Nghiên cứu quá trình cố định nấm men saccharomyces cerevisiae trên vỏ bưởi và ứng dụng trong lên men rượu vang bưởi

Bản chất của quá trình lên men rượu vang là nấm men sử dụng nguồn cơ chất từ nước quả, mà chủ yếu là đường glucose, ngoài ra còn có các acid hữu cơ acid tartaric, malic, succinic và muối

KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ TÀI NGUYÊN THIÊN NHIÊN

NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH CỐ ĐỊNH

NẤM MEN SACCHAROMYCES CEREVISIAE

TRÊN VỎ BƯỞI VÀ ỨNG DỤNG TRONG

LÊN MEN RƯỢU VANG BƯỞI

ThS HỒ THỊ NGÂN HÀ

AN GIANG, 5 - 2015

NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH CỐ ĐỊNH

NẤM MEN SACCHAROMYCES CEREVISIAE

TRÊN VỎ BƯỞI VÀ ỨNG DỤNG TRONG

LÊN MEN RƯỢU VANG BƯỞI

ThS HỒ THỊ NGÂN HÀ

AN GIANG, 5 - 2015

bưởi”, do tác giả ThS Hồ Thị Ngân Hà, công tác tại Bộ môn Công nghệ thực

phẩm, Khoa Nông nghiệp và Tài nguyên thiên nhiên thực hiện Tác giả đã báo cáo kết quả nghiên cứu và được Hội đồng khoa học và Đào tạo Trường Đại học An Giang thông qua ngày 18/6/2015

Thư ký

Phản biện 1 Phản biện 2

Chủ tịch hội đồng

Trong suốt quá trình thực hiện đề tài, nhờ sự tận tình giúp đỡ của quý thầy cô

và các anh chị, đề tài nghiên cứu đã hoàn thành Có được kết quả này, tôi xin gửi lời

Anh Thái Quốc Phong, Phó Giám đốc Trung tâm Khuyến công và Tư vấn Phát triển Công nghiệp đã chấp nhận chuyển giao, giới thiệu kết quả nghiên cứu của

đề tài cho các cơ sở, doanh nghiệp trên địa bàn Tỉnh An Giang nếu cơ sở, doanh nghiệp có nhu cầu ứng dụng công nghệ, đầu tư phát triển sản xuất

Cán bộ phản biện đã đọc và đóng góp ý kiến chuyên môn để công trình nghiên cứu được hoàn thiện

Xin chân thành cảm ơn và kính chúc quý thầy cô và các anh chị luôn dồi dào sức khỏe, thành công trong công việc và hạnh phúc trong cuộc sống

An Giang, ngày 29 tháng 5 năm 2015

Người thực hiện

Hồ Thị Ngân Hà

Để tìm ra các thông số tối ưu cho quá trình cố định nấm men Saccharomyces

cerevisiae trên vỏ bưởi và quá trình lên men rượu vang bưởi bằng nấm men cố định,

nghiên cứu tiến hành khảo sát các thí nghiệm sau:

- Khảo sát ảnh hưởng của độ brix (16 - 28 oBx), pH (3,0 - 5,0) và tỷ lệ nấm

men Saccharomyces cerevisiae thuần (0,2 - 0,6% w/v) đến quá trình nhân giống

- Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng NaHSO3 (80 - 160 mg/L) và thời gian thanh trùng (10 - 50 phút) đến quá trình nhân giống

- Khảo sát ảnh hưởng của thời gian chần (1 - 9 phút) và số lần xả (1 - 5 lần)

- Theo dõi khả năng tái sử dụng nấm men cố định

Sau thời gian nghiên cứu và tiến hành thí nghiệm, kết quả đạt được như sau:

- Với hàm lượng chất khô hòa tan ban đầu của dịch bưởi là 21 oBx, pH bằng 4,1, kết hợp với tỷ lệ nấm men bổ sung là 0,46% thì quá trình nhân giống nấm men

Saccharomyces cerevisiae đạt mật độ cao nhất (8,14470.109 tế bào/mL)

- Thanh trùng dịch bưởi bằng NaHSO3 với hàm lượng 109,50 mg/l và thời gian 38,21 phút đem lại hiệu quả cao nhất, mật độ nấm men đạt được khi nhân giống

cố định trên vỏ bưởi là cao nhất (3,58469.108 tế bào/g)

- Dịch bưởi được bổ sung nấm men cố định để đạt mật độ tế bào là 6.106 tế bào/mL thì quá trình lên men tốt nhất, độ cồn sinh ra cao

- Nấm men cố định trên vỏ bưởi có thể được tái sử dụng để lên men rượu

vang bưởi qua 5 chu kỳ

Từ khóa: Cố định, Saccharomyces cerevisiae, vỏ bưởi, rượu vang bưởi

To determine optimum parameters for the immobilization of Saccharomyces

cerevisiae on grapefruit peel and the fermentation of grapefruit juice by the

immobilized yeast, the following experiments were carried out:

- Investigating the effects of soluble solid content (16 - 28 oBx), pH (3.0 - 5.0)

and the ratio of Saccharomyces cerevisiae used (0.2 - 0.6% w/v) on the reproduction

of the yeast in grapefruit juice

- Evaluating the effects of NaHSO3 concentration (80 - 160 mg/L) and the

duration of pasteurization (10 - 50 minutes) on the propagation of Saccharomyces

cerevisiae in grapefruit juice

- Investigating the effects of blanching duration (1 - 9 minutes) and the times

of rinsing grapefruit peel (1 - 5 times) on the immobilization

- Finding out the effects of initial yeast cell density (10x107 - 30x107cells/mL) and ratio of grapefruit peel (5 - 25% w/v) on the immobilization

- Investigating the effects of immobilized yeast density (2x106-10x106cells/mL) on the kinetics of the grapefruit wine fermentation, and comparing with the free yeast

- Determining the reuse times of the immobilized yeast

The research results demonstrated that:

- The highest density of Saccharomyces cerevisiae (8.14470x109 cells/mL) was obtained when the soluble solid content of grapefruit juice was 21 oBx, the pH and the used yeast ratio were 4.1 and 0.46%, respectively

- Pasteurizing grapefruit juice with 109.50 mg/L NaHSO3 in 38.21 minutes to get the highest yeast density (8.89387x109 cells/mL)

- The optimum blanching duration and rinsing times which resulted in the

highest density of Saccharomyces cerevisiae cell (2.88575x108 cells/g) were 4.06 minutes and 2 rinsing times with cool water, respectively

- The yeast after reproduction was diluted to obtain the density of 25.04x107cells/mL and supplemented with 10.06% grapefruit peel These achieved the highest density of immobilized yeast cells on grapefruit peel (3,58469x108 cells/g)

- When grapefruit juice was supplemented with 6x106 cells/ml immobilized yeast, fermentation was the best and alcohol content was the most

- Yeast immobilized on grapefruit peel could be re-used to ferment grapefruit juice over 5 cycles

Key words: immobilization, Saccharomyces cerevisiae, grapefruit peel,

grapefruit wine

Tôi xin cam đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu trong công trình nghiên cứu này có xuất xứ rõ ràng Những kết luận mới về khoa học của công trình nghiên cứu này chưa được công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác

An Giang, ngày 29 tháng 5 năm 2015

Người thực hiện

Hồ Thị Ngân Hà

Chương 1: Giới thiệu 1

1.1 Tính cần thiết của đề tài 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 2

1.3 Nội dung nghiên cứu 2

1.4 Những đóng góp của đề tài 3

Chương 2: Lược khảo tài liệu 4

2.1 Nguyên liệu bưởi 4

2.1.1 Giới thiệu 4

2.1.2 Bưởi Năm Roi 4

2.1.3 Thành phần hóa học của bưởi 5

2.1.4 Một số sản phẩm từ bưởi 6

2.2 Nấm men 6

2.2.1 Hình thái và kích thước tế bào 7

2.2.2 Sự sinh sản của nấm men 8

2.2.3 Sinh trưởng nấm men 9

2.2.4 Dinh dưỡng nấm men 12

2.3 Rượu vang 14

2.3.1 Cơ chế hóa sinh học của lên men rượu 14

2.3.2 Sản phẩm phụ và sản phẩm trung gian của quá trình lên men rượu 16

2.3.3 Các vi khuẩn có hại cho nấm men 18

2.3.4 Tiêu chuẩn rượu vang 19

2.4 Phương pháp cố định tế bào 20

2.4.1 Sơ lược về kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật 20

2.4.2 Chất mang trong kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật 20

2.4.3 Các phương pháp cố định tế bào vi sinh vật 21

2.5 Các phụ liệu, phụ gia sử dụng trong nghiên cứu 25

2.5.1 Đường saccharose 25

2.5.2 Acid citric 25

2.5.3 Natri carbonat 26

2.6 Các quá trình chế biến sử dụng trong nghiên cứu 26

2.6.1 Ép 26

2.6.2 Lọc 27

2.6.3 Phối trộn 28

2.6.4 Chần 29

2.6.5 Nhân giống 29

2.7 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 33

2.7.1 Các nghiên cứu trong nước 33

2.7.2 Các nghiên cứu ngoài nước 34

Chương 3: Phương tiện và phương pháp nghiên cứu 36

3.1 Phương tiện nghiên cứu 36

3.1.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 36

3.1.2 Nguyên liệu 36

3.1.3 Hóa chất 36

3.1.4 Dụng cụ và thiết bị 36

3.2 Phương pháp nghiên cứu 36

3.2.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm, thu thập và xử lý số liệu 36

3.2.2 Quy trình cố định nấm men Saccharomyces cerevisiae trên vỏ bưởi 37

3.2.3 Quy trình lên men rượu vang bưởi bằng nấm men cố định 39

3.2.4 Nội dung nghiên cứu 40

3.2.5 Phương pháp phân tích 48

Chương 4: Kết quả và thảo luận 49

4.1 Các chỉ tiêu của nguyên liệu bưởi 49

4.2 Kết quả ảnh hưởng của độ brix, pH và tỷ lệ nấm men Saccharomyces cerevisiae thuần đến quá trình nhân giống trong dịch bưởi 50

