Nghiên cứu quy trình cố định nấm men saccharomyces cerevisiae trên vỏ bưởi và thử nghiệm lên men rượu vang bưởi

TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG KHOA NÔNG NGHIỆP & TÀI NGUYÊN THIÊN NHIÊN BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM BÁO CÁO NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CỐ ĐỊNH NẤM MEN SACCHAROMYCES C

TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG KHOA NÔNG NGHIỆP & TÀI NGUYÊN THIÊN NHIÊN

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

BÁO CÁO NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CỐ ĐỊNH NẤM MEN

SACCHAROMYCES CEREVISIAE TRÊN VỎ BƯỞI VÀ

THỬ NGHIỆM LÊN MEN RƯỢU VANG BƯỞI

Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thị Mỹ Anh

An Giang, Tháng 07 Năm 2013

TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG KHOA NÔNG NGHIỆP & TÀI NGUYÊN THIÊN NHIÊN

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

BÁO CÁO NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CỐ ĐỊNH NẤM MEN

SACCHAROMYCES CEREVISIAE TRÊN VỎ BƯỞI VÀ

THỬ NGHIỆM LÊN MEN RƯỢU VANG BƯỞI

Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thị Mỹ Anh Cán bộ hướng dẫn: ThS Hồ Thị Ngân Hà

LẢNH ĐẠO ĐƠN VỊ CÁN BỘ HƯỚNG DẪN CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI THỰC HIỆN ĐỀ TÀI (ký tên) (ký tên)

(ký tên)

Đoàn Văn Hổ Hồ Thị Ngân Hà Nguyễn Thị Mỹ Anh

An Giang, Tháng 07 Năm 2013

i

Lời cảm ơn

Trong suốt quá trình thực hiện đề tài nhờ sự tận tình giúp đỡ của quý thầy cô và các bạn,

đề tài nghiên cứu đã hoàn thành Có được kết quả này, tôi xin gửi lời cảm ơn đến:

Cô Hồ Thị Ngân Hà, người đã trực tiếp hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực

hiện đề tài

Các thầy cô ở bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm, khoa Nông Nghiệp & Tài Nguyên Thiên Nhiên, Trường Đại Học An Giang đã cho tôi những kiến thức quý báu trong thời gian học tập tại trường

Cán bộ thư viện, cán bộ phòng thí nghiệm bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm, khoa Nông Nghiệp & Tài Nguyên Thiên Nhiên, Trường Đại Học An Giang, đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành tốt đề tài

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn đến các bạn sinh viên ngành Công Nghệ Thực Phẩm, khóa 10, khoa Nông Nghiệp & Tài Nguyên Thiên Nhiên, Trường Đại Học An Giang đã động viên và giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện đề tài tại phòng thí nghiệm

Tôi xin chân thành cám ơn!

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Mỹ Anh

Tóm lược

Cố định nấm men Saccharomyces cerevisiae trên vỏ bưởi là phương pháp nhằm giữ các tế

bào nấm men trên chất mang vỏ bưởi Khi lên men rượu vang bưởi bằng nấm men

Saccharomyces cerevisiae cố định trên vỏ bưởi sẽ giúp tăng hiệu suất tinh sạch sản phẩm

Bên cạnh đó, do nấm men cố định có thể được tái sử dụng nhiều lần nên sẽ góp phần làm giảm chi phí cho quá trình sản xuất Rượu vang bưởi thu được không qua chưng cất, có hương thơm tự nhiên của bưởi, độ cồn nhẹ và là loại rượu giàu chất dinh dưỡng

Để tìm ra các thông số thích hợp cho quá trình cố định nấm men Saccharomyces cerevisiae trên vỏ bưởi và thử nghiệm khả năng ứng dụng của nấm men cố định trên vỏ

bưởi trong lên men rượu vang bưởi, chúng tôi tiến hành khảo sát các thí nghiệm sau: Khảo sát ảnh hưởng của độ Brix (19oBx; 22oBx; 25oBx), pH (3,5; 4,0; 4,5) và tỷ lệ nấm

men Saccharomyces cerevisiae thuần (0,2%; 0,3%; 0,4%) trong quá trình nhân giống đến

khả năng sinh trưởng và phát triển của nấm men

Khảo sát ảnh hưởng của mật độ tế bào nấm men ban đầu (20.107tb/ml; 40.107tb/ml; 60.107tb/ml), lượng vỏ bưởi (10%; 15%; 20%) và chiều dày vỏ bưởi (0,5cm; 0,75cm; 1,0cm) đến hiệu suất cố định nấm men trên vỏ bưởi

Thử nghiệm lên men rượu vang bưởi bằng nấm men cố định, so sánh với rượu vang bưởi lên men bằng nấm men tự do về khả năng lên men và tính chất cảm quan

Sau thời gian nghiên cứu, chúng tôi thu được các kết quả như sau:

Với độ Brix ban đầu của dịch lên men là 22%, tỷ lệ nấm men bổ sung là 0,3%, kết hợp

với điều chỉnh pH bằng 4,0 thì quá trình nhân giống nấm men Saccharomyces cerevisiae

đạt mật độ cao nhất

Dịch bưởi sau khi nhân giống được pha loãng với mật độ tế bào đạt 40.107tb/ml, lượng vỏ bưởi bổ sung là 15% so với dịch nước bưởi, chiều dày vỏ bưởi là 0,75cm thì mật độ tế bào nấm men cố định trên vỏ bưởi là cao nhất

Có thể sử dụng nấm men cố định để thay thế nấm men tự do trong lên men rượu vang bưởi, khi sử dụng nấm cố định thì quá trình lên men diễn ra dài hơn (9 ngày so với 7 ngày), sản phẩm có độ cồn sinh ra cao hơn (11 độ so với 10 độ) và độ trong tốt hơn khi lên men bằng nấm men tự do, tuy nhiên ở mẫu sử dụng nấm men cố định, do vỏ bưởi chưa được xử lý để loại bỏ hết các thành phần gây đắng nên làm ảnh hưởng đến tính chất cảm quan của sản phẩm, cần nghiên cứu cải thiện

iii

Mục lục

Lời cảm ơn i

Tóm lược ii

Mục lục iii

Danh sách bảng vi

Danh sách hình viii

Chương 1 Giới thiệu 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1

1.3 Nội dung nghiên cứu 1

Chương 2 Lược khảo tài liệu 2

2.1 Giới thiệu về nguyên liệu 2

2.1.1 Bưởi 2

2.1.1.1 Giới thiệu 2

2.1.1.2 Thành phần hóa học 3

2.1.1.3 Công dụng của quả bưởi 5

2.1.2 Nấm men Saccharomyces cerevisiae 6

2.1.2.1 Hình dạng tế bào nấm men 6

2.1.2.2 Kích thước tế bào nấm men 6

2.1.2.3 Cấu tạo tế bào nấm men 6

2.1.2.4 Các hình thức hô hấp của nấm men 7

2.1.2.5 Thành phần hóa học và dinh dưỡng của nấm men 7

2.1.2.6 Cơ chế vận chuyển các chất dinh dưỡng vào trong tế bào nấm men 8

2.1.2.7 Sinh dưỡng của tế bào nấm men 8

2.1.2.8 Các hình thức sinh sản của nấm men 9

2.2 Cơ sở khoa học và các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men rượu 10

2.2.1 Cơ sở khoa học của quá trình lên men rượu 10

2.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến lên men rượu 10

2.3 Kỹ thuật cố định tế bào 11

2.3.1 Phương pháp cố định tế bào nấm men trên bề mặt chất mang 11

2.3.2 Phương pháp nhốt tế bào vào hệ gel 12

2.4 Các phụ gia (hóa chất) sử dụng trong nghiên cứu 13

2.4.1 Đường saccharose 13

2.4.2 Acid citric 13

2.3.3 Natri bisulfit (NaHSO3) 14

2.5 Các quá trình, nguyên lý chế biến và bảo quản có liên quan 14

2.5.1 Quá trình chần 14

2.5.2 Quá trình ép 14

2.5.3 Quá trình phối chế 15

2.6 Các nghiên cứu trước đây 16

Chương 3 Phương tiện và phương pháp nghiên cứu 16

3.1 Phương tiện nghiên cứu 16

3.1.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 16

3.1.2 Nguyên liệu 16

3.1.3 Hóa chất 16

3.1.4 Dụng cụ và thiết bị 16

3.2 Phương pháp nghiên cứu 16

3.2.1 Phương pháp thu thập và xử lý số liệu 16

3.2.2 Quy trình cố định nấm men Saccharomyces cerevisiae trên vỏ bưởi 17

3.2.3 Quy trình lên men rượu bưởi bằng nấm men cố định 19

3.2.4 Nội dung nghiên cứu 20

3.2.4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của độ Brix, pH và tỷ lệ nấm men Saccharomyces cerevisiae thuần đến quá trình nhân giống nấm men trong dịch bưởi 20

