Nghiên cứu quy trình sản xuất thử nghiệm huyết thanh có kháng thể kháng sán lá lớn ở gan sử dụng trong ngoại kiểm chất lượng xét nghiệm

Xác định kháng thể IgG đặc hiệu kháng kháng nguyên sán lá lớn ở gancó trong mẫu huyết thanh ngoại kiểm .... CÂU HỎI NGHIÊN CỨUBộ mẫu huyết thanh có KT IgG đặc hiệu kháng KN sán

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH

-NGUYỄN LÂM ĐỨC VŨ

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM HUYẾT THANH CÓ KHÁNG THỂ KHÁNG SÁN LÁ LỚN Ở GAN

SỬ DỤNG TRONG NGOẠI KIỂM CHẤT LƯỢNG XÉT NGHIỆM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT Y HỌC

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - NĂM 2018

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH

-NGUYỄN LÂM ĐỨC VŨ

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM HUYẾT THANH CÓ KHÁNG THỂ KHÁNG SÁN LÁ LỚN Ở GAN

SỬ DỤNG TRONG NGOẠI KIỂM CHẤT LƯỢNG XÉT NGHIỆM

Ngành: Kỹ thuật xét nghiệm y học

Mã số: 8720601

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT Y HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS VŨ QUANG HUY

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - NĂM 2018

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu,kết quả trong luận văn này là trung thực và chưa từng được ai công bố trongbất kỳ công trình nào khác

Tác Giả

Nguyễn Lâm Đức Vũ

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Đại cương về xét nghiệm miễn dịch huyết thanh học 3

1.2 Đại cương về Sán lá lớn ở gan Fasciola hepatica và Fasciola gigantica 11

1.3 Hệ thống quản lý chất lượng xét nghiệm 13

1.4 Chương trình ngoại kiểm chất lượng xét nghiệm 15

1.5 Mẫu huyết thanh có KT IgG đặc hiệu kháng KN sán lá lớn ở gan sử dụng trong ngoại kiểm 21

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.1 Đối tượng nghiên cứu 26

2.2 Thiết kế nghiên cứu 26

2.3 Dân số mục tiêu 26

2.4 Dân số chọn mẫu 26

2.5 Cỡ mẫu 27

2.6 Kỹ thuật chọn mẫu 27

2.7 Tiêu chuẩn chọn mẫu 28

2.8 Phương pháp thu thập mẫu 28

2.9 Sơ đồ nghiên cứu 29

2.10 Thiết bị - Dụng cụ 30

2.11 Hoá chất sử dụng 30

2.12 Kỹ thuật xét nghiệm phân tích KT IgG đặc hiệu kháng KN sán lá lớn ở gan 30

2.13 Quy trình sản xuất bộ mẫu huyết thanh có KT IgG đặc hiệu kháng KN sán lá lớn ở gan sử dụng trong ngoại kiểm 51

KẾT QUẢ 613.1 Xác định kháng thể IgG đặc hiệu kháng kháng nguyên sán lá lớn ở gan

có trong mẫu huyết thanh ngoại kiểm 613.2 Sản xuất và đánh giá chất lượng của bộ mẫu huyết thanh ngoại kiểm có

KT IgG kháng KN sán lá lớn ở gan 653.3 Kết quả xây dựng quy trình sản xuất thử nghiệm huyết thanh có KTkháng sán lá lớn ở gan sử dụng trong ngoại kiểm 82

BÀN LUẬN 844.1 Kháng thể IgG đặc hiệu kháng kháng nguyên sán lá lớn ở gan trong huyếtthanh ngoại kiểm 844.2 Đánh giá chất lượng của bộ mẫu huyết thanh có KT IgG đặc hiệu kháng

KN của sán lá lớn ở gan 884.3 Quy trình sản xuất thử nghiệm huyết thanh có KT IgG đặc hiệu khángsán lá lớn ở gan sử dụng trong ngoại kiểm 90

Từ tiếng Việt

ATSH An toàn sinh học

SLLOG Sán lá lớn ở gan

Từ tiếng Anh

ECLIA Electrochemiluminescence ImmunoassayCMIA Chemiluminescent microparticle immunoassayELISA Enzyme linked immunosorbent assay

EQA External Quality Assessment

EQAS External Quality Assessment schemes

IVD In vitro diagnostic

OD Optical density

RIA Radioimmunoassay

DANH MỤC HÌNH Trang

Hình 1.1 Các epitopes trên kháng nguyên 4

Hình 1.2 Cấu trúc phân tử IgG 6

Hình 1.3 Cấu trúc phân tử IgM 8

Hình 1.4 Cấu trúc phân tử IgA 8

Hình 1.5 Tỷ lệ nhiễm SLLOG theo vùng tại Việt Nam 11

Hình 1.6 Sán lá lớn ở gan 12

Hình 1.7 Chu trình phát triển của sán lá lớn 13

Hình 1.8 Hệ thống quản lý chất lượng 14

Hình 1.9 Thiết bị đông khô mẫu EYELA FDU-2100 25

Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu 29

Hình 3.1 Kết quả kỹ thuật western blot xác định tính đặc hiệu của mẫu huyết thanh 64

Hình 3.2 Sơ đồ sản xuất bộ mẫu 66

Hình 3.3 Mẫu huyết thanh đông khô ĐK 1 67

Hình 3.4 Mẫu huyết thanh đông lạnh ĐL 1 69

Hình 3.5 Kết quả theo dõi độ ổn định bộ mẫu ĐL1 77

Hình 3.6 Kết quả theo dõi độ ổn định bộ mẫu ĐK 1 78

Hình 3.7 Kết quả theo dõi độ ổn định của bộ mẫu ĐK 3 80

Hình 3.8 Kết quả theo dõi độ ổn định của bộ mẫu ĐL 3 81

Hình 3.9 Kết quả theo dõi độ ổn định bộ mẫu ĐL 3 và ĐK 3 82

DANH MỤC BẢNG Trang

Bảng 2.1 Thiết bị - Dụng cụ 30

Bảng 2.2 Hoá chất - Sinh Phẩm 30

Bảng 2.3 Hoá chất xét nghiệm Western blot 32

Bảng 2.4 Hoá chất xét nghiệm ELISA 43

Bảng 3.1 Kết quả sàng lọc các bệnh truyền nhiễm trong mẫu huyết thanh thu thập 61