4.3 Kết quả ảnh hưởng của hàm lượng NaHSO3 và thời gian thanh trùng đến quá trình nhân giống nấm men Saccharomyces cerevisiae trong dịch bưởi 57

4.4 Kết quả ảnh hưởng của thời gian chần và số lần xả vỏ bưởi đến quá trình cố định nấm men Saccharomyces cerevisiae trên vỏ bưởi 63

4.5 Kết quả ảnh hưởng của mật độ tế bào nấm men ban đầu và tỷ lệ vỏ bưởi đến quá trình cố định nấm men Saccharomyces cerevisiae trên vỏ bưởi 68

4.7 Kết quả theo dõi khả năng tái sử dụng nấm men cố định 77

Chương 5: Kết luận và khuyến nghị 83

5.1 Kết luận 83

5.2 Khuyến nghị 86

Tài liệu tham khảo 87

Phụ chương A: Một số hình ảnh trong quá trình nghiên cứu 90

Phụ chương B: Phương pháp đánh giá cảm quan sản phẩm 92

Phụ chương C: Các phương pháp phân tích 94

Phụ chương D: Các bảng kết quả thống kê bằng phần mềm Statgraphics 102

Trang

Bảng 1: Thành phần hóa học của múi bưởi và vỏ bưởi 5

Bảng 2: Khả năng đồng hóa các nguồn hydratcarbon của nấm men 13

Bảng 3: Các chỉ tiêu hóa học 19

Bảng 4: Các chỉ tiêu cảm quan 20

Bảng 5: Ưu nhược điểm các phương pháp thông dụng để cố định tế bào 24

Bảng 6: Các chỉ tiêu của nguyên liệu cần xác định 40

Bảng 7: Bố trí thí nghiệm 1 41

Bảng 8: Bố trí thí nghiệm 2 42

Bảng 9: Bố trí thí nghiệm 3 44

Bảng 10: Bố trí thí nghiệm 4 45

Bảng 11: Bố trí thí nghiệm 5 47

Bảng 12: Các phương pháp phân tích 48

Bảng 13: Các chỉ tiêu của nguyên liệu bưởi 49

Bảng 14: Sự thay đổi mật độ tế bào nấm men trong dịch bưởi theo thời gian nhân giống ở các giá trị độ Brix, pH và tỷ lệ nấm men khác nhau 51

Bảng 15: Kết quả phân tích ANOVA mật độ tế bào nấm men trong dịch bưởi theo độ Brix, pH và tỷ lệ nấm men 52

Bảng 16: Giá trị thực nghiệm và giá trị tiên đoán theo mô hình của mật độ tế bào nấm men trong dịch bưởi ở các giá trị độ Brix, pH và tỷ lệ nấm men khác nhau 54

Bảng 17: Hàm lượng SO2 tổng số (ts) còn lại trong dịch bưởi sau khi thanh trùng 57

Bảng 18: Sự thay đổi mật độ tế bào nấm men trong dịch bưởi theo thời gian nhân giống ở các giá trị hàm lượng NaHSO3 và thời gian thanh trùng khác nhau 59

Bảng 19: Kết quả phân tích ANOVA mật độ tế bào nấm men trong dịch bưởi theo hàm lượng NaHSO3 và thời gian thanh trùng 60

Bảng 20: Giá trị thực nghiệm và giá trị tiên đoán theo mô hình của mật độ tế bào nấm men trong dịch bưởi ở các giá trị hàm lượng NaHSO3 và thời gian thanh trùng khác nhau 61

Bảng 21: Sự thay đổi mật độ tế bào nấm men trên vỏ bưởi theo thời gian cố định ở các giá trị thời gian chần và số lần xả khác nhau 63

Bảng 22: Kết quả phân tích ANOVA mật độ tế bào nấm men cố định trên vỏ bưởi theo thời gian chần và số lần xả 64

Bảng 24: Sự thay đổi mật độ tế bào nấm men trên vỏ bưởi theo thời gian cố định ở các giá trị mật độ nấm men ban đầu và tỷ lệ vỏ bưởi khác nhau 68 Bảng 25: Kết quả phân tích ANOVA mật độ tế bào nấm men cố định trên vỏ bưởi theo mật độ nấm men ban đầu và tỷ lệ vỏ bưởi 69 Bảng 26: Giá trị thực nghiệm và giá trị tiên đoán theo mô hình của mật độ tế bào nấm men cố định trên vỏ bưởi ở các giá trị mật độ nấm men ban đầu và tỷ lệ vỏ bưởi khác nhau 70 Bảng 27: Sự thay đổi độ Brix theo thời gian lên men 72 Bảng 28: Độ cồn sản phẩm ở các giá trị mật độ nấm men tự do và cố định khác nhau 74 Bảng 29: Hàm lượng acid dễ bay hơi trong sản phẩm ở các giá trị mật độ nấm men tự

do và cố định khác nhau 75 Bảng 30: Điểm cảm quan sản phẩm ở các giá trị mật độ nấm men tự do và cố định khác nhau 76 Bảng 31: Sự thay đổi mật độ nấm men trên vỏ bưởi theo thời gian lên men ở các chu

kỳ khác nhau 78 Bảng 32: Sự thay đổi mật độ nấm men trong dịch bưởi theo thời gian lên men ở các chu kỳ khác nhau 79 Bảng 33: Sự thay đổi độ Brix dịch bưởi theo thời gian lên men ở các chu kỳ khác nhau 80 Bảng 34: Điểm cảm quan sản phẩm ở các chu kỳ khác nhau 81 Bảng 35: Uớc tính chi phí nguyên liệu (cho 100 lít rượu) 86 Bảng 36: Bảng điểm mô tả chỉ tiêu độ trong, màu sắc và mùi vị của sản phẩm rượu vang bưởi 92 Bảng 37: Bảng điểm mô tả chỉ tiêu mức độ ưa thích của sản phẩm rượu vang bưởi 93 Bảng 38: Bảng tra tỷ lệ đường nghịch đảo 99

Trang

Hình 1: Bưởi Năm Roi 4

Hình 2: Một số sản phẩm từ bưởi 6

Hình 3: Hình thái tế bào nấm men và sợi nấm 7

Hình 4: Sự thay đổi hình thái tế bào nấm men khi có oxy 7

Hình 5: Hình thái tế bào nấm men ở trên và dưới ống nghiệm 8

Hình 6: Sinh sản của nấm men theo phương pháp nảy chồi 8

Hình 7: Sinh sản của nấm men bằng cách phân đôi 8

Hình 8: Chu kỳ sinh sản của Saccharomyces cerevisiae 9

Hình 9: Đồ thị sinh trưởng của vi sinh vật trong “hệ kín” 10

Hình 10: Các phương pháp cố định tế bào vi sinh vật 21

Hình 11: Mối quan hệ giữa nồng độ cơ chất ban đầu và tốc độ sinh trưởng riêng ở giai đoạn logarit của vi sinh vật theo phương trình Monod 31

Hình 12: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến giá trị μexpo của vi sinh vật 32

Hình 13: Quy trình cố định nấm men Saccharomyces cerevisiae trên vỏ bưởi dự kiến 37

Hình 14: Quy trình lên men rượu vang bưởi bằng nấm men cố định dự kiến 39

Hình 15: Nguyên liệu bưởi Năm Roi 50

Hình 16: Mức độ ảnh hưởng của các nhân tố độ Brix, pH và tỷ lệ nấm men đến mật độ tế bào nấm men trong dịch bưởi 53

Hình 17: Biểu đồ mặt đáp ứng thể hiện sự phụ thuộc của mật độ tế bào nấm men trong dịch bưởi vào độ Brix và pH khi cố định tỷ lệ nấm men ở 0,46% 55

Hình 18: Biểu đồ mặt đáp ứng thể hiện sự phụ thuộc của mật độ tế bào nấm men trong dịch bưởi vào độ Brix và tỷ lệ nấm men khi cố định pH ở 4,14 55

Hình 19: Biểu đồ mặt đáp ứng thể hiện sự phụ thuộc của mật độ tế bào nấm men trong dịch bưởi vào pH và tỷ lệ nấm men khi cố định độ Brix ở 21,07% 55

Hình 20: Hàm lượng SO2 tổng số còn lại trong dịch bưởi sau thi thanh trùng ở các giá trị hàm lượng NaHSO3 khác nhau 58

Hình 21: Hàm lượng SO2 tổng số còn lại trong dịch bưởi sau thi thanh trùng

ở các giá trị thời gian thanh trùng khác nhau 58

Hình 22: Mức độ ảnh hưởng của các nhân tố hàm lượng NaHSO3 và thời gian thanh trùng đến mật độ tế bào nấm men trong dịch bưởi 60

Hình 24: Mức độ ảnh hưởng của các nhân tố thời gian chần và số lần xả đến mật độ

tế bào nấm men cố định trên vỏ bưởi 65

Hình 25: Biểu đồ mặt đáp ứng thể hiện sự phụ thuộc của mật độ tế bào nấm men cố định trên vỏ bưởi vào thời gian chần và số lần xả 66

Hình 26: Mức độ ảnh hưởng của các nhân tố mật độ nấm men ban đầu và tỷ lệ vỏ bưởi đến mật độ tế bào nấm men cố định trên vỏ bưởi 69

Hình 27: Biểu đồ mặt đáp ứng thể hiện sự phụ thuộc của mật độ tế bào nấm men cố định trên vỏ bưởi vào mật độ nấm men ban đầu và tỷ lệ vỏ bưởi 71

