3100, máy tắnh và các phần mềm sinh Ờ tin học

3.2.4.2 Hoá chất và môi trường cần thiết

- Nước sinh lý 0,9%, cồn 70o, cồn Iod 5%; Kháng sinh: Penicillin, Streptomycin

- Hóa chất sử dụng cho phản ứng RT Ờ PCR: Nuclease free water, dNTP, enzyme, primers, TBE, agarose

- Bộ kit tách chiết RNA tổng số, QIAmp Viral Mini kit (QIA GEN Inc, USA) và hóa chất do hãng QIAGEN cung cấp

- Bộ kit dùng cho phản ứng RT-PCR do hãng Invitrogen cung cấp

- Bộ kit dùng ựể tinh sạch sản phẩm PCR/RT-PCR do hãng QIAGEN và BIOONER cung cấp

- Bộ kit tách dòng ỢTA-cloning kitỢ do hãng Invitrogen cung cấp

- Bộ kit tách DNA plasmid tái tổ hợp, ỢQIAprep Spin Miniprep kitỢ do hãng QIAGEN cung cấp

- Bộ kit dùng cho phản ứng PCR giải trình tự

- Bộ kit dùng ựể tinh sạch sản phẩm PCR giải trình tự Kit DyeEx do hãng QIAGEN cung cấp

- Enzyme giới hạn EcoRI của New England BioLabs

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Phân lập virus bằng phương pháp nuôi cấy virus trên phôi vịt

3.3.1.1 Xử lý bệnh phẩm

Bệnh phẩm là gan của vịt mắc bệnh viêm gan vịt, ựược nghiền nhỏ, bệnh phẩm là huyễn dịch ựều pha với nước sinh lý thành huyễn dịch 1/5 xử lý kháng sinh (Penicillin, Streptomycin), ựể ở nhiệt ựộ 4oC trong 2 giờ Mẫu gan

ly tâm với tốc ựộ 5000 vòng/phút trong 15 phút Lấy huyễn dịch ở trên xử lý