Bảng 3.2 Kết quả sàng lọc KT IgG kháng KN SLLOG trong mẫu huyết thanh 63

Bảng 3.3 Kết quả xác định tính đặc hiệu của các mẫu huyết thanh nguyên liệu 64

Bảng 3.4 Kết quả tiền phân tích của bộ mẫu ĐK 1 67

Bảng 3.5 Kết quả tiền phân tích của bộ mẫu ĐL 1 68

Bảng 3.6 Kết quả tiền phân tích của bộ mẫu ĐL 3 và ĐK 3 70

Bảng 3.7 Bảng kết quả tiền phân tích bộ mẫu âm tính ĐL 2 71

Bảng 3.8 Kết quả đánh giá tính đồng nhất của bộ mẫu ĐK 1 73

Bảng 3.9 Kết quả dánh giá tính đồng nhất cảu bộ mẫu ĐL 1 74

Bảng 3.10 Kết quả đánh giá tính đồng nhất của bộ mẫu ĐK 3 và ĐL 3 75

Bảng 3.11 Kết quả giá trị OD theo thời gian của bộ mẫu ĐL 1 78

Bảng 3.12 Kết quả giá trị OD theo thời gian của bộ mẫu ĐK 1 79

Bảng 3.13 Kết quả giá trị OD theo thời gian của bộ mẫu ĐK 3 80

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngoại kiểm chất lượng xét nghiệm là yêu cầu không thể thiếu trong đảmbảo chất lượng kết quả xét nghiệm theo tiêu chuẩn ISO 15189:2012[28], đồngthời cũng là tiêu chí đánh giá mức chất lượng phòng xét nghiệm y học theoquyết định số 2429/QĐ-BYT của Bộ Y Tế[1] Ngoại kiểm chất lượng xétnghiệm sẽ giúp cho phòng xét nghiệm phát hiện các vấn đề không phù hợp cóthể dẫn đến sai sót hay làm giảm chính xác kết quả xét nghiệm, từ đó giúp chocác nhà quản lý đề ra các giải pháp can thiệp, xử lý khắc phục kịp thời và từngbước cải tiến nâng cao chất lượng xét nghiệm Tham gia ngoại kiểm chất lượngxét nghiệm, cho thấy thái độ trách nhiệm về các vấn đề chất lượng được cácnhà quản lý đặt lên hàng đầu và lấy chất lượng làm cơ sở để liên thông kết quảxét nghiệm giữa các phòng xét nghệm với nhau [31] Ngoại kiểm chất lượngxét nghiệm còn cung cấp bằng chứng khách quan về độ tin cậy và tính chínhxác kết quả xét nghiệm cho tất cả các khách hàng sử dụng các dịch vụ xétnghiệm[2]

Chương trình ngoại kiểm chất lượng xét nghiệm sán lá lớn ở gan đượcthiết kế nhằm nâng cao chất lượng của xét nghiệm sàng lọc, chẩn đoán bệnhsán lá lớn ở gan, đồng thời là cở sở để kiểm soát và đánh giá chất lượng của cácphòng xét nghiệm tham gia thông qua so sánh kết quả liên phòng Tham giangoại kiểm chất lượng xét nghiệm sán lá lớn ở gan trở thành nhu cầu thực tếkhông thể thiếu đối với các phòng xét nghiệm[3] Tuy nhiên tại Việt Nam chotới thời điểm hiện tại chưa có bài báo hay công trình nghiên cứu sản xuất bộmẫu ngoại kiểm dùng trong chương trình ngoại kiểm chất lượng xét nghiệmhuyết thanh học sán lá lớn ở gan được công bố Vì vậy việc "nghiên cứu quytrình sản xuất thử nghiệm huyết thanh có kháng thể IgG kháng sán lá lớn ở gan

sử dụng trong ngoại kiểm chất lượng xét nghiệm " là rất cần thiết

CÂU HỎI NGHIÊN CỨU

Bộ mẫu huyết thanh có KT IgG đặc hiệu kháng KN sán lá lớn ở gan sửdụng trong ngoại kiểm chất lượng xét nghiệm, sản xuất tại Trung Tâm KiểmChuẩn Chất Lượng Xét Nghiệm Y Học Đại Học Y Dược TP Hồ Chí Minh, cóđạt tính đồng nhất, độ ổn định và đáp ứng được các yêu cầu trong ngoại kiểmchất lượng xét nghiệm hay không?

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨUMục tiêu cụ thể

1.Dùng kỹ thuật Western blot xác định KT IgG đặc hiệu kháng KN sánlá lớn ở gan có trong mẫu huyết thanh thu thập để sản xuất bộ mẫu huyết thanhngoại kiểm

2 Đánh giá chất lượng của bộ mẫu huyết thanh có KT IgG đặc hiệukháng KN sán lá lớn ở gan dựa vào tiêu chí đánh giá tính đồng nhất và độ ổnđịnh

3 Xây dựng quy trình sản xuất thử nghiệm bộ mẫu huyết thanh có KTIgG đặc hiệu kháng KN sán lá lớn ở gan sử dụng trong ngoại kiểm chất lượng

xét nghiệm.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU1.1 Đại cương về xét nghiệm miễn dịch huyết thanh học

Hiện nay, xét nghiệm miễn dịch huyết thanh học được ứng dụng rất nhiềutrong các công trình nghiên cứu, chẩn đoán y khoa với rất nhiều kỹ thuật được

áp dụng như: Western blot, Dot-blot, miễn dịch liên kết hấp thụ men (ELISA),miễn dịch điện hóa phát quang (ECLIA), miễn dịch vi từ phát quang(CMIA)[11],[13],[29],[30],[36]…Trong đó kỹ thuật ELISA rất có giá trị trongtầm soát các bệnh nhiễm ký sinh trùng[7],[8],[22] và được áp dụng hầu hếttrong các khoa, phòng xét nghiệm cũng như các trung tâm nghiên cứu tại ViệtNam, kỹ thuật này dựa trên phản ứng kháng nguyên và kháng thể đặc hiệu

Kháng nguyên 1.1.1.1 Định nghĩa

Kháng nguyên là một vật lạ đối với cơ thể, mà khi tiếp xúc với hệ miễndịch của cơ thể đó sẽ kích thích tạo nên miễn dịch đặc hiệu chống lại khángnguyên.[5]

1.1.1.2 Tính đặc hiệu

Đối với sán lá lớn ở gan do kích thước cơ thể lớn, dài từ 3cm – 5cm nên

có rất nhiều thành phần kháng nguyên nằm ở vách cơ thể, đồng thời các enzym,các chất giống hormone, các độc tố, các chất thải trong quá trình chuyểnhóa[10],[11],[19] đã tạo nên thảm kháng nguyên rất phong phú Tuy nhiên việc

đa dạng kháng nguyên trong khảm kháng nguyên làm cho các phản ứng huyếtthanh học có độ đặc hiệu không cao và thường xảy ra phản ứng chéo

Hiện nay với sự phát triển trình độ khoa học kỹ thuật cao, các khángnguyên của sán lá lớn được chiết tách và tinh chế tạo ra các kháng nguyên tinh

khiết, đặc hiệu rất có giá trị trong chẩn đoán nhiễm sán lá lớn gan trên người[11],[19],[26],[36]như băng protein kháng nguyên có trọng lượng 17 kDa (P17), băng protein có trọng lượng 23 kDa (P 23) và băng protein có trọng lượng

27 - 28 kDa (P 27-28) của Fasciola Hepatica cho phản ứng dương tính với độ

nhạy 95,5%, độ đặc hiệu 100%, giá trị tiên đoán dương 100%, giá trị tiên đoán

âm 95,71%.Với băng kháng nguyên P 27-28 tinh chế từ các sản phẩm bài

tiết/dịch tiết của Fasciola gigantica cho phản ứng dương tính với độ nhạy 100%

và độ đặc hiệu 97,6% trong kỹ thuật ELISA Trong đó các băng kháng nguyên

P 27-28 không cho phản ứng chéo với các ký sinh trùng khác

Tính đặc hiệu của kháng nguyên do các epitope nằm trên bề mặt khángnguyên tạo thành Một kháng nguyên có thể có nhiều loại epitope và như vậy

có thể có nhiều loại miễn dịch đặc hiệu chống lại nó[5]

Hình 1.1 Các epitopes trên kháng nguyên .

1.1.1.3 Tính sinh miễn dịch

Tính sinh miễn dịch của một phân tử kháng nguyên mạnh hay yếu phụthuộc vào các yếu tố sau:

Trọng lượng phân tử

Trọng lượng phân tử càng lớn, tính sinh miễn dịch càng mạnh Một phân

tử kháng nguyên muốn sinh được miễn dịch phải có trọng lượng tối thiểu ≥ 10kDa.