Hình 28: Sự thay đổi độ Brix theo thời gian lên men khi điều chỉnh mật độ nấm men tự do khác nhau 73

Hình 29: Sự thay đổi độ Brix theo thời gian lên men khi điều chỉnh mật độ nấm men cố định khác nhau 73

Hình 30: Sự thay đổi mật độ nấm men trên vỏ bưởi theo thời gian lên men ở các chu kỳ khác nhau 78

Hình 31: Sự thay đổi mật độ nấm men trong dịch bưởi theo thời gian lên men ở các chu kỳ khác nhau 79

Hình 32: Sự thay đổi độ Brix dịch bưởi theo thời gian lên men ở các chu kỳ khác nhau 80

Hình 33: Độ cồn sản phẩm khi kết thúc quá trình lên men ở các chu kỳ khác nhau 81 Hình 34: Quy trình cố định nấm men Saccharomyces cerevisiae trên vỏ bưởi 84

Hình 35: Quy trình lên men rượu vang bưởi bằng nấm men cố định 85

Hình 36: Cân phân tích 90

Hình 37: Buồng đếm tế bào nấm men và kính hiển vi điện tử 90

Hình 38: Đo pH dịch bưởi 90

Hình 39: Đo độ Brix dịch bưởi 91

Hình 40: Nhân giống nấm men 91

Hình 41: Dịch bưởi đang lên men 91

Hình 42: Sản phẩm rượu vang bưởi 91

Hình 43: Cấu tạo buồng đếm tế bào vi sinh vật 94

Hình 44: Lưới đếm Malassez 95

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU

1.1 TÍNH CẦN THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Rượu vang là một loại rượu nhẹ được lên men trực tiếp từ dịch ép trái cây, đây là một thức uống có giá trị dinh dưỡng cao, hương vị thơm ngon và có lợi cho sức khỏe của con người khi dùng một cách điều độ Rượu vang vốn có nguồn gốc từ quả nho, tuy nhiên ngày nay người ta đã mở rộng khái niệm rượu vang là rượu không chưng cất từ các loại nước quả

Bản chất của quá trình lên men rượu vang là nấm men sử dụng nguồn cơ chất

từ nước quả, mà chủ yếu là đường glucose, ngoài ra còn có các acid hữu cơ (acid tartaric, malic, succinic) và muối của những acid này, các hợp chất màu, hợp chất hương, vitamin, muối khoáng,… để tăng sinh khối đồng thời tạo ra sản phẩm là rượu,

CO2 và một số thành phần phụ như glycerin, acid acetic, acid lactic,…

Có hai phương pháp để lên men rượu vang là lên men tự nhiên và lên men nhờ các chủng nấm men thuần khiết Phương pháp sản xuất rượu vang từ chủng thuần khiết có rất nhiều ưu điểm như thời gian lên men nhanh, sử dụng triệt để nguồn

cơ chất, nồng độ cồn thu được cao hơn lên men tự nhiên, vang sáng màu nhanh hơn

và có hương vị thanh khiết hơn

Trong quá trình sản xuất rượu vang, nấm men thường bị loại bỏ sau khi kết thúc quá trình lên men Nấm men sau khi loại bỏ không thể tái sử dụng gây lãng phí Hơn thế nữa, nấm men phân tán trong dung dịch, nên không thể lọc bỏ hết triệt để, trong quá trình bảo quản, phần nấm men còn sót lại sẽ lắng xuống đáy, ảnh hưởng đến tính chất cảm quan của sản phẩm Để giải quyết những vấn đề này, các nhà khoa học đã đề ra biện pháp sử dụng nấm men cố định vào lên men rượu Mục tiêu của phương pháp này là giữ các tế bào nấm men trên một chất mang, nhằm tăng hiệu suất thu hồi và giảm chi phí tinh sạch Ngoài ra, khi sử dụng chất mang để cố định sẽ còn giúp làm tăng khả năng chịu đựng của nấm men với nồng độ cơ chất cao và giảm sự

ức chế do sản phẩm cuối, đồng thời có thể ứng dụng để sản xuất liên tục Bên cạnh

đó, rất nhiều nghiên cứu cho thấy việc sử dụng nấm men cố định trong lên men rượu vang không những giúp làm tăng năng suất lên men mà nó còn giúp làm tăng chất lượng của rượu vang thành phẩm như tạo thành nhiều ester hơn, tạo thành ít diacetyl, acetaldehye, methanol hơn và tạo thành rượu bậc cao ít hơn khi lên men ở nhiệt độ thấp (Bardi, Bakoyianis, Koutinas, & Kanellaki, 1996; Bardi, Koutinas, Psarianos, & Kanellaki, 1997; Kozawa, Yamagiwa, & Ohkawa, 1994; Kourkoutas, Kanellaki, Koutinas, Banat, & Marchant, 2003), điều đó là do sự có mặt của chất mang đã làm thay đổi một số đặc điểm về sinh lý và sinh hóa của nấm men theo hướng tích cực trong suốt quá trình lên men và gây ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình sinh tổng hợp sản phẩm phụ Nhiều loại chất mang đã được nghiên cứu để ứng dụng vào quá trình

cố định nấm men như cellulose vi khuẩn, chitosan, alginate, agar, gluten, các miếng trái cây như táo, lê,…

Bưởi là một loại trái cây ngon, rất được ưa chuộng và trồng phổ biến ở nước

ta Thịt bưởi có chứa nhiều nước và một lượng đường tương đối lớn, đặc biệt là hàm lượng vitamin C và chất khoáng khá cao, nên có thể dùng để sản xuất loại rượu vang vừa ngon lại vừa đem lại nhiều lợi ích cho sức khỏe Mặt khác, thịt quả là phần được dùng chủ yếu, nhưng phần vỏ quả chiếm một tỷ lệ lớn lại chưa được tận dụng triệt

để Hiện nay, người ta có thể dùng vỏ bưởi để chế biến một vài món ăn như chè bưởi, mứt vỏ bưởi,… nhưng với số lượng rất nhỏ ở qui mô hộ gia đình, do đó một lượng lớn vỏ bưởi đã bị loại bỏ một cách lãng phí Mặt khác, thành phần của vỏ bưởi chứa chủ yếu là cellulose và pectin, vỏ bưởi lại có cấu trúc xốp nên rất thích hợp để làm chất mang trong các phương pháp cố định

Từ những lý do trên, việc nghiên cứu quá trình cố định nấm men trên vỏ bưởi

và ứng dụng trong lên men rượu vang bưởi là rất cần thiết nhằm tạo ra sản phẩm rượu vang mới có chất lượng cao đồng thời giảm chi phí sản xuất bằng cách tận dụng nguồn phế phẩm rẻ tiền làm chất mang để có thể tái sử dụng nấm men nhiều lần và

dễ dàng thu hồi

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

- Xây dựng quy trình cố định nấm men Saccharomyces cerevisiae trên vỏ

bưởi

- Ứng dụng nấm men được cố định trên vỏ bưởi vào quá trình lên men chính rượu vang bưởi

- So sánh hiệu quả của việc sử dụng nấm men cố định so với nấm men tự do

1.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Để giải quyết các mục tiêu trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu một số nội dung sau:

- Khảo sát ảnh hưởng của độ brix, pH và tỷ lệ nấm men Saccharomyces

cerevisiae thuần đến quá trình nhân giống trong dịch bưởi

- Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng NaHSO3 và thời gian thanh trùng đến

quá trình nhân giống nấm men Saccharomyces cerevisiae trong dịch bưởi

- Khảo sát ảnh hưởng của thời gian chần và số lần xả vỏ bưởi đến quá trình

cố định nấm men Saccharomyces cerevisiae trên vỏ bưởi

- Khảo sát ảnh hưởng của mật độ tế bào nấm men ban đầu và tỷ lệ vỏ bưởi

đến quá trình cố định nấm men Saccharomyces cerevisiae trên vỏ bưởi

- Khảo sát ảnh hưởng của mật độ nấm men cố định đến động học quá trình lên men chính rượu vang bưởi, đồng thời so sánh với nấm men tự do

- Theo dõi khả năng tái sử dụng nấm men cố định

1.4 NHỮNG ĐÓNG GÓP CỦA ĐỀ TÀI

- Góp phần đa dạng hóa các sản phẩm từ bưởi

- Tận dụng được nguồn phụ phẩm vỏ bưởi góp phần cải thiện môi trường

- Tạo ra sản phẩm rượu vang mới có chất lượng cao, vừa ngon vừa có lợi cho sức khỏe nhưng lại tiết kiệm được một lượng chi phí đáng kể, từ đó giúp giảm giá thành sản phẩm, tạo điều kiện để người tiêu dùng sử dụng được nhiều hơn

- Chuyển giao quy trình công nghệ cho các đơn vị sản xuất

- Sử dụng làm tài liệu tham khảo cho giảng viên, sinh viên ngành công nghệ thực phẩm và các lĩnh vực có liên quan

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 NGUYÊN LIỆU BƯỞI

2.1.1 Giới thiệu

Tên khoa học: Citrus grandis(L.) Osbeck

Tên tiếng Anh: Pomelo

Giới (regnum) : Plantac Bộ (ordo) : Sapindales Ngành (divisio) : Magnoliophyta Họ (familia) : Rutaceae

Lớp (class) : Magnoliopsida Chi (genus) : Citrus

Phân lớp (subclass) : Rosida Loài (species) : C.maxima

(Đỗ Huy Bích và cs., 2003)

Cây to, có thể cao tới 6 - 7 m Quả tròn và to, đường kính 15 - 30 cm, khi chín

vỏ có màu vàng nhạt hoặc xanh, vỏ dày, bên trong có quả bì màu trắng hoặc hồng Vị ngọt, hơi đắng và chua Có nhiều hạt hoặc không có hạt (Nguyễn Danh Vàn, 2008)

