Nghiên cứu quy trình sản xuất thử nghiệm mẫu huyết thanh ứng dụng trong ngoại kiểm test nhanh helicobacter pylori

Chúng tôi tin rằng việc triển khai chương trình ngoại kiểm test nhanh đáp ứng tiêu chuẩn ISO 13528:2015 vàISO/IEC 17043 trong chẩn đoán tại Việt Nam là hoàn toàn hữu ích góp phầnchuẩn hó

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TEST NHANH HELICOBACTER PYLORI

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT Y HỌC

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2019

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT Y HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS TS TRẦN THIỆN TRUNG

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2019

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng chúng tôi Các

số liệu là hoàn toàn trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ côngtrình nào khác

Tác giả

NGUYỄN THỊ THANH TRÚC

MỤC LỤC

Trang

Lời cam đoan i

Mục lục ii

Danh mục các chữ viết tắt v

Danh mục các bảng viii

Danh mục các sơ đồ xi

Danh mục các biểu đồ xi

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Khái quát về vi khuẩn Helicobacter pylori 4

1.1.1 Lịch sử phát hiện 4

1.1.2 Đặc điểm sinh học của vi khuẩn 4

1.1.3 Kháng nguyên và độc tố 5

1.1.4 Các yếu tố nguy cơ và đường lây 7

1.1.5 Miễn dịch 8

1.1.6 Dịch tễ học nhiễm H pylori 8

1.1.7 Tầm quan trọng của việc chẩn đoán nhiễm H pylori 10

1.1.8 Phương pháp chẩn đoán nhiễm H pylori 11

1.2 Ngoại kiểm tra chất lượng xét nghiệm (EQA) 15

1.2.1 Định nghĩa 15

1.2.2 Phương thức áp dụng ngoại kiểm 16

1.2.3 Vị trí và tầm quan trọng của ngoại kiểm 17

1.2.4 Mẫu ngoại kiểm 18

1.3 Tình hình ngoại kiểm trên thế giới và tại Việt Nam 21

1.3.1 Trên thế giới 21

1.3.2 Tại Việt Nam 22

1.3.3 Tình hình ngoại kiểm test nhanh 22

1.4 Phương pháp bảo quản mẫu ngoại kiểm 24

1.4.1 Phương pháp đông khô 24

1.4.2 Phương pháp đông lạnh 25

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.1 Thời gian nghiên cứu 26

2.2 Địa điểm nghiên cứu 26

2.3 Thiết kế nghiên cứu 26

2.4 Đối tượng nghiên cứu 26

2.5 Tiêu chí chọn mẫu 26

2.5.1 Tiêu chuẩn đưa vào 26

2.5.2 Tiêu chuẩn loại trừ 26

2.6 Cỡ mẫu 27

2.7 Xử lý số liệu 27

2.8 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất 28

2.9 Tiến hành thử nghiệm: 30

2.9.2 Kỹ thuật chuyển đổi huyết tương thành huyết thanh 32

2.9.3 Đánh giá độ đặc hiệu của kháng thể IgG kháng H pylori 33

2.9.4 Xác định đặc tính mẫu 33

2.9.5 Phân phối mẫu 34

2.9.6 Bảo quản mẫu 34

2.10 Phương pháp đánh giá tính đồng nhất và độ ổn định của mẫu 35

2.10.1 Đánh giá tính đồng nhất 35

2.10.2 Đánh giá độ ổn định 37

2.11 Phương pháp ELISA đánh giá độ đặc hiệu của kháng thể IgG kháng H pylori 39

2.11.1 Vật liệu cần thiết 39

2.12 Kiểm soát sai lệch 42

2.12.1 Kiểm soát sai lệch do lựa chọn 42

2.12.2 Kiểm soát sai lệch thông tin 42

2.12.3 Sai lệch phương pháp xử lý mẫu 42

2.12.4 Kiểm soát sai lệch kết quả 42

2.13 Vấn đề y đức 43

2.14 Tính ứng dụng 43

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ 44

3.1 Kết quả sản xuất thử nghiệm mẫu huyết thanh chứa kháng thể IgG kháng H pylori dùng trong ngoại kiểm test nhanh 44

3.1.1 Kết quả sàng lọc mẫu huyết thanh sau thu thập 44

3.1.3 Kết quả xác định đặc tính mẫu huyết thanh 48

3.2 Kết quả đánh giá tính đồng nhất 50

3.2.1 Bộ mẫu dương tính 51

3.3 Kết quả đánh giá độ ổn định 55

3.3.1 Kết quả đánh giá độ ổn định dài hạn 55

3.3.2 Kết quả đánh giá độ ổn định ngắn hạn 66

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 71

4.1 Sản xuất thử nghiệm mẫu huyết thanh chứa kháng thể IgG-H pylori 71 4.1.1 Sàng lọc các tác nhân HBsAg, Anti-HCV và Anti-HIV 1/2 73

4.1.2 Đánh giá độ đặc hiệu kháng thể IgG kháng H pylori 74

4.1.3 Xác định đặc tính mẫu bằng nhiều loại sinh phẩm 76

4.2 Tính đồng nhất của bộ mẫu sản xuất bằng phương pháp đông khô và đông lạnh 78

4.3 Độ ổn định của bộ mẫu sản xuất theo nhiệt độ và thời gian 79

KẾT LUẬN 83

KIẾN NGHỊ 84 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮTTiếng Việt

Tiếng Anh

(Dấu ấn nhiễm trùng hiện tại)

(Giá trị điểm cắt)

(Mẫu chuẩn được chứng nhận)

(Xét nghiệm miễn dịch men)

(Xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết enzyme)

(Ngoại kiểm tra)

(Nội kiểm tra)

IARC International Agency for Research on Cancer

(Cơ quan nghiên cứu ung thư quốc tế)

(Tổ chức quốc tế về tiêu chuẩn hóa)

(Giá trị tiên đoán âm)

(Mật độ quang)

(Phản ứng khuếch đại kiểu gen)

(Giá trị tiên đoán dương)

(Kiểm soát chất lượng)

Assurance Programs(Chương trình đảm bảo chất lượng Đại học Hoàng gia vềbệnh học-Úc)

Hình 3.2 Mẫu huyết thanh âm tính với IgG-H pylori sau khi chuyển đổi 46

Hình 3.3 Xác định đặc tính mẫu 48Hình 3.4 Xử lý mẫu bằng phương pháp đông khô 50

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Độ nhạy, độ đặc hiệu các bộ kit ELISA 13