Cấu trúc phân tử

Cấu trúc phân tử càng phức tạp bao nhiêu, tính sinh miễn dịch càng mạnhbấy nhiêu Vì vậy, xếp theo tính sinh miễn dịch mạnh đến yếu, ta thấy mạnhnhất là protein, rồi đến các kháng nguyên có protein như glucoprotein,lipoprotein, nucleoprotein, sinh miễn dịch kém nhất là polysaccharide

Về mặt cấu trúc, kháng nguyên có hai phần Phần đặc hiệu là phần kíchthích sinh kháng thể đặc hiệu và phản ứng với kháng thể đó Phần này mangđặc hiệu kháng nguyên Phần mang tính kháng nguyên, phần này có khả năngkích thích cơ thể đáp ứng mạnh hay yếu còn gọi là phần mang tính khángnguyên

Tính lạ đối với cơ thể

Một kháng nguyên muốn sinh miễn dịch đối với cơ thể thì ít nhất khángnguyên đó phải mang một epitope lạ đối với cơ thể

 Kháng nguyên cùng cơ thể

 Kháng nguyên đồng chủng

 Kháng nguyên đồng loài

 Kháng nguyên khác loài

 Kháng nguyên không tiếp xúc

Kháng thể

1.1.2.1 Cấu trúc kháng thể

Kháng thể có bản chất hóa học là globulin, còn được gọi là globulin miễndịch Cấu trúc cơ bản của kháng thể gồm 2 chuỗi nặng (H, heavy chain) và 2chuỗi nhẹ (L, light chain) có trọng lượng phân tử là 50.000Da và 25.000Da, nối

với nhau bằng cầu nối di-sulfur Kháng thể có hai đầu, Một đầu gọi là Fab kếthợp được một cách đặc hiệu với một epitope kháng nguyên, một đầu gọi là Fc

là thành phần có thể tinh thể hóa được và đóng góp vai trò trong phản ứngopsonin hóa, cũng như điểm gắn bổ thể

Đầu gắn kháng nguyên trên chuỗi nặng H và chuỗi nhẹ L lại có hai vùngkhác nhau:

 Vùng có các acid amin ở đây cực kỳ thay đổi, ký hiệu V

 Vùng có các acid amin rất ít thay đổi, ký hiệu là C

Hình 1.2 Cấu trúc phân tử IgG

1.1.2.2 Các loại kháng thể

Sán lá lớn ở gan là loại ký sinh trùng kém thích nghi với người và thườngtạo ra các kháng thể dịch thể là các globulin miễn dịch loại IgG, IgM, IgA vàIgE thường có hiệu giá kháng thể rất cao trong giai đoạn sán ký sinh trong môgan

Kháng thể IgG

Kháng thể IgG có thời gian bán hủy rất dài đóng vai trò chủ yếu trongmiễn dịch dịch thể rất có giá trị trong các xét nghiệm huyết thanh học sàng lọcnhiễm ký sinh trùng nói chung và sán lá lớn ở gan nói riêng, trong quá trình

nhiễm sán lá lớn ở gan các kháng nguyên tiết (dịch tiết hay sản phẩm bài tiết)của của ký sinh trùng này đều có những tác động liên quan đến quá trình tạo rakháng thể IgG cũng như các phân lớp của IgG[10],[20],[35].

Kháng thể IgG có nồng độ cao nhất trong huyết thanh, chiếm khoảng80% tổng lượng globulin miễn dịch trong huyết thanh Có 4 lớp nhỏ IgG ởngười được đánh dấu theo nồng độ giảm dần của chúng trong huyết thanh:IgG1, IgG2, IgG3, và IgG4 Đặc trưng cấu trúc để phân biệt lớp nhỏ này vớilớp nhỏ khác là kích thước của vùng bản lề, số lượng cũng như vị trí của cáccầu di-sulfur liên chuỗi nối các chuỗi nặng Sự khác biệt về acid amin giữa cáclớp nhỏ của IgG đã làm cho hoạt tính sinh học của phân tử có những khác nhau.IgG1, IgG3 và IgG4 có thể chuyển vận dễ dàng qua nhau thai và đóng vai tròtrong việc bảo vệ thai phát triển Một số lớp nhỏ IgG có thể hoạt hoá bổ thểmặc dù hiệu quả của chúng khác nhau Lớp nhỏ IgG3 hoạt hoá bổ thể hiệu quảnhất, tiếp theo là IgG1 rồi đến IgG2 còn IgG4 thì không có khả năng hoạt hoá

bổ thể IgG cũng hoạt động như một kháng thể opsonin do chúng có thể gắnvào thụ thể dành cho Fc có trên bề mặt đại thực bào, nhưng chức năng này cũngthay đổi tuỳ theo lớp nhỏ: IgG1 và IgG3 có ái lực cao với thụ thể dành cho Fc,trong khi IgG4 có ái lực yếu hơn và IgG2 có ái lực rất yếu

1.1.2.3 Kháng thể IgM

IgM là lớp globulin miễn dịch đầu tiên xuất hiện trong đáp ứng lần đầuvới một kháng nguyên, có trọng lượng phân tử lớn không qua được nhau thai,IgM có cấu trúc phân tử gồm 5 phân tử cơ bản nối lại với nhau nhờ chuỗi J

Hình 1.3 Cấu trúc phân tử IgM

1.1.2.4 Kháng thể IgA

IgA có hai loại: IgA huyết thanh, có 2 lớp dưới IgAα1và IgAα2 và IgAtiết là kháng thể chịu trách nhiệm chính trong miễn dịch chống lại vi khuẩnxâm nhập vào cơ thể qua đường niêm mạc Cấu trúc phân tử IgA tiết gồm haiphân tử cơ bản kết nối với nhau nhờ chuỗi J và được bảo vệ khỏi sự phân hủycủa pH acid và các men thủy giải của dịch tiết nhờ một cấu trúc có tên là thànhphần tiết

Hình 1.4 Cấu trúc phân tử IgA

1.1.2.5 Kháng thể IgE

IgE có ái lực cao với tế bào mast thông qua một thụ thể với thành phần

Fc của kháng thể, IgE có trách nhiệm trong miễn dịch chống ký sinh trùng cũngnhư trong phản ứng quá mẫn

Xét nghiệm ELISA

Kỹ thuật miễn dịch hấp thụ liên kết men (ELISA) được phát triển độclập và đồng thời bởi nhóm nghiên cứu Peter Perlmann và Eva Engvall tại Đạihọc Stockholm ở Thụy Điển và nhóm nghiên cứu của Anton Schuurs và Baukevan Weemen ở Hà Lan từ năm 1970 Kỹ thuật này phát triển dựa trên nền tảngkỹ thuật miễn dịch phóng xạ (Radioimmunoassay – RIA) do Solomon Berson

và Rosalyn Yalow mô tả vào năm 1960 [32] Ngày nay, kỹ thuật ELISA được

sử dụng trong rất nhiều trong các công trình nghiên cứu khoa học, chẩn đoánbệnh nhiễm ký trùng đăc biệt đươc ứng dụng nhiều trong xét nghiệm huyếtthanh học chẩn đoán nhiễm sán lá lớn ở gan [18],[26],[30],[32],[38],[40]

1.1.3.1 Nguyên lí cơ bản

Theo nguyên lý cơ bản của miễn dịch học, mỗi một kháng nguyên(antigen) có nhiều yếu tố kháng nguyên (epitope), mỗi một epitope có khả năngkết hợp với một kháng thể (antibody) tương ứng với nó Hầu hết các khángnguyên đều có một hoặc nhiều epitope đặc trưng cho nó, dựa trên đó mà người

ta có thể xác định được kháng nguyên Bên cạnh đó, sự xuất hiện của khángnguyên trong cơ thể, sẽ kích thích cơ thể tạo ra kháng thể đặc hiệu để chống lạikháng nguyên đó Thông qua việc xác định kháng thể này người ta cũng có thểgián tiếp xác định kháng nguyên trong cơ thể

Dựa trên cơ sở đó, kỹ thuật ELISA được thiết lập nhằm xác định sự hiệndiện của kháng nguyên hay kháng thể có trong huyết thanh Để xác định mộtyếu tố cần chẩn đoán (kháng nguyên hay kháng thể) người ta sử dụng một hoặcnhiều yếu tố phát hiện (kháng thể, kháng nguyên, bổ thể) có phản ứng miễndịch đặc hiệu với yếu tố cần chẩn đoán Yếu tố phát hiện liên kết với phức hợpmen, phức hợp men sẽ phân giải cơ chất thích hợp trong phản úng KN-KT tạosự thay đổi màu sắc của cơ chất, qua sự đổi màu của cơ chất chứng tỏ đã xảy

ra phản ứng đặc hiệu KN-KT.