2.1.2 Bưởi Năm Roi

Hình 1: Bưởi Năm Roi

Bưởi Năm Roi là giống bưởi đặc sản của tỉnh Vĩnh Long, được người tiêu dùng đánh giá cao và có giá trị kinh tế lớn Tổng diện tích bưởi Năm Roi là 9.200 ha, phân bố chính ở Vĩnh Long (diện tích 4.500 ha, cho sản lượng 31.300 tấn, chiếm 48,06% về diện tích và 54,03% về sản lượng cả nước), tiếp theo là tỉnh Hậu Giang (1.300ha) và một số tỉnh miền Đông Nam Bộ

Theo Nguyễn Minh Châu (2009), cây bưởi Năm Roi 10 năm tuổi có chiều cao khoảng 7 - 8 m Thời gian trồng từ tháng 4 đến tháng 1 năm sau, thời gian ra hoa thu hoạch quả khoảng 210 - 220 ngày Đặc điểm của bưởi Năm Roi là có hình quả lê, trọng lượng trung bình từ 1,0 - 1,4 kg, khi chín vỏ quả có màu vàng xanh, thịt quả

màu vàng, mịn, đồng nhất Múi và vách múi dễ tách, ăn giòn, hơi ngọt Tỷ lệ ăn được trên 55%, độ Brix từ 9 - 12% Cây bưởi Năm Roi cho năng suất khá cao, khoảng 280-300 kg/cây/năm (cây trên 10 năm tuổi)

2.1.3 Thành phần hóa học của bưởi

Bảng 1: Thành phần hóa học của múi bưởi và vỏ bưởi

“Nguồn: Trần Xuân Hiển, Trần Phương Lan, & Nguyễn Duy Tân, 2002”

Nước bưởi chứa nhiều chất bổ dưỡng như các loại đường trái cây, đạm, béo, acid tannic, β-caroten và các chất khoáng như phospho, sắt, canxi, kali, magie Ngoài

ra, trong nước bưởi còn chứa nhiều vitamin (B1, B2, C), trong đó hàm lượng vitamin

C khá cao, gấp khoảng 10 lần so với quả lê, với 152g múi bưởi có thể cung cấp 130% nhu cầu vitamin C hàng ngày cho cơ thể

Các thành phần gây đắng trong vỏ bưởi (naringin và hesperidin)

Nhiều nghiên cứu cho thấy naringin và hesperidin là hai chất chủ yếu gây ra

vị đắng trong vỏ bưởi Trong màng bao của múi bưởi và gân bưởi có chứa hợp chất naringin (C27H32O14) và hesperidin (C28H34O5) Dưới tác dụng của enzyme peroxidase thì chất naringin bị thủy phân thành đường glucose, ramnose và naringinen (C15H12O5) không có vị đắng Còn hesperidin khi thủy phân cho glucose, ramnose và hesperitin (C16H14O6) (Nguyễn Văn Tiếp, Quách Đình & Ngô Mỹ Văn, 2000)

2.1.4 Một số sản phẩm từ bưởi

Bưởi là một trong những loại trái cây được rất nhiều người ưa thích bởi một

số lợi ích như: làm giảm cholesterol trong máu, chống cao huyết áp, ngăn ngừa ung thư… Có thể nói bưởi không chỉ đơn thuần là một loại thực phẩm giàu dinh dưỡng

mà nó còn là một vị thuốc Vì những lợi ích trên mà ngày nay bưởi đã được sử dụng làm nguyên liệu để chế biến thành nhiều sản phẩm như: rượu bưởi, nước ép bưởi, chè bưởi, mứt bưởi, nem bưởi,…

Nấm men là loại vi sinh vật có cấu tạo đơn bào, không di động và sinh sản chủ yếu bằng phương pháp nảy chồi Chúng phân bố rất rộng rãi trong thiên nhiên nhất là trong đất và đặc biệt là trên bề mặt của rất nhiều loại lá cây, các loại quả hay các loại cây lương thực, thực phẩm khác

Nấm men có khả năng sinh sản nhanh chóng, sinh khối của chúng rất giàu protein, vitamin và lipid Nấm men có khả năng lên men các loại đường để tạo thành

rượu trong điều kiện yếm khí, còn trong điều kiện hiếu khí thì chúng lại có khả năng tạo thành sinh khối tế bào, vì thế nấm men được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm để sản xuất rượu, bia, nước giải khát lên men, sản xuất men bánh

mì, sản xuất protein sinh khối, gây hương nước chấm, (Lê Xuân Phương, 2001)

2.2.1 Hình thái và kích thước tế bào

2.2.1.1 Hình dạng nấm men

Nấm men có dạng hình tròn, hình trứng như Saccharomyces cerevisiae, hình elip như Sacharomyces ellipsoideus, hình quả chanh như Saccharomyces apiculatus, đôi khi có hình chai như Saccharomyces ludwigii hoặc hình ống dài như Pichia Một

số tế bào nấm men có hình dài, nối tiếp nhau tạo thành dạng sợi gọi là khuẩn ty

(mycelium) hoặc khuẩn ty giả (pseudomycelium) như Endomyces, Endomycopsis,

Candida, Tế bào nấm men trong tự nhiên có thể đứng riêng lẻ hoặc sau khi nảy

chồi vẫn dính với nhau tạo thành chuỗi (Lê Xuân Phương, 2001)

Hình 3: Hình thái tế bào nấm men và sợi nấm

Hình dạng của nấm men hầu như không ổn định Nó phụ thuộc vào tuổi của

nấm men và phụ thuộc vào điều kiện nuôi cấy Ví đụ, Saccharomyces cerevisiae có

hình bầu dục, nếu nó ở môi trường giàu chất dinh dưỡng Trong điều kiện yếm khí nấm men có hình tròn, ngược lại, trong điều kiện hiếu khí tế bào kéo dài hơn

Hình 4: Sự thay đổi hình thái tế bào nấm men khi có oxy

Nếu chỉ quan sát một ống nghiệm nuôi trong môi trường lỏng, ta cũng thấy có

sự khác nhau về hình thái (Nguyễn Đức Lượng, 2006)

Hình 5: Hình thái tế bào nấm men ở trên và dưới ống nghiệm

2.2.1.2 Kích thước tế bào nấm men

Tế bào nấm men thường có kích thước lớn gấp 5 - 10 lần tế bào vi khuẩn Kích thước trung bình của tế bào nấm men: dài: 9 - 10 μm; rộng: 2 - 7 μm Kích thước của tế bào nấm men thay đổi theo điều kiện nuôi cấy, theo tuổi sinh lý

2.2.2 Sự sinh sản của nấm men

2.2.2.1 Sinh sản bằng cách nảy chồi

Đầu tiên hạch dày ra rồi bắt đầu thắt lại ở chính giữa Tế bào mẹ bắt đầu phát triển một chồi con Hạch một phần chuyển vào chồi và một phần ở tế bào mẹ Đồng thời một phần nguyên sinh chất cũng chuyển sang chồi con Chồi con lớn dần, khi chồi con gần bằng chồi mẹ, nó tách ra và sống độc lập Một tế bào mẹ tạo một lúc được một, hai hay nhiều chồi con Sự sắp xếp chồi con trên tế bào cũng không nhất thiết ở một nơi nhất định Ở nơi chồi non đã được tách khỏi tế bào mẹ sẽ không bao giờ tạo ra một chồi non mới mà nó sẽ tạo ra một vết sẹo

Hình 6: Sinh sản của nấm men theo phương pháp nảy chồi

Thời gian cần thiết kể từ lúc chồi mới hình thành tới lúc tế bào này phát triển

và bắt đầu tạo tế bào mới gọi là chu kỳ phát triển của nấm men

2.2.2.2 Sinh sản bằng cách phân đôi

Thường gặp phương pháp sinh sản này ở giống Shizosoccaromyces Lúc đầu

tế bào dài ra và từ từ thắt lại ở chính giữa Nơi thắt này nhỏ dần, nhỏ dần tới khi đứt hẳn và tạo thành hai tế bào con

Hình 7: Sinh sản của nấm men bằng cách phân đôi

2.2.2.3 Sinh sản bằng bào tử và sự hình thành bào tử

Nhiều loài nấm men có khả năng sinh bào tử Bào tử thường nằm trong những bào tử túi Túi có thế sinh ra theo một trong ba cách sau đây:

a) Tiếp hợp đẳng giao (Conjugation isogamic)

Do hai tế bào nấm men giống nhau tiếp hợp với nhau mà tạo thành (ví dụ,

nhiều loài trong giống Schizosaccharomyces, Debaryomyces, Zygosaccharomyces)

b) Tiếp hợp dị giao (Conjugation heterogamic)

Do hai tế bào nấm men có hình thái kích thước không giống nhau tiếp hợp

với nhau mà tạo thành (ví dụ Zygopichia, Naasonua)

c) Sinh sản đơn tính (Pasthenogensis)

Tạo thành bào tử trực tiếp từ tế bào riêng lẻ không thông qua tiếp hợp

(Pichia, Scliwannomyces, Torulospones, Saccharomyces), bào tử này, khi gặp điều

kiện thuận lợi sẽ phát triển thành tế bào mới Tế bào này lại tiếp tục nảy chồi

Ví dụ: Saccharomyces cerevisiae: Tế bào dinh dưỡng đơn bội sinh sản theo

cách nảy chồi Sau đó hai tế bào kết hợp với nhau xảy ra quá trình giao chất và giao nhân tạo thành tế bào dinh dưỡng lưỡng bội Tế bào này nảy chồi và sinh ra tế bào lưỡng bội khác và sau đó chuyển thành bào tử túi Nhân phân cắt giảm nhiễm và sinh

ra bốn bào tử túi rồi chuyến thành tế bào dinh dưỡng và tiếp tục sinh sản bằng cách nảy chồi

Hình 8: Chu kỳ sinh sản của Saccharomyces cerevisiae

(Nguyễn Đức Lượng, 2006)