Bảng 2.1 Số lượng bộ mẫu sản xuất 27

Bảng 2.2 Thiết bị và máy móc 28

Bảng 2.3 Hóa chất, thuốc thử 29

Bảng 2.4 Dụng cụ và vật tư tiêu hao 29

Bảng 2.5 Phân phối bộ mẫu 34

Bảng 3.1 Kết quả sàng lọc nguyên liệu ban đầu 44

Bảng 3.2 Kết quả đánh giá độ đặc hiệu bằng xét nghiệm ELISA 47

Bảng 3.3 Bảng đánh giá đặc tính mẫu bằng sinh phẩm test nhanh 49

Bảng 3.4 Bảng đánh giá đặc tính mẫu bằng sinh phẩm ELISA 49

Bảng 3.5 Kết quả đánh giá tính đồng nhất bộ mẫu KD 51

Bảng 3.6 Kết quả đánh giá tính đồng nhất bộ mẫu LD 52

Bảng 3.7 Kết quả đánh giá tính đồng nhất bộ mẫu KA 53

Bảng 3.8 Kết quả đánh giá tính đồng nhất bộ mẫu LA 54

Bảng 3.19 Độ ổn định dài hạn bộ mẫu KD80 lưu trữ -80ºC 55

Bảng 3.10 Độ ổn định dài hạn bộ mẫu KD20 lưu trữ -20ºC 56

Bảng 3.11 Độ ổn định dài hạn bộ mẫu LD80 lưu trữ -80ºC 57

Bảng 3.12 Độ ổn định dài hạn bộ mẫu LD20 lưu trữ -20ºC 58

Bảng 3.13 Độ ổn định dài hạn bộ mẫu KA80 lưu trữ -80ºC 60

Bảng 3.14 Độ ổn định dài hạn bộ mẫu KA20 lưu trữ -20ºC 61

Bảng 3.15 Độ ổn định dài hạn bộ mẫu LA80 lưu trữ -80ºC 62

Bảng 3.16 Độ ổn định dài hạn bộ mẫu LA20 lưu trữ -20ºC 63

Bảng 3.17 So sánh độ ổn định của các bộ mẫu sản xuất bằng 64

phương pháp đông khô và đông lạnh sau 12 tuần ở -80°C và -20°C 65

Bảng 3.18 Kết quả đánh giá độ ổn định ngắn hạn bộ mẫu KD 66

ở nhiệt độ thường 66

Bảng 3.19 Kết quả đánh giá độ ổn định ngắn hạn bộ mẫu LD 67

ở nhiệt độ 30°C 67

Bảng 3.20 Kết quả đánh giá độ ổn định ngắn hạn bộ mẫu KA 68

ở nhiệt độ thường 68

Bảng 3.21 Kết quả đánh giá độ ổn định ngắn hạn bộ mẫu LA 69

ở nhiệt độ 30°C 69

Bảng 3.22 Mức độ kháng thể IgG-H pylori sau vận chuyển 70

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 1.1 Sơ đồ vị trí của ngoại kiểm trong phòng xét nghiệm 17

Sơ đồ 2.1 Sơ đồ quy trình thực hiện 30

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỔ

Biều đồ 3.1 Biểu đồ theo dõi độ ổn định bộ mẫu KD và LD 59Biều đồ 3.2 Biểu đồ theo dõi độ ổn định bộ mẫu KA và LA 64

ĐẶT VẤN ĐỀ

Nhiễm Helicobacter pylori (H pylori) là một trong những bệnh nhiễm

khuẩn dai dẳng thường gặp, ảnh hưởng đến gần 50% dân số thế giới, có liênquan chặt chẽ với các bệnh về dạ dày như viêm-loét dạ dày, viêm dạ dày-ruột,

u lympho niêm mạc (MALT-Mucosa Associated Lymphoid Tissue) và ungthư dạ dày (UTDD) - nguyên nhân tử vong lớn thứ hai liên quan đến ung thư[22], [24], [53] Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) cùng Cơ quan Nghiên cứu

UTDD [19] Hiện nay, có nhiều phương pháp chẩn đoán khác nhau với độnhạy và độ đặc hiệu cao trên 90% được xem là cần thiết để chẩn đoán nhiễm

H pylori trong thực hành lâm sàng [52] Trong đó, phải kể đến vai trò của xét

nghiệm huyết thanh học bằng test nhanh Gần đây, việc sử dụng xét nghiệmtest nhanh bằng kỹ thuật sắc ký miễn dịch với dấu ấn CIM (Current Infection

Marker) đánh dấu tình trạng đang nhiễm trùng được xem là có ý nghĩa thiết

thực cho việc phát hiện các kháng thể IgG kháng H pylori trong mẫu huyết

thanh

Với mức độ sử dụng phổ biến tại các cơ sở y tế từ quận/huyện đến

tỉnh/thành phố, xét nghiệm test nhanh H pylori được xem là lựa chọn thích

hợp do tính thuận tiện, cho kết quả nhanh chóng, đảm bảo thực hiện được trêntất cả các đối tượng bệnh nhân (người già, trẻ em, người lần đầu bị nhiễm,xuất huyết đường tiêu hóa không có điều kiện nội soi,…) Tuy nhiên, theo kết

quả ghi nhận từ chương trình ngoại kiểm huyết thanh học H pylori tại Phần

Lan cho thấy một tỷ lệ âm tính giả cao thực hiện chủ yếu trên các sinh phẩmtest nhanh [21] Do đó, vấn đề đặt ra là xét nghiệm test nhanh có đủ tin cậy để

hỗ trợ tốt nhất cho công tác chẩn đoán và điều trị, đòi hỏi các PXN phải tối ưuhóa chất lượng xét nghiệm (CLXN) hơn nữa thông qua công cụ đánh giá chấtlượng xét nghiệm từ bên ngoài hay ngoại kiểm tra

Ngoại kiểm là một tiêu chí bắt buộc được quy định theo Thông tư01/2013/TT-BYT [1] làm căn cứ cho việc liên thông và công nhận kết quả xétnghiệm cùng với Quyết định số 316/QĐ-TTg của Thủ tướng Chính phủ nhằmnâng cao năng lực hệ thống CLXN, đồng thời hội nhập vào mạng lưới kiểmchuẩn trong khu vực và quốc tế [7] Trên thế giới, chương trình ngoại kiểm

huyết thanh học H pylori ứng dụng cho cả xét nghiệm định tính bằng test

nhanh và bán định lượng đã được triển khai tại Úc, Phần Lan, Đức [21], [48].Tuy nhiên, cho đến nay Việt Nam chưa có bất kỳ công trình nào về ngoại

kiểm test nhanh H pylori được công bố Chúng tôi tin rằng việc triển khai

chương trình ngoại kiểm test nhanh đáp ứng tiêu chuẩn ISO 13528:2015 vàISO/IEC 17043 trong chẩn đoán tại Việt Nam là hoàn toàn hữu ích góp phầnchuẩn hóa, nâng cao CLXN và hỗ trợ chẩn đoán trên lâm sàng [10], [14].Xuất phát từ những cơ sở khoa học và thực tiễn trên, chúng tôi thực hiện đề

tài “Nghiên cứu quy trình sản xuất thử nghiệm mẫu huyết thanh ứng

dụng trong ngoại kiểm test nhanh H pylori”.

CÂU HỎI NGHIÊN CỨU

Bộ mẫu huyết thanh chứa kháng thể IgG kháng H pylori trong nghiên

cứu sản xuất thử nghiệm ứng dụng trong ngoại kiểm test nhanh có đạt tínhđồng nhất, độ ổn định đáp ứng các tiêu chuẩn trong ngoại kiểm tra chất lượngxét nghiệm hay không?

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

1 Nghiên cứu sản xuất thử nghiệm bộ mẫu huyết thanh chứa kháng thể

IgG kháng H pylori ứng dụng trong ngoại kiểm test nhanh.

