Nghiên cứu quy trình sản xuất thử nghiệm máu toàn phần ứng dụng ngoại kiểm hba1c trong bệnh đái tháo đường

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞBÁO CÁO TỔNG HỢPKẾT QUẢ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM MÁU TOÀN PHẦN

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ

BÁO CÁO TỔNG HỢPKẾT QUẢ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM MÁU TOÀN PHẦN ỨNG DỤNG NGOẠI KIỂM HBA1C

TRONG BỆNH ĐÁI THÁO ĐƯỜNG

Cơ quan chủ trì nhiệm vụ :

TRUNG TÂM KIỂM CHUẨN CHẤT LƯỢNG XÉT NGHIỆM Y HỌC

Chủ trì nhiệm vụ: PGS TS VŨ QUANG HUY

BÁO CÁO TỔNG HỢP

KẾT QUẢ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM MÁU TOÀN PHẦN ỨNG DỤNG TRONG NGOẠI KIỂM HbA1C

(Đã chỉnh sửa theo kết luận của Hội đồng nghiệm thu ngày 22/04/2019)

Cơ quan chủ quản

TP, Hồ Chí Minh, ngày 23 tháng 04 năm 2019

BÁO CÁO THỐNG KÊ KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC

I THÔNG TIN CHUNG

1 Tên đề tài: Nghiên cứu quy trình sản xuất thử nghiệm máu toàn phần ứng dụng

trong ngoại kiểm HbA1c

Thuộc lĩnh vực (tên lĩnh vực): Ngoại kiểm xét nghiệm

2 Chủ nhiệm nhiệm vụ:

Họ và tên: Vũ Quang Huy

Ngày, tháng, năm sinh: 07/11/1961 Nam/ Nữ: Nam

Học hàm, học vị: Phó Giáo Sư

Chức danh khoa học: Tiến Sĩ

Chức vụ: Giám Đốc Trung tâm kiểm chuẩn chất lượng y học

Điện thoại: Tổ chức: 028 38530158 Nhà riêng: Mobile: 0913586389 Fax: 028 38552304; Email: drvuquanghuy@gmail.com

Tên tổ chức đang công tác: Trung tâm kiểm chuẩn chất lượng xét nghiệm y học Địa chỉ tổ chức: 131 Nguyễn Chí Thanh, Phường 9, Quận 5, Thành Phố Hồ Chí Minh

Địa chỉ nhà riêng: AA 54, Cảnh viên 1, khu đô thị Phú Mỹ Hưng, quận 7, Thành phố Hồ Chí Minh.

Địa chỉ: 131 Nguyễn Chí Thanh, Phường 9, Quận 5, Thành Phố Hồ Chí Minh

4 Tên cơ quan chủ quản đề tài: Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh

1 Tên Khoa hoặc Trung tâm, đơn vị - nơi quản lý trực tiếp cá nhân làm chủ nhiệm đề tài.

- Thực tế thực hiện: từ tháng 04 năm 2018 đến tháng 04 năm 2019

- Được gia hạn (nếu có):

Từ tháng… năm… đến tháng… năm….

2 Kinh phí và sử dụng kinh phí:

a) Tổng số kinh phí thực hiện: 29tr.đ, trong đó:

+ Kính phí hỗ trợ từ ngân sách khoa học của nhà trường: 5tr.đ.

Thời gian (Tháng, năm)

Kinh phí (Tr.đ)

Thời gian (Tháng, năm)

Kinh phí (Tr.đ) 1

Theo kế hoạch Thực tế đạt được

- Lý do thay đổi (nếu có):

3 Tổ chức phối hợp thực hiện nhiệm vụ:

Số

TT

Tên tổ chức đăng ký theo Thuyết minh

Tên tổ chức đã tham gia thực hiện

Nội dung tham gia chủ yếu

Sản phẩm chủ yếu đạt được

Ghi chú*

- Lý do thay đổi (nếu có):

4 Cá nhân tham gia thực hiện nhiệm vụ:

(Người tham gia thực hiện đề tài thuộc tổ chức chủ trì và cơ quan phối hợp, không quá

10 người kể cả chủ nhiệm)

Số

TT

Tên cá nhân đăng ký theo Thuyết minh

Tên cá nhân

đã tham gia thực hiện

Nội dung tham gia chính

Sản phẩm chủ yếu đạt được

Ghi chú*

1 PGS.TS Vũ

Quang Huy

PGS.TS Vũ Quang Huy

Theo dõi, thực hiện toàn bộ

đề tài

2 CN Nguyễn

Tiến Huỳnh

CN Nguyễn Tiến Huỳnh

Thu thập tài liệu, nguyên liệu, sản xuất mẫu, đánh giá chất lượng mẫu

3 CN Bùi Minh

Đức

CN Bùi Minh Đức

Thu thập tài liệu, nguyên liệu, đánh giá chất lượng mẫu, phân tích

số liệu, viết, chỉnh sửa hoàn thiện đề tài

- Lý do thay đổi ( nếu có): Thay đổi nhân sự

5 Tình hình hợp tác quốc tế:

Số

TT

Theo kế hoạch

(Nội dung, thời gian, kinh phí,

địa điểm, tên tổ chức hợp tác,

số đoàn, số lượng người tham

1

2

- Lý do thay đổi (nếu có):

6 Tình hình tổ chức hội thảo, hội nghị:

7 Tóm tắt các nội dung, công việc chủ yếu:

(Nêu tại mục 16 của đề cương, không bao gồm: Hội thảo khoa học, điều tra khảo sát trong nước và nước ngoài)

Theo kế hoạch

Thực tế đạt được

1 Nghiên cứu tài liệu

01/05/2018-01/07/2018

01/07/2018

01/05/2018-2 Rà soát hệ thống thiết bị làm

mẫu

15/06/2018

15/06/2018

20/05/2018-3 Thu thập nguyên liệu nguyên

liệu sản xuất

25/07/2018

25/07/2018

25/06/2018-4 Xác định đặc tính mẫu máu

tươi

25/07/2018

25/07/2018

25/06/2018-5 Tạo lô mẫu giá trị bình thường

và bệnh lý

25/07/2018

25/07/2018

25/06/2018-6 Đánh giá chất lượng toàn bộ

mẫu

01/01/2019

01/01/2019 Tổng hợp kết quả, phân tích số

30/07/2018-liệu, viết đề tài

01/04/2019

01/04/2019

01/01/2019-6 Chỉnh sửa và hoàn thiện đề tài

01/04/2019-18/04/2019

18/04/2019

01/04/2019 Lý do thay đổi (nếu có):

III SẢN PHẨM KH&CN CỦA ĐỀ TÀI

1 Sản phẩm KH&CN đã tạo ra:

Thực tế đạt được

1 Đề Cương Nghiên cứu

2 Nguyên liệu

3 Nguyên liệu chuẩn

4 Mẫu ngoại kiểm giả định

5 Nhóm mẫu ngoại kiểm

(Tạp chí, nhà xuất bản)

Theo

kế hoạch

Thực tế đạt được 1

2

- Lý do thay đổi (nếu có):

d) Kết quả đào tạo:

Theo kế hoạch Thực tế đạt

được

- Lý do thay đổi (nếu có):

đ) Tình hình đăng ký bảo hộ quyền sở hữu công nghiệp:

Số

TT

Tên sản phẩm đăng ký

Kết quả Ghi chú

(Thời gian kết thúc)

Theo

kế hoạch

Thực tế đạt được 1

2

- Lý do thay đổi (nếu có):

e) Thống kê danh mục sản phẩm KHCN đã được ứng dụng vào thực tế

2 Đánh giá về hiệu quả do đề tài mang lại:

a) Hiệu quả về khoa học và công nghệ:

Hiện nay, Ngoại kiểm tra chất lượng xét nghiệm HbA1c, Việt Nam chưa có bất kỳ một công trình nào được công bố về sản xuất mẫu máu toàn phần ứng dụng trong ngoại kiểm HbA1c, mẫu ngoại kiểm HbA1c các phòng xet xét nghiệm đang

sử dụng được nhập khẩu và với giá thành rất cao Trong tình hình đó, việc sản xuất mẫu mẫu máu toàn phần ứng dụng trong ngoại kiểm HbA1c là rất cần thiết Đề tài

là cở sở khoa học cho các công trình nghiên cứu khoa học về ngoại kiểm xét nghiệm sinh hóa khác khác có liên quan.

b) Hiệu quả về kinh tế xã hội:

Hiện tại đứng trước nhu cầu phát triển, nâng cao hệ thống quản lý chất lượng xét nghiệm, Bộ Y tế đã ban hành các thông tư hướng dẫn bắt buộc các phòng xét nghiệm phải thực hiện ngoại kiểm Bên cạnh đó là việc sản xuất mẫu ngoại kiểm cũng là yêu cầu bắt buộc của các trung tâm kiểm chuẩn theo đề án 316 của Thủ tướng chính phủ Các sản phẩm ngoại kiểm đang sử dụng trong nước lại đang được nhập khẩu từ nước ngoài nên giá thành rất cao nên việc sản xuất mẫu sẽ đáp ứng được nhu cầu rất lớn.