1.1.3.2 Các biến thể của ELISA

Hiện nay, kỹ thuật này không ngừng được phát triển và cải tiến nhằmnâng cao độ nhạy và độ đặc hiệu cũng như rút ngắn thời gian thực hiện Qua

đó, có nhiều biến thể của kỹ thuật ELISA được xây dựng và phát triển như:

 ELISA trực tiếp (Direct ELISA)

 ELISA gián tiếp (Indirect ELISA)

 ELISA cạnh tranh (Competitive ELISA)

 ELISA kẹp chả (Sandwich ELISA)

Xét nghiệm Western blot

Xét nghiệm Western blot được áp dụng từ năm 1981, đây là kỹ thuật xétnghiệm định tính chẩn đoán xác định kháng thể IgG có trong huyết thanh đặchiệu với các băng protein kháng nguyên Kỹ thuật Western blot được sử dụngnhiều trong các xét nghiệm chẩn đoán xác định các tác nhân gây bệnh trong yhọc Trong chẩn đoán bệnh sán lá lớn ở gan, kỹ thuật này được ứng dụng rất

nhiều để phát hiện KN đặc hiệu trên từng loài sán lá lớn Fasciola hepatica, Fasciola gigantica Kỹ thuật này giúp hạn chế tối đa những sai sót thường xảy

ra trong các xét nghiệm huyết thanh học sàng lọc nhiễm ký trùng do phản ứngchéo giữa các loại ký sinh trùng với nhau

1.1.4.1 Ứng dụng xét nghiệm Western blot trong chẩn đoán sán lá lớn ở

gan

Hiện nay kỹ thuật Western blot được ứng dụng nhiều trong lĩnh vực phântích phát hiện các băng protein kháng nguyên đặc hiệu của sán lá lớn ở gan[11],[12],[13],[16],[21],[25],[26],[29],[40] qua đó có thể ly trích, phân tích cáckháng nguyên này để tổng hợp các kháng nguyên tương ứng để sản xuất các bộ

thuốc thử có độ đăc hiệu và chính xác cao, qua đó làm tăng hiệu quả trong côngtác khám chữa bệnh và quản lý vùng lưu hành bệnh tốt hơn.

1.2 Đại cương về Sán lá lớn ở gan Fasciola hepatica và Fasciola gigantica

Bệnh sán lá lớn ở gan trên người thường do hai loài Fasciola hepatica

và Fasciola gigantica gây ra, trong đó Fasciola gigantica là tác nhân chính

gây bệnh tại Việt Nam, khu vực miền Trung và Tây Nguyên nước ta là

những vùng miền có tỷ lệ nhiễm sán lá lớn ở gan cao [4], [22],[39], do có khihậu nhiệt đới gió mùa là điều kiện phát triển thuận lợi cho các vật chủ trunggian của sán lá lớn (như các thực vật thuỷ sinh và các loài ốc thuộc họ

Lymnae sp), cùng với việc phát triển số lượng đàn gia súc (trâu, bò) chăn thả

ngày một tăng Cùng thói quen ăn sống các loại rau thủy sinh ô nhiễm mầm

bệnh, đặc biệt là các ấu trùng giai đoạn nhiễm Metacercarie của sán lá lớn Fasciola gigantica và Fasciola hepatica dính trên các loại rau thủy sinh và

nguồn nước không an toàn đã làm gia tăng số lượng người nhiễm bệnh ngàycao

Hình 1.5 Tỷ lệ nhiễm SLLOG theo vùng tại Việt Nam

Hình thể

1.2.1.1 Sán trưởng thành

Fasciola gigantica dài khoảng 5 cm, Fasciola hepatica dài khoảng 3cm,

sán lá có thân dày hình như một chiếc lá, có thể hình nón ở đầu Phần thân trướcrộng hơn phần thân sau Sán có đĩa hút bụng và đĩa hút miệng Thực quản tươngđối ngắn Ruột dài đến tận phần cuối thân, phân nhiều nhánh nhỏ Cơ quan sinhdục đực có tinh hoàn phân nhánh, ở phần thân sau thân sán Lỗ sinh dục ở phầnphía trước đĩa hút bụng

Hình 1.6 Sán lá lớn ở gan

Chu trình phát triển

Sán lá lớn trưởng thành sống trong ống dẫn mật của người, trâu, bò, cừu.Tại đây sán đẻ trứng, trứng theo đường dẫn mật xuống ruột và theo phân bàitiết ra ngoài

Khi được rơi xuống nước trứng tăng trưởng đủ độ sau 9-15 ngày, trứng

sán nở ra ấu trùng lông (miracidium), nhiệt độ thích hợp để trứng phát triển

thành ấu trùng lông là 15-250 C Ấu trùng lông tìm đến và ký sinh ở ốc thuộc

họ Lymnae sp để phát triển thành ấu trùng đuôi (cercaria) ở nhiệt độ thích hợp

là 20-250 C trong thời gian 6-7 tuần Sau đó, ấu trùng đuôi rời ốc, bám vào thực

vật thủy sinh hoặc bơi trong nước để phát triển thành nang trùng

(metacercaria).

Người ăn sống các thực vật thủy sinh hoặc uống nước không đun sôi cóchứa nang trùng sẽ bị nhiễm sán Sau khi ăn vào, nang trùng sẽ thoát kén vàxuyên qua thành ruột, sau 2 giờ xuất hiện trong ổ bụng, chúng tiếp tục xuyênqua bao gan để ký sinh ở gan Tại gan, sán ăn tổ chức gan và máu, sau đó dichuyển đến ống mật tại đó chúng có thể phát triển thành con trưởng thành vớithời gian khoảng 12 tuần[10]

Hình 1.7 Chu trình phát triển của sán lá lớn

1.3 Hệ thống quản lý chất lượng xét nghiệm

Là hệ thống để định hướng và kiểm soát một tổ chức về mặt chất lượng,

nó bao gồm một chuỗi các quá trình liên tục theo một tiêu chuẩn chất mongmuốn đạt được Một hệ thống chất lượng thường bao gồm 12 thành tố cơ bản

nó bao phủ toàn bộ mọi hoạt động diễn ra trong quá trình xét nghiệm [15]

Hình 1.8 Hệ thống quản lý chất lượngMọi hoạt hoạt động diễn ra đều có liên quan lẫn nhau hoặc tương tác đểbiến đổi đầu vào thành đầu ra, tạo thành các quá trình xét nghiệm và đồngthời diễn ra theo một luồng công việc nhất định nhằm đem lại hiệu quả hoạtđộng cao nhất và luôn đảm bảo hiệu suất công việc cao cũng như chất lượngxét nghiệm đạt mức tốt nhất và đồng thời hạn chế tối đa những sai sót có thể

xảy ra, luồng công việc trong khoa xét nghiệm thường bao gồm:

nghiệm chỉ định, chuẩn bị cho bệnh nhân, lấy mẫu bệnh phẩm, vận chuyển mẫuđến phòng xét nghiệm và kết thúc khi quy trình xét nghiệm bắt đầu thực hiện.