3.2.4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của mật độ tế bào nấm men ban đầu, tỷ lệ vỏ bưởi và chiều dày vỏ bưởi dùng cố định 21

3.2.4.3 Thí nghiệm 3: Thử nghiệm lên men rượu vang bưởi bằng nấm men cố định 22

3.4 Phương pháp phân tích 24

Chương 4 Kết quả và thảo luận 25

4.1 Thành phần của nguyên liệu 25

v

4.2 Ảnh hưởng của độ Brix, pH và tỷ lệ nấm men Saccharomyces cerevisiae thuần

đến quá trình nhân giống trong dịch bưởi 26

4.3 Ảnh hưởng của độ mật độ tế bào ban đầu, lượng vỏ bưởi và chiều dày vỏ bưởi đến quá trình cố định nấm men 30

4.4 Thử nghiệm lên men rượu vang bưởi bằng nấm men cố định 34

4.5 Thành phần sản phẩm 36

Chương 5 Kết luận và kiến nghị 37

5.1 Kết luận 37

5.2 Kiến nghị 39

Tài liệu tham khảo 40

Phụ chương pc_1 Phụ chương A pc_1 Phụ chương B pc_2 Phụ chương C pc_6 Phụ chương D pc_8

Danh sách bảng

Bảng 1: Thành phần hóa học của múi bưởi và vỏ bưởi 3

Bảng 2: Thành phần dinh dưỡng của nấm men ( % ) 7

Bảng 3: Các phương pháp phân tích 24

Bảng 4: Thành phần nguyên liệu dịch bưởi 25

Bảng 5: Sự thay đổi mật độ tế bào nấm men trong dịch bưởi theo thời gian nhân giống 26 Bảng 6: Giá trị mật độ tế bào nấm men cực đại ở các giá trị độ Brix, pH và tỷ lệ nấm men khác nhau 29

Bảng 7: Sự thay đổi mật độ tế bào nấm men cố định trên vỏ bưởi theo thời gian 30

Bảng 8: Giá trị mật độ tế bào nấm men cố định trên vỏ bưởi sau 3 giờ ở các giá trị mật độ tế bào nấm men ban đầu, lượng vỏ bưởi và chiều dày vỏ bưởi khác nha 33

Bảng 9: Sự thay đổi độ Brix theo thời gian lên men 34

Bảng 10: Kết quả phân tích độ cồn sản phẩm 35

Bảng 11: Điểm cảm quan của mẫu lên men bằng nấm men tự do và nấm men cố định 35

Bảng 12: Thành phần của sản phẩm 36 Bảng 13: Bảng tra tỷ lệ đường nghịch đảo pc_4 Bảng 14: Bảng điểm mô tả chỉ tiêu độ trong, màu sắc và mùi vị của sản phẩm rượu vang bưởi pc_6 Bảng 15: Bảng điểm mô tả mức độ ưa thích của sản phẩm rượu vang bưởi pc_7 Bảng 16: Bảng ANOVA biểu thị mật độ tế bào cực đại trong dịch bưởi khi nhân giống theo độ Brix, pH và tỷ lệ nấm men pc_8 Bảng 17: Sự khác biệt về mật độ tế bào cực đại trong dịch bưởi khi nhân giống giữa các mẫu pc_8 Bảng 18: Sự tương tác giữa độ brix, pH và tỷ lệ nấm men đến mật độ tế bào cực đại khi nhân giống pc_9 Bảng 19: Sự khác biệt về mật độ tế bào nấm men cực đại khi nhân giống theo độ Brix pc_9 Bảng 20: Sự khác biệt về mật độ tế bào nấm men cực đại khi nhân giống theo pH pc_9 Bảng 21: Sự khác biệt về mật độ tế bào nấm men cực đại khi nhân giống theo tỷ lệ nấm men pc_9 Bảng 22: Bảng ANOVA biểu thị mật độ tế bào cố định trên vỏ bưởi sau 3 giờ theo mật độ

tế bào ban đầu, lượng vỏ bưởi và chiều dày vỏ bưởi pc_9

vii

Bảng 23: Sự khác biệt về mật độ tế bào cố định trên vỏ bưởi sau 3 giờ giữa các mẫupc_10 Bảng 24: Sự tương tác giữa mật độ tế bào nấm men ban đầu, tỷ lệ vỏ bưởi và chiều dày vỏ bưởi đến mật độ tế bào nấm men cố định trên vỏ bưởi pc_10 Bảng 25: Sự khác biệt về mật độ tế bào nấm men cố định trên vỏ bưởi sau 3 giờ theo mật

độ tế bào ban đầu pc_11 Bảng 26: Sự khác biệt về mật độ tế bào nấm men cố định trên vỏ bưởi sau 3 giờ theo lượng vỏ bưởi bổ sung pc_11 Bảng 27: Sự khác biệt về mật độ tế bào nấm men cố định trên vỏ bưởi sau 3 giờ theo chiều dày vỏ bưởi pc_11 Bảng 28: Bảng ANOVA thể hiện điểm cảm quan về độ trong pc_11 Bảng 29: Sự khác biệt về điểm cảm quan độ trong pc_11 Bảng 30: Bảng ANOVA thể hiện điểm cảm quan về màu sắc pc_11 Bảng 31: Sự khác biệt về điểm cảm quan màu sắc pc_12 Bảng 32: Bảng ANOVA thể hiện điểm cảm quan về mùi vị pc_12 Bảng 33: Sự khác biệt về điểm cảm quan mùi vị pc_12 Bảng 34: Bảng ANOVA thể hiện điểm cảm quan về mức độ ưa thích pc_12 Bảng 35: Sự khác biệt về điểm cảm quan mức độ ưa thích pc_12

Danh sách hình

Hình 1: Bưởi Năm Roi 2

Hình 2: Cấu tạo một đơn vị của chuỗi pectin 5

Hình 3: Nấm men Saccharomyces cerevisiae 6

Hình 4: Chu kỳ sinh sản của nấm men Saccharomyces 9

Hình 5: Cấu tạo hóa học của acid citric 13

Hình 6: Quy trình cố định nấm men S cerevisiae trên vỏ bưởi dự kiến 17

Hình 7: Quy trình lên men rượu vang bưởi bằng nấm men Saccharomyces cerevisiae cố định trên vỏ bưởi dự kiến 19

Hình 8: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 1 20

Hình 9: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 2 22

Hình 10: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 3 23

Hình 11: Nguyên liệu Bưởi Năm Roi 25

Hình 12: Sự tăng trưởng của tế bào nấm men trong dịch bưởi theo thời gian nhân giống ở các giá trị độ Brix khác nhau 27

Hình 13: Sự tăng trưởng của tế bào nấm men trong dịch bưởi theo thời gianhân giống ở các giá trị pH khác nhau 27

Hình 14: Sự tăng trưởng của tế bào nấm men trong dịch bưởi theo thời gian nhân giống ở các tỷ lệ nấm men khác nhau 28

Hình 15: Sự thay đổi mật độ tế bào nấm men cố định trên vỏ bưởi theo thời gian cố định ở các giá trị mật độ tế bào ban đầu khác nhau 31

Hình 16: Sự thay đổi mật độ tế bào nấm men cố định trên vỏ bưởi theo thời gian cố định ở các tỷ lệ vỏ bưởi khác nhau 32

Hình 17: Sự thay đổi mật độ tế bào nấm men cố định trên vỏ bưởi theo thời gian cố định ở các chiều dày vỏ bưởi khác nhau 32