3 Tình hình thực hiện chế độ báo cáo, kiểm tra của đề tài:

Số

Thời gian thực hiện

Ghi chú

(Tóm tắt kết quả, kết luận chính, người chủ trì…)

I Báo cáo tiến độ

DANH MỤC HÌNH

DANH MỤC SƠ ĐỒ

DANH MỤC BẢNG

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CÂU HỎI NGHIÊN CỨU 3

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ glycAted hemoglobin (HbA1c) 4

1.1.1 Khái niệm HbA1c 4

1.2.2 Tính chất của HbA1c 6

1.2.3 Vai trò của HbA1c 7

1.2.4 Tương quan giữa trị số HbA1c và glucose máu trung bình 8

1.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến chỉ số HbA1c 8

1.1.2 Khái lượt về bệnh đái tháo đường 9

1.1.3 Nguyên nhân và cơ chế sinh bệnh ĐTĐ[6],[ 15] 11

1.1.3.1 Cơ chế sinh bệnh ĐTĐ týp 1 11

1.1.3.2 Cơ chế sinh bệnh ĐTĐ týp 2 12

1.2 CÁC YẾU TỐ LIÊN QUAN ĐẾN CHẤT LƯỢNG XÉT NGHIỆM 14

1.2.1 Khái niệm chất lượng xét nghiệm 14

1.2.2 Quy trình hoạt động của phòng xét nghiệm 15

1.3 NGOẠI KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG (EQA - External Quality Assessment) 16

1.3.1 Các phương thức ngoại kiểm tra 17

1.3.2 Lợi ích của việc thực hiện ngoại kiểm: 18

1.3.3 Các bước thực hiện ngoại kiểm 19

1.3.4 Đặc điểm chính của một chương trình ngoại kiểm 19

1.4 TIÊU CHUẨN SẢN XUẤT MẪU NGOẠI KIỂM 20

1.4.1 Mẫu máu toàn phần chứa HbA1c sử dụng trong ngoại kiểm[19],[ 22] 20

1.4.4 Nghiên cứu tính đồng nhất 21

1.4.5 Nghiên cứu độ ổn định 22

1.4.6 Các vật liệu mẫu kiểm chuẩn dùng trong xét nghiệm HbA1c[29] 23

1.5 TÌNH HÌNH NGOẠI KIỂM HÓA SINH TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM 26

1.5.1 Tình hình ngoại kiểm hóa sinh trên thế giới 26

1.5.2 Tình hình ngoại kiểm hóa sinh trong nước 26

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU: 28

2.2 THIẾT KẾ NGHIÊN CỨU 28

2.3 TIÊU CHUẦN CHỌN MẪU 28

2.3.1 Tiêu chí đưa vào 28

2.3.2 Tiêu chí loại ra 28

2.4 CỠ MẪU 29

2.5 PHƯƠNG PHÁP THU THẬP mẪU 29

2.5.1 Nguyên liệu được lựa chọn trong nghiên cứu: 30

2.5.2 Sơ đồ trong nghiên cứu: 31

2.5.3 Xử lý số liệu 31

2.5.4 Thiết bị - Dụng cụ 31

2.5.5 Hoá chất sử dụng 32

2.6 QUY TRÌNH SẢN XUẤT MẪU NGOẠI KIỂM HbA1c 32

2.6.1 Giai đoạn chuẩn bị vật liệu và nguyên liệu ban đầu 33

2.6.1.1 Chuẩn bị vật liệu 33

Hình 2.1 Chuẩn bị vật liệu ban đầu 34

2.6.1.2 Nguyên liệu ban đầu 34

2.6.2 Giai đoạn chia nhỏ tạo lô mẫu 34

2.6.3 Giai đoạn đánh giá kết quả ban đầu: 36

2.6.4 Phân lô tiến hành lưu trữ mẫu: 39

2.6.6.1 Đánh giá ổn định bộ mẫu đông lạnh 44

2.6.6.2 Đánh giá ổn định bộ mẫu đông khô 46

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ 50

3.1 THU THẬP NGUYÊN LIỆU 50

3.1.1 Nguyên liệu HbA1c mức nồng độ bình thường 50

3.1.2 Nguyên liệu HbA1c mức nồng độ cao 50

3.1.3 Phân chia 2 bộ mẫu 51

3.2 ĐÁNH GIÁ NGUYÊN LIỆU BAN ĐẦU 51

3.3 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ TÍNH ĐỒNG NHẤT 52

3.4 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ ĐỘ ỔN ĐỊNH 53

3.4.1 Kết quả phân tích độ ổ định của mẫu đôg khô và đông lạnh 53

3.5 KẾT QUẢ XÂY DỰNG QUY TRÌNH SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM MÁU TOÀN PHẦN CHỨA NỒNG ĐỘ HBA1C SỬ DỤNG TRONG NGOẠI KIỂM 55

BÀN LUẬN 57

KẾT LUẬN 59

KIẾN NGHỊ 59

TÀI LIỆU THAM KHẢO 60

ĐTĐ : Đái tháo đường

NĐBĐ : Nồng độ ban đầu

PXN : Phòng xét nghiệm

TCVN : Tiêu chuẩn Việt Nam

Từ tiếng Anh

ADA : American Diabetes Association

CDC : Centers for Disease Control and Prevention, USACLSI : Clinical and Laboratory Standards Institute

CRM : Certified Reference Material

CV : Coefficient of Variation

DCCT : Diabetes Control and Complication Trial

EQA : External Quality Assessment

Hb : Hemoglobin

HbA : Hemoglobin Adult

HbA1c : Glycohemoglobin

HbF : Hemoglobin Foetal

HPLC : High Performance Liquid Chromatography

ISO : International Organization for Standardization

IFCC : International Fedaration of Clinical Chemistry

NGSP : National Glycohemoglobin Standardization ProgramOIML : International Organisation of Legal Metrology

QMS : Quality Management System

RM : Reference Material

SD : Standard Deviation

WHO : World Health Organization

Hình 1.1 Sự hình thành HbA1c trong hồng cầu 4

Hình 1.2 Phản ứng tạo thành HbA1c 5

Hình 1.3 Tương quan giữa chỉ số HbA1c và glucose máu trung bình 8

Hình 1.4 Biến chứng của bệnh đái tháo đường 10

Hình 1.5 Quá trình hoạt động của phòng xét nghiệm 15

Hình 1.6 Thiết bị đông khô EYELA FDU-2100 26

Hình 2.1 Chuẩn bị vật liệu ban đầu 35

Hình 2.2 Chuẩn bị nguyên liệu ban đầu 36

Hình 2.3 Xác định khối lượng tube chứa mẫu 36

Hình 2.4 Quá trình chia nhỏ tạo bộ mẫu 37

Hình 2.5 Quá trình calib máy và chạy QC 39

Hình 2.6 QC đạt đánh giá kết quả ban đầu 39

Hình 2.7 Mẫu sau khi đông khô và tiến hành đánh giá đồng nhất 43

Hình 2.8 Hoàn nguyên – ly giải hồng cầu 43

Hình 2.9 Sau khi chuẩn máy và chạy kết quả HbA1c 43 Hình 2.10 Đánh giá ổn định theo 2 p pháp HPLC và miễn dịch đo độ đục 45