2 Đánh giá tính đồng nhất của bộ mẫu huyết thanh sau quá trình sản xuấtthử nghiệm

3 Đánh giá độ ổn định của bộ mẫu huyết thanh sau quá trình sản xuất thửnghiệm

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Khái quát về vi khuẩn Helicobacter pylori

1.1.1 Lịch sử phát hiện

Vào năm 1979, Warren (nhà khoa học người Úc) đã quan sát thấy trêntiêu bản giải phẫu bệnh lý viêm loét dạ dày - tá tràng thường có một loại vikhuẩn dạng xoắn nằm ở lớp niêm mạc Ông đưa ra giả thuyết vi khuẩn này làcăn nguyên gây viêm loét dạ dày - tá tràng Năm 1981, Marshall (Úc) đã bắtđầu tìm phương pháp phân lập vi khuẩn này ở phòng thí nghiệm vi sinh vànuôi cấy thành công một năm sau đó (1982) Lúc đầu, Marshall và Warren đã

nhận thấy vi khuẩn này giống Campylobacter jejuni nên đặt tên là

Campylobacter pyloridis, sau gọi là Campylobacter pylori vào năm 1987.

Năm 1989, Goodwin và cộng sự đã nghiên cứu cấu trúc tế bào cho thấycấu trúc lông của vi khuẩn này khác hẳn với giống Campylobacter, đồng thờitính chất sinh hóa, cấu trúc chuỗi RNA ribosom 16S cũng khác biệt nên xếpchúng vào giống mới-giống Helicobacter thuộc họ Helicobacteriaceae Do đó,

vi khuẩn Campylobacter pylori được đổi tên thành Helicobacter pylori [6].

Nhờ vào công trình này họ đã được trao giải thưởng Nobel Y học vào năm

2005 [38]

1.1.2 Đặc điểm sinh học của vi khuẩn

Helicobacter pylori là một vi khuẩn gram âm, có hình xoắn hoặc hơi

cong, kích thước 0,5-1,0 µm x 2,5-4,5 µm, có 1-5 lông ở một đầu, rất di độngtrong môi trường lỏng và không sinh nha bào Bên cạnh, có thể chuyển thànhdạng hình cầu khi ở môi trường không thuận lợi Đây là một trong số nhữngsinh vật đa kiểu hình nhất

Có hệ thống enzyme rất hoạt động như catalase, oxidase, đặc biệt làurease dương tính rất mạnh và thuộc loại vi hiếu khí Điều kiện thuận lợi cho

C trong

môi trường thích hợp H pylori chứa khoảng 1500 gen và không đồng nhất về

mặt di truyền, nhờ đặc tính này giúp vi khuẩn thích nghi với dạ dày của kýchủ cũng như những kiểu đáp ứng miễn dịch riêng của ký chủ đối với tình

trạng nhiễm H pylori [6].

Hình 1.1 Hình ảnh vi khuẩn Helicobacter pylori

Nguồn: “MicrobeWiki, Professor D J Kelly”

1.1.3 Kháng nguyên và độc tố

 Kháng nguyên

H pylori có hai loại kháng nguyên (KN) chính: KN O (KN thân) bản

chất là lipopolysaccharide chịu nhiệt và KN H (KN lông) bản chất là protein

không chịu nhiệt KN O có tính độc đối với tế bào ký chủ mà H pylori ký

sinh Ngoài ra còn có một số KN có vai trò quan trọng liên quan đến khả nănggây bệnh như KN adhesin giúp vi khuẩn kết dính vào tế bào niêm mạc và KNcytotoxin gây độc tế bào [6]

 Độc tố

Hai độc tố: Protein CagA do gen cagA (Cytotoxin associated gen A) mãhóa và protein VacA do gen VacA (Vacuolating cytotoxin A) mã hóa Chúnghiện diện tùy theo chủng phân lập từ dạ dày và theo tình trạng bệnh [5]

Gen CagA có hai týp là Western và East Asian H pylori chuyển CagA vào tế

bào biểu mô dạ dày của ký chủ theo hệ thống chế tiết protein týp IV, CagAđược phosphoryl hóa sẽ tương tác với một loạt các phân tử tín hiệu của tế bào

dày thể nặng, viêm teo dạ dày, loét dạ dày và UTDD

thích tạo không bào trong tế bào biểu mô Gen VacA có ba kiểu gen là s1/m1,s1/m2 và s2/m2 VacA tạo các lỗ trống trên màng tế bào, phá hủy hoạt động

ẩm bào và lysosome, kích thích sự chết tế bào theo chương trình (apoptosis)của tế bào

Dựa trên sự hiện diện hay vắng mặt của 02 gen CagA và VacA, người

ta xác định được 04 genotype của H pylori bao gồm:

 Genotype I với CagA (+) và VacA (+);

 Genotype II với CagA (-) và VacA (-);

 Genotype III với CagA (+) và VacA (-);

 Genotype IV với CagA (-) và VacA (+)

Theo WHO, H pylori genotype I là tác nhân hàng đầu gây ung thư biểu

mô dạ dày [53]

1.1.4 Các yếu tố nguy cơ và đường lây

Malcolm và cộng sự (2004) [36] đã báo cáo tình trạng nhiễm H pylori

có liên quan đến tuổi, giới tính và các điều kiện kinh tế xã hội Theo Rahul vàcộng sự (2015) [48] đã ghi nhận tình trạng hút thuốc, điều kiện kinh tế xã hộithấp, mức độ tiêu thụ thịt, ăn thực phẩm nhà hàng và uống nước không được

lọc sạch là các yếu tố nguy cơ đối với nhiễm H pylori.

Nghiên cứu của Mohamad (2011) [41] cho thấy nhóm máu hệ ABO, tuổi

và giới tính ảnh hưởng đến tình trạng nhiễm H pylori Bên cạnh đó, kết quả

từ nghiên cứu cũng cho thấy nhóm máu O dễ bị nhiễm H pylori và biến

chứng dạ dày hơn các nhóm máu hệ ABO khác, trong khi không có sự khácbiệt đáng kể giữa các bệnh nhân Rh (+) và Rh (-) Ngoài ra, kết quả còn cho

thấy tình trạng nhiễm H pylori thường gặp nhiều ở phụ nữ và thanh thiếu

niên

Ở Việt Nam, nghiên cứu của Trương Văn Lâm và cộng sự (2011) [4] chothấy số người trong gia đình, tình trạng hôn nhân, tiền sử bản thân bệnh dạdày - tá tràng, nguồn nước sông là những yếu tố nguy cơ liên quan đến nhiễm

khuẩn H pylori.

