Nghiên cứu quy trình sản xuất thực nghiệm mẫu huyết thanh chẩn đoán bệnh gạo heo (cysticercus celulosae) sử dụng trong ngoại kiểm

ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH KIỀU MỸ NGỌC MINH TÂM NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT THỰC NGHIỆM MẪU HUYẾT THANH CHẨN ĐOÁN BỆNH GẠO HEO CYSTICERCUS CELULOSAE SỬ DỤNG TRONG NGOẠI KIỂM LUẬN V

ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH

KIỀU MỸ NGỌC MINH TÂM

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT THỰC NGHIỆM MẪU HUYẾT THANH CHẨN ĐOÁN

BỆNH GẠO HEO (CYSTICERCUS CELULOSAE)

SỬ DỤNG TRONG NGOẠI KIỂM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT Y HỌC

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2018

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KIỀU MỸ NGỌC MINH TÂM

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT THỰC NGHIỆM MẪU HUYẾT THANH CHẨN ĐOÁN

BỆNH GẠO HEO (CYSTICERCUS CELULOSAE)

SỬ DỤNG TRONG NGOẠI KIỂM

NGÀNH: KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM Y HỌC

Mã số: 8720601

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT Y HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS VŨ QUANG HUY

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2018

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu là hoàn toàntrung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tác giả luận văn

KIỀU MỸ NGỌC MINH TÂM

MỤC LỤC

Trang LỜI CAM ĐOAN

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC HÌNH

DANH MỤC CÁC BẢNG

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Sán dải heo (Taenia solium) 3

1.2 Ấu trùng sán dải heo (Cysticercus cellulosae) 7

1.3 Khái quát chung về ngoại kiểm 23

1.4 Mẫu ngoại kiểm 33

1.5 Tiêu chuẩn đánh giá chất lượng mẫu ngoại kiểm 37

1.6 Tình hình cung cấp ngoại kiểm trên thế giới và trong nước 40

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 42

2.1 Thiết kế nghiên cứu 42

2.2 Cỡ mẫu 42

2.3 Đối tượng nghiên cứu 42

2.4 Tiêu chuẩn chọn mẫu 42

2.5 Phương pháp thu thập số liệu 43

2.6 Kỹ thuật xét nghiệm 44

2.7 Quá trình sản xuất mẫu ngoại kiểm (hình 2.10) 47

2.8 Vấn đề y đức 58

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 59

3.1 Thu thập nguyên liệu 59

3.2 Đánh giá nguyên liệu ban đầu 59

3.3 Chia nhỏ, bảo quản 62

3.4 Đánh giá chất lượng mẫu sản xuất 63

3.5 Đánh giá tác động của hai yêu tố nhiệt độ và thời gian 68

3.6 Xây dựng quy trình tạo bộ mẫu ngoại kiểm 71

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 74

4.1 So sánh kỹ thuật ELISA với kỹ thuật western – blot 74

4.2 Quy trình sản xuất thử nghiệm mẫu ngoại kiểm 76

4.3 Chất lượng mẫu huyết thanh sau sản xuất 79

KẾT LUẬN 83

KIẾN NGHỊ 84 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Từ viết tắt Tên tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt

CEIA Erythroimmunoadsortion by capture

CRM Certified Reference Material Vật liệu ngoại kiểm được

chứng nhận

EITB Electroimmunotransfer blot Miễn dịch điện di

ELISA Enzym Linked Immunosorbent Assay Phản ứng liên kết enzym EQA External Quality Assessment Ngoại kiểm tra chất lượng IEC International Electrotechnical Commissom Ủy ban kỹ thuật điện quốc tế ISO International Standard Organization Tổ chức tiêu chuẩn quốc tế

NTDs Neglected Tropical Diseases Bệnh nhiệt đới bị lãng quên

RM Reference Material Vật liệu ngoại kiểm

WHO World Health Organization Tổ chức Y tế Thế giới

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Đốt sán Taenia solium 3

Hình 1.2 Đầu sán Taenia solium trưởng thành 3

Hình 1.3 Trứng sán Taenia solium 4

Hình 1.4 Chu trình lây nhiễm Taenia solium 5

Hình 1.5 Những vùng có tỷ lệ cao nhiễm Cysticercus cellulosae, 2009 10

Hình 1.6 Kỹ thuật ELISA 16

Hình 1.7 Kỹ thuật Western blot 18

Hình 1.8 Hình ảnh băng Western blot 22

Hình 1.9 Protein GP50 trên băng Western blot 22

Hình 1.10 12 thành tố của hệ thống quản lý chất lượng 24

Hình 1.11 Quy trình hoạt động của một phòng xét nghiệm 25

Hình 1.12 Vị trí của ngoại kiểm trong đảm bảo chất lượng xét nghiệm 26

Hình 1.13 Các chương trình ngoại kiểm toàn cầu của WHO 28

Hình 1.14 Sơ đồ kiểm tra độ thành thạo 30

Hình 1.15 Quy trình thực hiện một chu kỳ ngoại kiểm 31

Hình 1.16 Quá trình đông khô tại Viện Hàn Lâm Khoa Học Công Nghệ 36

Hình 2.1 Quy trình kỹ thuật ELISA 45

Hình 2.2 Thu thập huyết thanh 48

Hình 2.3 Tách chiết huyết thanh 48

Hình 2.4 Sàng lọc mẫu với xét nghiệm nhanh 49

Hình 2.5 Kết quả xét nghiệm nhanh 49

Hình 2.6 Chia lô đông lạnh và đông khô 50

Hình 2.7 Đông lạnh mẫu huyết thanh 51

Hình 2.8 Đông khô mẫu huyết thanh 52

Hình 2.9 Quy trình sản xuất mẫu huyết thanh 53

Hình 2.10 Quá trình đánh giá tính đồng nhất 55

Hình 2.11 Quá trình đánh giá độ ổn định 57

Hình 3.1 Kết quả kết hợp KN – KT trong Cysticercosis 61

Hình 3.2 Biểu đồ thể hiện sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến mẫu đông khô 68

Hình 3.3 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của nhiệt độ lên mẫu đông lạnh 69

Hình 3.4 Xu hướng thay đổi của mẫu đông khô theo thời gian 70

Hình 3.5 Xu hướng thay đổi của mẫu đông lạnh theo thời gian 70

Hình 3.6 Đánh giá độ ổn định ngắn hạn 71

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Độ nhạy và độ đặc hiệu 20

Bảng 1.2 Phản ứng chéo trong kỹ thuật ELISA chẩn đoán Taenia solium 21

Bảng 1.3 So sánh kỹ thuật WB và kỹ thuật ELISA 23

Bảng 1.4 Mối quan hệ giữ nhiệt độ và áp suất 37

Bảng 2.1 Máy móc và trang thiết bị 44

Bảng 2.2 Dụng cụ và vật tư tiêu hao 44

Bảng 2.3 Hóa chất sử dụng trong kỹ thuật ELISA 45

Bảng 2.4 Hóa chất sử dụng trong kỹ thuật Western blot 46

Bảng 2.5 Quy trình làm test nhanh 49

Bảng 2.6 Biến thiên nhiệt độ trong đánh giá độ ổn định ngắn hạn 56

Bảng 3.1 Kết quả sàng lọc test nhanh HbsAg, Anti-HCV, HIV 1/2 59

Bảng 3.2 Kết quả trị số OD ban đầu của mẫu 60

Bảng 3.3 Kết quả Western blot (WB) 60

Bảng 3.4 Chia nhỏ mẫu huyết thanh 62

Bảng 3.5 Phân lô mẫu huyết thanh theo nhiệt độ 62

Bảng 3.6 Kết quả đánh giá độ đồng nhất 63

Bảng 3.7 Trị số OD của mẫu sau 1 tháng 64

Bảng 3.8 Trị số OD của mẫu sau 2 tháng 65

Bảng 3.9 Trị số OD của mẫu sau 3 tháng 66

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong nghiên cứu thực nghiệm cũng như trong thực tế, để phát hiện và điều trịthành công các bệnh trên người, động vật, thực vật, chẩn đoán ban đầu luôn đóng mộtvai trò thiết yếu Khoa học phát triển, việc chẩn đoán và điều trị bệnh hiện nay đã dễdàng hơn khi chúng ta sử dụng máy móc, kỹ thuật hiện đại, giúp công tác khám chữabệnh được nhanh chóng, hiệu quả Tuy nhiên, quá trình thao tác vẫn có thể xảy ra saisót, dẫn đến sai lệch kết quả xét nghiệm Vì vậy, đảm bảo chất lượng xét nghiệm làvấn đề đáng quan tâm, nhất là việc hướng đến liên thông kết quả giữa các phòng xétnghiệm