2.2.3 Sinh trưởng nấm men

Khi cấy nấm men vào môi trường dinh dưỡng, chúng sẽ sinh sản cho đến cơ chất dinh dưỡng cần thiết ở trong môi trường giảm tới mức thấp nhất Khi đó sinh trưởng phát triển của chúng chậm dần và ngừng hẳn, cũng có thể tế bào còn vài lần phân chia tiếp, nhưng sự tăng sinh khối không đáng kể Nếu trong cả quá trình nuôi cấy này ta không bổ sung chất dinh dưỡng và loại bỏ các sản phẩm trao đổi chất thì

ta có quần thể tế bào trong không gian sống có giới hạn Hệ sinh trưởng như vậy được coi là “hệ kín”, có nghĩa là trong môi trường không được đổi mới Hệ kín thường được thực hiện nghiên cứu sinh trưởng của vi sinh vật trong môi trường lỏng

Khi tiếp giống vào môi trường lỏng với nồng độ tế bào giống ban đầu là X,

đồ thị biểu diễn sự sinh trưởng của vi sinh vật sẽ phụ thuộc vào logarit số tế bào với thời gian Đồ thị này được chia làm 6 pha (hay 6 giai đoạn):

Hình 9: Đồ thị sinh trưởng của vi sinh vật trong “hệ kín”

a- Pha tiềm phát (Giai đoạn thích nghi)

Ở pha này vi sinh vật chưa sinh sản còn làm quen với môi trường Số lượng tế bào X không tăng và được gọi là Xo 

Đây là giai đoạn nấm men mới được cấy vào môi trường còn chưa sinh sản Vận tốc sinh trưởng coi như bằng không Nấm men còn thích nghi với môi trường mới, trong đó một số tế bào bị ức chế, thậm chí có thể bị chết Số lượng tế bào nấm men không tăng hoặc tăng không đáng kể, nhưng sự trao đổi chất của chúng lại xảy

ra mạnh mẽ Tế bào có kích thước tăng lên đáng kể, hàm lượng các chất protein, acid nucleic đều tăng lên, các enzyme thích ứng đều được tổng hợp mạnh mẽ Trong môi

A X = f(t) B lnX = f(t) C μx = f (t) μx: hằng số tốc độ sinh trưởng riêng của

vi sinh vật (giá trị này là tốc độ sinh trưởng của vi sinh vật được tính trên 1 đơn vị sinh khối

X: sinh khối t: thời gian

trường càng đầy đủ dinh dưỡng giống nấm men cấy vào càng trẻ khoẻ và lag-pha càng ngắn Người ta có thể cấy một lượng giống lớn với các tế bào trẻ khoẻ làm cho lag-pha càng rút ngắn và giống có thể phát triển ngay sau khi tiếp giống

Thực ra, trong giai đoạn thích nghi, tế bào nấm men sẽ sinh tổng hợp một số enzyme mới để giúp nó thực hiện tốt quá trình dị hóa các cơ chất trong môi trường ở những giai đoạn tiếp theo Thời gian của giai đoạn thích nghi có thể thay đổi và phụ thuộc vào trạng thái sinh lý của tế bào Những tế bào trẻ và có hoạt tính trao đổi chất cao sẽ thích nghi với môi trường nhanh hơn các tế bào già và có hoạt tính trao đổi chất yếu

b- Pha tăng dần (Giai đoạn sinh trưởng nhanh)

Đây là giai đoạn trung gian giữa giai đoạn thích nghi và giai đoạn logarit Giai đoạn sinh trưởng nhanh thường rất ngắn Trong giai đoạn này, nấm men bắt đầu sinh sản, lượng sinh khối tăng lên và giá trị tốc độ sinh trưởng riêng sẽ tăng nhanh từ

0 lên đến giá trị cực đại

c- Pha chỉ số (Giai đoạn logarit)

Ở pha này X tăng theo thời gian theo cấp số và lnX tỷ lệ thuận với thời gian t,

μx không đổi và là cực đại:

Trong pha này hầu hết nấm men đã qua pha tiềm phát sẽ phát triển số lượng

tế bào theo cấp số nhân với tốc độ sinh trưởng là cực đại:

Trong pha chỉ số tế bào phát triển ào ạt, khi đó các chất dinh dưỡng trong môi trường không phải là vô tận, mà ngược lại ngày một giảm đi, hơn nữa trong môi trường xuất hiện và tích tụ những sản phẩm trao đổi chất không cần thiết đối với giống nuôi cấy Như vậy, trong quá trình chất dinh dưỡng cạn dần, các sản phẩm sinh

ra làm cho các điều kiện mất đi sự thuận lợi cho sinh trưởng và quá trình chuyển sang pha ổn định

d- Pha giảm dần (Giai đoạn sinh trưởng chậm)

Đây là giai đoạn trung gian giữa giai đoạn logarit và giai đoạn ổn định Giai đoạn này thường rất ngắn Nấm men vẫn sinh trưởng nhưng không còn tuân theo nguyên tắc lũy thừa, tốc độ sinh trưởng chậm dần Nguyên nhân chính là do hàm lượng các chất dinh dưỡng trong canh trường đã giảm Ngoài ra, một số sản phẩm

trao đổi chất do nấm men sinh ra trong quá trình trao đổi chất có thể gây ức chế sự sinh sản của chính nấm men Lượng sinh khối tăng ít và tốc độ sinh trưởng riêng của nấm men giảm dần từ giá trị cực đại về 0

e- Pha ổn định (Giai đoạn ổn định)

Pha này được coi như pha cân bằng động, số lượng vi sinh vật đạt đến cực đại

và không thay đổi theo thời gian, μx = 0 

Trong pha này tế bào sống là ổn định và mật độ quần thể là tối đa Thực ra thì

sự sinh sản của nấm men vẫn tiếp diễn trong giai đoạn ổn định Tuy nhiên, bên cạnh quá trình sinh sản còn xảy ra quá trình chết và tự phân ở một số tế bào Tổng số tế bào mới được sinh ra trong giai đoạn ổn định sẽ bằng với tống số tế bào chết và bị

mất đi do quá trình tự phân

f- Pha suy vong (Giai đoạn suy vong)

Ở pha này số lượng vi sinh vật X giảm, tốc độ sinh trưởng riêng sẽ có giá trị

âm và giảm dần

Khi thời gian nuôi cấy kéo dài, hàm lượng các chất dinh dưỡng trong canh trường gần như cạn kiệt Ngược lại, hàm lượng các sản phẩm trao đổi chất gây ức chế sự sinh trưởng vi sinh vật sẽ tăng cao trong canh trường

Trong pha này các tế bào sống giảm dần và tế bào chết tăng dần, một số tế bào chết bị tự phân do các enzyme protease nội bào Các tế bào sống trở nên già đi, kích thước nhỏ lại, biến dạng và tế bào chết xuất hiện dạng hạt Tế bào chết bị tự phân trở nên trống rỗng và bên trong còn các hạt chất béo nhỏ

(Lê Văn Việt Mẫn, 2009 & Lương Đức Phẩm, 2006)

2.2.4 Dinh dƣỡng nấm men

2.2.4.1 Dinh dưỡng carbon

Các hợp chất hữu cơ khác nhau như các loại đường và dẫn xuất, các rượu, acid hữu cơ, acid amin, có thể là nguồn dinh dưỡng carbon (C) của nấm men. Hầu hết các loài nấm men đều không có enzyme polyhydrolase trong đó có amylase và cellulase Vì vậy, nấm men không sử dụng trực tiếp được tinh bột cũng như cellulose

và hemicellulose

Nguồn C dinh dưỡng trước hết phải kể đến các loại đường Đường glucose thuộc loại đường 6 (hexose) được tất cả các loài nấm men sử dụng Nhiều loài nấm

men, trong đó có giống Saccharomyces lên men rượu, không sử dụng được pentose

Những disaccharide (maltose và saccharose) trước khi được nấm men sử dụng phải qua thuỷ phân sơ bộ thành đường đơn nhờ enzyme tương ứng của nấm men Nấm men sử dụng maltose chỉ khi trong môi trường không có mặt glucose và fructose

Trong nuôi cấy theo giai đoạn glucose và fructose được sử dụng trước hết, kế tiếp là acid béo phụ thuộc vào chủng loài và thành phần của acid này

Bảng 2: Khả năng đồng hóa các nguồn hydratcarbon của nấm men

2.2.4.2 Dinh dưỡng nitơ

Các hợp chất hữu cơ chứa N của tế bào là các acid amin, các nucleotide purin

và pyrimidin, protein và một số vitamin Nấm men tiêu hoá rất tốt các acid amin, còn pepton kém hơn và hoàn toàn không sử dụng được protein Cần phải lưu ý rằng, nấm men chỉ sử dụng được axit amin ở dạng tự nhiên (L-axit amin)

Nguồn nitơ vô cơ được nấm men sử dụng tốt là các muối amoni của acid vô

cơ cũng như hữu cơ Đó là amoni sulfat, phosphat rồi đến các muối acetat, lactat, malat và succinat Trong môi trường lỏng, amoniac (NH3) ở dạng NH4+ gần với tiền chất của nitơ hữu cơ và là nguồn nitơ rất dễ cho nấm men sử dụng, chỉ xếp sau các axit amin Nấm men còn sử dụng được urê và pepton Đa số nấm men không đồng hoá được nitrat