Cho đến nay phương thức lây truyền H pylori vẫn chưa được xác định

rõ ràng Tuy nhiên, các nghiên cứu đã cho thấy vi khuẩn H pylori có thể lan

truyền trực tiếp từ người này sang người khác hoặc gián tiếp từ người bịnhiễm sang môi trường Sự lây truyền từ người sang người bằng đường uống,bằng miệng hoặc phân - miệng được xem là đường lây chính Nhiều tác giả

cũng đã nghiên cứu các nguồn lây nhiễm H pylori và các yếu tố nguy cơ đối

với cả đường truyền miệng và đường uống, ăn thực phẩm bị ô nhiễm, uốngnước bị ô nhiễm và tiếp xúc với động vật [40]

1.1.5 Miễn dịch

H pylori không xuyên qua lớp biểu mô dạ dày nhưng gây tổn thương do

phản ứng viêm cấp, tiếp đến là quá trình viêm mạn Lúc đầu, các bạch cầu hạttập trung nhiều tới vùng tổn thương nhưng sự thực bào của bạch cầu hạt vàđại thực bào đều bị ức chế

Hệ thống miễn dịch đặc hiệu được hoạt hóa bằng việc sản xuất kháng thểlớp IgM, IgG và IgA ở cả dạ dày và hệ thống tuần hoàn IgA tại dạ dày không

thể xuyên qua lớp chất nhầy, do đó không ngăn được vi khuẩn H pylori bám dính vào niêm mạc Vi khuẩn này bị bổ thể phân giải in vitro nhưng in vivo nó

được bảo vệ do các yếu tố ức chế hệ thống bổ thể tự nhiên

KT lớp IgM và IgG được tạo ra do đại thực bào nuốt một số vi khuẩn,gây đáp ứng miễn dịch trong hệ tuần hoàn Vi khuẩn vẫn thoát khỏi được hệmiễn dịch mặc dù cơ thể có đáp ứng miễn dịch dịch thể và miễn dịch tế bàomạnh Lúc đầu, tế bào hạt xâm nhập lớp duới biểu mô sẽ kích hoạt một phảnứng viêm cấp mạnh, khi đáp ứng viêm trở nên mạn tính, bạch cầu đơn nhânxâm nhập gây nhiễm khuẩn mạn tính

Hiện nay, có nhiều phương pháp chẩn đoán khác nhau với độ nhạy và độ

đặc hiệu cao trên 90% được xem là cần thiết để chẩn đoán nhiễm H pylori

Nghiên cứu của Hoii JKI và cộng sự (2017) [27] đã cho thấy nhiễm

trùng H pylori vẫn tiếp tục là một vấn đề sức khỏe mang tính cộng đồng lớn

trên toàn thế giới Vào năm 2015, uớc tính khoảng 4,4 tỷ người dương tính

với vi khuẩn H pylori trên toàn cầu Tỷ lệ nhiễm cao nhất ở châu Phi

(79,1%), châu Mỹ Latinh và Caribê (63,4%) và châu Á (54,7%) Ngược lại, ởBắc Mỹ (37,1%) và châu Đại Dương (24,4%) có tỷ lệ nhiễm thấp nhất Vào

đầu thế kỷ XXI, tỷ lệ nhiễm H pylori đã giảm ở các nước công nghiệp hóa

thuộc phương Tây trong khi tỷ lệ hiện này tại các nước đang phát triển vàcông nghiệp mới vẫn còn ở mức cao

Nguồn: “Hooi và cộng sự (2017)” [27]

Hình 1.2 Tình hình nhiễm H pylori trên thế giới

Tại khu vực Bắc Âu và Bắc Mỹ, khoảng 1/3 người trưởng thành bị

nhiễm H pylori, trong khi ở nam và đông Âu, nam Mỹ và châu Á tỷ lệ nhiễm

thường cao hơn 50% Những người nhập cư đến từ các quốc gia có tỷ lệnhiễm cao ở các nước đang phát triển và thấp hơn ở các nước phát triển Tỷ lệ

Biển Ả Rập Biển Đông

nhiễm H pylori tăng dần theo tuổi và có đến 80% người dân Việt Nam ở độ

tuổi 40-50 nhiễm vi khuẩn này [26]

Một nghiên cứu của Jiang JX và cộng sự (2016) [31] đã chứng minh

một xu hướng giảm nhiễm H pylori song song với việc giảm tình trạng loét

dạ dạy - tá tràng từ năm 2003 đến 2012 ở Đông Nam Trung Quốc Tỷ lệ

nhiễm H pylori giảm từ 42,4% xuống còn 23,82% Trong khi đó, tỷ lệ viêm

loét dạ dày giảm nhanh chóng từ 12,65% xuống 6,57% và từ 7,51% xuống3,78% tương ứng Các kết quả đã cho thấy mối tương quan giữa xu hướng

giảm các bệnh viêm dạ dày mạn tính và tỷ lệ giảm nhiễm H pylori.

Ở Việt Nam, Vương Tuyết Mai và cộng sự (2001) [5] đã sử dụng kỹ

thuật ELISA phát hiện tỷ lệ nhiễm H pylori ở 528 ở người khỏe mạnh trong

quần thể nghiên cứu tỷ lệ nhiễm lên đến 75,2% như nhau ở nam và nữ Kết

quả nghiên cứu đã cho thấy tỷ lệ nhiễm H pylori ở trẻ nhỏ thấp hơn người

lớn, xuất hiện ở cả nhóm 1-2 tuổi Trong một nghiên cứu của Lê Thọ và cộng

sự (2012) [9] đã ghi nhận có 40% (474/1186) trẻ từ 6 tháng đến 15 tuổi nhiễm

H pylori Trẻ em sống ở tỉnh Lâm Đồng có tỷ lệ nhiễm H pylori thấp nhất,

tiếp theo ở Đắk Lắk và trẻ em ở Gia Lai có tỷ lệ nhiễm cao nhất

1.1.7 Tầm quan trọng của việc chẩn đoán nhiễm H pylori

Các thống kê cho thấy có đến hơn 90% bệnh nhân viêm dạ dày có sự

hiện diện của khuẩn H pylori Trong đó, có 80% trường hợp nhiễm gây ra

tình trạng đau dạ dày mạn tính, 15-20% bị viêm teo dạ dày mạn tính và gần1% chuyển thành ung thư Mặc dù tỷ lệ nhiễm cao tuy nhiên chỉ có một tỷ lệnhỏ các cá nhân bị nhiễm bệnh có biểu hiện lâm sàng của bệnh, đồng thời cácđiều kiện ảnh hưởng đến quá trình lây nhiễm vẫn chưa được xác định đầy đủ

Ở Việt Nam đã ghi nhận tỷ lệ tái nhiễm H pylori rất cao, trung bình 11 tháng

sau khi vi khuẩn được diệt trừ có tỷ lệ tái nhiễm là 23,9%, trong đó 58,8%

nhiễm lại chủng vi khuẩn cũ [54] Tỷ lệ này ngày càng gia tăng ở Việt Nam

đã trở thành gánh nặng cho cả hệ thống y tế

Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), nguyên nhân chủ yếu gây UTDD là

do viêm dạ dày - tá tràng mạn tính và do nhiễm vi khuẩn H pylori UTDD là

loại ung thư phổ biến ở đường tiêu hóa, tỷ lệ tử vong rất cao, đứng hàng thứhai chỉ sau ung thư phổi [53] Tuy nhiên, trên 80% đối tượng bị nhiễm khuẩn

H pylori trong dạ dày không có biểu hiện triệu chứng Do đó thách thức đặt

ra về một chẩn đoán chính xác nhiễm H pylori là vô cùng quan trọng.