 Trong xét nghiệm (Examination processes)

Là các hoạt động hoặc các bước để thực hiện các xét nghiệm, phân tíchxét nghiệm

 Sau xét nghiệm (Postexamination processes)Là giai đoạn sau phân tích, bao gồm xem xét, diễn giải, thẩm quyền kýtrả kết quả, báo cáo, trả kết quả và lưu giữ mẫu xét nghiệm

1.4 Chương trình ngoại kiểm chất lượng xét nghiệm

Chương trình ngoại kiểm tra chất lượng (External Quality Assessmentschemes - EQAS) là một chương trình đánh giá chất lượng phòng xét nghiệmmột cách khách quan, thông qua việc so sánh kết quả liên phòng xét nghiệm.Các chương trình ngoại kiểm thường được triển khai bởi các trung tâm kiểmchuẩn chất lượng xét ngiệm y học với mục đích đánh giá và giám sát liên tụcchất lượng các phòng xét nghiệm tham gia, thông qua đó xác định những yếu

tố nguy cơ tiềm ẩn có thể ảnh hưởng đến chất lượng xét nghiệm và đưa ra giảipháp phòng ngừa, cải tiến kịp thời từng bước cải thiện và nâng cao chất lượngxét nghiệm

Chương trình ngoại kiểm trên thế giới

Trên thế giới, công tác giám sát và đánh giá chất lượng xét nghiệm đượctriển khai áp dụng từ rất sớm từ năm 1993, các chương trình ngoại kiểm huyếthọc, hoá sinh, vi sinh, miễn dịch, đã được lên kế hoạch triển khai một cách hàihoà giữa các nước trong khối cộng đồng Châu Âu như Áo, Bỉ, Đan Mạch, PhầnLan, Pháp, Đức, Hà Lan, Vương quốc Anh[31],[37],[41]

Năm 1996 các chương trình đánh giá thử nghiệm thành thạo độ cấp quốc

gia (National Proficiency Testing Scheme - NPTS) bao gồm huyết học, hóa họclâm sàng, miễn dịch lâm sàng, vi sinh học lâm sàng và ngân hàng máu đượctriển khai tại Thái Lan.

Tuy nhiên, việc thực hiện ngoại kiểm tra chất lượng xét nghiệm huyếtthanh học ký sinh trùng lại triển khai có phần muộn hơn so với các chương trìnhngoại kiểm khác [23],[31],[43], tại Vương Quốc Anh từ năm 2001-2003 thựchiện thử nghiệm chương trình ngoại kiểm huyết thanh học ký sinh trùng với ba

bộ huyết thanh mẫu ngoại kiểm, tới năm 2005 mới triển khai chương trình chínhthức với năm bộ huyết thanh mẫu ngoại kiểm cùng với 32 phòng xét nghiệmtham gia từ các quốc gia như Anh, Ý, Đức, Hà Lan, Đan Mạch,…Tại TrungQuốc chương trình ngoại kiểm huyết thanh học đánh giá chất lượng xét nghiệm

sàng lọc Toxoplasma bằng kỹ thuật ELISA triển khai từ 2003 đến 2014 nhằm

đánh giá các vấn đề liên quan đến độ nhạy, độ đặc hiệu của các kỹ thuật sàng

lọc nhiễm Toxoplasma mà có những cải tiến, khắc phục để nâng cao chất lượng

xét nghiệm của các phòng xét nghiệm

Chương trình ngoại kiểm trong nước

Tại Việt Nam các chương trình ngoại kiểm đã được triển khai bao phủkhắp cả nước, tuy nhiên các phòng xét nghiệm tham gia vẫn chưa thực hiện đầyđủ tất cả các chương trình ngoại kiểm so với các xét nghiệm thực tế được thựchiện tại phòng xét nghiệm, theo tiêu chí đánh giá mức chất lượng phòng xétnghiệm y học thì tất cả các xét nghiệm triển khai tại phòng xét nghiệm đều phảithực hiện ngoại kiểm và nội kiểm Đây cũng là mục tiêu cần tiến đến của cáctrung tâm kiểm chuẩn chất lượng xét nghiệm y học, nhằm kiểm soát, hổ trợ vàđánh giá chất lượng xét nghiệm của các phòng xét nghiệm một cách toàn diện

và liên tục

Hiện nay các chương trình ngoại kiểm do Trung tâm kiểm chuẩn xét

nghiệm y học Đại học y dược TP Hồ Chí Minh triển khai bao gồm hầu như tất

cả các lĩnh vực của xét nghiệm như huyết học, sinh hoá, miễn dịch đông máu,

vi sinh, ký sinh và các xét nghiệm chuyên sâu PCR -HCV, PCR-HPV…Sốlượng các chương trình ngoại kiểm được triển khai ngày càng tăng về chiềurộng lẫn chiều sâu, từ 02 chương trình ngoại kiểm sinh hoá, miễn dịch đượctriển khai từ năm 2012 với khoãng 86 đơn vị phòng xét nghiệm tham gia [2],[3]đến giữa tháng 07 năm 2017 đã có hơn 20 chương trình ngoại kiểm được triểnkhai với hơn 287 đơn vị tham gia (Hội nghị báo cáo tổng kết thường niên tháng07/2017 của Trung tâm kiểm chuẩn chất lượng xét nghiệm y học Đại học ydược TP Hồ Chí Minh)

Các phương thức ngoại kiểm

Có 3 phương thức được sử dụng trong ngoại kiểm tra chất lượng: Thửnghiệm thành thạo (Proficiency testing – PT), kiểm tra lại/phân tích lại(Rechecking/Retesting) và đánh giá tại chỗ (on – site evaluation)

 Thử nghiệm thành thạo

Đơn vị triển khai ngoại kiểm sẽ phân phối mẫu ngoại kiểm chocác phòng xét nghiệm tham gia Các phòng xét nghiệm phân tích mẫungoại kiểm và gửi kết quả về đơn vị triển khai để phân tích thống kế,

Ngoại kiểm EQA

Thử nghiệm thành thạo

Kiểm tra lại / phân tích lại

Đánh giá tại chỗ

đánh giá kết quả thực hiện Sau đó phòng xét nghiệm nhận bản phân tíchkết quả ngoại kiểm tra từ đơn vị triển khai để xem xét và khắc phục saisố.