2.2.4.3 Dinh dưỡng các nguyên tố vô cơ

Các nguyên tố vô cơ trong nuôi cấy nấm men, phospho được quan tâm trước hết, sau đó là kali và magiê, lưu huỳnh, Phospho tham gia vào các thành phần quan trọng của tế bào, như các nucleoproteid, acid nucleic, polyphosphat, phospholipid, Trong phòng thí nghiệm thường dùng muối KH2PO4 và K2HPO4 làm nguồn P và K, còn trong sản xuất thường dùng dịch chiết từ supephosphat làm nguồn P Lưu huỳnh

là thành phần của một số acid amin trong phân tử protein và là nhóm phụ (-SH) của một số enzyme CoA Trong môi trường nuôi cấy nấm men thường có (NH4)2SO4 làm nguồn amon và nguồn lưu huỳnh Các ion kali, canxi, magiê cũng cần có trong môi trường nuôi cấy hoặc lên men Thông thường ion kali được bổ sung cùng với các muối phosphat hoặc sulfat, còn ion Ca++

và Mg++ thường có đủ trong nước sinh hoạt Các nguyên tố vi lượng cũng rất cần để quá trình sinh lý trong tế bào nấm men xảy ra bình thường Các nguyên tố vi lượng là mangan, đồng, sắt, kẽm, molipđen, bo, liti, rubiđi, niken, coban, các nguyên tố này chỉ cần một lượng rất nhỏ Trong nước sinh hoạt thường có mặt các ion này

Ghi chú: + đồng hóa - không đồng hóa

2.2.4.4 Dinh dưỡng các chất sinh trưởng

Những chất kích thích sinh trưởng là các vitamin, các bazơ purin và pyrimidin Hàm lượng tối thiểu của vitamin cần cho sự phát triển bình thường của nấm men trong môi trường tổng hợp là như sau (μg/mL): inozit - 5; biotin - 0,0001; acid pantothenic - 0,25; thiamin - 1,0; pyridoxin - 0,25; acid nicotinic - 0,5

Acid amin ngoài vai trò là nguồn nitơ hữu cơ và cả nguồn carbon hữu cơ được vi sinh vật sử dụng trực tiếp làm vật liệu xây dựng tế bào còn là các chất kích thích sinh trưởng cho một số chủng nòi nấm men Nhu cầu riêng biệt này là rất nhỏ (Lương Đức Phẩm, 2006)

2.3 RƢỢU VANG

Rượu vang là loại đồ uống lên men trực tiếp từ nước quả Khi quá trình lên men kết thúc, người ta không chưng cất mà để lắng trong tự nhiên, gạn lọc và hoàn thành sản phẩm Rượu vang vốn có nguồn gốc từ quả nho, nên có tên gọi là “Vin” hoặc “Wine”, ngày nay người ta mở rộng ý nghĩa của rượu vang là rượu không chưng cất từ các loại nước quả (Lương Đức Phẩm, 2006)

2.3.1 Cơ chế hóa sinh học của lên men rƣợu

1 Đầu tiên do xúc tác của glucokinase, glucose kết hợp với gốc phosphat của phân tử ATP (Adenosintriphosphat) để tạo thành gluco-6 phosphat và ADP:

C6H12O6 + ATP CH2O(H2PO3)(CHOH)4CHO + ADP

2 Tiếp đó gluco-6-phosphat do tác dụng của enzyme đồng phân gluco phosphat-isomerase sẽ biến thành fructo-6-phosphat:

CH2O(H2PO3)(CHOH)4CHO CH2O(H2PO3)(CHOH)3COCH2OH

3 Giai đoạn ba dưới tác dụng của enzyme fructophosphate kinase, phân tử ATP thứ hai sẽ đính thêm một gốc phosphat nữa vào fructo-6-phosphat để tạo thành fructo-1,6-diphosphat và phân tử ADP thứ hai:

CH2O(H2PO3)(CHOH)3COCH2OH + ATP

CH2O(H2PO3)(CHOH)3COCH2O(H2PO3) + ADP

Sự tạo thành fructo-1,6-phosphat đánh dấu kết thúc giai đoạn chuẩn bị của lên men rượu Giai đoạn thực hiện chuyển hóa các nối liên kết cao năng thành dạng dễ biến đổi dưới tác dụng của các enzyme

4 Giai đoạn tiếp theo quan trọng là phân cắt mạch carbon của diphosphat thành hai phân tử triose: gồm phosphodioxyaceton và aldehyt-3-phosphoglyceric Phản ứng này được xúc tác bởi aldolase:

fructo-1,6-CH2O(H2PO3)CO(CHOH)3CH2O(H2PO3)

CH2O(H2PO3)COCH2OH+CH2O(H2PO3)CHOHCHO phosphodioxyaceton aldehyt-3-phosphoglyceric

Vai trò chủ yếu trong các biến đổi tiếp theo của quá trình lên men rượu là aldehyt-3-phosphoglyceric, nhưng trong dịch đang lên men chúng chứa rất ít Điều này được giải thích bằng hiện tượng đồng phân dưới tác dụng của enzyme triphosphat isomerase:

5 CH2O(H2PO3)COCH2OH CH2O(H2PO3)CHOHCHO

Như vậy là trong quá trình lên men aldehyt-3-phosphoglyceric luôn được tạo thành từ phosphodioxyaceton

6 Giai đoạn tiếp theo là hai phân tử aldehyt-3-phosphoglyceric bị oxy hóa Phản ứng này có sự tham gia của acid phosphoric trong canh trường nhờ xúc tác của enzyme glyceraldehyt triphosphatdehydrogenase - coenzyme của nó là NAD (Nicotinamit- Adenin-Dinucleotid)

2CH2O(H2PO3)CHOHCHO + 2H3PO4 + 2NAD

2CH2O(H2PO3)CHOHCOO ~ H2PO3 + 2NaD.H2 acid-1,3-diphosphoglyceric

7 Tiếp theo với sự tham gia của phosphoglycerate kinase, gốc phosphat chứa cao năng của acid-1,3-diphosphoglyceric sẽ chuyển vào phân tử ADP Kết quả acid-3-phosphoglyceric được tạo thành, còn ADP nhận thêm năng lượng và biến thành ATP:

2CH2O(H2PO3)CHOHCOO ~ (H2PO3) + 2ADP

2CH2O(H2PO3)CHOHCOOH+2ATP

8 Dưới tác dụng của enzyme phosphoglycerate mutase, gốc acid phosphoric

sẽ chuyển từ vị trí carbon thứ ba sang carbon thứ hai Kết quả là acid-3- phosphoglyceric biến thành acid-2-phosphoglyceric theo phản ứng:

2CH2O(H2PO3)CHOHCOOH 2CH2OHCHO(H2PO3)COOH

9 Dưới tác dụng của enolase, acid-2-phosphoglyceric sẽ mất nước và biến thành acid phosphopyruvic:

2CH2OHCHO(H2PO3)COOH 2CH3CO(H2PO3)COOH + 2H2O

10 Acid phosphopyruvic rất không bền nên dễ bị mất gốc acid phosphoric do enzyme pyruvate kinase và do đó acid pyruvic được tạo thành:

2CH2 = CO ~ (H2PO3)COOH + 2ADP 2CH3CO-COOH + 2ATP

11 Tới đây acid pyruvic bị decarboxyl để tạo thành aldehyt acetic:

2CH3CO-COOH 2CO2 + 2CH3CHO

12 Giai đoạn cuối cùng của lên men rượu là aldehyt acetic bị khử bởỉ NAD.H2 dưới tác dụng của enzyme alcohol dehydrogenase:

2CH3CHO + 2NAD.H2 2CH3CH2OH + 2NAD

Phương trình tổng quát của lên men rượu như sau:

C6H12O6 2CO2 + 2CH3CH2OH Trong quá trình lên men rượu, mỗi phân tử gam glucose sẽ giải phóng ra khoảng 50 kcal Năng lượng này được nấm men sử dụng chừng 20 kcal Số còn lại sẽ

thải ra canh trường do đó làm tăng nhiệt độ dịch lên men (Nguyễn Đình Thưởng &

Nguyễn Thanh Hằng, 2007)

2.3.2 Sản phẩm phụ và sản phẩm trung gian của quá trình lên men rƣợu

Trong quá trình lên men, ngoài sản phẩm chính là rượu và CO2, còn tạo ra nhiều chất khác Bằng phân tích sắc ký khí người ta phát hiện trên 50 chất khác nhau, nhưng có thể xếp thành 4 nhóm chính: acid, este, aldehyt và alcol có số carbon lớn hơn 2 (alcol cao phân tử)

CH3CHO + CH3CHO + H2O = CH3COOH + C2H5OH

- Acid lactic được tạo bởi pyruvate dehydronase:

CH3CO-COOH + NAD.H2 = CH3CHOHCOOH + NAD

hoặc:

CH2O(H2PO3)CHOHCHO + H2O = CH3CHOHCOOH + H3PO4

- Acid citric được tạo từ aldehyt acetic:

9CH3CHO + 4H2O = (CH2COOH)2C(OH)COOH + 6CH3CH2OH

- Acid succinic được tạo thành có thể theo hai con đường:

Dehydro và trùng hợp hai phân tử acid acetic với một phân tử aldehyt acetic: 2CH3-COOH + CH3CHO COOHCH2CH2COOH + C2H5OH

Hoặc được tạo thành do deamin acid glutamic Trường hợp này aldehyt glyceric tiếp nhận hydro và tạo ra cả glycerin:

C6H12O6 + COOH-CH2-CH2-CHNH2COOH + 2H2O =

COOH-CH2CH2COOH + 2C3H8O3 + NH3 + CO2Glycerin và aldehyt đều là sản phấm trung gian của lên men rượu Trong điều kiện lên men nhằm mục đích chỉ thu alcol etylic, người ta khống chế pH dịch lên men trong giới hạn 4,5 - 5,2 Với điều kiện ấy lượng glycerin tạo thành chỉ chiếm 0,3

- 0,45%, tương ứng tiêu tốn đường 2 - 3% so với lượng đưa vào Nếu tăng pH tới

zymase

kiềm thì lượng đường tham gia tạo glycerin tăng tới 23,4% và đường tạo aldehyt nhưng chưa chuyển thành rượu đạt 11,9%