Quá trình ngoại kiểm cần mẫu kiểm đạt tiêu chuẩn về chất lượng, an toàn, đồngnhất và ổn định Hiện nay, các cơ sở trong nước vẫn chưa sản xuất được sinh phẩm,dùng để kiểm tra chất lượng xét nghiệm miễn dịch chẩn đoán bệnh do ký sinh trùngđặc biệt bệnh do gạo heo (cysticercocis) nói riêng Vì thế, các phòng xét nghiệm trên

cả nước vẫn chưa chưa xây dựng được chương trình ngoại kiểm huyết thanh học

Bệnh do sán trưởng thành (taeniasis) và bệnh gạo heo (cysticercosis) phân bố

rộng rãi ở Việt Nam, gây nguy hại cho sức khoẻ, đặc biệt là chứng rối loạn thần kinh

nghiêm trọng Loài của Taenia ở Việt Nam bao gồm T asiatica, T saginata, và T.solium nhưng chỉ T solium gây bệnh gạo heo ở người [48] Theo Burneo, Garcia

và Takayanagui O.M (2001), trên thế giới có khoảng 20 triệu người nhiễm gạo heo

và 50.000 người chết mỗi năm do bệnh này [53] [32] [62] Theo tài liệu của WHO,bệnh phổ biến ở các nước châu Á, châu Phi và châu Mỹ La Tinh, tỷ lệ 0,7% - 22,6%[2] [6] [10] [11] [14] [50] Ngoại trừ bệnh ở dưới da chẩn đoán trực tiếp bằng phương

pháp sinh thiết thì Cysticercus cellulosae ở cơ quan khó chẩn đoán Vì vậy, các nhà

khoa học đã nghiên cứu và tìm ra nhiều kỹ thuật huyết thanh học chẩn đoán để pháthiện kháng thể kháng gạo heo như: miễn dịch huỳnh quang, ngưng kết hồng cầu,miễn dịch hấp phụ gắn enzym (ELISA) và Western blot Y văn thế giới ghi nhận cáctác giả Costa J.M (1986), Wang K.H (1993), Simac C 1995, Vaz A.T (1996),Dekumyoy P (1998), Silva A.D (2000), Bueno E.C (2000), Das S (2002), Bragazza(2002) đã điều chế kháng nguyên từ gạo heo để dùng trong kỹ thuật ELISA [42] [51]

Trong nước, tại các tỉnh phía Bắc, Nguyễn thị Minh Tâm, Phan Trí Tuệ (1991) [33]

đã nghiên cứu kỹ thuật ELISA với kháng nguyên điều chế từ gạo heo Phía Nam từ

1987, Trần Vinh Hiển và cs – Bộ môn Ký sinh học Khoa Y, Đại Học Y Dược TPHCM đã điều chế KN sử dụng trong kỹ thuật ELISA để chẩn đoán một số bệnh do

ký sinh trùng, trong đó có bệnh gạo heo [5] [20] [66] [69] [71]

Kỹ thuật ELISA được sử dụng rất rộng rãi vì tiện lợi, hạn chế xâm lấn và giúpchẩn đoán bệnh nhanh chóng Tuy nhiên, ELISA có hiện tượng nhiễm chéo nên chỉgóp phần giúp chẩn đoán chứ không quyết định chẩn đoán Western blot khắc phụcđược nhược điểm của kỹ thuật ELISA, có độ đặc hiệu cao hơn, cho phép chẩn đoánxác định loại ký sinh trùng bị nhiễm thông qua phản ứng kết hợp giữa từng thànhphần kháng nguyên (KN) với kháng thể (KT) đặc hiệu

Xuất phát từ thực tiễn, với mong muốn sản xuất ra được mẫu huyết thanh kiểmchuẩn đảm bảo chất lượng, sử dụng trong ngoại kiểm xét nghiệm ký sinh trùng, chúng

tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu quy trình sản xuất thực nghiệm mẫu huyết thanh chẩn đoán bệnh gạo heo (Cysticercus cellulosae) sử dụng trong ngoại kiểm.” Nghiên

cứu này sử dụng kỹ thuật Western blot để xác định mẫu chuẩn Kết quả của nghiêncứu không chỉ nhằm nâng cao chất lượng xét nghiệm chẩn đoán bệnh lý do ký sinhtrùng gây ra mà còn giúp cho các phòng xét nghiệm trong nước hực hiện chương trìnhngoại kiểm với giá cả hợp lý nhưng vẫn đảm bảo độ tin cậy của kết quả

Nghiên cứu có ba mục tiêu sau:

1 Khẳng định tính đặc hiệu của kháng thể kháng Cysticercus cellulosae trong

huyết thanh bằng kỹ thuật Western blot

2 Đánh giá tính đồng nhất, độ ổn định của mẫu huyết thanh chứa kháng thể đặc

hiệu

3 Xây dựng quy trình sản xuất thử nghiệm mẫu huyết thanh ngoại kiểm.

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 SÁN DẢI HEO (TAENIA SOLIUM)

1.1.1 Hình thể

Taenia solium dài từ 2 - 4 m, có khoảng 800 – 1000 đốt, gồm đầu cổ và đốt sán.

Đầu nhỏ hình cầu, kích thước khoảng 1mm, có 4 đĩa hút, trên đầu có chủy với haihàng móc, mỗi hàng từ 25 – 30 móc Cổ ngắn là nơi sản sinh các đốt sán, thân gồmcác đốt sán Đốt sán non ở gần cổ, chiều ngang rộng hơn chiều dài, chỉ có cơ quansinh dục đực Đốt trưởng thành có chiều ngang bằng chiều dài, chứa cơ quan sinh dụcđực và cái Các đốt già có chiều dài gấp rưỡi chiều ngang Ở các đốt già chỉ còn thấy

tử cung có 7 – 12 nhánh bên dầy chứa 30.000 – 50.000 trứng Mỗi đốt sán có lỗ sinhdục bên hông xen kẽ khá đều [11]

Hình 1.1 Đốt sán Taenia solium (Nguồn: PHIL 5261 - CDC)

Hình 1.2 Đầu sán Taenia solium trưởng thành (Nguồn: PHIL 5262 - CDC)

Trứng Taenia solium hình cầu, vỏ dày, đường kính khoảng 35µm, bên trong

chứa phôi 6 móc [11]

Tỷ lệ nhiễm bệnh sán dải heo ở nam giới cao hơn ở nữ giới (68,2% so với

31,8%) Các trứng Taenia đã được tìm thấy trong 20,0 - 22,5% bệnh nhân bệnh sán

dải heo thông qua xét nghiệm phân Các mẫu đất ở các vùng lưu hành đã được kiểm

tra để tìm trứng Taenia, và kết quả cho thấy tỷ lệ trứng Taenia dương tính là 2,0

-25,0% Một số bệnh nhân bị nhiễm hơn 2 con sán trưởng thành /người [72]

Hình 1.3 Trứng sán Taenia solium (Nguồn: PHIL 4832 - CDC) Nang ấu trùng (Cysticercus cellulosae) còn gọi là gạo heo, nang có chứa dịch

và đầu ấu trùng sán rất giống đầu sán trưởng thành Nang sán có kích thước từ 0,5cm– 1,5cm, những nang từ 3cm – 4cm hiếm gặp [11]

Các nang sán ký sinh ở não thất thường lớn hơn các nang ở khoảng dưới màngnhện Hình dạng nang sán có thể thay đổi tùy áp suất nơi nó ký sinh:

 Ở cơ: nang sán có hình bầu dục giống như hạt gạo

 Ở mô dưới da: nang sán có hình hạt đậu

 Ở thùy tinh dịch, não thất: nang sán có hình tròn

 Ở nhu mô não: nang tròn [15] [32]

1.1.2 Chu trình phát triển của Taenia solium

Hình 1.4 Chu trình lây nhiễm Taenia solium [5]