 Kiểm tra lại - phân tích lại

Phòng xét nghiệm lựa chọn mẫu xét nghiệm ngẫu nhiên gửi đếnphòng xét nghiệm tham chiếu hoặc đơn vị kiểm chuẩn để phân tích vàđánh giá lại các kết quả phân tích mà phòng xét nghiệm đã thực hiện

Đoàn đánh giá được thành lập bởi các cơ quan có thẩm quyền (Bộ

Y tế, Sở Y tế…) hoặc tổ chức được công nhận của quốc gia (Văn phòngcông nhận chất lượng, Trung tâm kiểm chuẩn Xét nghiệm…) sẽ đến đánhgiá phòng xét nghiệm định kỳ hoặc đột xuất Việc đánh giá này căn cứvào bảng kiểm, những tiêu chí đã được duyệt Bảng kiểm sẽ khác nhautùy thuộc vào từng lĩnh vực xét nghiệm

Quy trình thực hiện ngoại kiểm

Nguyên tắc thực hiện ngoại kiểm

Theo tiêu chuẩn ISO 15189 về năng lực và chất lượng đối với phòng xétnghiệm y tế, việc thực hiện ngoại kiểm tra là quy định bắt buộc của nhiều phòngxét nghiệm nhằm đảm bảo sự tin cậy chất lượng kết quả xét nghiệm Vì vậymỗi phòng xét nghiệm cần tham gia ngoại kiểm tra để đủ điều kiện công nhậnđạt tiêu chuẩn quốc tế Để tham gia ngoại kiểm tra chất lượng, phòng xétnghiệm cần chú ý các nguyên tắc sau:

1.4.5.1 Trước khi tham gia ngoại kiểm

Trước khi tham gia xét nghiệm, phòng xét nghiệm có thể tìm hiểu rõ về

các thông tin của đơn vị triển khai ngoại kiểm như về các chương trình ngoạikiểm, các lĩnh vực, các thông số, mẫu ngoại kiểm, các yếu tố ảnh hưởng đếnmẫu ngoại kiểm và bản phân tích kết quả ngoại kiểm, thời gian nhận mẫu ngoạikiểm, thời gian trả kết quả phân tích mẫu ngoại kiểm.

1.4.5.2 Trong khi tham gia ngoại kiểm

Phòng xét nghiệm cần tuân thủ quy định của đơn vị triển khai ngoại kiểmvề các biểu mẫu, khai báo đúng phương pháp phân tích, thiết bị và thuốc thử.Tuân thủ các điều kiện về quy trình bảo quản, hoàn nguyên mẫu và phân tíchmẫu ngoại kiểm để tránh làm hỏng hoặc biến tính mẫu Phân tích mẫu ngoạikiểm trong điều kiện bình thường khi chạy mẫu xết nghiệm thường quy Phòngxét nghiệm cần hiểu rõ về các chỉ số thống kê và biểu đồ phân tích thông dụng

để xem xét kết quả thực hiện, phát hiện sai số (nếu có) tìm ra nguyên nhân vàkhắc phục sai số cùng với sự tham vấn của đơn vị triển khai ngoại kiểm Dựavào kết quả ngoại kiểm tra để phát hiện sự thay đổi bất thường của kết quả, xácđịnh sai số tiềm ẩn, đề ra biện pháp khắc phục và phòng ngừa sai số xảy ra.Liên hệ với đơn vị triển khai ngoại kiểm để có hướng dẫn, hỗ trợ kịp thời

1.4.5.3 Sau khi kết thúc một chương trình ngoại kiểm

Sau khi kết thúc chương trình ngoại kiểm, phòng xét nghiệm nên tự kiểmtra, đánh giá lại quá trình thực hiện, xác định lại các yếu tố có thể ảnh hưởngđến hệ thống chất lượng xét nghiệm như: phương pháp, chất lượng thuốc thử,tình trạng thiết bị, điều kiện cơ sở vật chất, nguồn nhân lực, kinh phí, thao tácthực hiện của nhân viên, quy trình thao tác chuẩn…Lưu trữ tất cả hồ sơ ngoạikiểm, theo dõi và cải thiện công tác đảm bảo chất lượng tại phòng xét nghiệm

Tầm quan trọng của việc thực hiện ngoại kiểm

Ngoại kiểm tra chất lượng là một công cụ quan trọng giúp giám sát chấtlượng xét nghiệm, đánh giá được độ tin cậy về kết quả của phòng xét nghiệmtại thời điểm cụ thể Ngoại kiểm tra giúp phòng xét nghiệm biết được năng lựcthực hiện kết quả xét nghiệm có đạt chuẩn và đảm bảo độ chính xác và xác thựchay không để có thể đưa ra phương án khắc phục xử lý nếu có và tiếp tục nângcao cải thiện chất lượng chuyên môn cũng như chất lượng hóa chất, phươngtiện, trang thiết bị.

Ngoại kiểm tra cung cấp bằng chứng khách quan về năng lực phòng xétnghiệm là cơ sở khoa học để công nhận đạt chuẩn quốc tế của phòng xétnghiệm Chương trình ngoại kiểm tra giúp phòng xét nghiệm, bác sĩ lâm sàng,nhà quản lý… tin tưởng vào kết quả xét nghiệm, giúp bệnh nhân giảm đượcthời gian và chi phí khám chữa bệnh Ngoại kiểm tra chất lượng giúp đơn vịkiểm chuẩn nắm được thực trạng, tình hình thực hiện xét nghiệm của các phòngxét nghiệm để đưa ra những chính sách, tham vấn hỗ trợ phương án cải thiệnnâng cao chất lượng xét nghiệm Để đảm bảo tốt nhất cho chất lượng xétnghiệm thì lãnh đạo phòng xét nghiệm cần xây dựng cơ cấu, thiết lập tổ chức,lập kế hoạch và theo dõi cải tiến quy trình tại phòng xét nghiệm và kết hợp vớiđơn vị triển khai ngoại kiểm để nâng cao chất lượng chuyên môn cũng như chấtlượng thực hành tại phòng xét nghiệm

Ngoại kiểm tra giúp duy trì và nâng cao chất lượng phân tích của các xétnghiệm trong phòng thí nghiệm Ngoại kiểm tra là một chương trình giúp nângcao thỏa thuận liên phòng và tiêu chuẩn chất lượng

1.5 Mẫu huyết thanh có KT IgG đặc hiệu kháng KN sán lá lớn ở gan sử dụng trong ngoại kiểm

Hiện nay, bộ mẫu sử dụng cho các chương trình ngoại kiểm chất lượngxét nghiệm thường là mẫu chuẩn (RM- Reference meterial) và mẫu chuẩn được

chứng nhận (CRM – Certified refence material)[9].

- Mẫu chuẩn (RM) là vật liệu đủ đồng nhất và ổn định đối với một hoặc

nhiều tính chất quy định, được thiết lập phù hợp cho việc sử dụng dự kiến trongquá trình đo

- Mẫu chuẩn được chứng nhận (CMR) là mẫu chuẩn được đặc trưng

bằng thủ tục đo có hiệu lực đối với một hay nhiều tính chất quy định cùng vớigiấy chứng nhận đưa ra giá trị tính chất xác định, độ không đảm bảo đo kèmtheo và công bố về tính liên kết chuẩn đo lường

Tuy nhiên tại Việt Nam chưa có đơn vị nào sản xuất hay cung cấp mộttrong hai loại bộ mẫu trên cho chương trình ngoại kiểm huyết thanh học sán lálớn ở gan, vì vậy trong nghiên cứu chúng tôi sản xuất mẫu huyết thanh có khángthể đặc hiệu IgG kháng kháng nguyên sán lá lớn ở gan sử dụng trong ngoại

kiểm xét nghiễm ELISA-Fasciola, bộ mẫu này sử dụng nguyên liệu từ các mẫu

huyết thanh của bệnh nhân nhiễm sán lá ở gan

Các yêu cầu về chất lượng mẫu huyết thanh có KT IgG đặc hiệu kháng KN sán lá lớn ở gan sử dụng trong ngoại kiểm

Đối với chương trình ngoại kiểm huyết thanh học ký sinh trùng, do bộmẫu ngoại kiểm được gửi đến nhiều đơn vị phòng xét nghiệm tham gia phântích sau đó gửi kết quả phân tích về trung tâm kiểm chuẩn chất lượng xétnghiệm thống kê, đánh giá thông qua so sánh kết quả liên phòng, vì vậy mẫungoại kiểm cần đạt được các yêu cầu sau:

- Mẫu huyết thanh ngoại kiểm được xác định đặc tính rõ ràng không cócác yếu tố nguy cơ gây bệnh truyền nhiễm : HIV, HCV, HBsAg

- Mẫu được chứa trong các ống có nắp đậy kín, không bị rò rỉ trong vậnchuyển cũng như khi bảo quản

- Mẫu huyết thanh ngoại kiểm có kháng thể IgG đặc hiệu kháng khángnguyên sán lá lớn ở gan.