Sơ đồ 1.2 Các phương thức ngoại kiểm 18

Sơ đồ 2.1 Quá trình thực hiện nghiên cứu 31

Sơ đồ 2.2 Quá trình đánh giá đồng nhất lô mẫu 44

Sơ đồ 2.3 Quá trình đánh giá ổn định lô mẫu 47

Sơ đồ 3.3 Quy trình nghiên cứu sản xuất mẩu chuẩn HbA1c 50

Bảng 2.2 Hóa chất – sinh phẩm 33

Bảng 2.3 Kết quả đánh giá nồng độ HbA1c 2 mức ban đầu 40

Bảng 2.4 Kết quả đánh giá đồng nhất bộ mẫu HbA1c đông lạnh 42

Bảng 2.5 Kết quả đồng nhất đông khô 44

Bảng 3.1 Kết quả đánh giá nồng độ HbA1c ban đầu……… 51

Bảng 3.2 Kết quả đánh giá độ đồng nhất của bộ mẫu chứa nồng độ HbA1c……….52

Bảng 3.3 Kết quả lô mẫu chứa HbA1c ở mức bình thường 53

Bảng 3.4 Kết quả lô mẫu chứa HbA1c ở mức nồng độ cao 54

Bảng 3.5 Bảng phân tích kết quả lô mẫu chứa HbA1c lô mẫu tan đông……55

ĐẶT VẤN ĐỀ

Theo trung tâm kiểm soát và phòng chống dịch bệnh Hoa kỳ (CDC)công bố năm 2011 ở Mỹ: ĐTĐ chiếm tỉ lệ 8,3% tương đương 25,8 triệu người,trong đó chỉ có 18,8 triệu người được phát hiện, có tới 7 triệu người khôngđược chẩn đoán Nguy cơ tử vong ở người ĐTĐ cao gấp đôi so với người cùng

độ tuổi không mắc bệnh ĐTĐ Chi phí dịch vụ chăm sóc và điều trị cho ngườiĐTĐ cao gấp đôi so với người không mắc ĐTĐ Tổng chi phí cho người bịĐTĐ tại Mỹ 2007 là 174 tỷ USD, trong đó chi phí y tế trực tiếp là 116 tỷ, giántiếp là 58 tỷ USD[12] Trên thế giới mỗi năm phải chi số tiền khổng lồ từ 232

tỷ đến 430 tỷ USD cho việc phòng chống và điều trị bệnh đái tháo đường[9]

Ở Việt Nam, theo nghiên cứu năm 2012 của Bệnh viện Nội tiết trungương cho thấy: tỷ lệ hiện mắc ĐTĐ trên toàn quốc ở người trưởng thành là5.42%, tỷ lệ đái tháo đường chưa được chẩn đoán trong cộng đồng là 63.6%

Tỷ lệ rối loạn dung nạp glucose toàn quốc 7,3%, rối loạn glucose máu lúc đóitoàn quốc 1,9% (năm 2003) Theo kết quả điều tra STEPwise về các yếu tốnguy cơ của bệnh không lây nhiễm do Bộ Y tế thực hiện năm 2015, ở nhómtuổi từ 18-69, cho thấy tỷ lệ ĐTĐ toàn quốc là 4,1%, tiền ĐTĐ là 3,6%[6]

Để kiểm soát tốt các sai sót trong quá trình thực hiện và trả kết quả xétnghiệm đảm bảo độ tin cậy cho chẩn đoán và điều trị đạt hiệu quả cho ngườibệnh thì mỗi phòng xét nghiệm cần tiến hành nội kiểm tra và đặc biệt là ngoạikiểm tra chất lượng xét nghiệm Ngoại kiểm tra chất lượng (EQA) không thểthiếu trong việc kiểm soát chất lượng xét nghiệm đặc biệt giai đoạn trong xétnghiệm theo tiêu chuẩn ISO 15189[52], đồng thời EQA như là một công cụminh chứng cho sự hoàn thiện của hệ thống đánh giá mức chất lượng theoquyết định 2429/BYT ngày 12 tháng 6 năm 2017[7], kiểm soát chất lượngtrong phòng xét nghiệm góp phần không nhỏ trong việc chẩn đoán và điều trịcho bệnh nhân đạt hiệu quả[44] Ở Việt Nam thủ tướng và Bộ y tế đã ban hànhcác thông tư, nghị định, quyết định nhằm tăng cường pháp lý trong quá trình

kiểm soát quản lý chất lượng xét nghiệm và tiến tới lộ trình liên thông kết quảxét nghiệm năm 2020 - 2025 Hướng dẫn Thông tư số 01/2013/TT-BYT[5],ngày 11 tháng 01 năm 2013, Quyết định số 316/QĐ-TTg[2], ngày 27 tháng 02năm 2016 thủ tướng chính phủ Tuy nhiên, để có thể kiểm tra chất lượng xétnghiệm thì cần phải có một mẫu chuẩn đạt tiêu chuẩn hay mẫu được chứngnhận[19] Các mẫu chuẩn thường dùng trong ngoại kiểm hiện nay ở nước ta đa

số được nhập khẩu từ thị trường nước ngoài với giá thành rất cao Hiện tại ởViệt Nam chưa có bất kỳ một bài báo hay công trình nào được công bố về sảnxuất mẫu ngoại kiểm HbA1c trong nước Ngày nay HbA1c được lựa chọn hàngđầu trong chẩn đoán và theo dõi điều trị bệnh “Đái tháo đường” Vì HbA1ckhông ảnh hưởng bởi chế độ ăn uống, không phụ thuộc vào thời điểm làm xétnghiệm Cho nên việc lựa chọn xét nghiệm này là tốt nhất[6],[ 34] Với thựctrạng hiện tại như vậy, việc sản xuất một bộ mẫu HbA1c dùng trong ngoạikiểm tra chất lượng xét nghiệm là điều cần thiết Vì vậy, tôi tiến hành thực hiện

đề tài “ Nghiên cứu quy trình sản xuất thử nghiệm máu toàn phần để ứng

dụng trong ngoại kiểm HbA1c”.

CÂU HỎI NGHIÊN CỨU

Bộ mẫu máu toàn phần chứa nồng độ HbA1c sử dụng trong ngoại kiểmtra chất lượng xét nghiệm, sản xuất tại Trung Tâm Kiểm Chuẩn Chất LượngXét Nghiệm Y Học Đại Học Y Dược TP Hồ Chí Minh, có đạt tính đồng nhất,

độ ổn định và đáp ứng được các yêu cầu trong ngoại kiểm chất lượng xétnghiệm hay không?

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

2 Xây dựng được quy trình sản xuất bộ mẫu máu toàn phần chứa nồng độHbA1c theo phương pháp đông lạnh và đông khô

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ GLYCATED HEMOGLOBIN (HBA1C)

1.1.1 Khái niệm HbA1c

HbA1c lần đầu tiên được xác định năm 1968, như là một biến thểhemoglobin lạ có liên kết với tiểu đường (Rahbar S 1968) Tuy nhiên, phảiđến năm 1977 lần đầu tiên được công nhận HbA1c như một chỉ số để kiểm soátđường huyết (Lancet 1977) Trong suốt 30 năm qua, HbA1c (một phầnglycosylated chủ yếu) đóng vai trò quan trọng trong việc theo dõi bệnh ĐTĐvới cơ sở vững chắc từ “the Diabetes Control and Complications Trial(DCCT), (N Engl J Med 1993) và the United Kingdom Prospective DiabetesStudy (UKPDS), (Lancet 1998)”

HbA1c là thuật ngữ dùng để chỉ hemoglobin bị glycosyl hóa Hồng cầutrong quá trình lưu hành làm chức năng hô hấp có một tỷ lệ nhỏ hemoglobinnày sẽ gắn kết với glucose máu để tạo nên phân tử HbA1c Glucose có thể liênkết với hemoglobin trong máu ở bất kỳ thời gian nào trong suốt quá trình tồntại của nó bởi một phản ứng không cần enzyme[28], quá trình liên kết này làkhông thể đảo ngược và tỉ lệ Hb (Hemoglobin) bị Glycosyl hóa sẽ tăng lên theolượng đường trong máu

Hình 1.1 Sự hình thành HbA1c trong hồng cầu

Ở người lớn, HbA chiếm khoảng 97 - 98%, HbA2 chiếm khoảng 2,5% vàHbF khoảng 0,5% HbA gắn với glucose tại đoạn cuối với amino acid valin củachuỗi beta Quá trình gắn này gọi là glycosyl hóa (glycosylate) và hemoglobin

bị glycosyl hóa gọi là HbA1 Mặc dù HbA1 chiếm chủ yếu trong sốhemoglobin gắn với glucose, quá trình glycosyl hóa có thể xảy ra tại các vị tríkhác trong chuỗi globin và ở các hemoglobin khác nữa ngoài HbA Quá trìnhglycosyl hóa hemoglobin xảy ra khi hồng cầu tiếp xúc với glucose huyết tương