Hình 18: Quy trình cố định nấm men Saccharomyces cerevisiae trên vỏ bưởi đề nghị 38

Hình 19: Dịch bưởi đang lên men pc_1 Hình 20: Sản phẩm rượu vang bưởi pc_1 Hình 21: Cấu tạo buồng đếm tế bào vi sinh vật pc_2 Hình 22: Lưới đếm pc_2

Chương 1 Giới thiệu 1.1 Đặt vấn đề

Rượu vang là một loại thức uống lên men truyền thống có nguồn gốc từ phương Tây Hiện nay, các sản phẩm rượu vang đã trở nên phổ biến trên toàn thế giới vì những tác động có lợi đến sức khỏe của con người Khác với rượu trắng và các loại rượu pha chế, rựơu vang là loại thức uống lên men trực tiếp từ nước quả Khi quá trình lên men kết thúc, người ta không chưng cất mà để lắng trong tự nhiên, gạn lọc và hoàn thành sản phẩm Chính vì lẽ đó, trên thế giới có rất nhiều công trình nghiên cứu nhầm nâng cao hiệu quả kinh tế và chất lượng rượu vangvà một trong những phương pháp có triển vọng nhất hiện nay là sử dụng nấm men cố định Rượu vang vốn có nguồn gốc từ quả nho, nên có tên gọi là “Vin” hoặc “Wine”, ngày nay người ta mở rộng ý nghĩa của rượu vang là rượu không chưng cất từ các loại nước quả

Nấm men Saccharomyces cerevisiae là chủng nấm men được sử dụng phổ biến trong

quá trình lên men rượu vang.Trong quá trình sản xuất rượu vang, nấm men thường bị loại bỏ sau khi kết thúc quá trình lên men Nấm men sau khi loại bỏ không thể tái sử dụng gây lãng phí Hơn thế nữa, nấm men phân tán trong dung dịch, nên không thể lọc bỏ hết triệt để, trong quá trình bảo quản phần nấm men còn sót lại sẽ lắng xuống đáy gây ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm về chỉ tiêu cảm quan

Do đó, việc nghiên cứu đề tài cố định nấm men Saccharomyces cerevisiae trên vỏ bưởi

sẽ giúp giảm chi phí cho quá trình lên men do nấm men có thể tái sử dụng nhiều lần,

và tạo được sự ổn định về hoạt tính của nấm men cũng như nâng cao chất lượng sản phẩm rượu vang Bên cạnh đó, khi cố định nấm men trên vỏ bưởi còn tận dụng được phế liệu vỏ bưởi góp phần nâng cao hiệu quả kinh tế Mục tiêu của phương pháp này là

giữ các tế bào nấm men trên một chất mang, nhằm tăng hiệu suất thu hồi và giảm chi

phí tinh sạch Khi sử dụng nấm men cố định để lên men rượu vang sẽ hạn chế sự phân tán của nấm men trong dung dịch giúp quá trình lọc được tương đối triệt để nên ít làm ảnh hưởng đến giá trị cảm quan của sản phẩm khi bảo quản

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

- Tìm ra quy trình cố định nấm men trên vỏ bưởi

- Thử nghiệm khả năng ứng dụng của nấm men cố định trên vỏ bưởi trong lên men rượu vang bưởi

1.3 Nội dung nghiên cứu

- Khảo sát ảnh hưởng của độ Brix, pH và tỷ lệ nấm men Saccharomyces cerevisiae

thuần trong quá trình nhân giống đến khả năng sinh trưởng và phát triển của nấm men

- Khảo sát ảnh hưởng của mật độ tế bào nấm men ban đầu, lượng vỏ bưởi và chiều dày

vỏ bưởi đến hiệu suất cố định nấm men trên vỏ bưởi

- Thử nghiệm lên men rượu vang bưởi bằng nấm men cố định, so sánh với rượu vang bưởi lên men bằng nấm men tự do về khả năng lên men và tính chất cảm quan

Chương 2 Lược khảo tài liệu 2.1 Tổng quan về nguyên liệu

2.1.1 Bưởi

2.1.1.1 Giới thiệu

Theo tự điển Bách Khoa Nông Nghiệp (1991), bưởi là loại cây ăn quả thuộc họ cam

quýt (Rutaeae), có tên khoa học là Citrus Grandis (L.) Obseek Quả bưởi là loại có

kích thước lớn nhất trong số các loại quả citrus

Bưởi xuất hiện từ miền Đông Nam Châu Á, được du nhập vào Trung Quốc khoảng

100 năm trước công nguyên, từ đó bưởi được trồng nhiều ở Trung Quốc và các nước khác đặc biệt là ở miền Nam Thái Lan, Nhật Bản, Ấn Độ, Indonesia, Hungari,…

Theo Phạm Hoàng Hộ (2000), bưởi có hai loại: Citrus grandis Obseck var.grandis là bưởi ngọt thông thường như bưởi Năm Roi, Biên Hòa và Citrus grandis Obseck var.racemosa là bưởi đắng trồng tốt ở Đà Lạt và các nơi có khí hậu tương tự

Hình 1: Bưởi Năm Roi Hình 1: Bưởi nguyên liệu

Bưởi Năm Roi là giống bưởi đặc sản của tỉnh Vĩnh Long, được người tiêu dùng đánh giá cao và có giá trị kinh tế lớn Tổng diện tích bưởi Năm Roi là 9.200ha, phân bố chính ở Vĩnh Long (diện tích 4.500 ha, cho sản lượng 31.300 tấn, chiếm 48,06% về diện tích và 54,03% về sản lượng cả nước), tiếp theo là tỉnh Hậu Giang (1.300ha) và một số tỉnh miền Đông Nam Bộ

Theo Nguyễn Minh Châu (2009), cây bưởi Năm Roi 10 năm tuổi có chiều cao khoảng

7 - 8m Thời gian trồng từ tháng 4 đến tháng 1 năm sau, thời gian ra hoa thu hoạch quả khoảng 210 - 220 ngày Đặc điểm của bưởi Năm Roi là có hình quả lê, trọng lượng trung bình từ 1,0 - 1,4 kg, khi chín vỏ quả có màu vàng xanh, thịt quả màu vàng, mịn, đồng nhất Múi và vách múi dễ tách, ăn giòn, hơi ngọt Tỷ lệ ăn được trên 55%, độ Brix từ 9 - 12% Cây bưởi Năm Roi cho năng suất khá cao, khoảng 280-300 kg/cây/năm (cây trên 10 năm tuổi)

2.1.1.2 Thành phần hóa học

Bảng 1: Thành phần hóa học của múi bưởi và vỏ bưởi

“Nguồn: Trần Xuân Hiển, Trần Phương Lan, Nguyễn Duy Tân, 2002”

Nước bưởi chứa nhiều chất bổ dưỡng như các loại đường trái cây, đạm, béo, acid tannic, bêta-caroten và các chất khoáng như phospho, sắt, canxi, kali, magie Ngoài ra, trong nước bưởi còn chứa nhiều vitamin (B1, B2, C), trong đó hàm lượng vitamin C khá cao, gấp khoảng 10 lần so với quả lê, với 152g múi bưởi có thể cung cấp 130% nhu cầu vitamin C hàng ngày cho cơ thể

Pectin

- Cấu tạo, tính chất

Hình 2: Cấu tạo một đơn vị của chuỗi pectin

Pectin tồn tại ở hai dạng là protopectin không tan và pectin hòa tan Dưới tác dụng của acid hay enzyme pectinase hoặc khi đun sôi, protopectin chuyển thành pectin hòa tan

Do đó, thành phần pectin giữ vai trò quan trọng trong quá trình chín của quả Khi quả

còn xanh và đang phát triển, protopectin phân tán ở thành tế bào với tỉ lệ khá cao làm cho quả cứng Khi quả bắt đầu chín, protopectin chuyển dần sang dạng pectin hòa tan dưới tác dụng của acid hữu cơ và enzyme protopectinase trong quả, quả càng chín càng mềm, pectin hòa tan tăng cao, protopectin không hòa tan sẽ giảm dần Khi rau quả bị nấu chín, các thành phần protopectin không hòa tan trong nước sẽ bị thủy phân thành pectin hòa tan, kết quả là tạo độ mềm cho rau quả