- Mẫu huyết thanh ngoại kiểm được xác định khoảng giá trị kháng thểIgG ban đầu (giá trị OD tiền phân tích)

- Bộ mẫu huyết thanh ngoại kiểm đạt đồng thời hai tiêu chí chất đánhgiá chất lượng là tính đồng nhất và độ ổn định trong khoảng thời giannhất định

Các phương pháp sản xuất bộ mẫu huyết thanh có KT IgG đặc hiệu kháng KN sán lá lớn ở gan sử dụng trong ngoại kiểm

Hiện nay có nhiều phương pháp sản xuất mẫu ngoại kiểm như đông khômẫu huyết thanh, đông khô mẫu huyết tương hay đông lạnh mẫu huyết thanh,đông lạnh mẫu huyết tương, đông khô máu toàn phần, đông lạnh máu toànphần Trong nghiên cứu này chúng tôi sản xuất mẩu ngoại kiểm theo phươngpháp đông khô mẫu huyết thanh [6] và đông lạnh mẫu huyết thanh[23],[31],[34],[43], tuy nhiên việc đông khô mẫu huyết thanh đòi hỏi phải cóthiết bị đông khô chuyên dụng và cần phải tính toán thể tích chính xác khi hoànnguyên mẫu nhưng việc bảo quản và phân phối mẫu đến các phòng xét nghiệmphân tích sẽ an toàn và thuận lợi

1.5.2.1 Kỹ thuật đông khô mẫu huyết thanh

Phương pháp đông khô được áp dụng trong sản xuất mẫu ngoại kiểm sẽgiúp cho mẫu ngoại kiểm không bị thay đổi tính chất và nồng độ KT không bịthay đổi sau khi hoàn nguyên, tuy nhiên thể tích mẫu đông khô (200 µl huyếtthanh cho mỗi ống mẫu ngoại kiểm) sẽ lớn hơn nhiều so thể tích của mẫu đônglạnh (50 µl cho mỗi ống mẫu)

1.5.2.2 Giá trị của đông khô

Đông khô có giá trị làm ổn định chất lượng của sản phẩm tươi, sức sống

của sản phẩm kéo dài, giảm độ nhạy của sản phẩm với nhiệt độ nóng.Vậnchuyển và bảo quản dễ dàng hơn Đông khô được sử dụng trong nhiều lĩnh vựcnhư bảo quản vaccin, sinh phẩm, protein, máu, huyết tương và các sản phẩmcủa huyết tương, các tổ chức mô, xương, vitamin, enzym, các mẫu bệnhphẩm.[7].

1.5.2.3 Nguyên lý:

Nguyên lý của quá trình đông khô là nguyên liệu được đông lạnh độtngột tại điểm chuyển thể, khiến nước từ thể lỏng sang thể rắn, rồi qua xử lýchân không thăng hoa thành thể hơi rồi ngưng tụ thành nước rồi thải ra ngoài.Theo nguyên lý này, sản phẩm được làm đông khô vẫn giữ nguyên hình thái,khi hoàn nguyên bằng nước cất hoặc dung dịch thích hợp thì sản phẩm sẽ trởlại trạng thái ban đầu

Quá trình đông khô trải qua 03 giai đoạn:

Giai đoạn 1 hay là giai đoạn đông lạnh: trong giai đoạn này sảnphẩm được làm lạnh từ nhiệt độ môi trường khoảng 20oC giảm xuống nhiệt độ

âm 10oC đến âm 40oC Đồng thời, trong giai đoạn này bình thăng hoa đượchút chân không nên áp suất hơi nước trong bình giảm so với trong lòng vật liệudẫn tới hiện tượng thoát ẩm trong lòng vật liệu Kết thúc giai đoạn này khoảng10% – 15% nước thoát ra khỏi sản phẩm

Giai đoạn 2 hay còn gọi là giai đoạn thăng hoa: trong giai đoạnnày nhờ dòng nhiệt chủ yếu là các bức xạ từ các tấm bức xạ, nước trong sảnphẩm sấy bắt đầu thăng hoa Độ ẩm của sản phẩm sấy giảm rất nhanh, giai đoạnnày có tốc độ và nhiệt độ sấy không đổi Cuối giai đoạn này, nhiệt độ sản phẩmsấy mới dần tăng từ âm 100C đến âm 400C lên đến 00C Đến đây quá trìnhthăng hoa kết thúc Hiệu quả đông khô ở giai đoạn này đạt được từ 95 – 97 %

áp suất trong bình thăng hoa vẫn duy trì bé hơn áp suất bên ngoài nhờ bơm chânkhông và sản phẩm vẫn tiếp tục được gia nhiệt, nước vẫn tiếp tục từ thể lỏngsang thể hơi và đi vào bình thăng hoa, giai đoạn bốc hơi ẩm còn lại chính là quátrình sấy chân không bình thường, kết thúc quá trình đông khô sản phẩm Hiệuquả đông khô ở giai đoạn này đạt tới 99% (độ ẩm còn lại là 1% đến < 2%).

Hình 1.9 Thiết bị đông khô mẫu EYELA FDU-2100

Phương pháp đánh giá tính đồng nhất và độ ổn định của mẫu huyết thanh có KT IgG đặc hiệu kháng KN sán lá lớn ở gan sử dụng trong ngoại kiểm

Sử dụng phương pháp kiểm định F-test phân tích phương sai một yết tố(one way Anova) bằng phần mềm SPSS 20.0 để đánh giá tính đồng nhất

Sử dụng phép kiểm t-test độc lập (independent-sample t test) xác địnhchênh lệch giữa giá trị trung bình OD của mẫu tại thời điểm đánh giá và thờiđiểm phân tích ban đầu (tiền phân tích) có xảy ra hay không, sử dụng phầnmềm thống kê SPSS 2.0 để đánh giá độ ổn định

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU2.1 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu huyết thanh bệnh nhân có KT IgG kháng KN sán lá lớn ở gan

(Fasciola gigantica) phát hiện tại phòng khám chuyên khoa thuộc Viện Sốt Rét

Ký Sinh Trùng Côn Trùng Qui Nhơn

2.2 Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu thực nghiệm, nghiên cứu đánh giá tính đồng nhất và độ ổnđịnh của bộ mẫu huyết thanh có KT IgG đặc hiệu kháng KN sán lá lớn ở gan

sử dụng trong ngoại kiểm chất lượng

Bộ mẫu huyết thanh nghiên cứu bị tác động bởi yếu thời gian (lưu trữ)

và nhiệt độ (đông khô-đông lạnh) để đánh giá giá độ đồng nhất và tính ổn địnhcủa bộ huyết thanh mẫu, nghiên cứu diễn ra trong thời gian từ tháng 01/2018đến tháng 05/2018 tại Trung Tâm Kiểm Chuẩn Chất Lượng Xét Nghiệm Y HọcĐại Học Y Dược TP.Hồ Chí Minh

2.3 Dân số mục tiêu

Mẫu huyết thanh bệnh nhân được lấy tại Phòng khám chuyên khoa thuộcViện Sốt Rét Ký Sinh Trùng Côn Trùng Qui Nhơn