Taenia solium sống trong ruột non của người, bám vào niêm mạc ruột nhờ đĩa

hút và móc ở đầu Mỗi ngày sán trưởng thành phóng thích 4 – 5 đốt già trong lòngruột, mỗi đốt chứa 60.000 đến 75.000 trứng, các đốt này theo phân ra ngoài Ra ngoạicảnh, các đốt tan rã và phóng thích khoảng 20.000 – 40.000 trứng [11]

Khi người ăn phải thịt heo nấu chưa chín chứa nang sán còn gọi là gạo heo, vàođến hệ tiêu hóa, ấu trùng thoát ra khỏi nang và phát triển thành con trưởng thành, bámchắc vào thành ruột non nhờ các móc ở đầu

Ngoài chu trình trên, sán dải heo còn gây nên chu trình tự nhiễm ở người: bệnhgạo heo Có hai đường gây nên tự nhiễm:

- Người nuốt phải trứng sán từ môi trường ô nhiễm do đốt sán theo phân thải

ra ngoài bị vỡ, phóng thích trứng

- Do phản nhu động ruột: người chứa con trưởng thành trong ruột non, khi bịsốt hay buồn nôn…đốt sán trưởng thành theo phản nhu động ruột trào ngượcvào dạ dày, ở đó đốt sán bị vỡ ra Nhiễm kiểu này thì bệnh rất nặng vì đốt sánchứa đầy trứng

Trong mô ký chủ, sự tồn tại của nang sán phụ thuộc vào vị trí ký sinh và sự đápứng miễn dịch của ký chủ Nang sán ở mắt có thể tồn tại đến 20 năm, nang ở não từ

3 – 6 năm, ở cơ hay dưới da nang sán hóa vôi sau vài năm [11] [15]

Trong bệnh đường ruột thì có 82,9 - 92,1% gây nên các triệu chứng chính ởngười, bao gồm: đau bụng 59,7 – 62,1%, rối loạn tiêu hóa 45,2 – 50,0%, khó ngủ 35,2

-39,5%, hạ huyết áp 10,4 - 12,1%, trứng Taenia dương tính trong phân 18,1 - 22,5%, tăng bạch cầu ái toan 76,1 - 81,1% và dương tính ELISA với kháng nguyên Taenia

72,2 - 76,7% [10] [72] [90] [96]

Trong bệnh gạo thì các cơ quan bị ảnh hưởng là mắt (31,0%), hàm (14,2%),họng (12,2%), lưỡi (9,3%), vai (8,3%), lưng (6,0%), cổ (6,3%), ngực (5,3%), mông(4,6%) và màng phổi (2,3%) với 1.067 nang /10 kg thịt lợn [72]

1.1.3 Đặc điểm dịch tễ

Một báo cáo của WHO (2016), Taeniasis là một nhiễm trùng đường ruột gây rabởi sán dây trưởng thành Ba loài sán dây gây ra chứng nhiễm sán trưởng thành ở

người là Taenia solium, Taenia saginata và Taenia asiatica Chỉ có T.solium gây ra

những vấn đề về sức khoẻ Taeniasis gây ra do ăn thịt chứa gạo chưa được nấu chín

kinh do T solium neurocysticercosis, các can thiệp phẫu thuật phức tạp để điều trị là

cần thiết [56]

Châu Mỹ La Tinh: tùy từng nơi, tỷ lệ nhiễm từ 0,2% – 2,7%.

Châu Á: Theo các nghiên cứu đã phát hiện, tỷ lệ mắc Taenia solium từ 3,9 –

38,0% và tỷ lệ phát hiện kháng thể kháng Taenia solium từ 0,7 – 32% Theo kết quả

điều tra của viện Ký Sinh trùng - Sốt rét và Côn trùng trung ương, tỷ lệ nhiễm sán dảiheo vùng đồng bằng là 0,5% - 2%, vùng trung du và miền núi là 3,8% - 6,0%.

Taeniasis người đã được tìm thấy từ hơn 50 tỉnh của Việt Nam Tỷ lệ Taeniasis

ở miền Bắc là 0,5 - 12%, miền Trung là 0,2 - 2,8% và ở miền Nam 0,3 - 1,5% Vùng

cao 3,8 - 10,1% [49] [72] Tỉ lệ mắc bệnh do gạo heo ở vùng đồng bằng là 0,5 - 12,0%

và ở vùng núi 2,0 - 10,4% [49] [72]

Châu Phi: Theo y văn thì tỷ lệ nhiễm từ 0,13% - 8,6% Những nước theo đạo

Hồi ở vùng Bắc Phi rất hiếm nhiễm sán dải heo [11]

Một số báo cáo ở Việt Nam cho thấy chúng được phân bố ở trên 50 trong số 63tỉnh Ở một số vùng dịch tễ, tỷ lệ mắc bệnh sán dải heo là 0,2 - 12,0 % và bệnh gạoheo là 1,0 - 7,2%.Việc xác định loài Taenia ở Việt Nam bao gồm Taenia asiatica,

Taenia saginata, và Taenia solium dựa trên kết hợp hình thái học và kỹ thuật sinh

học phân tử Chỉ có T solium gây ra bệnh cysticercosis cho người [48] Tỷ lệ gạo

heo là 0,04% tại các cơ sở giết mổ ở Hà Nội, 0,03 - 0,31% tại các lò giết mổ ở cáctỉnh miền Bắc, và 0,9% ở các lò giết mổ miền Nam nước ta [48]

Tại Việt Nam, theo kết quả điều tra của Viện Sốt rét - Ký Sinh trùng - Côn trùng

TP Hồ Chí Minh, tỉ lệ mắc bệnh do gạo heo ở đồng bằng 0,5 – 2,0 %, trung du vàmiền núi 3,8 – 6 % Một nghiên cứu khác của Annette E và cs tại tỉnh Bắc Ninh tỉ lệ

phát hiện kháng thể kháng Cysticercus cellulosae là 5,7% [2] [22] [36].

1.2 ẤU TRÙNG SÁN DẢI HEO (CYSTICERCUS CELLULOSAE)

1.2.1 Lược sử bệnh do ấu trùng sán dải heo

Vào khoảng thế kỷ XVI người Hy Lạp đã phát hiện nang sán của Taenia solium

ở lưỡi của heo bị bệnh, lúc bấy giờ họ gọi là “sởi heo” Người ta nghĩ đây là một loài

sán của thú được Linnaeus gọi là Cysticercus Từ Cysticercus xuất phát từ chữ Hy Lạp Kustis (cyst, verside) kecos (tail) vì hình thể của nang sán giống như một cái túi,

bên trong chứa ấu trùng sán giống như cái đuôi Năm 1809, dựa vào đặc điểm, vị trí

của nang thường ký sinh trong mô liên kết, Rudolphi đã đặt tên là Cysticercus cellulosae Năm 1855, Kuchenmeiser tìm ra chu trình phát triển của Toenia solium Những năm đầu của thế kỷ XIX, các nhà khoa học đã phát hiện Cysticercus cellulosae

ký sinh ở người khi khám nghiệm tử thi tại các bệnh viện ở Berlin Năm 1944,

Mazzotti và năm 1946 Robles báo cáo các ca bệnh Cysticercus cellulosae tại Mexico Năm 1957, Deut báo cáo ca bệnh Cysticercus cellulosae tại Louisiana Đến nay từ

“Cysticercus cellulosae” vẫn tiếp tục được sử dụng dù rằng chu trình phát triển của Taenia solium đã được xác định [23].