Pectin là một polysaccharide mạch thẳng chứa từ 300 đến 1.000 đơn vị monosaccharide Acid D-galacturonic là monosaccharide chủ yếu của pectin Ngoài ra trong thành phần của pectin còn chứa một số loại đường trung tính Trọng lượng phân

tử của pectin trong khoảng từ 50.000 đến 150.000 daltons Nhóm methyl trong phân tử acid galacturonic của pectin có thể bị methyl hóa, dựa trên mức độ methyl hóa người

ta chia ra hai loại pectin: pectin có nhóm methyl trong phân tử acid galacturonic bị methyl hóa hơn 50% gọi là pectin có độ methyl hóa cao hay HMP (High Methoxyl Pectin), ngược lại pectin có độ methyl hóa ở phân tử acid galacturonic nhỏ hơn 50% gọi là pectin có độ methyl hóa thấp hay LMP (Low Methoxyl Pectin) Pectin có độ methyl hóa thấp (< 50% độ ester hóa) có thể tạo gel thuận nghịchở pH (3,0 - 4,5) khi

có sự hiện diện của ion canxi, trái lại pectin có độ methyl hóa cao có thể tạo gel nhanh

ở nồng độ đường khoảng 65% (đường sucrose) ở pH thấp (< 3,5) và không cần sự hiện diện của ion canxi nhưng quá trình tạo gel không thuận nghịch Pectin có độ methyl hóa thấp sẽ tạo gel chậm hơn pectin có độ methyl hóa cao hơn

Pectin là một loại chất xơ, tan trong nước, làm tăng độ nhớt, không tan trong ethanol, pectin có trong nhiều loại quả, song ở cùi và vỏ hạt bưởi có tỷ lệ cao và dễ chiết xuất nhất

Pectin là ester của acid pectic Dưới tác dụng của enzyme pectinase, pectin bị thủy phân đến các thành phần đơn giản hơn là đường và acid tetragalacturonic Pectin hòa tan dưới tác dụng của enzyme pectinase hay kiềm loãng sẽ giải phóng nhóm methyl tạo rượu methylic và acid pectic tự do Acid pectic phản ứng với ion canxi tạo pectat canxi Acid pectic tự do không có khả năng tạo gel kể cả khi có đường

(Trần Xuân Hiển, 2010)

- Tác dụng

+ Kéo dài thời gian tiêu hóa thức ăn trong ruột, tăng hấp thu dưỡng chất

+ Giảm béo (do tạo cảm giác no bụng kéo dài)

+ Giảm hấp thu lipid, giảm cholesterol toàn phần trong máu

+ Khống chế tăng đường huyết ở người có bệnh tiểu đường

+ Chống táo bón, cầm máu và sát trùng

Cellulose

Cellulose thuộc loại polysacharide cao phân tử không có tính chất đường, là thành phần chính của tế bào thực vật Cellulose tham gia chủ yếu trong cấu tạo màng, thành

tế bào thực vật làm cho các mô thực vật có tính bền cơ học, tính đàn hồi và tạo thành

bộ xương cho tất cả các loại cây Cellulose được hình thành trong cây nhờ quá trình quang hợp

- Cấu tạo, tính chất, vai trò

Cellulose có công thức chung giống tinh bột (C6H10O5)n Trong phân tử cellulose, glucose là đơn vị cơ bản cấu thành và chúng liên kết với nhau bằng liên kết 1,4-glucoside Mỗi phân tử cellulose chứa 1.400 - 15.000 gốc D-glucose (M = 2,5.104

- 5.104)

Trong phân tử cellulose có nhiều gốc -OH ở dạng tự do, nhưng cũng có vài nhóm -OH

mà hydro của nó được thay thế bằng một số gốc hóa học như gốc methyl (-CH3), acethyl (CH3CO-) hình thành nên dẫn xuất ete hay ester của cellulose hay gốc có nitơ tạo dẫn xuất nitơ

Cellulose trong tự nhiên tồn tại dưới dạng sợi và không hoàn toàn nguyên chất Nó thường liên kết chặt chẽ với các thành phần khác như chất béo, hemicellulose, pentozan, các chất nhựa và các muối vô cơ,…

Cellulose không tan trong nước, không tan trong các dung môi hữu cơ như ete, rượu Trong điều kiện thường nó cũng khá bền đối với các dung dịch kiềm loãng, acid loãng

và các chất oxi hóa yếu Con người không thể tiêu hóa được cellulose trong khẩu phần

vì không có các enzyme cần thiết để phân hủy chúng Tuy nhiên, một số loại vi khuẩn

có khả năng phân hủy cellulose thành CO2 và H2O

(Trần Xuân Hiển, 2010)

- Tác dụng

Trong dinh dưỡng, cellulose có ý nghĩa rất quan trọng trong việc phòng ngừa ung thư ruột kết - cellulose giữ vai trò nhất định trong điều hòa hệ vi khuẩn có ích ở ruột và tạo điều kiện tốt nhất cho chức phận tổng hợp của chúng Cellulose có tác dụng kích thích nhu động ruột, vì thế chúng điều hoà bài tiết

Gần đây nhiều nghiên cứu cho thấy cellulose tạo điều kiện bài tiết cholesterol ra khỏi

cơ thể, vì vậy cellulose có vai trò nhất định trong phòng ngừa xơ vữa động mạch Cellulose phòng ngừa hình thành sỏi mật, giảm được hàm lượng mỡ trong máu Cellulose còn tác động đến mức đường huyết, giảm bớt tác dụng dựa vào insulin của bệnh nhân tiểu đường, ngăn ngừa sự thừa dinh dưỡng và béo phì

Các thành phần gây đắng trong vỏ bưởi (naringin và hisperdin)

Nhiều nghiên cứu cho thấy naringin và hisperdin là hai chất chủ yếu gây ra vị đắng trong vỏ bưởi Trong màng bao của múi bưởi và gân bưởi có chứa hợp chất narinhin (C27H32O14) Khi chín thì chất narinhin trong thịt quả dưới tác dụng của enzyme peroxidase bị thủy phân thành đường (glucose và ramnose) và narinhinen không có vị đắng (Nguyễn Văn Tiếp và ctv, 2000)

2.1.1.3 Công dụng của quả bưởi

Quả bưởi có nhiều hoạt chất sinh học quý và là một vị thuốc chữa được nhiều chứng

bệnh

Múi bưởi: Có vị ngọt, chua, tính mát, không độc, có tác dụng trị ho, trị đau đầu, giải

rượu, nước bưởi có chứa thành phần gần giống như insulin, giúp hạ đường huyết, tốt với bệnh nhân tiểu đường, cao huyết áp, ăn bưởi thường xuyên giúp giảm cân

Cùi bưởi: Vị ngọt đắng, tính ấm, tác động vào tỳ, thận và bàng quang, công dụng hóa

đàm, tiêu thực, hạ khí và làm khoan khoái lồng ngực, trị các bệnh như viêm loét ngoài

da, phụ nữ mang thai nôn nhiều, sán khí, chứng ho hen ở người già, chậm tiêu,…

(Việt Linh, 2004)

2.1.2 Nấm men Saccharomyces cerevisiae

Giống Saccharomyces quan trọng nhất là loài Saccharomyces cerevisiae, được dùng

nhiều trong công nghiệp thực phẩm Một số chủng nấm men dùng trong công nghiệp sản xuất bánh mì, một số khác dùng trong công nghiệp rượu, bia, sản xuất glycerol hoặc enzyme invertase

2.1.2.1 Hình dạng tế bào nấm men

Nấm men có nhiều hình dạng khác nhau, thường chúng có hình cầu, hình elip, hình bầu dục và cả hình dài Hình dạng tế bào nấm men hình như không ổn định, nó phụ thuộc vào tuổi của nấm men và phụ thuộc vào điều kiện nuôi cấy

Hình 3: Nấm men Saccharomyces cerevisiae

(Bùi Thị Quỳnh Hoa, 2001)

2.1.2.2 Kích thước tế bào nấm men

Tế bào nấm men thường có kích thước rất lớn, gấp 5 - 10 lần kích thước tế bào vi khuẩn