1.1.8 Phương pháp chẩn đoán nhiễm H pylori

 Chẩn đoán trực tiếp

Bệnh phẩm là mẫu mô sinh thiết niêm mạc dạ dày, được lấy qua nội soi,

và được bảo quản trong dung dịch NaCl 0,9% ở nhiệt độ 4°C tối đa trong 5giờ [6]

Nghiền nát bệnh phẩm rồi làm phết nhuộm để nhuộm Gram Sau đó

quan sát hình thể và tính chất bắt màu của vi khuẩn H pylori dưới kính hiển

vi ở vật kính x100, có thể dùng kỹ thuật nhuộm huỳnh quang miễn dịch trên

lam kính để xác định H pylori

Cấy bệnh phẩm sau khi nghiền nát vào thạch máu có chọn lọc (hoặc môitrường Pylori-agar, Skirow’s cải tiến, Columbia, BHI-agar có thêm 10% máungựa)

Xét nghiệm này có kết quả khá chính xác, giúp theo dõi điều trị nhiễm vi

khuẩn H pylori

 Phương pháp sinh học phân tử

Bệnh phẩm là các mẫu mô niêm mạc dạ dày, dịch dạ dày, nước bọt vàphân bệnh nhân Sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử khác nhau như PCR,

Realtime-PCR, Multiplex-PCR,…) Việc xác định genotype H pylori có ý

nghĩa lớn trong nghiên cứu sinh bệnh học, lên kế hoạch tầm soát, theo dõi

bệnh nhân nhiễm H pylori, phát hiện yếu tố nguy cơ cao và giúp chẩn đoán

sớm UTDD

 Chẩn đoán gián tiếp

Các xét nghiệm phát hiện hoạt tính của men Urease Giúp phát hiện hoạt

động sống (sinh men Urease) của H pylori Các xét nghiệm này được sử dụng rộng rãi để chẩn đoán nhiễm khuẩn H pylori và có thể thực hiện trên

bệnh phẩm hoặc ở người [6]

Cho mẫu sinh thiết dạ dày vào môi trường Urea có chất chỉ thị màu Nếu

trong bệnh phẩm không có H pylori, môi trường sẽ không đổi màu.

Xét nghiệm miễn dịch enzyme để phát hiện sự hiện diện của kháng thể

IgG kháng H pylori trong huyết thanh hoặc huyết tương người Hiện nay trên

thị trường có nhiều bộ kit khác nhau dùng để chẩn đoán nhiễm H pylori theo

đó độ nhạy và độ đặc hiệu cũng khác nhau tùy từng bộ kit

Bảng 1.1 Độ nhạy, độ đặc hiệu các bộ kit ELISA

Helicobacter pylori IgG ELISA

Xét nghiệm miễn dịch liên kết enzyme pha rắn dựa trên nguyên lý kẹp

“sandwich” Các giếng đã được phủ kháng nguyên của H.pylori Các kháng

thể đặc hiệu của mẫu liên kết với các giếng đươc phủ kháng nguyên và đượcphát hiện do một kháng thể liên hợp enzyme thứ cấp (E-Ab) đặc hiệu cho IgG

ở người Sau phản ứng chất nền, cường độ của màu tăng tỷ lệ thuận với lượngkháng thể IgG đặc hiệu được phát hiện Kết quả của mẫu có thể được xác địnhtrực tiếp bằng đường cong chuẩn

Các phương pháp bán định lượng ELISA thường được sử dụng trong cácnghiên cứu Nó cho phép xác định hiệu giá kháng thể IgG để so sánh với cácmẫu huyết thanh ở giai đoạn cấp tính và hồi phục 3-6 tháng hoặc lâu hơn

Phát hiện kháng thể IgG kháng H pylori, mức độ kháng thể cao xuất hiện

ngay khi mới bắt đầu hoặc đang nhiễm Một số nghiên cứu đã chứng minh xétnghiệm IgA ít nhạy cảm và ít đặc hiệu hơn so với xét nghiệm IgG.

Nghiên cứu của Hung HH và cộng sự (2010) [28] đã cho thấy độ nhạy,

độ đặc hiệu, giá trị tiên đoán dương (PPV), giá trị tiên đoán âm (NPV) và độchính xác của ELISA lần lượt là là 93,5%; 94,4%; 95,6%; 91,9% và 93,9% ởbệnh nhân < 45 tuổi và 100%; 81,3%; 94,3%; 100% và 95,6% ở bệnh nhân

45 tuổi Ở bệnh nhân viêm dạ dày teo đét, xét nghiệm này có độ nhạy và

độ đặc hiệu lần lượt là 100%; 86,7% và trên bệnh nhân viêm dạ dày khôngteo là 96,5%; 91,9% tương ứng Trong nghiên cứu của Aziz F và cộng sự(2013) [17] cũng cho thấy độ nhạy, độ đặc hiệu và độ chính xác của bộ kit

sELISA (In-house ELISA based on H pylori sonicate whole cell antigen) lần

lượt là 98%; 100% và 98% ELISA là một xét nghiệm được thiết kế và chuẩnhóa tốt cho việc phát hiện kháng thể

Nguyên tắc: Huyết thanh được đặt trên một dải sắc ký có chứa sẵn

những kháng nguyên đặc hiệu, phản ứng ngưng kết sẽ xảy ra trong vòng 2-3phút và cho kết quả chẩn đoán dương tính

Một phát triển gần đây trong chẩn đoán nhiễm H pylori là xét nghiệm test nhanh sử dụng kỹ thuật sắc ký miễn dịch với bộ kit Assure H pylori

Rapid Test có khả năng dự đoán cao, giúp phát hiện nhanh kháng thể IgG rất

hữu ích cho chẩn đoán nhiễm H pylori đối với những nơi không có điều kiện

nội soi Hơn nữa, sự có mặt của kháng thể IgG kháng kháng nguyên CIM(Current Infection Marker) còn cho thấy một dấu hiệu đang nhiễm trùng.Trong đó, CIM là một protein kháng nguyên tổng hợp bằng kỹ thuật DNA tái

tổ hợp và tương đồng với protein do H pylori tiết ra Độ chính xác, độ nhạy,

độ đặc hiệu, giá trị tiên đoán dương, giá trị tiên đoán âm của xét nghiệm CIM

lần lượt là 93,2%; 90,5%; 94,9%; 87,5% và 92,3% Xét nghiệm này đơn giản,

nhanh chóng, chính xác và hữu ích cho việc chẩn đoán không xâm hại nhiễm

H pylori [52].

Hình 1.3 Xét nghiệm sắc ký miễn dịch với bộ kit ASSURE ®

H pylori Rapid Test.