Lên men đường xảy ra theo phương trình:

2C6H12O6 + H2O = 2C3H8O3 + CO2 + CH3COOH + CH3CH2OH

2.3.2.2 Sự tạo thành alcol cao phân tử

Một trong những sản phẩm phụ quan trọng được tạo thành trong quá trình lên men rượu, là các rượu có số nguyên tử carbon lớn hơn hai (gọi chung là alcol cao phân tử) Các alcol này tuy ít nhưng nếu lẫn vào cồn etylic sẽ gây ảnh hưởng xấu tới chất lượng sản phẩm Đó là các alcol propylic, isobutylic, isoamylic, amylic, Hàm

lượng của chúng chỉ vào khoảng 0,4 - 0,5% so với cồn etylic nhưng gây cho sản

phẩm mùi hôi khó chịu

Nguyên nhân là do nấm men sử dụng nitơ của các acid amin Cơ chế tạo thành gồm các phản ứng sau:

Đầu tiên các acid amin bị khử mất H2 và tạo imino acid:

R-CH-COOH R-C-COOH

NH2 NH

α-amino acid α-imino acid

Tiếp theo imino acid kết hợp với nước để tạo thành ceto acid và giải phóng

hoặc bị oxy hóa để tạo ra các acid tương ứng:

RCHO + 0,5O2 RCOOH

Phương trình tổng quát quá trình tạo thành alcol có phàn tử cao được đơn giản theo phản ứng:

R-CH-COOH + H20 RCH2OH + NH3 + CO2

NH2

-H2

-CO2

Nhiều nhà nghiên cứu cho rằng, sự tạo thành alcol cao phân tử chỉ phụ thuộc vào cấu trúc và hàm lượng acid amin có trong dịch lên men Theo giáo sư Vexeiop, việc tạo thành alcol cao phân tử xuất hiện chủ yếu trong giai đoạn sinh trưởng của nấm men Ông cho biết nếu tăng hoặc giảm nhiệt độ lên men so với bình thường thì alcol cao phân tử được tạo thành sẽ ít đi Trong giới hạn pH từ 3 đến 5, alcol cao phân tử tích tụ nhiều hơn, nhưng nếu tiếp tục tăng pH thì hàm lượng dầu fusel sẽ giảm Sục khí vào canh trường sẽ làm tăng sự tạo thành alcol cao phân tử Bổ sung acid amin vào môi trường chứa saccharose cũng làm tăng lượng alcol cao phân tử

Sự tạo thành dầu fusel sẽ tăng cùng với tăng sinh khối nấm men và bằng cách hạn chế sinh trưởng của nấm men chúng ta cố thể giảm được lượng fusel tạo thành,

Sự tạo thành este xảy ra dễ hơn khi cấu tử tham gia phản ứng là các aldehyt:

R1CHO + R2CHO R1COOCH2R2

(Nguyễn Đình Thưởng & Nguyễn Thanh Hằng, 2007)

2.3.3 Các vi khuẩn có hại cho nấm men

Dịch đường lên men không chỉ là môi trường dinh dưỡng tốt cho nấm men

mà còn cho các vi sinh vật khác Trong nước, trong không khí cũng như trong các nguyên liệu tham gia vào thành phần môi trường luôn chứa một lượng vi sinh vật có hại cho lên men rượu Các vi sinh vật nếu lẫn vào dịch đường, chúng sẽ biến đường thành các sản phẩm khác và do đó làm giảm hiệu suất lên men rượu

Trong điều kiện lên men rượu, thường gặp nhất là các vi khuẩn sau đây:

Vi khuẩn lactic

Đây là loại vi khuẩn yếm khí Chúng gồm hai loại: lactic điển hình và không điển hình Lactic điển hình sẽ biến đường thành sản phẩm duy nhất là acid lactic:

C6H12O6 2CH3CHOHCOOH + 18 kcal

Vi khuẩn lactic không điển hình sẽ sử dụng đường và tạo ra acid lactic, ngoài

ra còn tạo ra một lượng đáng kể các chất khác như alcol, acid acetic, carbonic, diacetyl và acetoin

Lactic điển hỉnh có nhiệt độ tối ưu trong khoảng 49 - 51 °C, còn lactic không điển hình có nhiệt độ tối ưu trong khoảng 37 - 38 °C

(Nguyễn Đình Thưởng & Nguyễn Thanh Hằng, 2007)

2.3.4 Tiêu chuẩn rƣợu vang

Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F9 Đồ uống (2013) đã đưa ra TCVN 7045-2013 về rượu vang như sau:

2.3.4.1 Chỉ tiêu hóa học

Bảng 3: Các chỉ tiêu hóa học

1 Hàm lượng etanol (cồn) ở 20 oC, % thể tích, không nhỏ hơn 8,5

2 Hàm lượng metanol, mg/L etanol 100o, không lớn hơn

3 Độ acid dễ bay hơi, meq/L sản phẩm a), không lớn hơn 20

4 Hàm lượng lưu huỳnh dioxit (SO2), mg/L sản phẩm, không lớn hơn

- rượu vang đỏ có hàm lượng đường tính theo tổng hàm lượng glucose

và fructose nhỏ hơn 5 g/L

150

- rượu vang đỏ có hàm lượng đường tính theo tổng hàm lượng glucose

và fructose không nhỏ hơn 5 g/L

200

- rượu vang trắng và rượu vang hồng có hàm lượng đường tính theo

tổng hàm lượng glucose và fructose nhỏ hơn 5 g/L

200

- rượu vang trắng và rượu vang hồng có hàm lượng đường tính theo

tổng hàm lượng glucose và fructose không nhỏ hơn 5 g/L

250

5 Áp suất dư trong chai tại 20 oC, bar, không nhỏ hơn

- đối với chai có dung tích không nhỏ hơn 0,25 lít 3,5

- đối với chai có dung tích nhỏ hơn 0,25 lít 3,0 a)

meq = mili đương lượng, 1 meq tương đương với 60 mg acid acetic

2.3.4.2 Chỉ tiêu cảm quan

Bảng 4: Các chỉ tiêu cảm quan

1 Màu sắc Đặc trưng cho từng loại sản phẩm

2 Mùi Thơm đặc trưng của nguyên liệu và sản phẩm lên men,

không có mùi lạ

3 Vị Đặc trưng cho từng loại sản phẩm, không có vị lạ

4 Trạng thái Trong, không vẩn đục

2.4 PHƯƠNG PHÁP CỐ ĐỊNH TẾ BÀO

2.4.1 Sơ lược về kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật

Kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật được định nghĩa là kỹ thuật bao bọc hoặc định vị các tế bào nguyên vẹn vào một vùng không gian nhất định nhằm bảo vệ các hoạt tính xúc tác mong muốn Hiện tượng cố định thường là sự bắt chước các hiện tượng xảy ra trong tự nhiên khi các tế bào có thể phát triển trên bề mặt và bên trong các cấu trúc tự nhiên (Kourkoutasa, 2004)

Cố định tế bào còn được định nghĩa là việc gắn tế bào vi sinh vật vào chất mang không hòa tan trong nước, tế bào sau khi sử dụng có thể được tái sử dụng nhiều lần, không bị lẫn vào sản phẩm và có thể chủ động ngừng phản ứng mong muốn (Lương Đức Phẩm, 2006)

2.4.2 Chất mang trong kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật

Có nhiều loại chất mang được sử dụng trong kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật, chúng được phân loại theo các nhóm sau: chất mang có nguồn gốc hữu cơ, chất mang có nguồn gốc vô cơ, chất mang có nguồn gốc tự nhiên và hệ thống màng Chất mang có nguồn gốc thiên nhiên thích hợp chất đối với các ứng dụng trong lĩnh vực thực phẩm, vừa sạch, không cần phải xử lý như gỗ, mạt cưa, miếng trái cây, Mặt khác các vật liệu hữu cơ được tổng hợp hay chiết xuất từ các nguồn vật liệu gốc thiên nhiên thì không cần chú ý tới vấn đề tinh sạch (Đặng Thị Phương Linh, k.n)

Điều kiện lựa chọn chất mang:

- Rẻ

- Có tính chất cơ lý bền vững nên chịu được khuấy trộn, áp lực

- Không tan trong môi trường phản ứng

- Kháng khuẩn cao, bền vững với sự tấn công của vi sinh vật

- Phù hợp hình dạng thiết bị phản ứng sinh học

- Cố định vi sinh vật dễ dàng

- Có thể sử dụng nhiều lần

- An toàn cho môi trường sống

- Độ trương tốt, diện tích bề mặt tiếp xúc lớn, vừa tăng khả năng cố định vi sinh vật vừa tăng khả năng tiếp xúc giữa cơ chất và enzyme, nhờ đó làm tăng hoạt tính enzyme và số lần tái sử dụng

- Có cấu trúc siêu lỗ

2.4.3 Các phương pháp cố định tế bào vi sinh vật

Những kỹ thuật này có thể được chia thành bốn nhóm chính, dựa trên cơ chế vật lý của việc gắn tế bào vi sinh vật với chất mang (Kourkoutasa, 2004)

Hình 10: Các phương pháp cố định tế bào vi sinh vật

2.4.3.1 Phương pháp cố định tế bào vi sinh vật trên bề mặt chất mang

Tế bào cố định trên chất mang rắn được thực hiện bởi hiện tượng hấp phụ vật

lý dựa trên lực tương tác tĩnh điện hoặc bằng liên kết cộng hóa trị giữa màng tế bào

và chất mang Phương pháp sử dụng tế bào nấm men cố định trên bề mặt khá phổ

biến do tương đối dễ thực hiện Do không có rào cản giữa các tế bào và môi trường,

tế bào có thể tách rời và di chuyển vào môi trường

Gắn tế bào bằng phương pháp cộng hóa trị

- Định nghĩa: Bản chất của liên kết cộng hóa trị là nối giữa tế bào vi sinh vật

và chất mang thông qua “cầu nối” Cầu nối này có kích thước không lớn lắm, và có hai đầu, một đầu nối polymer và một đầu nối tế bào