1.2.2 Miễn dịch học bệnh do gạo heo

Ký sinh trùng có cấu trúc đa tế bào nên miễn dịch học về ký sinh trùng phức tạphơn nhiều so với vi trùng và siêu vi trùng Sự hiện diện của kháng thể kháng ký sinhtrùng trong huyết thanh bệnh nhân rất hữu ích trong việc chẩn đoán bệnh Nhữngthành quả trong nghiên cứu về miễn dịch học trong những năm gần đây đã mang đếnnhiều thuận lợi cho chẩn đoán [74]

1.2.3 Biểu hiện lâm sàng

Dựa vào vị trí nang sán định vị, ký sinh sẽ có các thể bệnh sau:

Thể dưới cơ, da:

 Ở dưới da, nếu nhẹ nang sán tạo thành những hạt như hạt đậu, không đau, di động.Quan sát đại thể thấy bao xơ với vài tế bào khổng lồ Langerhans, thâm nhiễm bạchcầu

 Ở cơ: thường không có triệu chứng, đôi khi làm phồng cơ gây đau, bệnh được pháthiện khi tình cờ chụp X – quang lúc nang sán đã hóa vôi ở bất kỳ vị trí nào trên cơthể

Thể ở mắt:

 Ký sinh trùng có tính hướng đến mô mắt như hốc mắt, nang sán gặp ở các cơ xungquanh nhãn cầu làm lồi mắt, lé mắt Triệu chứng là nhìn mờ, chảy nước mắt Ở dâythần kinh thị giác gây viêm dây thần kinh thị giác [18] [23]

Thể thần kinh:

 T solium là nguyên nhân gây ra 30% các trường hợp động kinh ở nhiều vùng lưuhành, nơi người và lợn thả rong sống gần nhau Hơn 80% trong số 50 triệu ngườitrên thế giới bị ảnh hưởng bởi chứng động kinh sống ở các nước có thu nhập trungbình thấp [94]

Bệnh thần kinh trung ương liên quan đến nhiều dấu hiệu và triệu chứng tùy thuộcvào số lượng, kích thước, giai đoạn và vị trí của những thay đổi bệnh lý cũng như đápứng miễn dịch của cơ thể, nhưng cũng có thể không có triệu chứng lâm sàng Triệuchứng có thể bao gồm nhức đầu mãn tính, chứng mù, động kinh, tràn dịch não, viêmmàng não, chứng mất trí [15] [18] [94].

Thể lan tỏa hay còn gọi là thể phối hợp:

Là trường hợp mà nang sán ký sinh tại hai hay nhiều cơ quan khác nhau trên cùngmột bệnh nhân, thể này thường gặp ở người trẻ, hàng trăm nang sán trong não kèmnang sán ở cơ và mô dưới da Sự phối hợp giữa các cơn động kinh, sa sút trí tuệ và

có các nốt dưới da, cơ là thể lan tỏa

Thể cơ quan nội tạng:

tiếng tim thay đổi, bệnh nhân khó thở, ngất xỉu

1.2.4 Đặc điểm dịch tễ bệnh do gạo heo

 Các yếu tố nguy cơ nhiễm bệnh

Người nhiễm bệnh gạo heo do nuốt phải trứng của sán dải heo (T solium), khác

với bệnh nhiễm sán dải heo trưởng thành, do ăn thịt heo nấu chưa chín [43]

Bệnh do gạo heo được Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) bổ sung vào danh sách cácbệnh nhiệt đới nghiêm trọng bị bỏ rơi (NTDs) vào năm 2010 với các mục tiêu lộ trình

NTD nhằm tạo ra một chiến lược xác nhận để kiểm soát và loại bỏ T solium taeniasis/ cysticercosis và những can thiệp đó được mở rộng các nước được lựa chọn vào năm

2020 [92]

Tại Việt Nam, các yếu tố nguy cơ được quan tâm liên quan đến việc truyền bệnh

của Taenia cho thấy việc ăn thịt heo nấu chưa chín kỹ (4,5 - 74,3%), kiểm tra và kiểm

soát thịt không tốt, vệ sinh kém ở một số vùng lưu hành và việc sử dụng chất thải củangười không qua xử lý làm phân bón cho cây trồng có thể đóng vai trò quan trọng[48]

 Đặc điểm dịch tễ

Theo Cherry J, Demmler-Harrison GJ và cộng sự, khoảng 50 – 100 triệu người

trên toàn thế giới bị xem là nhiễm Cysticercus cellulose Tỷ lệ cao ở Mỹ La Tinh,

Trung Sahara châu Phi và phía nam châu Á [45]

Một nghiên cứu khác do Burneo, Garcia và Takayanagui O.M thực hiện, bệnhthường gặp ở châu Mỹ La Tinh, châu Á, châu Phi [12]

Có rất ít dữ liệu ở Canada, trong năm 2012, Del Brutto đã thực hiện ở Medlin

đã tìm kiếm, báo cáo trường hợp và loạt trường hợp bệnh nhân bị chứng cysticercosis

được chẩn đoán ở Canada Tổng cộng có 21 bài báo cáo, 60 bệnh nhân, trong đó 40(67%) được chẩn đoán trong hai thập kỷ qua Người nhập cư chiếm 96% trong số 28trường hợp có thông tin [53] Có thể ít nhất một số bệnh nhân có thể đã mắc bệnh ở

Canada từ một hộ gia đình có chứa T solium trưởng thành trong ruột [43].

T solium ảnh hưởng đến hàng triệu người trên toàn thế giới và được coi là vấn

đề sức khoẻ cộng đồng, đặc biệt là ở các nước đang phát triển Chẩn đoán bệnh nangthần kinh (NCC) là phức tạp và bao gồm việc phân tích dữ liệu về dịch tễ, lâm sàng,triệu chứng thần kinh và miễn dịch NCC là loại bệnh đặc hữu của Brazil, có liên

quan đến nguyên nhân tử vong chủ yếu ở khu vực Đông Nam, Nam, và Trung Tây[69].

T solium là loài đặc hữu ở châu Phi, Nam và Trung Mỹ, Brazil, Mexico, Trung

Quốc, Ấn Độ, Myanmar, Malaysia, Hàn Quốc, Indonesia, Philippines, và Đông Nam

Á, bao gồm Việt Nam [66] [75] Một nghiên cứu tại Lào 2018 chỉ ra rằng

phần lớn khu vực Đông Nam Á được xem là nơi có loài đặc hữu của sán dây Taenia

ở người như: Taenia solium, T saginata, và T asiatica [37] [67].

Ở nước ta, bệnh cysticercosis ở người được phân bố ở hơn 50 tỉnh, đặc biệt là ởphía Bắc của đất nước như Bắc Ninh, Thái Bình và Thanh Hoá, Tỷ lệ mắc chứngcysticercosis ở miền Bắc là 1,0 - 7,2% và 4,3% ở khu vực phía Nam của đất nước[49] [72]

Châu Mỹ La Tinh

Tình hình nhiễm Cysticercus cellulosae tương đối cao Theo Bern nhận định,

tại Mỹ La Tinh có 75 triệu người sống strong vùng dịch lưu hành, 40.000 người đã

có triệu chứng bệnh Cysticercus cellulosae Tùy từng nơi tỷ lện nhiễm từ 4,9%

-22,6% [3]

Châu Á

Tùy từng nơi tỷ lệ nhiễm Cysticercus cellulosae 0,7% - 32% Các quốc gia có

tỷ lệ nhiễm cao như Indonesia, Ấn Độ, Trung Quốc, Nepal, Triều Tiên Ở Việt Nam,năm 2001 Nguyễn Văn Đề và cộng sự đã nghiên cứu tại xã Phú Hòa, huyện Long

Tài, tỉnh Bắc Ninh cho biết tỷ lệ phát hiện kháng thể kháng Cysticercus cellulosae là

5,7% (12/2010) [3] [16]

Châu Phi

Theo nghiên cứu thì tỷ tỷ nhiễm là 1% - 7% Các quốc gia có tỷ lệ nhiễm cao

là Benin, Togo, Burundi, Cameroon Một nghiên cứu khác đã phát hiện trong cácbệnh nhân mắc bệnh có triệu chứng thần kinh, kháng thể được phát hiện 1,54 – 54,1%[2]

Tuổi và giới mắc bệnh Cysticercus cellulosae

Ở Việt Nam từ 10/1991 – 4/1999, Ngô Đăng Thục và cộng sự đã nghiên cứu

118 trường hợp bệnh thể thần kinh tại bệnh viện Bạch Mai và bệnh viện Hai Bà Trưng(Hà Nội), từ 12 – 82 tuổi, nhóm tuổi có số bệnh nhân cao là từ 30 – 50 tuổi, số bệnhnhân nam cao gấp 3,5 lần số bệnh nhân nữ [22]

Nghề nghiệp dễ mắc bệnh Cysticercus cellulosae

Taenia solium taeniasis hay cysticercosis là bệnh ký sinh trùng nằm trong danh

sách các bệnh nhiệt đới bị bỏ sót của WHO Cần có công cụ chẩn đoán chính xác chongười và heo để theo dõi từ đó có can thiệp [53]

- Chăn nuôi heo, nhất là heo thả rong

- Các hành vi và thói quen:

 Ăn uống không hợp vệ sinh

 Tập quán, thói quen nuôi heo thả rong

- Môi trường bị ô nhiễm

- Người nhâp cư

1.2.5 Chẩn đoán bệnh do gạo heo

Cách chính xác nhất để chẩn đoán ký sinh trùng là tìm được các giai đoạn pháttriển của chúng trong bệnh phẩm Tuy nhiên, với ký sinh trùng còn non, chưa trưởngthành thì không thể tìm được trứng hoặc chúng định vị sâu trong nội tạng hay lạc chỗ,lạc chủ hoặc chúng là ký sinh trùng của thú nhưng tình cờ, ngẫu nhiên nhiễm quangười thường khó tìm được chúng Vì vậy, chỉ còn cách dùng phương pháp miễn dịchhọc để chẩn đoán [7] [30] [31]

Các triệu chứng chính của bệnh do gạo heo trên người bao gồm nhức đầu 65,9

90,4%, động kinh 56,4 67,5%, tăng trương lực cơ 35,3 48,9%, mất trí nhớ 42,4 46,9%, khó ngủ 40,3 - 46,4%, rối loạn khả năng nghe 36,4 - 42,4%, buồn nôn hoặcnôn 39,2 - 40,8%, tê liệt 28,4 - 30,8%, rối loạn cảm giác 18,2 - 20,1%, sinh thiếtdương tính ở mô dưới da 92,2 - 95,4%, tăng bạch cầu ái toan 83,4 - 84,5% ELISA

-dương tính với kháng nguyên Taenia 85,1-86,6% và chụp MRI /CT cho kết quả bướu

sán trong não 90,1 - 92,2% Bướu sán dưới da đã được tìm thấy ở cơ ngực sau 36,6%,

cơ tay 28,7%, vùng cơ ở cổ; mặt 18,2% [10] [39] [72]

Một nghiên cứu được tiến hành ở các thành phố Jataí, Goiás ở vùng Trung Tây

- Tây của Brazil từ tháng 4 đến tháng 8 năm 2012 Tổng cộng 529 mẫu huyết thanh

được sử dụng kỹ thuật ELISA để phát hiện kháng thể lớp IgG kháng ấu trùng T.

solium và kỹ thuật Western blot (WB) để xác định chẩn đoán, thông qua nhận biết ít

nhất hai protein đặc hiệu của KN Các mẫu phản ứng dương là 351/529 (66,3%) cũng

sử dụng các kỹ thuật ELISA và WB, trong đó có 73 mẫu đã đã có phản ứng với haiprotein đặc hiệu Tỷ lệ huyết thanh dương tính là 13,8%, cho thấy khu vực nghiêncứu là vùng lưu hành bệnh này [69]

Đối với các thể bệnh của Cysticercus cellulosae, bệnh thể thần kinh rất khó chẩn

đoán so với nhiều bệnh nhiễm ký sinh trùng khác vì trứng sán không có trong phâncủa bệnh nhân và các triệu chứng lâm sàng không đặc hiệu Các tổn thương là điểnhình của thể thần kinh cũng có thể xảy ra ở bệnh lao, áp xe não và khối u, dễ gây chẩnđoán lầm [45]

Các xét nghiệm phát hiện kháng thể đặc hiệu đối với ấu trùng T solium trong

huyết thanh và dịch não tủy (CSF) Xét nghiệm Western blot là xét nghiệm huyếtthanh học được Trung tâm Kiểm soát và Phòng ngừa Bệnh của Hoa Kỳ tin cậy vì tínhnhạy cảm và độ đặc hiệu của nó [39] Kháng thể có thể tồn tại lâu dài sau khi điều trịthành công [45] Tuy nhiên xét nghiệm huyết thanh học ít có ý nghĩa khi chỉ có mộttổn thương đơn độc Điều này đã được công bố trong một nghiên cứu trên trẻ em vàngười lớn ở Ấn Độ [71]

Với bệnh do gạo heo, ngoại trừ bệnh ở dưới da chẩn đoán trực tiếp bằng phươngpháp sinh thiết thì bệnh ở nội tạng thường khó chẩn đoán Có thể dựa vào:

 Cận lâm sàng:

- X – quang chỉ có giá trị khi nang sán đã hóa vôi.

- MRI rất có giá trị trong chẩn đoán.

- Các xét nghiệm:

 Công thức máu: bạch cầu ái toan tăng cao

 Xét nghiệm dịch não tủy

- CT Scan, MRI khi nghi ngờ nang ấu trùng ở não, khi đó hình ảnh nang ấu

trùng là các nốt tròn khi nang hóa vôi hay vòng tròn dạng nhẫn, có thể phùnão

- Chẩn đoán miễn dịch:

 Thử nghiệm cố định bổ thể

 Phản ứng ngưng kết hồng cầu

 Miễn dịch điện di

 CEIA (Erythroimmunoadsortion by capture).

 EITB (Electroimmunotransfer blot).

 ELISA (Enzym Linked Immunosorbent Assay) [10] [11].

1.2.6 Kỹ thuật miễn dịch hấp phụ gắn enzym ELISA

Ký sinh trùng sau khi xâm nhập vào cơ thể bệnh nhân có khả năng kích thích

cơ thể sản xuất ra kháng thể đặc hiệu Vì vậy, các nguyên lý chung về miễn dịch họcđều có thể áp dụng được đối với các bệnh ký sinh trùng

Các nhà khoa học đã tìm ra nhiều kỹ thuật huyết thanh học: kỹ thuật miễn dịchhuỳnh quang, ngưng kết hồng cầu, cố định bổ thể, miễn dịch khuếch tán, ELISA vàmiễn dịch Western blot

Kỹ thuật miễn dịch được sử dụng trong các trường hợp mà phương pháp trựctiếp không thể làm được như:

 Giai đoạn mới nhiễm: ký sinh trùng còn non, chưa đẻ trứng (sán lá gan, sánmáng…)

 Trong giai đoạn mãn tính, ký sinh trùng đóng kén như Toxoplasma.

 Mật độ ký sinh thấp như Trypanosoma.

 Ký sinh trùng định vị trong nội tạng sâu như bệnh amíp ở gan, gạo heo

Cysticercus cellulosae ở cơ, não.

 Ngõ cụt ký sinh như hội chứng ấu trùng di chuyển, ký sinh trùng ở dạng ấutrùng, không bao giờ tiến đến giai đoạn trưởng thành và không bao giờ hoàn

tất chu trình phát triển như Toxocara sp.

Việc lựa chọn ELISA trong số rất nhiều kỹ thuật chẩn đoán vì thời gian thựchiện xét nghiệm ngắn, đạt yêu cầu về độ nhạy, độ đặc hiệu Tuy nhiên, ký sinh trùnglại có cấu tạo đa bào, đa kháng nguyên, vì vậy kỹ thuật ELISA có hạn chế là sẽ chokết quả dương tính chéo.

Các phương tiện chẩn đoán được sử dụng hiện nay đều có nhược điểm Các xétnghiệm huyết thanh học chủ yếu phải đối mặt với vấn đề là tính xác định kém Cụ thể

một nghiên cứu cho thấy KN hòa tan có phản ứng chéo với Taenia hydatigena, với

KN tiết ra do vi trùng Ngoài ra, khi nuốt phải trứng của các loài Taenia khác cũng

có thể dẫn đến việc xuất hiện KT dương tính chéo với KN gạo heo, dễ gây chẩn đoánlầm [11] [30] [31]

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), còn được gọi là enzyme immunoassay (EIA) được sử dụng như một phương tiện chẩn đoán trong y học và

nhiều lĩnh vực khác Khi một lượng kháng nguyên được gắn liền với một bề mặt, vàsau đó là một kháng thể đặc hiệu được cho vào để nó có thể liên kết với kháng nguyênvừa gắn, kháng thể này sẽ liên kết với một enzyme, và cuối cùng thêm cơ chất

để enzyme phân giải cơ chất và phát ra những tín hiệu, phổ biến nhất là sự đổi màumột chất hóa học Hiện nay, ELISA được dùng rộng rãi tại các phòng xét nghiệmchẩn đoán bệnh ký sinh trùng

 Cơ chế của phản ứng ELISA (Hình 1.6)