Hình 1.2 Phản ứng tạo thành HbA1c

Hemoglobin và glucose có thể tạo cầu nối ban đầu lỏng lẻo nhưng sau đóbền vững, rất khó tách được hemoglobin và glucose Đối với HbA1, phần cầunối lỏng lẻo thường chiếm 10% tổng số cầu nối HbA1-glucose Sự hình thànhHbA1 xảy ra rất chậm trong suốt đời sống hồng cầu (120 ngày), số lượng HbA

bị glycosyl hóa phụ thuộc vào nồng độ glucose và thời gian tiếp xúc vớiglucose

HbA1 gồm 3 loại: A1a, A1b, và A1c, trong đó HbA1c chiếm 60 - 70%lượng HbA1 HbA1 chiếm đa số hemoglobin bị glycosyl hoá ở điều kiện bình

thường nên HbA1c đại diện cho hemoglobin bị glycosyl hóa Loại huyết sắc tốglycosyl hóa A1c (HbA1c) thường chiếm 4 - 6% tổng số huyết sắc tố.Hemoglobin bị glycosyl hóa có cầu nối bền vững tăng dần khi nồng độ glucosemáu tăng ổn định, cầu nối này bắt đầu tăng khoảng 2 - 3 tuần (thay đổi trong 1

4 tuần) Thế nên, HbA1c phản ánh nồng độ glucose máu trung bình trong 2

-3 tháng trước đó

1.2.2 Tính chất của HbA1c

HbA1c ổn định cao trước kiểm nghiệm (1tuần ở 4°C) trong khi quá trìnhthủy phân glucose (glycolysis) tiêu thụ glucose trong hai giờ đầu tiên bảo quảntrong fluoride sau khi máu được thu thập Trong 10 năm qua, tiềm năng chuẩnđoán HbA1c đã được kiểm định lại Gần đây nhất, nhóm DETECT-2 đã phântích dữ liệu máu từ 47.364 người tại 12 quốc gia và báo cáo một ngưỡngHbA1c là 6,3% (45 mmol/mol) là ngưỡng cho bệnh võng mạc (một biến chứngđặc trưng của bệnh tiểu đường), và qua một phân tích hoạt động đã chỉ ra mộtmức tối ưu là HbA1c 6.5% (48 mmol/mol), (Diabetes Care 2011) Cần phảinhấn mạnh rằng HbA1c không phải là một sự thay thế cho glucose, nhưng nó

là một yếu tố sàng lọc cho các biến chứng vi mạch (Diabetes care 2010)

Dựa vào cơ sở trên, ADA hiện tại khuyến khích HbA1c ≥ 6.5% (48mmol/mol) thay thế cho glucose huyết làm nền tảng trong chẩn đoán Sau khiphân tích chi tiết hơn, WHO ủng hộ quan điểm này cho tiêu chuẩn chẩn đoán(World Health Organisation, 2011) Cả hai tổ chức này tham khảo tầm quantrọng của việc đo HbA1c ở bệnh nhân có biểu hiện liên quan đến số lượnghồng cầu bất thường, trong đó bao gồm suy thận cũng như sự thiếu máu và tanmáu Chứng nhận bởi những xét nghiệm lặp lại nên dùng cùng một phươngpháp (ví dụ: HbA1c không nên dùng lần thứ hai ở những bệnh nhân khôngđược chẩn đoán bằng xét nghiệm glucose ban đầu) HbA1c không được khuyếncáo cho tiểu đường trong thai kỳ Tại Anh, tuyên bố của WHO đã ngay lập tứcđược chào đoán bởi Hiệp hội tiểu đường Vương quốc Anh (Diabetes UK) vàđược xác nhận bởi một số chuyên gia, nhưng không phải tất cả họ điều công

nhận Bộ Y tế Anh thiết lập đề nghị kết hợp HbA1c vào tiêu chuẩn chẩn đoántiểu đường hiện tại.

HbA1c bây giờ được chấp nhận là một xét nghiệm chẩn đoán tiểu đường.Người ta sẽ tiếp tục thảo luận về các điểm cắt tối ưu nhất, nhưng dường nhưđiều không thay đổi là 6.5% (48 mmol/mol)

HbA1c 5,7-6,5% (39-48 mmol/mol) đã được đề xuất bởi ADA để biểu thịkhoảng giữa tăng đường huyết (Diabetes Care, 2011)[51] và WHO đã đề nghịnhững người có HbA1c giữa 6.0-6.5% (42-48 mmol/mol) nên được xem xétcan thiệp vào phòng chống tiểu đường (World Health Organisation, 2011)[41]

1.2.3 Vai trò của HbA1c

HbA1c có thể được sử dụng để chẩn đoán tiểu đường, phát hiện nguy cơ,theo dõi hiệu quả điều trị và giúp ngăn ngừa biến chứng

- Huyết sắc tố glycosyl hóa phản ánh mức glucose máu trong vòng trêndưới 8 tuần lễ trước khi đo và sẽ cho biết sự kiểm soát glucose máu trong thờigian dài Ở bệnh nhân tiểu đường nồng độ HbA1c khoảng 5-7% cho biết bệnhnhân đã được ổn định glucose máu tốt trong 2-3 tháng trước Nếu HbA1c >10% chứng tỏ glucose máu bệnh nhân không được kiểm soát tốt Ngược lại,trên bệnh nhân glucose máu cao, nếu điều trị tích cực giảm được glucose máuthì huyết sắc tố kết hợp với glucose sẽ chỉ thay đổi sớm nhất sau 4 tuần

Xét nghiệm HbA1c là nền tảng đánh giá tình trạng sức khỏe Giá trịHbA1c ≥ 6,5% (48 mmol/mol) cho phép chẩn đoán tiểu đường, trong khi giátrị này nằm trong khoảng 42 - 47 mmol/mol (6,1% - 6,5%) nghĩa là có nguy cơmắc tiểu đường Bệnh nhân tiểu đường nên đo HbA1c ít nhất 1 lần mỗi năm.Những người bệnh có chỉ số đường huyết thất thường hoặc có đường huyết banđầu cao nên xét nghiệm HbA1c thường xuyên để đánh giá hiệu quả kiểm soátđường huyết và có những điều chỉnh kịp thời để phòng ngừa biến chứng

1.2.4 Tương quan giữa trị số HbA1c và glucose máu trung bình

ADA đang khuyến khích sử dụng một thuật ngữ mới trong chẩn đoán vàđiều trị tiểu đường, đó là đường huyết trung bình ước tính viết tắt là eAG(estimated average glucose) Xét nghiệm HbA1c sẽ quyết định sự thay đổi điềutrị, quyết định đường huyết cho đối tượng xét nghiệm có được kiểm soát tốthay không vì nó tương quan với tỉ lệ biến chứng mạn tính mà tương lai có thểmắc phải Kết quả chuyển đổi ở bảng dưới đây được tính theo công thức

28.7 x HbA1c – 46.7 = eAGCông thức này được công bố công khai bởi the A1C-Derived AverageGlucose study (ADAG)- trên Diabetes Care (2008)

Hình 1 3 Tương quan giữa chỉ số HbA1c và glucose máu trung bình[50]

(www.daithaoduong.com) 1.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến chỉ số HbA1c

- Sự thay đổi của quá trình glycosyl hóa do chu chuyển hồng cầu, do genảnh hưởng đến quá trình glycosylate hóa, hoặc glucose huyết tăng bất thường

- Các yếu tố liên quan đến huyết sắc tố

- Thai kỳ: Thai kỳ ảnh hưởng đến HbA1c, nồng độ HbA1c thường thấphơn phụ nữ không có thai do pha loãng máu chu chuyển tế bào gia tăng Tuynhiên vào quí 3 của thai kỳ HbA1c có thể gia tăng do thiếu sắt.