- Cách tiến hành:

+ Theo một giai đoạn: Chất mang có khả năng liên kết trực tiếp với tế bào Việc gắn sẽ hiệu quả hơn nếu diện tích tiếp xúc của tế bào và chất mang có dấu ngược nhau

+ Theo hai giai đoạn: Trước tiên là hoạt hóa chất mang, sau đó thực hiện liên kết giống trên

- Chất mang: cellulose, DEAE- cellulose, agarose, silicagel, bentoit, gỗ, mùn

cưa, mạt cưa,

Gắn tế bào bằng phương pháp hấp phụ

- Định nghĩa: Trong quá trình cố định tế bào vi sinh vật bằng phương pháp

hấp phụ có các liên kết sau hình thành:

+ Liên kết tĩnh điện Val der walls: Giữa tế bào và bề mặt chất mang tạo nên

sự chênh lệch điện thế, làm cho tế bào và chất mang gắn liền với nhau

+ Lực mao quản: Chất mang có các mao quản được ngâm trong huyền phù,

do đó lực mao quản kéo tế bào với chất mang

+ Lực liên kết ion: Việc gắn tế bào sẽ có hiệu quả cao khi điện tích của tế bào

vi sinh vật và chất mang có dấu ngược nhau

- Chất mang: Vật liệu vô cơ như polygorskite, montmorilonite, hydromica, sứ

xốp, thủy tinh có cấu trúc xốp, Các vật liệu rắn như kính hoặc cellulose có thể được xử lý với polycations, chitosan hoặc hóa chất khác, để nâng cao khả năng hấp phụ của chúng

2.4.3.2 Phương pháp cố định tế bào vi sinh vật trong cấu trúc gel

Trong phương pháp cố định này, các tế bào đi vào trong cấu trúc của vật liệu làm chất mang Polymer tạo thành màng bao bọc xung quanh tế bào Mạng lưới này

có lỗ nhỏ tới mức đủ để tế bào không chui ra ngoài, nhưng vẫn đủ lớn để vận chuyển

cơ chất và sản phẩm trao đổi chất của tế bào ra vào

Ví dụ đặc trưng phương pháp cố định này là nhốt trong gel polysaccharide như alginate, k-carrageenan, agar, chitosan và polygalacturonic acid hoặc các polymer khác như gelatin, collagen Tế bào phát triển trong chất mang cũng có những hạn chế về khả năng khuếch tán của vật liệu

Các loại gel cơ bản:

- Ion gel: là một loại gel mà mạng lưới được tạo thành từ những phân tử polymer gắn với nhau bằng liên kết ion

- Covalent gel: loại gel này do các phân tử polymer gắn với nhau bằng liên kết cộng hóa trị

- Non-covalent gel: các phân tử polymer gắn với nhau bằng liên kết cộng hóa trị và liên kết hydro

- Cryogel: là cấu trúc gel polymer mới được tạo ra bằng phương pháp lạnh đông các tiền polymer có phân tử lượng thấp và cao

Để gói tế bào vi sinh vật vào trong khuôn gel, người ta tiến hành thanh trùng, hợp hóa trong gel khi có mặt đồng thời tế bào vi sinh vật Sau khi hoàn thành, tế bào

vi sinh vật bị giữ chắc trong gel Các tế bào vi sinh vật được gói theo kiểu này thường phân bố không đều Thông thường chỉ những tế bào vi sinh vật ở gần bề mặt gel là tiếp xúc được với cơ chất

2.4.3.3 Phương pháp cố định tế bào vi sinh vật không mang chất mang

Phương pháp cố định bằng liên kết chéo giữa các tế bào vi sinh vật

- Định nghĩa: Các tế bào liên kết với nhau thành một khối tế bào Sự liên kết

giữa các tế bào được xem như một phương pháp cố định tế bào do sự kết tụ lại của các tế bào làm cho chúng có thể được sử dụng trong các thiết bị phản ứng

- Tác nhân liên kết: glutaraldehyde, toluen diisocyanate, hexamethylen

Bảng 5: Ưu nhược điểm các phương pháp thông dụng để cố định tế bào

- Số lượng tế bào cố định thường thấp

và hoạt tính của tế bào

- Mỗi tế bào phải có phản ứng đặc thù

Liên kết giữa

các tế bào

- Điều kiện nhẹ nhàng, khả năng kéo dài thời gian hoạt động của tế bào

“Nguồn: Uông Nguyễn Đức Minh, 2008”

Ưu nhược điểm của vi sinh vật cố định so với vi sinh vật tự do (Uông

Nguyễn Đức Minh, 2008)

Ưu điểm:

- Kéo dài thời gian hoạt động và ổn định của các tế bào này Đồng thời chất mang cố định cũng được xem như nhân tố bảo vệ tế bào chống lại các tác nhân ảnh hưởng như pH, nhiệt độ, dung môi, kim loại nặng,

- Có khả năng lên men liên tục

- Tăng sức chịu đựng với nồng độ cơ chất cao, giảm sự ức chế của sản phẩm cuối

- Sản phẩm được thu hồi dễ dàng hơn do giảm bớt quá trình tách chiết và lọc

do đó làm giảm chi phí yêu cầu về thiết bị và năng lượng

- Có khả năng tái sử dụng trong quá trình lên men mà không cần loại bỏ khỏi môi trường

Nhược điểm:

- Hoạt lực thấp hơn tế bào tự do

- Trong môi trường phản ứng, không tránh khỏi hiện tượng rửa trôi tế bào ra khỏi chất mang

- Cơ chất muốn vào trong tế bào để trao đổi chất tạo thành sản phẩm phải qua chất mang Vì thế phải lựa chọn chất mang phù hợp với kỹ thuật cố định để làm giảm trở lực của quá trình thẩm thấu vào ra của sản phẩm

2.5 CÁC PHỤ LIỆU, PHỤ GIA SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU

2.5.1 Đường saccharose

2.5.1.1 Cấu tạo và tính chất

Saccharose có công thức cấu tạo là C12H22O11, ở dạng tinh thể trắng, được cấu tạo từ hai phân tử đường đơn là glucose và fructose Saccharose rất phổ biến trong giới thực vật, đặc biệt chiếm tỉ lệ cao trong cây mía (14 - 20%), trong củ cải đường (16 - 20%)

Saccharose dễ tan trong nước, kết tinh từ dung dịch nước sẽ cho những tinh thể lớn Nồng độ saccharose trong dung dịch nước có thể xác định bằng phân cực kế hay đường kế

Saccharose dễ bị thủy phân trong môi trường acid hay ngay cả với acid yếu nhất như H2O + CO2 tạo thành glucose và fructose Hiện tượng này gọi là sự nghịch đảo đường Saccharose cũng dễ bị thủy phân dưới tác dụng của enzyme saccharase

2.5.1.2 Tác dụng của đường

- Tạo vị ngọt cho sản phẩm, làm tăng giá trị cảm quan của sản phẩm

- Kìm hãm sự phát triển của một số loại vi sinh vật có hại

- Cung cấp cơ chất cho nấm men lên men rượu (Trần Xuân Hiển, 2010)

2.5.2 Acid citric

- Công thức cấu tạo:

- Tính chất vật lý: acid citric khan nóng chảy ở 135 oC, tinh thể ngậm 1 phân

tử nước nóng chảy ở 100 oC, ở nhiệt độ phòng acid tan trong nước với tỉ lệ 133 gam trong 100 ml nước

- Acid citric có nhiều trong các loại họ citrus Trong nguyên liệu thực vật acid citric và acid malic thường đi kèm với nhau, có vị ngọt dịu nên thường được dùng để điều vị trong các sản phẩm rau quả và bánh kẹo Trong công nghiệp, trước kia acid citric được sản xuất từ chanh, ngày nay được sản xuất từ rỉ đường bằng phương pháp lên men acid citric

- Acid citric được ứng dụng nhiều trong công nghiệp thực phẩm (nước giải khát, bánh, kẹo, mứt, sữa,…) (Nguyễn Chí Linh, 2007)

Theo Bộ y tế (2012), giới hạn tối đa của acid citric trong sản phẩm rượu vang

là 700 mg/L

2.5.3 Natri carbonat (Na 2 CO 3 )

Natri carbonat là một phụ gia với chỉ số E170i được dùng để điều chỉnh độ acid Theo Bộ y tế (2012), giới hạn tối đa của Na2CO3 trong sản phẩm nước giải khát

có cồn là 5000 mg/L

2.5.4 Natri bisulfit (NaHSO 3 )

Natri bisufit là một hợp chất hóa học với công thức là NaHSO3, nó là một chất phụ gia với chỉ số E222

- Phạm vi ứng dụng:

+ Được dùng làm chất sát khuẩn có phạm vi hoạt động rộng, chống men, mốc, vi khuẩn

+ Dùng để ức chế sự biến chất hóa nâu của hoa quả

+ Dùng để khử màu trong công nghiệp đường

- Tính độc hại:

+ Thử nghiệm trên thỏ, liều lượng 1 - 3 g/ngày, từ 127 đến 185 ngày, có hiện tượng sút cân, chảy máu dạ dày Với chuột cống trắng thì liều lượng 0,1% ức chế sự phát triển, do phá hủy vitamin nhóm B

+ Tác dụng độc hại cấp tính (chảy máu dạ dày) chủ yếu là đối với những người uống nhiều rượu có chế biến, bảo quản với SO2, do đó cần khống chế dư lượng còn lại trong rượu (Dương Thanh Liêm, k.n)

Theo Bộ y tế (2012), giới hạn tối đa của NaHSO3 trong sản phẩm rượu vang

mà chúng ta cần thu hồi