1.2 Ngoại kiểm tra chất lƣợng xét nghiệm (EQA)

1.2.1 Định nghĩa

Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), thuật ngữ ngoại kiểm tra (EQA)được định nghĩa như một hệ thống đánh giá khách quan năng lực của PXN domột cơ quan độc lập từ bên ngoài triển khai Các mẫu chuẩn đồng nhất chưabiết trước giá trị (mẫu mù) sẽ được đơn vị ngoại kiểm gửi đến các PXN thamgia, qua đó cho phép thực hiện xét nghiệm và so sánh liên phòng

EQA là một công cụ quan trọng liên quan đến việc giám sát giúp cácPXN phát hiện các yếu tố nguy cơ tiềm ẩn từ đó giúp giải quyết, phòng ngừa,cải tiến liên tục, nâng cao CLXN theo thời gian và hướng đến một sự côngnhận EQA cung cấp một dữ liệu khách quan, độc lập và đồng hành cùng IQC(Internal Quality Control-Nội kiểm tra) trong vai trò thúc đẩy sự phát triểncủa hệ thống đảm bảo CLXN [55]

Dương tính Âm tính Không xác định

1.2.2 Phương thức áp dụng ngoại kiểm

Hình 1.4 Các phương thức trong ngoại kiểm tra

Có 03 phương thức sử dụng trong ngoại kiểm, mỗi phương thức đều có ưuđiểm và nhược điểm riêng [55]:

- Thử nghiệm độ thành thạo (Proficiency Testing-PT): nhà cung cấpchương trình ngoại kiểm sẽ gửi các mẫu chưa biết trước giá trị đến một bộphận các PXN Kết quả của các PXN sẽ được phân tích, so sánh và phản hồilại cho từng đơn vị, theo đó các PXN sẽ xem xét và khắc phục các sai số (nếucó)

- Kiểm tra lại, phân tích lại (Rechecking/Retesting): các PXN chọn ngẫunhiên mẫu nghiệm phẩm gửi đến phòng xét nghiệm tham chiếu hoặc đơn vịkiểm chuẩn để phân tích và đánh giá lại các kết quả mà PXN đã thực hiện

- Đánh giá tại chỗ (Onsite Evaluation): được tiến hành khi 02 phương

thức thử nghiệm độ thành thạo và kiểm tra lại/phân tích lại khó thực hiện.Trong đó, thử nghiệm độ thành thạo (PT) là phương thức được sử dụngphổ biến nhất vì hiệu quả đạt được cao hơn 02 phương pháp còn lại

1.2.3 Vị trí và tầm quan trọng của ngoại kiểm

Ngoại kiểm tra chất lượng xét nghiệm là một yêu cầu cơ bản, thiết yếutrong tất cả các hệ thống chất lượng liên quan đến hoạt động của các PXN và

là thước đo hiệu suất, đảm bảo độ chính xác, tin cậy của các kết quả xétnghiệm, duy trì và cải tiến chất lượng dịch vụ PXN đảm bảo vì lợi ích củabệnh nhân Việc tham gia ngoại kiểm sẽ giúp đánh giá độ tin cậy của phươngpháp, vật liệu, thiết bị và giám sát tác động của đào tạo, giúp cải thiện hệthống quản lý chất lượng PXN

Hơn nữa, tham gia ngoại kiểm là cơ sở khoa học cho việc công nhậnđạt chất lượng và chuẩn hóa các PXN đồng thời là phương tiện giúp so sánhchất lượng giữa các PXN với nhau Là cơ hội để các PXN hòa nhập vào mạnglưới kiểm chuẩn trong khu vực và thế giới

Sơ đồ 1.1 Sơ đồ vị trí của ngoại kiểm trong phòng xét nghiệm

Nội kiểm tra

Chính sách chất lƣợng

(QP)

Kiểm soát chất lƣợng

1.2.4 Mẫu ngoại kiểm

Dựa theo TCVN 7366:2011 (tương đương ISO Guide 34:2009) quy địnhyêu cầu chung về năng lực của nhà sản xuất mẫu chuẩn, theo đó thuật ngữ mẫuchuẩn được giải thích rất rõ Đồng thời yêu cầu nhà sản xuất phải xác định cácbước thực hiện từ giai đoạn thu thập mẫu, xử lý mẫu, phân tích mẫu đến giaiđoạn điều chế mẫu đảm bảo tính đồng nhất, độ ổn định [11]

Ngoài ra, nhà xuất mẫu chuẩn phải đáp ứng các tiêu chuẩn của TCVN17043:2011 (tương ứng với ISO 17043:2010) về đánh giá sự phù hợp-yêu cầuchung đối với thử nghiệm thành thạo Mẫu sản xuất phải đảm bảo đạt tính đồngnhất và độ ổn định, đồng thời nhà sản xuất phải thiết lập tiêu chí đối với tínhđồng nhất và độ ổn định phù hợp theo TCVN 9596:2013 (tương ứng với ISO13528:2003) về phương pháp thống kê dùng trong thử nghiệm độ thành thạobằng so sánh liên phòng [10], [14]

 Mẫu chuẩn

Vật liệu hay chất có một hay nhiều giá trị về tính chất của nó được xác định

đủ đồng nhất và tốt hiệu chuẩn một thiết bị, đánh giá một phương pháp đo hoặc để

ấn định các giá trị của vật liệu Vật liệu đủ đồng nhất và ổn định về một hoặcnhiều tính chất quy định, được thiết lập phù hợp với việc sử dụng đã định trongmột quá trình đo [11]

Các thuật ngữ liên quan vật liệu [12]:

 Mẫu chuẩn (RM-Reference Material): Là một thuật ngữ chung dùng

để chỉ vật liệu, đủ đồng nhất và ổn định về một hoặc nhiều tính chất quy định,được thiết lập phù hợp với việc sử dụng đã định trong một quá trình đo, cóthể định lượng hoặc định tính Một RM riêng lẻ không thể được sử dụng cho

cả việc hiệu chuẩn và xác nhận giá trị sử dụng trong cùng thủ tục đo

 Mẫu chuẩn đƣợc chứng nhận (CRM-Certified Reference

Material): Mẫu chuẩn có kèm theo giấy chứng nhận, trong đó một hay nhiều

giá trị về tính chất của nó được chứng nhận theo một thủ tục nhằm thiết lập sựliên kết với việc thể hiện chính xác đơn vị mà theo đó các giá trị về tính chấtđược biểu thị ra và mỗi giá trị được chứng nhận có kèm theo độ không đảmbảo tương ứng ở mức tin cậy quy định.

Cho đến thời điểm hiện tại, chưa có bất kỳ đơn vị sản xuất mẫu ngoạikiểm nào cung cấp 02 loại bộ mẫu trên (RM và CRM) cho chương trình ngoại

kiểm test nhanh H pylori Chính vì thế, chúng tôi quyết định sản xuất thử nghiệm bộ mẫu huyết thanh chứa kháng thể IgG kháng H pylori dùng trong

ngoại kiểm test nhanh

 Mô tả đặc tính (characterization): Là quá trình xác định tính chất

(cần định lượng) của một mẫu chuẩn và là một phần của quá trình chứngnhận

 Tính đồng nhất (homogeneity): Là tính chất cần thiết và tiêu chuẩn

bắt buộc để đảm bảo cung cấp các bộ mẫu chuẩn cho các đơn vị tham giangoại kiểm đủ tính đồng nhất nhằm cho kết quả khách quan khi so sánh liênphòng [58] Điều kiện để có cấu trúc hoặc thành phần cấu tạo giống nhau đốivới một hoặc nhiều tính chất xác định Mẫu chuẩn được xem là đồng nhất vềmột tính chất xác định nếu giá trị tính chất, khi được xác định bằng thửnghiệm trên mẫu có cỡ mẫu qui định, là nằm trong giới hạn độ không đảmbảo đo qui định, với mẫu được lấy từ các đơn vị cung cấp khác nhau (chai,gói,…) hoặc từ một đơn vị cung cấp

• Độ ổn định (stability): Khả năng một mẫu chuẩn, khi được bảo quản ở

điều kiện xác định, duy trì giá trị tính chất đã công bố trong giới hạn qui địnhtrong một khoảng thời gian xác định Trong đó:

- Độ ổn định ngắn hạn (short-term stability): Là độ ổn định về một

tính chất của mẫu chuẩn trong suốt quá trình vận chuyển ở những điều kiệnvận chuyển quy định

- Độ ổn định dài hạn (long-term stability): Là độ ổn định về một tính

chất của mẫu chuẩn ở những điều kiện bảo quản quy định của nhà sản xuấtmẫu chuẩn được chứng nhận

 Đánh giá tính đồng nhất

Dựa trên tiêu chuẩn quốc gia TCVN 9596:2013, tất cả các mẫu sử dụng làmvật liệu ngoại kiểm phải đảm bảo tính đồng nhất trong từng bộ mẫu sản xuất,được thực hiện sau khi mẫu chuẩn đã được đóng gói ở dạng cuối cùng Việcthực hiện bao gồm lấy mẫu ngẫu nhiên và thực hiện các phép phân tích để chứngminh vật liệu là đủ đồng nhất Nếu mẫu chuẩn được sản xuất trong các bộ khácnhau thì cần kiểm tra tính tương đương của từng bộ mẫu [14]

Việc chọn mẫu phụ thuộc chủ yếu vào việc nghiên cứu tính đồng nhấtgiữa các đơn vị bao gói Số lượng tối thiểu các đơn vị bao gói được lựa chọnngẫu nhiên từ 10 đến 30, nhưng thường không ít hơn 10 Có thể xác định sốlượng mẫu tối ưu cho nghiên cứu tính đồng nhất bằng kỹ thuật thiết kế có sự

hỗ trợ của phương pháp thống kê Số lượng đơn vị bao gói phụ thuộc vào cỡ

bộ mẫu, sao cho số lượng mẫu lấy từ mỗi bộ mẫu có thể được xem là “đạidiện” của toàn bộ bộ mẫu [13]

ổn định của vật liệu trong suốt quá trình vận chuyển không vượt quá độ không

ổn định của vật liệu tại nơi lưu giữ của nhà sản xuất [14]

Nghiên cứu độ ổn định thường được thực hiện ở các nhiệt độ khác nhau,

để nghiên cứu tác động của các nhiệt độ khác nhau tới tính chất của vật liệu.Nhiệt độ của mẫu có thể thay đổi trong quá trình vận chuyển từ -50°C lên đến70°C, tùy thuộc vào dạng bao gói và phương thức vận chuyển Một nghiêncứu độ ổn định thường mất khoảng 02 tháng nhưng chỉ liên quan đến điềukiện bảo quản Thiết kế cho nghiên cứu độ ổn định, bao gồm xác định số thờiđiểm tối ưu và số mẫu trong đó, có thể dựa vào thiết kế thống kê [13]

1.3 Tình hình ngoại kiểm trên thế giới và tại Việt Nam.

1.3.1 Trên thế giới

Tại Thái Lan, các chương trình ngoại kiểm đã được các chuyên gia củaWHO khởi xướng vào năm 1973 Theo đó, các mẫu thử nghiệm độ thành thạo(PT) được gửi đến các PXN tham gia 3-4 đợt/năm Đại học Mahidol đã tổchức các chương trình ngoại kiểm về hóa sinh, hormone, kính hiển vi, miễndịch và huyết thanh học Chương trình ngoại kiểm đầu tiên được thành lậpvào năm 1986 và các chương trình còn lại được thành lập vào năm 1999 [44].Vào năm 2014, Chương trình đảm bảo chất lượng Đại học Hoàng gia vềbệnh học (RCPAQAP - Úc) đã giới thiệu một chương trình ngoại kiểm về xétnghiệm nhanh tại giường POCT-HIV dùng các mẫu máu thu thập từ đầu ngóntay Kết quả cho thấy hiệu suất các PXN tham gia đã được cải thiện, từ năm

2014 đến năm 2015 độ nhạy tăng từ 97,7% lên 99,3% và độ đặc hiệu tăng từ95,3% lên đến 98,6% Bên cạnh đó, từ năm 2012 RCPAQAP cũng đã cungcấp chương trình ngoại kiểm POCT - Influenza (Cúm) với các mẫu vật làvirus bất hoạt từ các chủng cúm A và B ở người Hiệu suất tổng thể của cácPXN tham gia được cải thiện đáng kể từ năm 2014 đến năm 2015, cụ thể độnhạy tăng từ 68,7% lên 87,2% và độ đặc hiệu tăng từ 98,7% lên 99,1% [47]

1.3.2 Tại Việt Nam

Nghiên cứu của Vũ Quang Huy và cộng sự (2016) [2] đã khảo sát nhucầu tham gia ngoại kiểm và đánh giá kết quả thực hiện xét nghiệm với 19chương trình ngoại kiểm khác nhau Kết quả cho thấy tỷ lệ ngoại kiểm hóasinh chiếm 95,7%, tiếp theo là huyết học chiếm 73,9% và cuối cùng là đôngmáu với 34,8%

Nghiên cứu của Trần Tôn và cộng sự (2017) [15] đã triển khai thànhcông chương trình ngoại kiểm cho xét nghiệm huyết thanh học tìm kháng thểtoàn bộ kháng HCV (Anti-HCV) Kết quả đã cho thấy có 35 PXN tham giathực hiện 45 lượt xét nghiệm với 03 nhóm sinh phẩm chính lần lượt là Cobas-Roche, Architect-Abbott, và các thử nghiệm nhanh Thêm vào đó, đã ghi nhận

có 11,4% (4/35) các kết quả sai sót đều thực hiên xét nghiệm trên các sinhphẩm test nhanh

Nghiên cứu của Lê Thọ và cộng sự (2012) [9] cũng đã xây dựng và triểnkhai chương trình ngoại kiểm huyết thanh học HIV của Viện Pasteur thànhphố Hồ Chí Minh tại khu vực phía Nam và Tây Nguyên nhằm cải thiệnCLXN Kết quả cho thấy đến cuối năm 2014, có 384 PXN tham gia và các saisót cũng được ghi nhận chủ yếu trên các sinh phẩm nhanh Theo đó tỷ lệ kếtquả sai sót khác nhau tùy theo sinh phẩm sử dụng: Determine HIV 1/2: 0,11%(1/916), SD Bioline HIV 1/2 3.0: 0,39% (4/1020), Card test-Dipstick HIV1&2: 0,83% (1/72), Bio Tracer HIV 1/2 Rapid Card 9,5% (4/42), Rapid Anti-HIV test (Intech): 15,9% (14/88)