Kháng nguyên được cố định trên một bề mặt vững chắc - giá thể rắn Sau khikháng nguyên được cố định, kháng thể cần phát hiện được thêm vào, tạo thành mộtphức hợp kháng nguyên – kháng thể Kháng thể cần phát hiện có thể liên kết tiếp theovới một enzyme, hay chính nó có thể được phát hiện bởi một kháng thể thứ cấp liênkết với một enzyme thông qua liên kết cộng hóa trị giữa các phân tử sinh học Nguyêntắc phản ứng của kỹ thuật ELISA tương tự với kỹ thuật Western blot Giữa mỗi bước,giá nhựa thường được rửa bằng dung dịch tẩy nhẹ để loại bỏ các protein hoặc cáckháng thể không đặc hiệu Sau bước rửa cuối cùng, cơ chất của enzyme được thêmvào để tạo ra tín hiệu có thể nhìn thấy, giúp chỉ ra số lượng kháng nguyên trong mẫu

Hình 1.6 Kỹ thuật ELISA

 Thiết bị cần thiết cho một phản ứng ELISA

o Giá nhựa ELISA pha rắn

Giá nhựa ELISA 96 giếng được sử dụng nhiều nhất trong ELISA thường làpolystyrene hoặc các dẫn xuất của polystyrene thu được bằng cách biến đổi hóa họchoặc chiếu xạ bề mặt Phổ biến nhất là giá 96 giếng gồm 12 thanh, mỗi thanh 8 giếng

o Máy đọc kết quả ELISA

Tương tự máy rửa ELISA, máy đọc ELISA cũng chia thành 3 nhóm: có thể đọcmột thanh trong một lần, hoặc nguyên giá hoặc nhiều giá tùy theo nhu cầu

Cysticercus cellulosae là bệnh gây ra do ấu trùng sán dải heo định vị trong cơ,

não, cơ quan nội tạng Việc chẩn đoán trực tiếp gặp khó khăn nên ELISA được sửdụng phổ biến tại các phòng xét nghiệm nhờ vào những đặc tính có lợi như dễ thựchiện, tốc độ nhanh, chi phí thấp, dễ sản xuất Mặc dù được sử dụng rộng rãi trên thếgiới, tuy nhiên có hiện tượng nhiễm chéo, vì vậy các nhà lâm sàng không thể khẳngđịnh chẩn đoán mà thường phải phối hợp với các xét nghiệm cận lâm sàng khác.Nghiên cứu này sử dụng kỹ thuật Western blot vì Western blot có độ đặc hiệu cao,nhằm khắc phục nhược điểm của ELISA để sản xuất mẫu ngoại kiểm

1.2.7 Kỹ thuật Western blot

 Kỹ thuật Western blot

Western blot là một kỹ thuật phân tích được sử dụng nhằm phát hiện các protein

chuyên biệt của KN Kỹ thuật Western blot (hay còn được gọi là protein

immunoblot) là một kỹ thuật phân tích được sử dụng rộng rãi nhằm phát hiện

các protein chuyên biệt trên các mẫu mô hay dịch chiết xuất mô

Chẩn đoán Taenia solium, cysticercosis ở các cộng đồng lưu hành phụ thuộc

vào các xét nghiệm huyết thanh học, như thường không có phương tiện chụp ảnh.Trong một nghiên cứu 2018, Maria M Cortez, Glenda C Rojas và R Michael E đã

chứng minh rằng HP10 Ag ELISA có chức năng phát hiện T saginata, T hydatigena

và bệnh gạo heo KN HP10 Ag đặc hiệu với bệnh gạo heo ở người nhưng thường

không dùng để chẩn đoán bệnh gạo ở heo vì có phản ứng chéo với T hydatigena cũng

ký sinh ở heo [74]

Phương pháp này sử dụng điện di trên gel để phân tách các protein KN thànhnhiều thành phần di chuyển trên gel điện di theo trọng luọng phân tử (trọng lượngphân tử nhỏ di chuyển trước, lớn di chuyển sau) Protein này sau đó sẽ được chuyểnlên màng, KT đặc hiệu trong huyết thanh bệnh nhân sẽ găn với từng thành phần KNđặc hiệu của ký sinh trùng vừa được tách ra ở trên Điện di trên gel giải quyết các vấn

đề của các phản ứng chéo

Hình 1.7 Kỹ thuật Western blot

 Nguyên lý

Western blot là kỹ thuật kết hợp giữa protein với protein (kháng nguyên – khángthể) Protein kháng nguyên được phát hiện qua phản ứng tạo màu hoặc phát huỳnhquang

 Các bước thực hiện

Bước 1: Xử lý mẫu

Lấy mẫu KN từ toàn bộ khối mô hay môi trường nuôi cấy tế bào Đầu tiên, xử

lý mô rắn bằng phương pháp cơ học sử dụng máy nghiền đồng hóa Thêm các loạichất tẩy rửa, muối và dung dịch đệm để ly giải tế bào và hòa tan protein

Bước 2: Điện di trên gel

Điện di trên gel để phân tách các protein trong mẫu Sự phân tách này củaprotein dựa trên điểm đẳng điện, trọng lượng phân tử, điện tích hoặc phối hợp cácyếu tố trên

Mẫu KN được nạp vào trong các giếng của bản gel (giếng nhỏ chưa proteinchuẩn là chất chỉ thị, giếng lớn chưa KN mẫu) Khi điện thế được thiết lập trên gel,protein bắt đầu di chuyển với tốc độ khác nhau phụ thuộc vào trọng lượng phân tửcủa chúng (trọng lượng phân tử nhỏ di chuyển trước, lớn di chuyển sau) Vận tốckhác nhau của các protein sẽ tạo thành vạch khác nhau trên giếng.

Bước 3: Chuyển protein gel lên giấy

Thường dùng là giấy nitrocellulosae, các protein được chuyển lên giấy mà vẫnduy trì sự sắp xếp như trên bản gel Kết quả là protein sẽ được phơi ra trên lớp mỏng

bề mặt để tiến hành xác định

Bước 4: Xử lý giấy nitrocellulosae (blocking)

Để ngăn chặn các liên kết không đặc hiệu, protein trong dung dịch loãng sẽ gắnvới giấy ở tất cả các vị trí mà KN chưa gắn vào Do đó, khi KT được bổ sung vàokhông còn chỗ bám trên giấy ngoại trừ các vị trí liên kết đặc hiệu với KN Điều nàylàm giảm nhiễu cơ bản trong sản phẩm cuối cùng của Western blot, cho kết quả rõràng và loại trừ hiện tượng dương tính giả

Bước 5: Phản ứng đặc hiệu KN - KT

Để phát hiện các protein chuyên biệt, giấy chứa protein KN cần phải tiếp xúcvới KT cần chẩn đoán KT này có khả năng liên kết với enzyme chỉ thị, enzyme nàykhi kết hợp với một cơ chất tương ứng sẽ thúc đẩy phản ứng hấp thụ quang và tạomàu

Ứng dụng:

o Xác định sự hoạt động của gel thông qua sự có mặt của protein trong mô

o Nhận dạng protein mục tiêu

o Đánh giá tính chuyên biệt của kháng thể

o Phân tích bệnh do vi khuẩn và virus gây ra: thử nghiệm khẳng định HIV,viêm gan B

Một nghiên cứu tại Peru vào năm 2017 nói lên rằng: so với Western blot, độnhạy của cả hai xét nghiệm ELISA bằng hai bộ kít khác nhau để phát hiện các kháng

thể đặc hiệu ở bệnh nhân có dấu hiệu thần kinh do Cysticercus cellulosae thấp (44,4%

và 22,2%), đối với NCC nang hoá, chỉ có 6,7% và 4,5% Huyết thanh từ những bệnhnhân bị bệnh bướu cystic đã phản ứng chéo trong cả hai phương pháp ELISA (38/45,84,4% và 25/45, 55,6%) Huyết thanh từ những bệnh nhân bị hở bàng quang phảnứng chéo trong 5 trường hợp trong một trong các xét nghiệm (11,1%) và chỉ trongmột mẫu với xét nghiệm thứ hai (2,2%) [56].