2.4 Dân số chọn mẫu

Mẫu huyết thanh có phản ứng dương tính với xét nghiệm ELISA pháthiện KT IgG kháng KN của sán lá lớn ở gan được lấy tại Phòng Khám chuyênkhoa thuộc Viện Sốt Rét Ký Sinh Trùng Côn Trùng Qui Nhơn

Đồng thời mẫu huyết thanh cho phản ứng âm tính với xét nghiệm sànglọc nhanh HIV1-2, HCVAb, HBSAg

2.5 Cỡ mẫu

Để bộ mẫu huyết thanh có KT IgG đặc hiệu kháng KN sán lá lớn ở gan

sử dụng trong ngoại kiểm chất lượng đáp ứng được các tiêu chí đánh giá độ ổnđịnh và tính đồng nhất theo các quy định và hướng dẫn của tiêu chuẩn ISO 35: 2006[9] và ISO 13528 : 2015[27]

Số lượng mẫu được tính trong quá trình đánh giá:

- Tính đồng nhất 14 mẫu/lô :

14 x 2 (lô) = 28 mẫu

- Độ ổn định 3 mẫu/lô/thời điểm đánh giá:

Thời điểm đánh giá 2 tuần, 3 tuần, 4 tuần, 8 tuần, 12 tuần

3 x 2 (lô) x 5 (thời điểm đánh giá) = 30

Cỡ mẫu được tính cho mỗi bộ mẫu:

n = 28+30= 58 mẫuTuy nhiên trong nghiên cứu này chúng tôi sản xuất 2 bộ mẫu :

- Bộ mẫu dương tính với 3 mức nồng độ là mức nồng độ cao, trungbình và thấp, mỗi mức nồng độ gồm 100 mẫu

- Bộ mẫu âm tính gồm 100 mẫu

Tâm Kiểm Chuẩn Chất Lượng Xét Nghiệm Y Học Đại Học Y Dược TP HỒCHÍ MINH thực hiện các bước tiếp theo trong quá trình nghiên cứu.

2.7 Tiêu chuẩn chọn mẫu

Tiêu chí đưa vào

Mẫu huyết thanh có phản ứng dương tính với xét nghiệm ELISA phát

hiện kháng thể IgG kháng KN của Fasciola gigantica.

Mẫu huyết thanh cho phản âm tính với cả ba xét nghiệm sàng lọc HIV1-2, HCVAb và HBsAg

Tiêu chí loại ra

Mẫu huyết thanh tiêu huyết, sậm màu, mẫu để quá 48 giờ kể từ khi lấymáu và không được bảo quản ở nhiệt độ 2-8oC

2.8 Phương pháp thu thập mẫu

Trong quá trình thu thập mẫu đảm bảo tuân theo theo các qui định antoàn sinh học trong phòng xét nghiệm Mẫu được thu thập theo sơ đồ sau:

2.9 Sơ đồ nghiên cứu

Quá trình nghiên cứu sẽ thực hiện theo sơ đồ sau:

Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu

2.10 Thiết bị - Dụng cụ

Quá trình phân tích mẫu được thực hiện tại Trung Tâm Kiểm Chuẩn ChấtLượng Xét Nghiệm Y Học Đại Học Y Dược TP.Hồ Chí Minh, trên các thiết bịsau:

Bảng 2.1 Thiết bị - Dụng cụ

1 Tủ an toàn sinh học cấp 2 2012-73893 Esco - Singapore

3 Máy ủ lắc - nhiệt PST-60 HL Biosan- Latvia

10 Tủ âm sâu -80oC 823888-4906 Thermo-Mỹ

11 Đồng hồ đếm thời gian Q&Q-DT32 Trung Quốc

2.11 Hoá chất sử dụng

Bảng 2.2 Hoá chất - Sinh Phẩm

2.12 Kỹ thuật xét nghiệm phân tích KT IgG đặc hiệu kháng KN sán lá lớn ở gan

Trong quá trình nghiên cứu chúng tôi áp dụng các kỹ thuật xét nghiệmxét nghiệm sau:

- Kỹ thuật Western blot dùng xác định kháng thể đặc hiệu IgG kháng

kháng nguyên sán lá lớn ở gan.

- Kỹ thuật ELISA dùng để thu thập mẫu huyết thanh dương tính vớikháng nguyên sán lá lớn ở gan

- Kỹ thuật sắc ký miễn dịch miễn dịch định tính (xét nghiệm nhanh)dùng để sàng lọc các yếu tố nguy cơ gây bệnh truyền nhiễm HIV,HCV, HBV

Kỹ thuật xét nghiệm Western blot 2.12.1.1 Giới thiệu

Western blot là xét nghiệm định tính chẩn đoán xác định kháng thể IgGđặc hiệu với các băng protein kháng nguyên của sán lá gan lớn, dựa trên phảnứng kháng nguyên kháng thể

2.12.1.2 Nguyên tắc kỹ thuật

Điện di kháng nguyên tiết, dịch tiết của sán lá gan lớn trên thạchacrylamid (thường dùng là thạch PAGE polyacrylamid gel electrophoresis) đểphân tách các băng protein kháng nguyên đặc hiệu Chuyển các băng khángnguyên sang màng nitrocellulose

Thưc hiện kỹ thật ELISA trên màng nitrocellose: Mỗi mẫu thử (huyếttương bệnh nhân) cần xác định kháng thể sẽ được ủ riêng biệt với một màngnitrocellose, kháng thể có trong huyết tương sẽ liên kết đặc hiệu với các băngprotein kháng nguyên đặc hiệu trên màng nitrocellulose tạo phức hợp KN-KT,sau đó cho phức hợp gắn kết phosphate kiềm (alkaline phosphatase) gắn trênkháng thể kháng IgG người vào để tạo phức hợp KN-KT-KT kháng IgG Cuốicùng, phức hợp KN-KT-KT kháng IgG phản ứng với chất nền (substrate) vàkhi phản ứng xảy ra sẽ được xác định bởi sự xuất hiện các băng màu tại vị trícác băng kháng nguyên đặc hiệu của sán lá lớn ở gan

2.12.1.3 Thành phần thuốc thử (LDBIO WB-fasciola IgG)

Bảng 2.3 Hoá chất xét nghiệm Western blot

R1 Các que nitrocellulose đánh số từ 1 đến 12,

có gắn các băng KN của sán lá lớn ở gan

dê kháng KT IgG người

1 lọ 30 ml

(buffer + NBT* + BCIP* +chất ổn định)

1 lọ 30 ml

(Buffer + surfactan + NaN3 ) < 0.1 %

1 lọ 60 ml

R10 Dung dịch huyết tương chứng dương tính 1 lọ 200 ml

Các lọ R2, R3, R5 và R6 thường được cung cấp theo cùng 1 lô của thuốcthử và cùng 1 ngày sản xuất Do đó cần kiểm tra các lọ thuốc thử trước khi sửdụng để đảm bảo chất lượng xét nghiệm tốt nhất

*NBT: Nitroblue tetrazolium

*BCIP: 5-bromo-4-chloro-3-indolyl photphate

- Bảo quản - Ổn định

Bộ thuốc thử bảo quản ở nhiệt độ 2-8o C, các thuốc thử của bộ thuốc thử

ổn định đến hết thời gian ghi bên ngoài hộp vả trên các lọ thuốc

Dung dịch nước rửa R6 đã pha loãng 1/10 bền trong 2 tháng ở 2-8oC vàbền 1tuần ở nhiệt độ phòng

- Độ nhạy: 100%

- Độ đăc hiệu :100%