1.3.3 Tình hình ngoại kiểm test nhanh

Tại Phần Lan, cho đến nay Labquality EQA đã thực hiện hơn 160chương trình ngoại kiểm đánh giá chất lượng hàng đầu và đều tuân thủ đầy đủcác yêu cầu của ISO/EN 15189 và ISO 17043:2010 Các sản phẩm được phânphối rộng khắp khu vực châu Âu và Trung Đông Trong số đó, chương trình

ngoại kiểm huyết thanh học H pylori là một trong 60 chương trình ngoại

kiểm vi sinh lâm sàng đã được thiết lập từ năm 2000 cho việc đánh giá CLXNđịnh tính và bán định lượng với chu kỳ 04 đợt/năm Kết quả từ năm 2004 đếnnăm 2005 đã cho thấy mặc dù các phương pháp xét nghiệm phát hiện khángthể IgA vẫn cho thấy tỷ lệ âm tính giả cao tuy nhiên các giá trị tiên đoán tronglâm sàng của các xét nghiệm định tính (test nhanh) và bán định lượng (EIAhay ELISA) đã được cải thiện đáng kể, cụ thể có 02 bộ xét nghiệm test nhanh

là Orion Diagnostica Pyloriset Dry và Meridian Diagnostic, Premier; 02 bộxét nghiệm IgG-EIA là Dade Behring, Enzygnost và DPC Immulite đã chothấy một hiệu suất tốt với tỷ lệ âm tính giả là 0% Từ năm 2000, cùng vớiLabquality (Chương trình ngoại kiểm tại Phần Lan), Instand-chương trình

ngoại kiểm huyết thanh học H pylori tại Đức cũng đã được thiết lập [21],

Nghiên cứu của Gillet và cộng sự (2010) [25] đã báo cáo kết quả củachương trình ngoại kiểm về việc sử dụng test nhanh trong chẩn đoán bệnh sốtrét Kết quả đã cho thấy có tổng cộng có 96,2% (128/133) các PXN sử dụngtest nhanh tham gia, trong đó gần 4,4% người tham gia dựa vào test nhanhlàm công cụ chính với 06 sinh phẩm được sử dụng

Tại Cộng Hòa Dân chủ Công-gô, nghiên cứu của Mukadi P và cộng sự(2012) [42] đã thực hiện chương trình ngoại kiểm CLXN đầu tiên cho việcđọc và giải thích kết quả xét nghiệm test nhanh chẩn đoán bệnh sốt rét trong

số 1849 người dùng cuối thông qua dịch vụ tin nhắn ngắn (SMS-ShortMessage Service) Kết quả từ chương trình đã cho thấy một số điểm mạnh củangoại kiểm dựa trên SMS nên được chú trọng

Nghiên cứu của Lê Chí Thanh và cộng sự (2015) [8] về ngoại kiểm xétnghiệm huyết thanh học HIV của Viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh tạikhu vực phía Nam và Tây Nguyên đánh giá kết quả ngoại kiểm về mức độchính xác xét nghiệm HIV thông qua việc thử nghiệm trên các sinh phẩm testnhanh cho xét nghiệm HIV chiếm tỷ lệ cao nhất

1.4 Phương pháp bảo quản mẫu ngoại kiểm

1.4.1 Phương pháp đông khô

Là quá trình tách nước hoặc dung môi khác từ sản phẩm đônglạnh Gồm 03 giai đoạn: làm lạnh, thăng hoa và bốc hơi ẩm còn lại

Ưu điểm: dễ sử dụng và có tính mỹ quan cao, làm tăng độ ổn định của

mẫu Sản phẩm đông khô vẫn giữ nguyên hình thái, khi hoàn nguyên bằngnước cất hoặc dung môi thích hợp, sản phẩm sẽ trở lại dạng ban đầu Các sảnphẩm được đông khô đúng cách không cần phải giữ đông lạnh và có thể bảoquản được ở điều kiện nhiệt độ phòng

Nhược điểm: nhà sản xuất phải có thiết bị đông khô, tốn kém điện

năng Các đơn vị sử dụng phải thao tác hoàn nguyên chính xác và cẩn thận đểhạn chế tối đa việc sai sót trong quá trình xét nghiệm

1.4.2 Phương pháp đông lạnh

Đông lạnh là quá trình bảo quản mẫu bệnh phẩm ở trạng thái nhiệt độ âmsâu Mẫu bệnh phẩm sẽ được làm lạnh nhanh và bất hoạt các hoạt động của cácenzym, protein, lipid,… làm cho các tế bào ngừng hoạt động ở trạng thái đóngbăng

Ưu điểm: mẫu có chất nền tối thiểu và không cần hoàn nguyên bằng

dung dịch khác, dễ thực hiện và bảo quản trong thời gian dài, áp dụng rộng rãi

để bảo quản và lưu trữ mẫu lâu dài trong nhiều lĩnh vực khác nhau nhau

Nhược điểm: khó khăn trong việc vận chuyển lạnh sâu khi gửi mẫu

ngoại kiểm cho số lượng lớn các PXN tham gia

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU2.1 Thời gian nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện trong thời gian từ tháng 11/2018 đến tháng5/2019

2.2 Địa điểm nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện tại Trung tâm kiểm chuẩn chất lượng xétnghiệm y học - Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh

2.3 Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu thực nghiệm

2.4 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu huyết thanh chứa kháng thể IgG kháng H pylori

2.5 Tiêu chí chọn mẫu

2.5.1 Tiêu chuẩn đưa vào

 Mẫu dương tính với IgG-H pylori:

- Mẫu huyết thanh bệnh nhân có kết quả dương tính với IgG-H pylori

được thực hiện bằng test nhanh với CIM

- Mẫu huyết thanh không bị tán huyết, không đục

- Mẫu được bảo quản ở 2-8°C từ khi lấy mẫu cho đến khi thu thập mẫu

 Mẫu âm tính với IgG-H pylori:

- Mẫu huyết tương tươi đông lạnh (HTTĐL) bảo quản ở -20°C

- Mẫu không bị tán huyết, không đông vón

- Mẫu cho kết quả âm tính với IgG-H pylori được thực hiện bằng kỹ

thuật test nhanh với CIM

2.5.2 Tiêu chuẩn loại trừ

- Mẫu bị tán huyết, vón cục, đóng mỡ, rã đông trên 03 lần

- Ống chứa mẫu kém chất lượng (bị rò rỉ), mất nhãn

2.6 Cỡ mẫu

Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành sản xuất 04 bộ mẫu và đượctrình bày theo bảng sau:

Bảng 2.1 Số lƣợng bộ mẫu sản xuất

+ Dài hạn: điều kiện bảo quản trong 04 tuần, 08 tuần, 12 tuần:

03 mẫu x 03 thời điểm x 04 bộ mẫu x 02 nhiệt độ = 72 mẫu

+ Ngắn hạn: điều kiện vận chuyển trong 03 ngày, 05 ngày, 07 ngày:

03 mẫu x 03 thời điểm x 04 bộ mẫu x 02 nhiệt độ = 72 mẫu

Như vậy, tổng cỡ mẫu đánh giá là: 40 + 72 + 72 = 184 mẫu

2.7 Xử lý số liệu

 Số liệu được nhập và xử lý bằng phần mềm Excel

 Thống kê phân tích: đánh giá tính đồng nhất của mẫu bằng phương phápphân tích phương sai một yếu tố Oneway ANOVA; đánh giá độ ổn định củamẫu bằng phương pháp kiểm định T-test độc lập (Independent-sample T-test)

2.8 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất

Các thiết bị, máy móc, hóa chất, thuốc thử, dụng cụ và vật tư tiêu haođược sử dụng trong nghiên cứu tại Trung tâm kiểm chuẩn chất lượng xétnghiệm y học - Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh, được liệt kê tại bảng2.2, 2.3 và 2.4

Bảng 2.2 Thiết bị và máy móc