 Western blot chẩn đoán xác định bệnh do gạo heo

Kết quả phát hiện của một kỹ thuật cho biết những thông số kỹ thuật có thể đạtđược, đó là độ nhạy và độ đặc hiệu Những tiến bộ về y học giúp cho những mặt hạnchế ngày càng giảm đi, độ nhạy và độ đặc hiệu ngày càng tăng cao

Theo Kely Yoshiko Martins Shiguekawa, José Roberto Mineo, Leandro Pajuaba

de Moura và Julia Maria Costa-Cruzl [70], kết quả nghiên cứu cho thấy khi tiến hành

kỹ thuật ELISA ở độ pha loãng 1:20 và 1:100 ta có độ dặc hiệu lần lượt là 52% và88% đối với kháng nguyên thân, 74% và 96% đối với kháng nguyên dịch nang.Không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê cho độ đặc hiệu ở những nồng độ khácnhau, tuy nhiên ở độ pha loãng 1:100 vẫn đặc hiệu hơn cho tất cả kháng nguyên.Kháng nguyên dịch nang là đặc hiệu nhất Tuy nhiên vẫn xảy ra phản ứng chéo vớikháng nguyên của các loại ký sinh trùng khác [70]

Bảng 1.2 Phản ứng chéo trong kỹ thuật ELISA chẩn đoán Taenia solium

SE: KN thân VF: KN dịch nang

Phản ứng chéo, sử dụng kỹ thuật ELISA ở độ pha loãng 1:20 và 1:100 của 85mẫu huyết thanh (55 mẫu của bệnh nhân nhiễm KST đường ruột và 30 người khỏe

mạnh) của Taenia solium [70].

Có 21 thành phần protein (8, 12 – 14, 18, 24, 26 –28, 32 – 36, 39 – 42, 47 – 52,

56, 64 – 68, 72, 75, 80, 85, 88, 92, 98, 105, 110, 115 –120 và 126 – 155 kDa) đã được

xác định bằng kháng thể lớp IgG kháng Taenia solium trên 80 mẫu huyết thanh nghiên

cứu bằng kỹ thuật Western blot [55]

Hình 1.8 Hình ảnh băng Western blot

GP50, một loại protein của Taenia solium xác định chẩn đoán bệnh gạo

heo.GP50 là một kháng nguyên glycoprotein (LLGP) đã được sử dụng để chẩn đoán

dựa trên kháng thể của Taenia solium trong một khảo nghiệm Western blot gần 15

năm.GP50 protein gốc có trọng lượng phân tử là 50 kDa, nhưng trọng lượng phân tửcủa protein hoạt tính là 28.9 kDa, trích từ gạo heo là thành phần protein kết hợp đặchiệu với KT trong huyết thanh người mắc bệnh do gạo heo [57]

Hình 1.9 Protein GP50 trên băng Western blot [57]

Khi so sánh giữa hai kỹ thuật ELISA và Western blot, với hai loại kháng nguyênkhác nhau là kháng nguyên thân và kháng nguyên dịch nang, kết quả là ELISA tốthơn khi dùng với kháng nguyên dịch nang còn Western – blot cho kết quả tốt hơn khidùng với kháng nguyên thân Y văn đã chứng minh ELISA có độ nhạy cao hơn, cònWestern – blot đặc hiệu hơn.

Bảng 1.3 So sánh kỹ thuật WB và kỹ thuật ELISA [55]

+: phản ứng dương tính -: phản ứng âm tính

Theo một nghiên cứu mới nhất (2018) tại Lào, ELISA và Western blot sử dụngkháng nguyên LMWAgs đã được thực hiện như đã mô tả trước đây [84]

Đối với ELISA, các giá trị cắt được xác định là trung bình của OD cộng với 4

độ lệch tiêu chuẩn của huyết thanh từ 37 người hiến tặng lành mạnh (mẫu âm tính)[73]

Nhiên cứu này ứng dụng kỹ thuật Western blot trong việc chọn lựa mẫu theotiêu chuẩn vàng để tạo bộ mẫu ngoại kiểm đặc hiệu, đồng nhất, ổn định Đồng thờiứng dụng kỹ thuật ELISA để xây dựng quy trình sản xuất thử nghiệm mẫu huyếtthanh ngoại kiểm, xây dựng chương trình ngoại kiểm tại các phòng xét nghiệm trongnước, nâng cao chất lượng xét nghiệm

1.3 KHÁI QUÁT CHUNG VỀ NGOẠI KIỂM

1.3.1 Một số khái niệm về quản lý chất lượng

Chất lượng (Quality): là tập hợp các đặc tính vốn có đáp ứng được các yêu cầu

[1] [27] [25] [26]

Quản lý chất lượng (Quality Management – QM): là một loạt các hoạt động

có phối hợp để định hướng và kiểm soát một tổ chức về chất lượng bao gồm chínhsách chất lượng, mục tiêu chất lượng,… đảm bảo chất lượng và cải tiến chất lượng[4] [27] [26] [28] [35]

Hệ thống quản lý chất lượng (Quality Management System – QMS): là một

tập hợp các chính sách, quy trình và thủ tục cần thiết cho việc lập kế hoạch và thựchiện (sản xuất, phát triển, dịch vụ) trong các lĩnh vực kinh doanh cốt lõi của một tổchức [26] [27] [28] [35] [51] (hình 1.10)

Đảm bảo chất lượng xét nghiệm hay còn gọi là QA (Quality Assurance): là

toàn bộ các hoạt động có kế hoạch và có hệ thống được tiến hành trong hệ thống quản

lý chất lượng, liên quan đến nhiều yếu tố của phòng xét nghiệm như: chính sách, tổchức, các quy trình thao tác chuẩn (SOPs), nhân sự, cơ sở hạ tầng, trang thiết bị…[26] [27] [28] [34]

Kiểm tra chất lượng QC (Quality Control): là một quá trình thiết lập các yêu

cầu về kỹ thuật, về quá trình tiến hành… Trong kiểm tra chất lượng xét nghiệm thìnội kiểm và ngoại kiểm là hai quá trình rất quan trọng [26] [27] [28]

Hình 1.10 12 thành tố của hệ thống quản lý chất lượng

Nội kiểm tra chất lượng IQC (Internal Quality Control): gọi tắt là nội kiểm,

là một quy trình được chính các nhân viên xét nghiệm thực hiện hằng ngày để giámsát liên tục và nhanh quá trình xét nghiệm IQC là một công cụ đặc biệt giúp pháthiện và giám sát lỗi ngẫu nhiên hoặc lỗi hệ thống bằng cách sử dụng biểu đồ và cácquy tắc kiểm soát chất lượng

So sánh liên phòng xét nghiệm: là công việc tổ chức, thực hiện và đánh giá

các thử nghiệm trên cùng một mẫu hoặc mẫu thử nghiệm tương tự được thực hiện bởihai hay nhiều phòng xét nghiệm theo các điều kiên xác định trước [34]

1.3.2 Quy trình hoạt động của một phòng xét nghiệm

Quy trình hoạt động của PXN (hình 1.11) chia làm 3 giai đoạn: trước, trong và

sau xét nghiệm [4] [35]

Hình 1.11 Quy trình hoạt động của một phòng xét nghiệm

 Giai đoạn trước xét nghiệm

Đây là giai đoạn thường xảy ra lỗi nhất trong quy trình xét nghiệm, chiếm tỉ lệkhoảng 41% [41] Ở giai đoạn này sẽ bao gồm việc chuẩn bị cho quá trình xét nghiệm

từ khâu lấy mẫu như: thông tin bệnh nhân, điền phiếu yêu cầu xét nghiệm, thao tác

lấy mẫu bệnh phẩm, xử lý mẫu, bảo quản và vận chuyển mẫu tới nơi tiếp nhận Tất

cả các quá trình trên đều có thể sai sót, gây ảnh hưởng tới độ chính xác các kết quảxét nghiệm

 Giai đoạn trong xét nghiệm

Hay còn gọi là giai đoạn quan trọng nhất trong toàn bộ quá trình vận hành phòngxét nghiệm Đây là giai đoạn gây ra khoảng 4% lỗi của quá trình xét nghiệm [41].Trong giai đoạn này, sai sót chủ yếu xảy ra do kỹ thuật phân tích và xử lý kết quả,phương pháp đo lường của trang thiết bị hay tay nghề, trình độ của kỹ thuật viên Tuynhiên, những sai số này thường hay gặp ở các phong xét nghiệm không thực hiệnkiểm soát chất lượng, chưa có quy trình chuẩn và không tuân thủ các quy trình kiểmtra, bảo trì, bảo dưỡng và hiệu chuẩn máy móc định kỳ [81]