- Thiếu máu: Thiếu máu tán huyết, mất máu cấp thiếu máu thiếu sắt có thểlàm giảm HbA1c xuất hiện hồng cầu non và reticulocyte chưa đủ thời gian

để glycosylate hóa

- Bệnh nhân bị cắt lách có HbA1c tăng do đời sống hồng cầu kéo dài

- Bệnh huyết sắc tố: Bệnh HbF có thể làm tăng trị số HbA1c HbC và HbS

có thể làm giảm trị số HbA1c, điều này tùy thuộc phương pháp đo HbA1c Cácphương pháp đo miễn dịch có thể khắc phục tình trạng này

- Suy chức năng thận: Do sự hiện hiệu của Carbamylated Hb, HbA1c cóthể thấp do đời sống hồng cầu ngắn lại

- Các nguyên nhân khác: dùng erythropoietin tái tổ hợp, môi trường tăngurea máu, truyền máu

- Các thuốc gây tán huyết có thể làm mức HbA1c hạ thấp: Dapsone,Rabavirin, Sulfonamide

- Các thuốc thay đổi cấu trúc Hb: Hydroxyurea thay đổi HbA thành HbF,dùng thuốc phiện kéo dài có thể làm tăng HbA1c

Ngoài ra có những chênh lệch nhỏ chỉ số HbA1c giữa các phương phápxét nghiệm khác nhau

1.1.2 Khái lượt về bệnh đái tháo đường

Tình hình bệnh ĐTĐ ở trong nước và trên thế giới[6],[ 9],[ 15],[ 24]

ĐTĐ là do sự thiếu hụt về tác động của insulin ở các tổ chức đích Sựthiếu hụt đó là do tiết insulin không đầy đủ và/hoặc giảm đáp ứng của tổ chứcđối với insulin, ở một hoặc nhiều khâu trong tác động của nó Rối loạn quátrình tiết insulin và thiếu hụt về tác động của nó thường xảy ra trên một bệnhnhân và thường khó xác định nguyên nhân nào xảy ra trước gây nên tình trạngtăng đường huyết

Những triệu chứng gây nên tình trạng tăng đường huyết bao gồm đáinhiều, uống nhiều, sụt cân, đôi khi ăn nhiều, mờ mắt, rối loạn về sự phát triển

và sức chống đỡ đối với nhiễm khuẩn gây nên nhiều biến chứng (Hình 1.4).

Hình 1.4 Biến chứng của bệnh đái tháo đường.

Năm 2000, theo WHO toàn thế giới có ít nhất khoảng 171 triệu người bịbệnh ĐTĐ tỷ lệ này tăng rất nhanh, dự đoán tới năm 2030 con số này tăng gấpđôi (khoảng trên 349 triệu người trên toàn cầu) Bệnh ĐTĐ xảy ra khắp cácchâu lục, thường gặp nhất là ĐTĐ týp 2, đặc biệt ở các nước phát triển Tuynhiên tỷ lệ bệnh tăng nhanh nhất là các nước thuộc Châu Phi và Châu Á, dựbáo tới năm 2030 số bệnh nhân ĐTĐ chủ yếu là hai châu lục này Năm 2005 ở

Mỹ đã có khoảng 20,8 triệu người bị bệnh ĐTĐ Theo Hiệp Hội Đái TháoĐường Hoa Kỳ (ADA), có khoảng 6,2 triệu người không được chẩn đoán vàkhoảng 41 triệu người trong nhóm tiền ĐTĐ

Ở Việt Nam, theo tài liệu nghiên cứu thống kê của ba nhóm tác giảnghiên cứu trên ba vùng khác nhau của đất nước vào đầu những năm 90 thế kỷtrước cho thấy: Ở Hà Nội tỷ lệ ĐTĐ từ 15 tuổi trở lên là 1,1%, nội thành 1,44%ngoại thành 0,63%, tỷ lệ giảm dung nạp glucose là 1,6% (Lê Huy Liệu vàCS.1991) Ở Thành Phố Hồ Chí Minh theo Mai Thế Trạch và cộng sự năm(1993): Tỷ lệ mắc bệnh ĐTĐ ở Thành phố Hồ Chí Minh ở người từ 15 tuổi: ởnội thành 2,52 ± 0,4%, tỷ lệ giảm dung nạp glucose là 0,96 ± 0,2% Tại Huế:Theo kết quả nghiên cứu của Trần Hữu Dàng (1996) tỷ lệ mắc bệnh ĐTĐ ở ngườitrên 15 tuổi là 0,96 ± 0,14%, tỷ lệ giảm dung nạp glucose 1,45 ± 0,17%.

1.1.3 Nguyên nhân và cơ chế sinh bệnh ĐTĐ[6],[ 15]

1.1.3.1 Cơ chế sinh bệnh ĐTĐ týp 1

Vào thời điểm ĐTĐ týp 1 xuất hiện, hầu hết các tế bào bêta trong tuyếntụy đã bị thương tổn Trong quá trình gây thương tổn này, thực chất là một quátrình tự miễn dịch, mặc dù từng chi tiết nhỏ còn đang được thảo luận Nhiều ýkiến cho rằng, quá trình sinh bệnh được minh họa như sau:

- Bước 1: tính mẫn cảm di truyền (genetic susceptibility) đối với bệnh làcần phải có

- Bước 2: môi trường sống thường khởi xướng quá trình bệnh ở những

ổn định, thường có tăng ceton huyết khi không được điều trị, bệnh xuất hiện ởtuổi thanh thiếu niên, nhưng đôi khi cũng có thể gặp ở người lớn, đặc biệtkhông có béo phì và triệu chứng tăng đường huyết là triệu chứng khởi bệnh

1.1.3.2 Cơ chế sinh bệnh ĐTĐ týp 2

ĐTĐ týp 2 là bệnh không đồng nhất, không phải là một bệnh duy nhất,

mà là một tập hợp các hội chứng khác nhau Bệnh có những bất thường quantrọng về sự tiết và tác dụng của insulin Dù cho bản chất của sự bất thường là

gì cũng đều dẫn đến kháng insulin và giảm tiết insulin, tương tác lẫn nhautrong quá trình phát triển của bệnh, cuối cùng suy giảm tiết insulin do suy kiệt

tế bào bêta là đều tất yếu xảy ra Thêm vào đó, một khi đã tăng đường huyết,độc tính glucose sẽ gây ra thêm sự bất thường về tác động và bài tiết insulin

1.1.4 Chẩn đoán bệnh ĐTĐ[4],[ 6],[ 9],[ 15],[ 24],[ 40]

1.1.4.1 Các triệu chứng kinh điển: Ăn nhiều, uống nhiều, đái nhiều và sụt cân nhiều 1.1.4.2 Một số yếu tố nguy cơ cho chẩn đoán: Béo phì, tiền sử gia đình có

người bị bệnh ĐTĐ, phụ nữ có thai lúc thai nghén, tiền sử đẻ con nặng trên 4kg

1.1.4.3 Dựa vào tiêu chuẩn chẩn đoán của hiệp hội ĐTĐ Hoa Kỳ (ADA) năm 2017 thì chúng ta sử dụng 1 trong 4 tiêu chuẩn để chẩn đoán ĐTĐ[6]:

- Glucose huyết tương lúc đói (fasting plasma glucose: FPG) ≥ 126mg/dL (hay 7 mmol/L)

- Glucose huyết tương ở thời điểm sau 2 giờ làm nghiệm pháp dung nạpglucose đường uống 75g (oral glucose tolerance test: OGTT) ≥ 200 mg/dL(hay 11,1 mmol/L)

- HbA1c ≥ 6,5% (48 mmol/mol) Xét nghiệm này phải được thực hiện ởphòng thí nghiệm được chuẩn hóa theo tiêu chuẩn quốc tế

- Ở bệnh nhân có triệu chứng kinh điển của tăng glucose huyết hoặc mứcglucose huyết tương ở thời điểm bất kỳ ≥ 200 mg/dL (hay 11,1 mmol/L)

* Giá trị bình thường của Glucose[6]:

- Huyết tương: 60 - 110 mg/dl hay 3,36 – 6,16 mmol/L

- Máu toàn phần: 60 – 105 mg/dL hay 3,36 – 5,58 mmol/L

- Trẻ sơ sinh: 20 – 80 mg/dL hay 1,12 – 4,48 mmol/L.