Kích thước trung bình của tế bào nấm men: dài 8 - 10 m, rộng 2 - 7 m Kích thước này cũng thay đổi, sự không đồng đều thấy ở các loài khác nhau, ở lứa tuổi khác nhau

và ở điều kiện nuôi cấy khác nhau

(Bùi Thị Quỳnh Hoa, 2001)

2.1.2.3 Cấu tạo tế bào nấm men

Tế bào nấm men cũng như nhiều loại tế bào khác được cấu tạo chủ yếu từ các phần cơ bản sau:

- Thành tế bào: Thành tế bào nấm men được cấu tạo từ nhiều thành phần khác nhau Trong đó đáng kể nhất là: glucan, manan, protein, lipid và một số thành phần nhỏ khác như kitin

- Màng nguyên sinh chất: Gồm các hợp chất phức tạp như protein, phospholipid, enzyme permase

- Nhân: Tế bào nấm men có nhân thật, nhân có hình bầu dục hay hình cầu,chứa protein

và acid nucleic

Những thành phần khác như: Không bào, volutin, ty lạp thể, ribosom

(Bùi Thị Quỳnh Hoa, 2001)

2.1.2.4 Các hình thức hô hấp của nấm men

Ở nấm men, hô hấp là quá trình khá phức tạp, nó xảy ra theo hai chiều hướng khác nhau Vì thế, người ta phân ra thành hai loại hô hấp: hiếu khí và yếm khí

- Giống nhau:

+ Cả hai dạng hô hấp đều sinh ra năng lượng, năng lượng này dùng để cung cấp cho

cơ thể sống hoạt động và một phần thải ra bên ngoài

+ Sản phẩm trung gian ban đầu đều giống nhau, nghĩa là tạo ra acid pyruvic

+ Quá trình chuyển hóa của hai kiểu hô hấp đều có sự tham gia của những hệ enzyme oxy hóa gần giống nhau

2.1.2.5 Thành phần hóa học và dinh dưỡng của nấm men

Thành phần hóa học và dinh dưỡng của nấm men phụ thuộc vào chủng giống, môi trường, trạng thái sinh lý cũng như điều kiện nuôi cấy Men ép chứa 75% nước và 25% chất khô Các chất khô của nấm men bao gồm các thành phần sau:

Bảng 2: Thành phần dinh dưỡng của nấm men (%)

- Protein chứa trong nấm men rượu thường có đủ các acid amin không thay thế được

Về giá trị dinh dưỡng thì protein nấm men tương đương protein động vật nhưng giá trị hơn protein thực vật Ở nhiệt độ cao và bình thường, dưới tác dụng của protease có sẵn trong nấm men, protein sẽ biến thành pepton, peptid và acid amin

- Gluxit của nấm men chủ yếu là glycogen (C6H10O5)n, đây là chất dự trữ của tế bào, theo thành phần cấu tạo thì glycogen giống như amylopectin nhưng khác là khối lượng phân tử lớn hơn Hàm lượng của nó trong tế bào nấm men tùy thuộc trước hết vào môi trường dinh dưỡng Trong môi trường dư đường, lượng glycogen tăng đáng kể Trong

giai đoạn đầu lên men, nồng độ đường còn cao nên nấm men chứa nhiều glycogen Khi lượng đường giảm, nấm men sẽ sử dụng glycogen để duy trì sự sống Dưới tác dụng của α-amylase, glycogen sẽ biến thành maltose và dextrin

- Chất béo là thức ăn dự trữ của nấm men và chứa chủ yếu trong nguyên sinh chất Trong nấm men còn chứa các chất tương tự chất béo như leucithin

2.1.2.6 Cơ chế vận chuyển các chất dinh dưỡng vào trong tế bào nấm men

Nấm men hoàn toàn không có cơ quan dinh dưỡng riêng biệt, các chất dinh dưỡng mà chúng sử dụng chủ yếu được vận chuyển qua thành tế bào theo hai con đường cơ bản sau:

- Con đường thứ nhất là thẩm thấu bị động: Trên thành tế bào nấm men có những lỗ nhỏ, những lỗ này có tác dụng làm cho các chất dinh dưỡng vận chuyển vào trong tế bào từ môi trường bên ngoài nhờ áp suất thẩm thấu Ngược lại, chất thải trong quá trình trao đổi chất cũng được thải qua những lỗ này

- Con đường thứ hai là hấp thu thức ăn một cách chủ động: Các thành phần dinh dưỡng không có khả năng xâm nhập vào tế bào thì lập tức có hệ permease hoạt hóa Permease là một protein hoạt động, chất này sẽ liên kết với chất dinh dưỡng hình thành hợp chất và hợp chất này chui qua thành tế bào vào trong, tại đây chúng tách ra

và permease lại tiếp tục làm công việc vận chuyển

(Bùi Thị Quỳnh Hoa, 2001)

2.1.2.7 Sinh dưỡng của tế bào nấm men

Nấm men tiếp nhận thức ăn bằng con đường hấp thu chọn lọc trên bề mặt của tế bào

và sau đó khuếch tán vào bên trong Màng và lớp bao bọc nguyên sinh chất của tế bào trong trường hợp này đóng vai trò là lớp màng bán thấm ngăn cách, điều khiển các chất dinh dưỡng vào tế bào và thải ra môi trường xung quanh những sản phẩm của hoạt động sống Để cho tế bào dễ hấp thụ, các chất dinh dưỡng phải là những chất có phân tử lượng thấp và hòa tan vào trong nước, một phần các chất dinh dưỡng chuyển hóa thành các hợp chất cao phân tử như: protein, glucid, lipid,… trong tế bào và xây dựng thành tế bào mới

Nấm men cũng giống như các cơ thể thực vật khác cần các nhu cầu dinh dưỡng như: oxy, carbon, nitơ, kali, magie

- Oxy, hydro, cacbon: Oxy, hydro cung cấp cho tế bào nấm men từ môi trường Nguồn cung cấp carbon là các loại đường khác nhau Ở những giai đoạn nhất định, nấm men còn sử dụng nguồn carbon của acid amin

- Nitơ: Nấm men không có enzyme ngoại phân giải protein, cho nên không thể phân tách albumin của môi trường thành chất có khả năng hấp thụ và phải cung cấp ở dạng hòa tan, có thể là dạng vô cơ hoặc hữu cơ Dạng hữu cơ thường được sử dụng là acid amin, pepton amid, ure Dạng vô cơ là các muối amon khử nitrat, sulfat

- Các vitamin: Để đảm bảo cho sự sống, nấm men cần các vitamin như B1 có trong thành phần của coenzyme cacboxylase, B2 ở dạng ester phosphoric, acid nicotic có trong cozymase,… Biotin và acid paraamino benzoic là những chất kích thích cho sinh trưởng của nấm men (Nguyễn Đình Thưởng, 2000)

- Chất khoáng: Chất khoáng có ảnh hưởng to lớn đến hoạt động sống của tế bào nấm men Trước hết là phospho, có trong thành phần của nucleoprotein polyphosphate của

nhiều enzyme và của sản phẩm trung gian của quá trình lên men rượu Chúng tạo thành mối liên kết có năng lượng hơn Lưu huỳnh tham gia vào thành phần của một số acid amin, albumin, sinh tố và một số nguyên tố vi lượng như magie, sắt có ảnh hưởng đến quá trình sinh lý, sinh hóa của nấm men Magie tham gia vào nhiều phản ứng trung gian của sự lên men Sắt tham gia vào thành phần enzyme của sự hô hấp và các quá trình khác Nấm men cần nhiều kali, nó thúc đẩy sự phát triển của nấm men tham gia vào sự lên men rượu, tạo điều kiện hồi phục phosphoric hóa của acid pyruvic Mangan đóng vai trò tương tự magie

2.1.2.8 Các hình thức sinh sản của nấm men

Khi nghiên cứu đặc tính di truyền của nấm men tại Đan Mạch (1935), ông Carlsberg phát hiện, các loài thuộc giống Saccharomyces có thể biến đổi giữa hai dạng đơn bội

và nhị bội

Tế bào nấm men có hai giới tính α và a Các tế bào đơn bội sinh ra α và a được hình thành qua nguyên phân bằng cách nẩy chồi Chúng kết hợp với nhau thành bào tử luỡng bội aα Khi gặp điều kiện dinh dưỡng kém, chúng giảm phân tạo nang chứa 4 bào tử: 2α và 2a Sau đó, tế bào sinh sản theo kiểu vô tính hoặc hữu tính