 Giai đoạn sau xét nghiệm

Giai đoạn này thường gây sai sót chiếm 55% quá trình xét nghiệm [41] Sau khihoàn thành xét nghiệm, việc đánh giá, xử lý và trả kết quả sau đó lưu trữ hồ sơ vàmẫu bệnh phẩm rất quan trọng

 Vị trí của ngoại kiểm trong đảm bảo chất lượng xét nghiệm

Hình 1.12 Vị trí của ngoại kiểm trong đảm bảo chất lượng xét nghiệm

Đánh giá chất lượng từ bên ngoài (EQA) hoặc các chương trình kiểm tra trình

độ (PT) đánh giá độ chính xác của một kết quả kiểm tra Chương trình ngoại kiểm tra

`chất lượng được thực hiện bởi một đơn vị có thẩm quyền trong kiểm soát, đánh giáliên quan đến việc phân phối các mẫu thử nghiệm tới các phòng thí nghiệm tham gia

và đánh giá kết quả kiểm tra bằng các xét nghiệm liên phòng thí nghiệm tại phòng thínghiệm chuẩn

1.3.3 Ngoại kiểm tra chất lượng xét nghiệm EQA

 Định nghĩa ngoại kiểm

Thuật ngữ EQA (External Quality Assessment) được dùng để mô tả một

phương pháp cho phép so sánh việc thực hiện xét nghiệm của phòng xét nghiệm nàyvới các phòng xét nghiệm bên ngoài EQA giúp đánh giá độ thành thạo, giám sát liêntục việc tiến hành xét nghiệm của các phòng xét nghiệm tham gia Từ đó, xác địnhnhững yếu tố nguy cơ có thể ảnh hưởng đến kết quả xét nghiệm nhằm đưa ra nhữnggiải pháp phòng ngừa, khắc phục EQA giúp so sánh kết quả phân tích giữa các phòngxét nghiệm tham gia và các nhóm phương pháp, giúp chứng minh độ tin cậy của kếtquả xét nghiệm đối với lâm sàng [93]

Năm 2002, WHO đã công nhận NCID về kỹ thuật chuyên môn về chẩn đoánphòng thí nghiệm ở các lĩnh vực bệnh ưu tiên và có kinh nghiệm để thực hiện EQAquốc gia và quốc tế cho các phòng thí nghiệm y tế thuộc khu vực Châu Phi của WHO

[40] [95]

Ngoại kiểm tra được sử dụng nhằm giám sát chất lượng xét nghiệm, mang lạinhiều lợi ích cho phòng xét nghiệm, cơ sở khám chữa bệnh, bác sĩ lâm sàng, bệnhnhân, cơ quan quản lý…giúp phòng xét nghiệm thực hiện so sánh kết quả của mìnhvới các phòng xét nghiệm khác trong cùng khu vực, trong một hay nhiều quốc giathông qua một đơn vị triển khai ngoại kiểm độc lập [4] [81]

Đơn vị triển khai ngoại kiểm (còn gọi cơ quan/ đơn vị kiểm chuẩn) là một tổchức độc lập có trách nhiệm - vai trò trong xây dựng, vận hành chương trình ngoạikiểm tra, có tính khách quan và không có xung đột về quyền lợi Một số đơn vị ngoạikiểm tra trên thế giới như RCPA (Úc), CLIA (Mỹ), MLE (Châu Âu)…Ở nước ta, các

trung tâm kiểm chuẩn chất lượng xét nghiệm ở phía Bắc và phía Nam đã được thànhlập.

Hình 1.13 Các chương trình ngoại kiểm toàn cầu của WHO [91]

 Mục đích của ngoại kiểm

 Đánh giá và giám sát liên tục việc thực hiện xét nghiệm của các phòng xétnghiệm tham gia

 Xác định yếu tố tiềm ẩn có thể ảnh hưởng đến chất luọng xét nghiệm, từ đóđưa ra hành động phòng ngừa nhằm cải tiến chất lượng

 So sánh kết quả giữa các phòng xét nghiệm tham gia, giữa các nhóm phươngpháp với nhau

 Chứng minh độ tin cậy của kết quả cho người sử dụng xét nghiệm;

 Đánh giá các đặc tính của phương pháp;

 Đào tạo liên tục cho nhân viên phòng xét nghiệm đáp ứng yêu cầu về quản lý,công nhận và chuyên môn [44]

 Các phương pháp thực hiện ngoại kiểm

Hiện tại trên thế giới có 03 phương thức được sử dụng trong ngoại kiểm tra chất

lượng xét nghiệm y học: Thử nghiệm thành thạo (Proficiency testing – PT), kiểm tra lại/phân tích lại (Rechecking/Retesting) và đánh giá tại chỗ (On – site evaluation).

 Thử nghiệm thành thạo – Proficiency testing là đơn vị triển khai ngoại kiểm

sẽ phân phối mẫu ngoại kiểm cho các phòng xét nghiệm tham gia Các phòngxét nghiệm phân tích mẫu ngoại kiểm và gửi kết quả về đơn vị triển khai đểphân tích thống kê, đánh giá kết quả thực hiện Sau đó phòng xét nghiệm nhậnbản phân tích kết quả ngoại kiểm tra từ đơn vị triển khai để xem xét và khắcphục sai số (nếu có)

 Kiểm tra lại hay phân tích lại – rechecking/ retesting là phòng xét nghiệm

lựa chọn mẫu nghiệm ngẫu nhiên gửi đến phòng xét nghiệm tham chiếu hoặcđơn vị kiểm chuẩn để phân tích và đánh giá lại các kết quả phân tích mà phòngxét nghiệm đã thực hiện

 Đánh giá tại chỗ - onsite evaluation là đoàn đánh giá được thành lập bởi các

cơ quan có thẩm quyền (Bộ Y tế, Sở Y tế…) hoặc tổ chức được công nhậncủa quốc gia (Văn phòng công nhận chất lượng, Trung tâm kiểm chuẩn Xétnghiệm…) sẽ đến đánh giá phòng xét nghiệm định kỳ hoặc đột xuất [59] [83]

Trong ba phương pháp trên thì thử nghiệm thành thạo (Proficiency testing – PT) mang lại hiệu quả cao hơn so với hai phương pháp còn lại nên được sử dụng phổ

biến nhất Một nghiên cứu được thực hiện tại Khoa Huyết học, Viện Khoa học Ykhoa của Ấn Độ (AIIMS), New Delhi từ năm 1992 đã chỉ ra rằng cần kiểm soát chấtlượng nội bộ trong phòng thí nghiệm thông qua nội kiểm tra (IQC) và tham gia vàocác chương trình thử nghiệm thành thạo bên ngoài (PT)

Hình 1.14 Sơ đồ kiểm tra độ thành thạo [64]

 Các nhóm phương pháp xét nghiệm sử dụng trong ngoại kiểm tra

 Nhóm phương pháp xét nghiệm định lượng: kết quả ngoại kiểm tra đuọc thể

hiện dưới dạng trị số, khoảng giá trị hay tỉ lệ ứng với đơn vị đo lường nhấtđịnh

 Nhóm phương pháp xét nghiệm định tính: kết quả ngoại kiểm thể hiện bằng

sự hiện diện hay vắng mặt, trình tự sắp xếp của một chất, tế bào, vi khuẩn,…

mô tả hình thái, đặc tính,…

 Quy trình thực hiện ngoại kiểm

Hình 1.15 Quy trình thực hiện một chu kỳ ngoại kiểm

TÌM HIỂU THÔNG TINLĨNH VỰC NKT ĐƯỢCTRIỂN KHAI

XEM XÉT, KHẮC PHỤCSAI SỐ (nếu có)

NHẬN BẢN PHÂNTÍCH KQNK, XEM XÉT,TÌM NGUYÊN NHÂN

SAI SỐ

NHẬN VÀ PHÂN TÍCHMẪU NGOẠI KIỂM

CHỌN LĨNH VỰC,THÔNG SỐ PHÙ HỢPĐĂNG KÝ NK

XỬ LÝ, PHÂN TÍCH SỐ

LIỆU

KHUYẾN CÁO SAI SỐ

NHẬN THÔNG TIN VÀĐẶT MÃ PXN

THÔNG BÁO TRIỂNKHAI CHƯƠNG TRÌNH

PHÒNG XÉT NGHIỆM

THAM GIA

ĐƠN VỊ TRIỂN KHAI NGOẠI KIỂM