1.1.7 Các phương pháp định lượng HbA1c[10],[ 31],[ 35],[ 38],[ 39]

Trên thực tế có rất nhiều phương pháp để định lượng HbA1c nhưphương pháp miễn dịch ức chế độ đục (đo quang), sắc ký lỏng cao áp, sắc kýtrao đổi ion, điện di… nhưng hai phương pháp phổ biến nhất là phương phápmiễn dịch đo độ đục (được thực hiện trên các máy sinh hóa tự động được kiểmsoát kết quả theo hướng dẫn của DCCT/NGSP) và sắc ký lỏng trao đổi ion(trên các hệ thống được kiểm soát bởi HPLC/IFCC)[37]

- Trong đó phương pháp trên cơ sở sắc ký lỏng trao đổi ion (HPLC) làchính xác nhất Phương pháp HPLC được thực hiện theo nguyên lý: Mẫu máutoàn phần được pha động (dung môi hữu cơ) dẫn qua cột sắc ký chứa pha tĩnhdưới áp suất cao Tùy thuộc vào ái lực của chất phân tích mang điện tích khácnhau với pha tĩnh mà thời gian lưu lại khác nhau Kết quả được xác định bằngthời gian lưu (thời gian từ khi bơm mẫu vào đến khi chất phân tích ra khỏi cộtpha tĩnh) và diện tích của pick tạo ra Mỗi chất khác nhau sẽ có thời gian lưukhác nhau và nồng độ khác nhau thì sẽ tạo ra pick có diện tích khác nhau Với

kỹ thuật này sẽ tách riêng được từng loại HbA ra và định lượng được nồng độcủa chúng một cách chính xác nhất

- Phương pháp miễn dịch đo độ đục trên cơ sở kiểm soát bởi DCCTđược thực hiện trên các máy sinh hóa tự động Nguyên lý của phương pháp nàydựa trên xét nghiệm miễn dịch ức chế đo độ đục đầu tiên dùng một hóa chất để

ly giải phá vỡ hồng cầu giải phóng HbA1c Sau đó mẫu thử và đệm R1(đệm/kháng thể), glycohemoglobin (HbA1c) trong mẫu phản ứng với khángthể kháng HbA1c để tạo thành các phức hợp kháng nguyên - kháng thể hòa tan

Vì vị trí gắn kháng thể đặc hiệu HbA1c chỉ hiện diện một lần trong phân tửHbA1c, sự hình thành các phức hợp không hòa tan không xảy ra Thêm R2(đệm/polyhapten) và bắt đầu phản ứng các polyhapten phản ứng với kháng thểkháng HbA1c dư để tạo thành phức hợp kháng thể - polyhapten không tan,

máy sẽ đo riêng lẽ hai thành phần là Hb và A1c Kết quả được máy tính tỉ lệA1c trên Hb từ đó tính được nồng độ HbA1c [47].

1.2 CÁC YẾU TỐ LIÊN QUAN ĐẾN CHẤT LƯỢNG XÉT NGHIỆM

TCVN ISO 9000:2007 định nghĩa: “Chất lượng là mức độ của một tậphợp các đặc tính vốn có đáp ứng các yêu cầu” Khái niệm “chất lượng” được sửdụng trong mọi lĩnh vực của cuộc sống Đối với phòng xét nghiệm (PXN), chấtlượng lại được Tổ chức y tế thế giới (WHO) định nghĩa là sự chính xác, tin cậy

và kịp thời của kết quả xét nghiệm

Hiệu quả điều trị phụ thuộc vào sự chính xác của quá trình và kết quả xétnghiệm Nếu phòng xét nghiệm cung cấp kết quả không chính xác sẽ gây ra rấtnhiều hậu quả nghiêm trọng gây tổn thất về kinh tế và sức khỏe như:

- Chẩn đoán chậm;

- Phải xét nghiệm chẩn đoán bổ sung và không cần thiết;

- Điều trị không đúng

- Điều trị không cần thiết hoặc quá phức tạp[8]

1.2.1 Khái niệm chất lượng xét nghiệm[2],[ 5],[ 8],[ 20],[ 23],[ 42],[ 43],[ 48]

- Chất lượng (Quality) là tập hợp các đặc tính vốn có của sản phẩm đápứng các yêu cầu của khách hàng

- Quản lý chất lượng (Quality Management – QM) là một loạt các hoạtđộng có phối hợp để định hướng và kiểm soát một tổ chức về chất lượng baogồm: chính sách chất lượng, mục tiêu chất lượng, hoạch định chất lượng, kiểmsoát chất lượng, đảm bảo chất lượng và cải tiến chất lượng

- Hệ thống quản lý chất lượng (Quality Management System – QMS) là cáchoạt động phối hợp để chỉ đạo và kiểm soát một tổ chức về phương diện chấtlượng Hệ thống quản lý chất lượng bao gồm 12 thành tố thiết yếu, mỗi yếu tố củathành tố là một mắt xích quan trọng của hệ thống quản lý chất lượng

Sơ đồ 1.1 Hệ thống tổ chức quản lý chất lượng (CLSI)[42]

- Đảm bảo chất lượng xét nghiệm hay còn gọi là QA (QualityAssurance) là toàn bộ các hoạt động có kế hoạch, có hệ thống đảm bảo cho cácyêu cầu cung cấp chất lượng đảm bảo đủ độ tin cậy Đảm bảo chất lượng xétnghiệm liên quan đến nhiều yếu tố như: chính sách, kế hoạch tổ chức, các quytrình thao tác chuẩn, nhân sự, cơ sở hạ tầng, trang thiết bị, quản lý hồ sơ

1.2.2 Quy trình hoạt động của phòng xét nghiệm[8],[ 16],[ 23]

Quy trình hoạt động của phòng xét nghiệm được chia thành 3 giai đoạn:

* Giai đoạn trước xét nghiệm

Đây là giai đoạn thường xảy ra lỗi nhất trong quy trình xét nghiệm, chiếm đến41% Giai đoạn này bao gồm các giai đoạn chuẩn bị cho quá trình xét nghiệm từkhâu thông tin bệnh nhân, điền phiếu biểu mẫu yêu cầu, các giai đoạn thu thập

và xử lý mẫu, vận chuyển và tiếp nhận mẫu cho đến khâu quản lý mẫu trước xétnghiệm, chuẩn bị và bảo quản bệnh phẩm

* Giai đoạn trong xét nghiệm

Trong giai đoạn này sai sót thường xảy chiếm 4% do kỹ thuật phân tích và xử

lý kết quả, phương pháp đo của máy móc thiết bị hay do trình độ tay nghề,

chuyên môn của nhân viên xét nghiệm Những sai sót trong quá trình nàythường gặp ở các đơn vị không thực hiện kiểm soát chất lượng, không có quytrình chuẩn và không tuân thủ các quy trình kiểm tra, bảo trì, bảo dưỡng vàhiệu chuẩn máy móc hàng năm.

* Giai đoạn sau xét nghiệm

Giai đoạn này thường gây ra sai sót chiếm 55% trong quá trình xét nghiệm.Sau khi hoàn thành xét nghiệm, việc đánh giá, ghi nhận kết quả, lưu và trả kếtquả, bảo quản hồ sơ và bảo quản mẫu bệnh phẩm là việc rất quan trọng Việcbảo quản hồ sơ, lưu giữ và trả kết quả cần nhanh chóng, chính xác, tránh sai sót

và nhầm lẫn gây ảnh hưởng đến chất lượng PXN

1.3 NGOẠI KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG (EQA - EXTERNAL QUALITY ASSESSMENT)

- EQA là phương pháp cho phép so sánh kết quả xét nghiệm của mộtPXN với một nhóm đơn vị các PXN tương đương hoặc PXN chuẩn bên ngoài.Thông tư 01/2013/TT-BYT của Bộ y tế cũng định nghĩa “Chương trình ngoạikiểm là kiểm soát chất lượng, đối chiếu và so sánh kết quả xét nghiệm của một

Hình 1.5 Quy trình hoạt động của phòng xét nghiệm[43]

phòng xét nghiệm với kết quả của nhiều PXN khác trên cùng một mẫu, so sánhkết quả của PXN tham chiếu trong nước hoặc quốc tế nhằm không ngừng nângcao chất lượng xét nghiệm và góp phần cung cấp bằng chứng công nhận PXNđạt tiêu chuẩn quốc gia hoặc tiêu chuẩn quốc tế”.

- EQA thường được tổ chức bởi một đơn vị được giao chức trách ngoạikiểm tra chất lượng, tổ chức này sẽ sản xuất, phân phối mẫu xét nghiệm chocác PXN thành viên cùng tham gia vào hoạt động ngoại kiểm tra, sau đó thuthập kết quả và tiến hành so sánh, đánh giá kết quả của các thành viên thamgia Kết quả của PXN nào bị sai hoặc nằm ở ngưỡng nguy cơ sẽ được đơn vị tổchức thông báo, tham gia tìm hiểu đánh giá sự không phù hợp, phân tíchnguyên nhân gốc rễ để khắc phục và cải tiến lỗi nhằm nâng cao chất lượng[8]

1.3.1 Các phương thức ngoại kiểm tra[8],[ 16],[ 23],[ 33],[ 46],[ 47]

Có 3 phương thức được sử dụng trong ngoại kiểm tra chất lượng: Thử nghiệmthành thạo (Proficiency testing – PT); Kiểm tra lại/phân tích lại(Rechecking/Retesting) và đánh giá tại chỗ (On – site evaluation)

 Thử nghiệm thành thạo (Proficiency testing): ISO/IEC Guide 43-1:1997:

“Thử nghiệm thành thạo là sự so sánh liên PXN được tổ chức thường xuyên để

đánh giá hoạt động của các PXN phân tích cũng như năng lực cán bộ xétnghiệm” Từ một tổ chức Ngoại kiểm sẽ phân phối mẫu ngoại kiểm cho cácPXN tham gia Các PXN phân tích mẫu ngoại kiểm và gửi kết quả về đơn vị triểnkhai để phân tích thống kê, đánh giá kết quả thực hiện Sau đó PXN nhận bảnphân tích kết quả ngoại kiểm tra từ đơn vị triển khai để xem xét và khắc phục sai

số (nếu có)

 Kiểm tra lại, phân tích lại thường được sử dụng khi tiến hành Ngoại kiểmcác tiêu bản hiển vi của vi khuẩn lao (AFB), và xét nghiệm chẩn đoán nhanhvirus HIV Hình thức là PXN lựa chọn mẫu nghiệm phẩm ngẫu nhiên gửi đếnPXN tham chiếu hoặc đơn vị kiểm chuẩn để phân tích và đánh giá lại các kếtquả phân tích mà PXN đã thực hiện

 Đánh giá tại chỗ tức là đoàn đánh giá được thành lập bởi các chuyên gia kỹthuật, cơ quan có thẩm quyền (Bộ Y tế, Sở Y tế…) hoặc tổ chức được công nhậncủa quốc gia (Văn phòng công nhận chất lượng, Trung tâm kiểm chuẩn Xétnghiệm…) sẽ đến đánh giá tại PXN định kỳ hoặc đột xuất Việc đánh giá nàycăn cứ vào bảng kiểm, những tiêu chí đã được duyệt Bảng kiểm sẽ khác nhautùy thuộc vào lĩnh vực của xét nghiệm

Trong 3 phương pháp trên thì thử nghiệm độ thành thạo được sử dụng phổ biếnnhất, các vật liệu (mẫu ngoại kiểm) dùng phân phối cho các PXN phải đảm bảotính đồng nhất và độ ổn định trong từng mẫu từ giai đoạn sản xuất, lưu trữ vàvận chuyển đến phòng xét nghiệm

1.3.2 Lợi ích của việc thực hiện ngoại kiểm:

Cho phép so sánh việc thực hiện và các kết quả giữa các PXN khác nhau:

- Cung cấp các cảnh báo sớm về lỗi hệ thống liên quan đến sinhphẩm hoặc việc vận hành;

- Đưa ra bằng chứng khách quan về chất lượng xét nghiệm;

- Chỉ ra những lĩnh vực cần cải tiến;

- Xác định nhu cầu đào tạo

1.3.3 Các bước thực hiện ngoại kiểm

Theo tiêu chuẩn ISO 15189 về chất lượng và năng lực đối với PXN y tế, PXNbắt buộc phải tham gia ngoại kiểm thích hợp với xét nghiệm và diễn giải cáckết quả xét nghiệm PXN phải theo dõi các kết quả đã làm và thực hiện cáchành động khắc phục khi kết quả sai lệch[20]

 Trước khi tham gia ngoại kiểm

PXN lặp kế hoạch tham gia các chương trình ngoại kiểm phù hợp với danhmục kỹ thuật đã ban hành Đăng ký tham gia ngoại kiểm với các cơ quan, tổchức đã được công nhận pháp lý Thiết lập danh mục xét nghiệm sẽ tham gia

cụ thể đối với từng chương trình và cung cấp thông tin chuyên môn ngoại kiểmcho nhà cung cấp

 Trong khi tham gia ngoại kiểm

Xem tất cả các mẫu ngoại kiểm như mẫu bệnh phẩm trong PXN, thực hiệnphân tích mẫu theo hướng dẫn của nhà cung cấp Trong quá trình tham gia, nếuPXN có bất kỳ thắc mắc nào có thể liên hệ nhà cung cấp để hỗ trợ kịp thời.Phân tích kết quả và gửi kết quả phân tích cho nhà cung cấp ngoại kiểm

 Sau khi kết thúc một chương trình ngoại kiểm

Khi nhận được bản phân tích kết quả ngoại kiểm từ các nhà cung cấp, PXNthực hiện hành động đánh giá các kết quả ngoại kiểm đã thực hiện Dựa vàocác kết quả, PXN sẽ đưa ra hướng khắc phục phù hợp để nâng cao chất lượng

1.3.4 Đặc điểm chính của một chương trình ngoại kiểm.

Các chương trình EQA có thể là miễn phí hoặc thu phí, các chương trìnhEQA miễn phí gồm các chương trình được cung cấp bởi nhà sản xuất để đảmbảo thiết bị hoạt động đúng và do các chương trình cấp khu vực hoặc quốc giađối với việc cải tiến chất lượng Một số chương trình là bắt buộc theo luật pháphoặc theo cơ quan công nhận Các chương trình khác là tự nguyện và ngườiquản lý chất lượng có thể chọn lựa để tham gia vào chương trình EQA nhằmđạt được sự cải tiến về chất lượng thực hiện của phòng xét nghiệm Chương

trình EQA có thể được tổ chức ở các mức độ khác nhau: vùng, quốc gia, hoặcquốc tế Các kết quả EQA của mỗi PXN được bảo mật và thường chỉ có PXNtham gia và nhà cung cấp EQA được biết Các PXN sẽ được cung cấp một bảnkết quả tóm tắt kết quả so sánh giữa các PXN[49].

1.4 TIÊU CHUẨN SẢN XUẤT MẪU NGOẠI KIỂM

Tiêu chuẩn quốc gia (TCVN) 7366:2011 tương ứng với ISO 34:2009quy định rất rõ “yêu cầu chung về năng lực của nhà sản xuất mẫu chuẩn”[22].Ngoài ra, nhà sản xuất mẫu chuẩn phải đáp ứng các tiêu chuẩn của TCVN17043:2011 (tương ứng ISO/IEC 17043:2010) về “đánh giá sự phù hợp - yêucầu chung đối với thử nghiệm thành thạo”[21] Trong tiêu chuẩn này yêu cầunhà sản xuất phải đảm bảo tính đồng nhất và độ ổn định của mẫu được sảnxuất, phải thiết lập tiêu chí đối với tính đồng nhất và độ ổn định phù hợp theoTCVN 9596:2013 (tương ứng ISO/IEC 13528:2015) về “phương pháp thống

kê dùng trong thử nghiệm thành thạo bằng so sánh liên phòng thí nghiệm”[18]

1.4.1 Mẫu máu toàn phần chứa HbA1c sử dụng trong ngoại kiểm[19],[ 22]

Mẫu ngoại kiểm là mẫu được sử dụng trong các chương trình ngoại kiểmtra chất lượng xét nghiệm, thường là mẫu mù với giá trị ấn định được xác địnhdựa vào sự đồng thuận của các phòng xét nghiệm tham gia

Có 2 loại mẫu là mẫu chuẩn RM (Reference Material) và mẫu chuẩn đượcchứng nhận CRM (Certified Reference Material)

Theo định nghĩa của cơ quan đo lường hợp pháp quốc tế (OIML): Mẫu chuẩn

là một vật liệu hay một chất mà một hay nhiều tính chất của chúng đủ độ đồngnhất và ổn định được tạo nên để chuẩn hóa một dụng cụ, đánh giá một phươngpháp đo hoặc để xác định giá trị đối với các vật liệu

Mẫu chuẩn được chứng nhận là mẫu chuẩn được đặc trưng với một giấy chứngnhận cung cấp giá trị của tính chất quy định, độ không đảm bảo kèm theo vàcông bố về liên kết chuẩn đo lường

Hiện nay tại Việt Nam chưa có đơn vị nào sản xuất bộ mẫu chuẩn chochương trình ngoại kiểm HbA1c trong bệnh đái tháo đường, vì vậy trongnghiên cứu này chúng tôi xây dựng quy trình sản xuất mẫu máu toàn phần chứanồng độ HbA1c dùng trong ngoại kiểm kiểm soát chất lượng xét nghiệmHbA1c, bộ mẫu này sử dụng nguyên liệu từ các mẫu máu toàn phần chứa nồng

độ HbA1c từ người bình thường và người mắc bệnh đái tháo đường

1.4.2 Đánh giá tính đồng nhất

Việc đánh giá tính đồng nhất luôn đòi hỏi nhà sản xuất phải thiết lập tínhđồng nhất của mẫu chuẩn đối với xét nghiệm định lượng HbA1c Định nghĩamẫu chuẩn đủ đồng nhất được yêu cầu trong TCVN 9596:2013 Nhà sản xuấtmẫu chuẩn phải tiến hành đánh giá tính đồng nhất của mẫu chuẩn trong quátrình thực hiện và thực hiện sau khi mẫu chuẩn đã được đóng gói ở dạng cuốicùng Việc thực hiện bao gồm lấy mẫu ngẫu nhiên và thực hiện các phép phântích để chứng minh vật liệu là đủ đồng nhất Nếu mẫu chuẩn được sản xuấttrong các lô khác nhau thì cần kiểm tra tính tương đương của từng lô[18]