Hình 4: Chu kỳ sinh sản của nấm men Saccharomyces

(1): Quá trình sinh sản vô tính (nẩy chồi) (2): Quá trình sinh sản hữu tính (giao hợp) (3): Quá trình tạo nang chứa 4 bào tử Quá trình sinh sản của nấm men liên quan chặt chẽ đến sự nẩy chồi Chồi tách khỏi tế bào mẹ khi có kích thước bằng tế bào mẹ và bắt đầu sinh sản Thời gian thế hệ là chu

kỳ sinh sản được tính là khoảng thời gian giữa hai lần phân chia Thời gian thế hệ của

nấm men Saccharomyces cerevisiae là 2 giờ Quá trình nẩy chồi diễn ra đồng thời với

sự bắt đầu tổng hợp ADN Quá trình này liên quan đến hiện tượng làm mềm vỏ tế bào bằng enzyme lytic, enzyme này tác dụng lên polysaccaride của thành vỏ tế bào Từ chồi mới hình thành các vật liệu mới của tế bào lớn dần lên, hình thành vách ngăn chitin, mannan, glucan Chồi tách ra và để lại sẹo

(Lương Đức phẩm, 2006)

2.2 Cơ sở khoa học và các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men rượu

2.2.1 Cơ sở khoa học của quá trình lên men rượu

Lên men là một quá trình trao đổi chất dưới tác dụng của các enzyme tương ứng gọi là chất xúc tác sinh học Tùy theo sản phẩm tích tụ sau quá trình lên men mà người ta chia làm nhiều kiểu lên men khác nhau Tuy nhiên có hai hình thức lên men chính là lên men yếm khí (kị khí) và lên men hiếu khí

Lên men rượu là quá trình lên men yếm khí với sự có mặt của nấm men, chúng sẽ chuyển hóa đường thành ethanol và CO2

Quá trình lên men rượu được chia làm hai thời kỳ chính:

- Thời kỳ phát triển sinh khối: giai đoạn này với sự có mặt của oxy, tế bào nấm men phát triển sinh khối

- Thời kỳ lên men chuyển đường thành rượu và CO2: giai đoạn này nấm men hấp thụ các chất dinh dưỡng và sử dụng các enzyme sẵn có của mình thực hiện xúc tác sinh học trong quá trình trao đổi chất để duy trì sự sống, tạo thành rượu và CO2

2.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men rượu

2.2.2.1 Oxy

Hầu hết các chủng nấm men trong lên men rượu vang thuộc giống Saccharomyces

Chúng là nhóm vi sinh vật kị khí tùy tiện Khi trong môi trường có đủ lượng oxy, nấm men phân hủy đường để dùng làm nguồn năng lượng và tham gia cấu tạo tế bào tăng

sinh khối

Trường hợp thiếu oxy (kị khí), nấm men sử dụng phần oxy hòa tan trong môi trường

để sinh trưởng và chủ yếu là lên men

Trong quá trình lên men giai đoạn đầu, yêu cầu oxy cao nhất để nấm men sinh sản, phát triển tăng sinh khối Nếu có giai đoạn nhân giống thì cũng cần phải cung cấp oxy bằng cách lắc hoặc sục khí

C Nhiệt độ lên men cao, thời gian của quá trình lên men ngắn, độ cồn có thể thấp, đường sót còn nhiều và hương vị của sản phẩm có khi không tốt

2.2.2.3 Hàm lượng đường

Đường là nguồn dinh dưỡng quan trọng, ảnh hưởng trực tiếp đến hoạt động của nấm men và quá trình lên men Đường cung cấp năng lượng và carbon cho nấm men hoạt động, dạng glucose là thích hợp nhất vì tất cả các loài men đều đồng hóa được Tỉ lệ đường càng cao thì tạo thành nhiều ethanol, cho nên thêm đường vào nước quả là một biện pháp rất phổ biến

Môi trường có nồng độ đường từ 10 - 25% thuận lợi cho sự lên men Khi nồng độ đường từ 25% trở lên thì sự lên men khó khăn và chậm Dung dịch đường có nồng độ rất cao sẽ tạo ra áp suất thẩm thấu lớn gây phá hủy trạng thái sinh lý bình thường của nấm men, thời gian lên men sẽ kéo dài, sử dụng đường không triệt để, hiệu suất tạo thành rượu giảm, lượng rượu tạo ra không nhiều Ngược lại, môi trường lên men có nồng độ đường quá thấp sẽ không đủ cơ chất cho nấm men họat động

2.2.2.4 pH của môi trường

Trong thực tế, khi lên men những dịch quả chua thường được rượu vang ngon Đối với dịch quả thường có độ pH từ 2,8 - 3,8 Khoảng pH này nấm men vẫn hoạt động được Vùng pH tối thích của nấm men là 4 - 6

Trong sản xuất rượu vang người ta thường chuẩn bị môi trường nước quả có độ pH bằng 3,0 - 3,5

2.2.2.6 Ảnh hưởng của ethanol

Sản phẩm của quá trình lên men kị khí là ethanol Ethanol kìm hãm hoạt động sống của tế bào nấm men, tuy nhiên mức độ kìm hãm khác nhau đối với các chủng, nòi nấm

men khác nhau Ví dụ, đối với S.ellipsoideus có thể chịu đựng được 18%V ethanol nhưng đối với Kl.apiculata chỉ chịu đựng được từ 4 - 6%V ethanol Khả năng chịu

đựng ethanol của nấm mốc, vi khuẩn kém hơn nhiều so với nấm men Điều này thực

sự có ý nghĩa lớn trong sản xuất, bởi vì khi quá trình lên men kị khí bắt đầu xảy ra thì những sản phẩm ethanol hình thành trong môi trường có tác dụng kìm hãm mạnh mẽ nấm mốc, vi khuẩn (luôn có đi kèm trong dịch nho) và sau đó là ức chế những nấm

men dại đi lẫn với S.ellipsoideus, để rồi phải nhường môi trường cho nấm men vang

hoạt động

(Lê Ngọc Tú và ctv, 2002)

2.3 Kỹ thuật cố định tế bào

2.3.1 Phương pháp cố định tế bào trên bề mặt chất mang

Phương pháp gắn tế bào lên bề mặt chất mang

- Vật liệu: Thủy tinh xốp, cellulose, than, các oxide kim loại, cao lanh,…

- Nguyên tắc thực hiện: Thông qua các liên kết cộng hóa trị, liên kết tĩnh điện, lực Vandewalls Các phương pháp gắn này cụ thể dựa trên những nguyên tắc sau:

+ Gắn tế bào bằng liên kết ion: dựa vào sự tích điện trái dấu giữa tế bào và chất mang + Gắn tế bào bằng liên kết cộng hóa trị: có thể xảy ra hai trường hợp:

* Trường hợp 1: Chất mang có chứa các nhóm có thể tham gia trực tiếp với nhóm amin của protein vi sinh vật

* Trường hợp 2: Phải hoạt hóa chất mang bằng cách gắn lên chất mang những chất có khả năng phản ứng Tiếp theo đó, là tạo liên kết giữa các nhóm trên chất mang với tế bào vi sinhvật

- Ưu và nhược điểm: Phương pháp này có thể tạo được những liên kết hóa học mạnh giữa tế bào và chất mang Tuy nhiên, để tạo ra các mối nối đồng hóa trị này thường tốn công và đắc tiền

+ Thứ ba, khi chất mang tích điện (nhựa trao đổi ion), chúng sẽ tạo liên kết ion

- Phương pháp thực hiện: tế bào vi sinh vật được phối trộn với chất mang trong môi trường lỏng, khuấy trộn trong điều kiện thích hợp, sau đó rửa bã để loại bỏ phần tế bào

vi sinh vật dư

- Ưu và nhược điểm: Phương pháp này dễ thực hiện, đơn giản Tuy nhiên, liên kết vật

lý rất yếu nên vi sinh vật dễ tuột khỏi chất mang

2.3.2 Phương pháp nhốt tế bào vào hệ gel

- Vật liệu: Có thể sử dụng các loại sau:

+ Ion gel: các polymer mà tế bào gắn kết với nhau tạo thành mạng lưới bằng liên kết ion

+ Covalent gel: polymer gắn với nhau bằng liên kết cộng hóa trị, tạo thành mạng lưới + Non-covalent gel: polymer gắn với nhau thường bằng liên kết hydro

+ Cryogel: là cấu trúc gel polymer mới được tạo bởi phương pháp lạnh đông các tiểu phần polymer có phân tử lượng cao hay thấp

+ Aginate là vật liệu lấy từ rong biển, có khả năng tạo gel tốt, rất tốt để bao gói enzyme hay tế bào

- Nguyên tắc thực hiện: Trong hệ gel, các polymer sẽ tạo thành mạng lưới bao bọc tế bào Mạng lưới có lỗ nhỏ đến mức tế bào không thể ra ngoài, nhưng đủ lớn để cơ chất

+ Đối với gel aginate: Đầu tiên gel alginate được đun sôi và để nguội đến 30oC Sau

đó, khuấy trộn alginate và huyền phù tế bào với tỷ lệ 1:1, khuấy nhẹ 30 vòng / phút, trong 5 - 10 phút Tạo hình, cố định trong dung dịch CaCl2 Tiếp theo, rửa nước vô trùng Cuối cùng bảo quản lạnh

- Ưu & nhược điểm: Phương pháp này có hiệu suất cao, tế bào ít bị rửa trôi Tuy nhiên, vì nằm trong khuôn gel nên không chịu được khuấy trộn Các tế bào trong khuôn gel phân bố không đồng đều, các tế bào nằm trên bề mặt sẽ tham gia lên men Đồng thời sản phẩm trao đổi chất làm trương nở hạt gel, gây bể vỡ

2.4 Các phụ gia (hóa chất) sử dụng trong nghiên cứu

2.4.1 Đường saccharose

2.4.1.1 Cấu tạo và tính chất

Saccharose có công thức cấu tạo là C12H22O11,ở dạng tinh thể trắng, được cấu tạo từ hai phân tử đường đơn là glucose và fructose Saccharose rất phổ biến trong giới thực vật, đặc biệt chiếm tỉ lệ cao trong cây mía (14 - 20%), trong củ cải đường (16 - 20%) Saccharose dễ tan trong nước, kết tinh từ dung dịch nước sẽ cho những tinh thể lớn Nồng độ saccharose trong dung dịch nước có thể xác định bằng phân cực kế hay đường kế

Saccharose dễ bị thủy phân trong môi trường acid hay ngay cả với acid yếu nhất như

H2O + CO2 tạo thành D-glucose và D-fructose Hiện tượng này gọi là sự nghịch đảo đường Saccharose cũng dễ bị thủy phân dưới tác dụng của enzyme saccharase

2.3.1.2 Tác dụng của đường

- Tạo vị ngọt cho sản phẩm, làm tăng giá trị cảm quan của sản phẩm

- Kìm hãm sự phát triển của một số loại vi sinh vật có hại

- Cung cấp cơ chất cho nấm men lên men rượu

(Trần Xuân Hiển, 2010)

2.4.2 Acid citric (E330)

- Nguồn gốc: tồn tại trong rau quả, trái cây nhưng nhiều nhất trong các loại trái cây thuộc họ cam, quít Trong công nghiệp, acid citric được sản xuất từ rỉ đường bằng phương pháp lên men acid citric

- Cấu tạo hóa học:

Hình 5: Cấu tạo hóa học của acid citric

- Đặc tính: Acid citric là một acid hữu cơ yếu, không màu hay màu vàng, không mùi,

vị chua, dễ bị thủy phân bởi nhiệt độ, hòa tan tốt trong nước và ethanol

(Trần Xuân Hiển, 2010)

2.4.3 Natri bisulfit (NaHSO 3 )

Natri bisufit là một hợp chất hóa học với công thức là NaHSO3, nó là một chất phụ gia với chỉ số E222

Theo Lương Đức Phẩm (2006), lượng SO2 cho phép trong dịch quả là từ 30 - 120 mg/l

có tác dụng chống oxy hóa, diệt tạp khuẩn, men dại, khi lên men tạo điều kiện cho nấm men sinh ra một ít glycerin làm hoàn thiện vị cho rượu vang

- Thủy phân protopectin thành pectin, giúp các quá trình xử lý sau đó được dễ dàng hơn

- Làm thay đổi thể tích, khối lượng nguyên liệu để các quá trình chế biến sau thuận lợi

- Loại trừ các chất không thích hợp như các chất gây ra vị đắng và các chất có vị không thích hợp

- Tăng độ thẩm thấu của chất nguyên sinh, làm cho dịch bào thoát ra dễ dàng, hoặc dung dịch dễ ngấm vào tế bào

- Tiêu diệt các vi sinh vật bám bên ngoài nguyên liệu

(Đào Văn Thanh, 2005)

2.5.2 Quá trình ép

Tác dụng của quá trình ép là phân chia pha lỏng rắn trong vật liệu (tách chất lỏng đã được giải phóng ra khỏi tế bào còn nằm trong vật liệu ra ngoài) Chất lỏng là sản phẩm cần thu

Dịch ép là một hệ keo phức tạp gồm thành phần chủ yếu là một số chất hòa tan kể cả một ít chất không tan Yêu cầu dung dịch có độ tinh khiết cao Độ tinh khiết là tỉ lệ giữa hàm lượng chất tan chủ yếu và tổng các chất tan trong dung dịch được tính bằng

% chất rắn thu được là sản phẩm đặc còn ít nước

Quá trình ép là một quá trình cơ học, chủ yếu là biến đổi về vật lý như biến đổi về cấu trúc, trạng thái liên kết, tỉ lệ hai pha lỏng - rắn, hoặc lỏng - đặc, sự giảm độ xốp, tăng

sự kết dính giữa các phân tử

Không có sự thay đổi đáng kể về hóa học, sinh hóa, tuy nhiên có thể có sự tổn thất vitamin, các hoạt chất được giải phóng ra khỏi tế bào, các enzyme cũng có khả năng giải phóng ra khỏi tế bào, có khả năng oxy hóa mạnh hơn, khả năng bảo quản lâu dài

và tốt hơn do không còn có độ hỏng không khí, khi bảo quản ít bị biến đổi

(Đào Văn Thanh, 2005)

2.5.3 Quá trình phối chế

Nhằm điều chỉnh độ Brix và pH đến mức thích hợp để nấm men có thể phát triển tốt trong dung dịch

2.6 Các nghiên cứu trước đây

- Đỗ Dương Phương Thảo (2005) khi “nghiên cứu chế biến sản phẩm vỏ bưởi tẩm đường” đã rút ra kết luận: Đối với công đoạn xử lý the và đắng, vỏ bưởi được chần trong thời gian 5 phút, xả 2 lần sẽ có vị the và đắng thấp nhất (tỷ lệ nước chần : vỏ bưởi là 3:1, nhiệt độ chần 95 - 100oC, tỷ lệ nước xả : vỏ bưởi là 4:1)

- Nguyễn Thị Huyền Trang (2011) khi “nghiên cứu chế biến rượu vang bưởi” đã rút ra kết luận:

+ Với lượng đường ban đầu của dịch lên men là 22o

brix, tỷ lệ nấm men bổ sung là 0,3%, kết hợp với điều chỉnh pH bằng 4,0 thì sản phẩm lên men tốt nhất, độ cồn sinh

- Phan Ngọc Mỹ Hòa (2010) khi “nghiên cứu cố định nấm men Saccharomyces cerevisiae trên bã mía để sản xuất rượu dâu tằm” đã rút ra kết luận:

+ Mật độ nấm men của dung dịch là 15.107để cố định đem lại kết quả tốt

+ Chiều dài bã mía dùng để cố định là 2 cm

- Nguyễn Minh Dũng (2009) khi “ khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố pH và SO2 đến động học quá trình lên men chính rượu vang nho sử dụng nấm men cố định trên chất mang Bacterial cellulose” đã rút ra kết luận:

+ Mật độ tế bào nấm men sử dụng để lên men rượu vang nho là 5.106 tb/ml

+ Thời gian lên men sản phẩm rượu vang nho là 14 ngày đem lại kết quả tốt

Chương 3 Phương tiện và phương pháp nghiên cứu

3.1 Phương tiện nghiên cứu

3.1.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm Bộ Môn Công Nghệ Thực Phẩm, Khoa Nông Nghiệp & TNTN, Trường Đại Học An Giang

Thời gian nghiên cứu: tháng 12/2012 đến tháng 6/2013

3.1.2 Nguyên liệu

- Bưởi Năm Roi được mua tại chợ Long Xuyên

- Đường saccharose tinh luyện (RE) được mua tại chợ Long Xuyên

- Nấm men Saccharomyces cerevisiae

3.1.3 Hóa chất

- Acid citric

- Na2CO3

- Natri bisulfit (NaHSO3)

Và các hóa chất khác dùng để phân tích đường, acid tổng, vitamin C

- Cân điện tử, cân phân tích

- Kính hiển vi và buồng đếm nấm men

Và một số dụng cụ thông thường khác

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Phương pháp thu thập và xử lý số liệu

Các thí nghiệm được tiến hành với ba lần lặp lại Khi khảo sát công đoạn đầu, cố định các thông số kỹ thuật của công đoạn sau dựa trên số liệu tham khảo Chọn các thông

số kỹ thuật tối ưu của thí nghiệm trước sử dụng cho các thí nghiệm ở công đoạn sau Các số liệu thu thập sẽ được vẽ đồ thị bằng chương trình Microsoft Excel và xử lý thống kê bằng phương pháp phân tích ANOVA sử dụng phần mềm Portable Statgraphics Centurion 15.2.11.0 với sự kiểm tra mức độ ý nghĩa của các nghiệm thức qua LSD ở độ tin cậy 95%(P = 0,05)

3.2.2 Quy trình cố định nấm men Saccharomyces cerevisiae trên vỏ bưởi

Hình 6: Quy trình cố định nấm men S cerevisiae trên vỏ bưởi dự kiến

Rửa

Tách vỏ

Rửa chất mang

Phối trộn - Cố định

Nước vô khuẩn

Pha loãng Dịch bưởi Tiệt trùng (121oC, 20 phút)

Ép Gọt vỏ xanh, cắt nhỏ

Nấm men cố định trên vỏ bưởi

bbuobưởi

Thuyết minh quy trình:

- Nguyên liệu bưởi: Chọn loại bưởi Năm Roi tươi tốt, không bầm dập, sâu thối, độ chín vừa phải.

- Rửa: Bưởi sau khi mua về được đem rửa sạch bề mặt vỏ bên ngoài nhằm giảm tỷ lệ nhiễm bẩn và nhiễm khuẩn trước khi đưa vào sử dụng

- Tách vỏ: Sau đó, bưởi được đưa vào công đoạn tách vỏ

- Ép: Phần thịt múi bưởi được ép lấy dịch quả

- Phối chế: Dịch bưởi được pha loãng với tỷ lệ dịch bưởi : nước là 1:1, sau đó điều chỉnh độ brix bằng cách bổ sung đường, điều chỉnh pH bằng cách bổ sung acid citric hoặc Na2CO3 để tạo điều kiện thích hợp cho nấm men phát triển

- Thanh trùng: Cần thanh trùng dịch bưởi bằng NaHSO3 0,01% trong 30 phút để tiêu diệt các vi sinh vật tạp

- Nhân giống: Bổ sung nấm men Saccharomyces cerevisiae thuần vào dịch bưởi và

tiến hành nhân giống ở điều kiện nhiệt độ thường

- Pha loãng: Dùng dịch bưởi đã điều chỉnh độ Brix, pH và thanh trùng để pha loãng dịch huyền phù nấm men đạt mật độ theo yêu cầu

- Gọt vỏ xanh, cắt nhỏ: Phần vỏ quả được gọt bỏ phần xanh, giữ lại phần thịt trắng, cắt nhỏ thành từng miếng vuông có kích thước dài x rộng là 1cm x 1cm

- Chần - Xả: Vỏ bưởi được chần ở nhiệt độ 95 - 100oC trong 5 phút và xả hai lần bằng nước sạch để loại bỏ vị the đắng, sau đó vắt ráo

- Sấy: Vỏ bưởi sau khi vắt ráo được sấy ở 70oC đến khối lượng ban đầu để độ ẩm luôn

3.2.3 Quy trình lên men rượu bưởi bằng nấm men cố định

Hình 7: Quy trình lên men rượu vang bưởi bằng nấm men Saccharomyces

cerevisiae cố định trên vỏ bưởi dự kiến

Thuyết minh quy trình:

Bưởi sau khi mua về đem rửa sạch, tách vỏ, múi bưởi ép lấy nước Nước bưởi được pha loãng theo tỷ lệ dịch bưởi : nước là 1:1, phối chế với đường và acid citric hoặc

Na2CO3 để dung dịch đạt độ Brix và pH theo yêu cầu Sau đó, dịch bưởi được thanh trùng bằng NaHSO3 0,01% trong 30 phút Bổ sung nấm men cố định với mật độ theo yêu cầu để tiến hành lên men Sau khi quá trình lên men kết thúc, tiến hành lọc thu thành phẩm

3.2.4 Nội dung nghiên cứu

3.2.4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của độ Brix, pH và tỷ lệ nấm men Saccharomyces cerevisiae thuần đến quá trình nhân giống nấm men trong dịch bưởi

a Mục đích

Nhằm xác định độ Brix và pH của dịch nước bưởi cũng như tỷ lệ nấm men S cerevisiae thuần bổ sung thích hợp để nấm men sinh trưởng và phát triển tốt

b Bố trí thí nghiệm

- Thí nghiệm được bố trí với ba nhân tố:

Nhân tố A: Độ Brix dịch bưởi (o

Nhân giống Nấm men

c Tiến hành thí nghiệm

Chọn loại bưởi Năm Roi tươi, độ chín vừa phải, sau đó tách vỏ ép lấy nước Mỗi mẫu

sử dụng 100ml dịch nước ép bưởi Dịch bưởi được pha loãng với nước theo tỷ lệ 1:1,

bổ sung đường saccharose để đạt độ Brix 19%, 22%, 25% và điều chỉnh pH lần lượt về các giá trị 3,5; 4,0; 4,5 Sau đó, tiến hành thanh trùng bằng NaHSO3 và phối trộn nấm men theo các tỷ lệ 0,2%; 0,3%; 0,4% Nhân giống ở điều kiện nhiệt độ thường

d Chỉ tiêu theo dõi

- Xác định mật độ tế bào nấm men trên một đơn vị dịch huyền phù sau mỗi 6 giờ nhân giống

3.2.4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của mật độ tế bào nấm men ban đầu, tỷ lệ

vỏ bưởi và chiều dày vỏ bưởi dùng cố định

a Mục đích

Nhằm xác định mật độ tế bào nấm men ban đầu và tỷ lệ vỏ bưởi cũng như chiều dày

vỏ bưởi dùng cố định nấm men để quá trình cố định đạt hiệu suất cao

b Bố trí thí nghiệm

- Thí nghiệm được bố trí với ba nhân tố:

Nhân tố D: Mật độ nấm men ban đầu (tế bào / ml)

C trong 20 phút Dùng dịch bưởi

đã pha loãng, điều chỉnh độ Brix, pH và thanh trùng để pha loãng huyền phù nấm men đạt được các mật độ ban đầu là 20.107

tb/ml, 40.107 tb/ml và 60.107 tb/ml Phối trộn vỏ bưởi vào dịch huyền phù nấm men lần lượt theo các tỷ lệ 10%, 15%, 20% để cố định Sau khi cố định, vớt vỏ bưởi ra khỏi dịch huyền phù nấm men và rửa mặt ngoài của vỏ bưởi bằng nước vô khuẩn

d Chỉ tiêu theo dõi

- Xác định mật độ tế bào nấm men cố định trên một đơn vị khối lượng vỏ bưởi cứ sau mỗi giờ cố định

Nấm men cố định trên vỏ bưởi

Nước vô khuẩn