1.4.3 Đánh giá độ ổn định

Việc đánh giá độ ổn định luôn yêu cầu phải thiết lập độ ổn định của mẫuchuẩn phải phù hợp với mục đích của nhà sản xuất là xét nghiệm định lượngHbA1c phải đạt được yêu cầu trong TCVN8245: 2009; TCVN 9596:2013 Khiđánh giá độ ổn định của mẫu chuẩn, nhà sản xuất phải tiến hành thử nghiệm,hiệu chuẩn, đo lường, lấy mẫu hoặc các hoạt động để đánh giá độ ổn định.Trong quá trình đánh giá độ ổn định phải đánh giá cả trong điều kiện vậnchuyển và chọn thời điểm đánh giá phù hợp để xác nhận tất cả các mẫu đủ ổnđịnh từ khi sản xuất đến khi triển khai chương trình ngoại kiểm[19],[ 22]

1.4.4 Nghiên cứu tính đồng nhất

 Khái niệm tính đồng nhất

Về mặt lý thuyết, một vật liệu được xem là hoàn toàn đồng nhất với đặc trưng

đã cho nếu không có sự khác biệt nào giữa những giá trị trong từng cá thể với

nhau Tuy nhiên trong thực tế, một vật liệu được chấp nhận là đồng nhất khinhững giá trị giữa những cá thể có sự khác biệt không đáng kể khi so sánh vớicác mẫu thử được sản xuất[22].

 Thiết kế thực nghiệm

Đối với việc nghiên cứu tính đồng nhất, TCVN 9596: 2013 quy định khi đánhgiá tính đồng nhất phải chọn 10 mẫu tối thiểu hoặc 10% số lượng mẫu đượcchọn ngẫu nhiên từ các lô Tất cả các mẫu đã lựa chọn tiến hành thử nghiệm 2lần lặp lại cho từng xét nghiệm[18]

Có 2 dạng ổn định được xem xét trong chứng nhận mẫu chuẩn[18],[ 22]:

+ Độ ổn định dài hạn của vật liệu tại nơi lưu trữ của nhà sản xuất,thường là thời hạn sử dụng của vật liệu

+ Độ ổn định ngắn hạn kèm theo mọi tác động đặc biệt do vậnchuyển mẫu (có thể là điều kiện vận chuyển giả định)

 Thiết kế thực nghiệm

Có 2 phương thức cơ bản trong nghiên cứu độ ổn định

+ Nghiên cứu độ ổn định cổ điển tức là các mẫu riêng biệt đượcchuẩn bị cùng một điều kiện giống nhau và được đo theo thời gian

+ Nghiên cứu độ ổn định đẳng thời đánh giá các mẫu chuẩn đồngthời trong những điều kiện lặp lại

Khi nghiên cứu độ ổn định thường mất thời gian 2 tháng, TCVN 9596:2013quy định phải chọn 3 mẫu tối thiểu ngẫu nhiên trong từng lô được sản xuất theotừng thời điểm và tiến hành thử nghiệm 2 lần lặp lại đối với từng tính chất, kếtquả thu được sẽ so sánh với tính chất trước khi được bảo quản[18]

1.4.6 Các vật liệu mẫu kiểm chuẩn dùng trong xét nghiệm HbA1c[29]

Loại vật liệu được sản xuất dùng trong xét nghiệm ngoại kiểm HbA1c làmẫu máu toàn phần Mẫu máu toàn phần được thu thập từ nhiều nguồn khácnhau, chẳng hạn thu thập từ người tình nguyện, từ mẫu máu của bệnh nhân saukhi thực hiện xét nghiệm chẩn đoán bệnh và mẫu máu mua từ các trung tâmtruyền máu

Do bộ mẫu ngoại kiểm được gửi đến nhiều đơn vị phòng xét nghiệmtham gia phân tích sau đó gửi kết quả phân tích về trung tâm kiểm chuẩn chấtlượng xét nghiệm thống kê, đánh giá thông qua so sánh kết quả liên phòng, vìvậy mẫu ngoại kiểm phải đạt được các yêu cầu sau:

- Mẫu máu toàn phần dùng trong ngoại kiểm được xác định đặc tính rõràng không có các yếu tố nguy cơ gây nhiễm : HIV, HCV, HBsAg

- Mẫu được chứa trong các ống có nắp đậy kín, không bị rò rỉ trong vậnchuyển cũng như khi bảo quản

- Mẫu máu toàn phần trong ngoại kiểm phải chứa nồng độ HbA1c đạttiêu chuẩn chọn mẫu ban đầu

- Bộ mẫu máu toàn phần ngoại kiểm HbA1c đạt đồng thời hai tiêu chíđánh giá chất lượng là tính đồng nhất và độ ổn định trong khoảng thời giannhất định

1.4.6 Các phương pháp sản xuất bộ mẫu máu toàn phần chứa nồng độ HbA1c dùng trong ngoại kiểm

Hiện nay mẫu ngoại kiểm chứa nồng độ HbA1c có nhiều cách thức sảnxuất khác nhau như đông khô, đông lạnh mẫu máu toàn phần hoặc sử dụngmáu toàn phần không qua bảo quản dùng trong ngoại kiểm như nghiên cứu củaKaiser P và các cộng sự (2016)[30] Trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hànhsản xuất bộ mẫu ngoại kiểm theo hai phương pháp đông khô [3],[17] và đônglạnh mẫu máu toàn phần[26],[ 29], tuy nhiên việc đông khô mẫu máu toànphần đòi hỏi phải có thiết bị đông khô chuyên dụng và cần phải cân đo thể tích

mẫu ban đầu khi chia nhỏ thật chính xác để thuận lợi cho việc hoàn nguyên saunày đảm bảo nồng độ mẫu không chênh lệnh đáng kể, giúp cho việc đánh giá,bảo quản, phân phối mẫu đến PXN phân tích an toàn thuận lợi.

1.4.6.1 Kỹ thuật đông khô mẫu máu tòa phần

Phương pháp đông khô được áp dụng trong sản xuất mẫu chuẩn ngoại kiểm sẽgiúp cho mẫu sau khi đông khô không bị thay đổi tính chất và nồng độ HbA1csau khi hoàn nguyên, từ nguồn nguyên liệu ban đầu máu toàn phần sau khi đãđược trộn đều không bi tán huyết sau đó chia nhỏ thể tích 1,0 ml máu toànphần vào tube chứa mẫu

1.4.6.2 Giá trị của của mẫu đông khô

Mẫu đông khô có giá trị làm ổn định chất lượng của sản phẩm tươi, sứcsống của sản phẩm kéo dài, vận chuyển và bảo quản dễ dàng hơn Đông khôđược sử dụng trong nhiều lĩnh vực như bảo quản vaccin, sinh phẩm, protein,máu, huyết tương và các sản phẩm của huyết tương, các tổ chức mô, xương,vitamin, enzym, các mẫu bệnh phẩm khác[3],[ 17],[ 36]

1.4.6.3 Nguyên lý hoạt động của quy trình đông khô

Nguyên lý của quá trình đông khô là nguyên liệu được đông lạnh độtngột tại điểm chuyển thể, khiến nước từ thể lỏng sang thể rắn, rồi qua xử lýchân không thăng hoa thành thể hơi rồi ngưng tụ thành nước rồi thải ra ngoài.Theo nguyên lý này, sản phẩm được làm đông khô vẫn giữ nguyên hình thái,khi hoàn nguyên bằng nước cất hoặc dung dịch thích hợp thì sản phẩm sẽ trởlại trạng thái ban đầu

Quá trình đông khô trải qua 3 giai đoạn:

Giai đoạn 1: Trong giai đoạn này sản phẩm được làm lạnh từ nhiệt độmôi trường khoảng 20oC giảm xuống nhiệt độ âm 10oC đến âm 51oC hay còngọi là giai đoạn cấp đông Đồng thời, trong giai đoạn này bình thăng hoa đượchút chân không nên áp suất hơi nước trong bình giảm so với trong lòng vật liệudẫn tới hiện tượng thoát ẩm trong lòng vật liệu Kết thúc giai đoạn này khoảng