NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CỐ ĐỊNH NẤM MEN TRÊN CHẤT MANG CENLLULOSE VI KHUẨN VÀ ỨNG DỤNG VÀO QUÁ TRÌNH LÊN MEN CHÍNH RƯỢU VANG NHO

 Nấm men cố định trên BC khi ứng dụng vào quá trìnhlên men chính rượu vang nho cho hiệu quả lên men cao hơn hẳnnấm men tự do: thời gian lên men ngắn hơn, hàm lượng acid tổngvà acid dễ b

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em xin cảm ơn thầy cô trường Đại họcBách Khoa Tp.HCM đã tận tình dạy bảo, xây dựng nhữngkiến thức cơ bản cần thiết cho em trong quá trình học tậptại trường

Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến cô Tôn NữMinh Nguyệt và thầy Lê Văn Việt Mẫn vì sự giúp đỡ vàhướng dẫn tận tình mà thầy cô đã dành cho em trongsuốt quá trình làm luận văn

Mặc dù gặp nhiều khó khăn trong thời gian vừa qua nhưng sự động viên, giúp đỡ của các thầy cô, bạn bè vàgia đình đã giúp em đã hoàn thành tốt nhiệm vụ được giao

Em xin chân thành cám ơn tất cả những người đã giúp đỡ em hoàn thành tốt luận văn này

Tp Hồ Chí Minh, tháng 1/2008

Nguyễn Đức Ninh

NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG

DẪN

Tp.Hồ Chí Minh, Ngày tháng năm 2008

NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN PHẢN

BIỆN

Tp.Hồ Chí Minh, Ngày tháng năm 2008

TÓM TẮT LUẬN VĂN

Trong công nghệ sản xuất rượu vang, việc ứng dụng nấm mencố định vào quá trình lên men chính đã được nghiên cứu kháphổ biến trên thế giới Nhiều loại chất mang đã được nghiêncứu để ứng dụng vào quá trình cố định nấm men Trong nghiêncứu này, chúng tôi tìm hiểu về quá trình cố định nấm mentrên chất mang Cellulose vi khuẩn (BC) và ứng dụng nấm men cốđịnh trên chất mang này vào quá trình lên men chính rượu vangnho

Chúng tôi đã tiến hành các thí nghiệm sau:

 Tối ưu hóa các thông số kĩ thuật của quá trình cốđịnh nấm men trên chất mang BC theo phương pháp hấp phụ

 Khảo sát động học sinh trưởng của nấm men cố địnhtrên chất mang BC trong thời gian ủ sau khi cố định nấm menbằng phương pháp hấp phụ

 So sánh hiệu quả lên men giữa nấm men cố định trênchất mang BC và nấm men tự do trong quá trình lên men chínhrượu vang nho

Kết quả chúng tôi thu được như sau:

 Hiệu suất cố định nấm men trên chất mang BC theophương pháp hấp phụ đạt được sau khi tối ưu là 62,61%

 Sau thời gian ủ, mật độ tế bào cố định đạt giá trị cựcđại sau hai ngày ủ là 14,0x108 tế bào/g chất mang, gấp 2,4 lầnmật độ tế bào cố định trên chất mang trước khi ủ

 Nấm men cố định trên BC khi ứng dụng vào quá trìnhlên men chính rượu vang nho cho hiệu quả lên men cao hơn hẳnnấm men tự do: thời gian lên men ngắn hơn, hàm lượng acid tổngvà acid dễ bay hơi sinh tổng hợp thấp hơn hẳn so với trường hợpsử dụng nấm men tự do

MỤC LỤC

Chương 1: GIỚI THIỆU

1 Chương 2: TỔNG QUAN

3

2.1 TỔNG QUAN VỀ RƯỢU VANG, NHO VÀ NẤM MEN DÙNG

TRONG SẢN XUẤT RƯỢU VANG 3

2.1.1 Nho 3

2.1.2 Rượu vang 6

2.1.3 Nấm men 6

2.2 TỔNG QUAN VỀ CỐ ĐỊNH NẤM MEN VÀ CỐ ĐỊNH NẤM MEN TRÊN CHẤT MANG CELLULOSE VI KHUẨN 8

2.2.1 Sơ lược một số vấn đề về kỹ thuật cố định tế bào 8 2.2.2 Điều kiện cố định vi sinh vật 14

2.2.3 Cố định nấm men trên Cellulose vi khuẩn (Bacterial Cellulose- BC) 15

2.2.4 Ảnh hưởng của việc cố định nấm men 26

2.2.5 Thuận lợi và khó khăn của tế bào cố định so với tế bào tự do 29

2.3 ỨNG DỤNG KĨ THUẬT CỐ ĐỊNH TRÊN CELLULOSE VI KHUẨN TRONG MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN 30

2.3.1 Ứng dụng cố định tế bào trên BC để loại acid trong rượu vang bằng quá trình lên men malolactic 30

2.3.2 Một số ứng dụng khác của việc cố định tế bào trên chất mang BC 32

Chương 3: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35 3.1 NGUYÊN LIỆU 35

3.1.1 Nho 35

3.1.2 Nấm men 36

3.1.3 Bacterial Cellulose (BC) 36

3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37

3.2.1 Mục đích và nội dung nghiên cứu 37

3.2.2 Các quy trình cố định nấm men trên BC 37

3.2.3 Khảo sát tối ưu hóa quá trình cố định nấm men trên chất mang BC theo phương pháp hấp phụ 40

3.2.4 Khảo sát động học sinh trưởng của nấm men trong quá trình ủ- giai đoạn hai của quá trình cố định theo phương pháp hấp phụ- ủ 42

3.2.5 So sánh động học quá trình sử dụng cơ chất trong thời gian lên men giữa phương pháp hấp phụ và hấp phụ- ủ 42

3.2.6 So sánh tính chất sản phẩm lên men giữa hai phương pháp hấp phụ và hấp phụ- ủ

43 3.3 XỬ LÝ KẾT QUẢ 43

3.3.1 Xác định phương trình hôì quy bằng phương pháp quy

hoạch thực nghiệm trực giao có tâm cấp hai 43

3.3.2 Xác định tốc độ sử dụng đường 45

3.3.3 Xác định tốc độ sinh tổng hợp cồn 45

3.3.4 Xác định hiệu suất cố định 45

3.4 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 45

3.4.1 Mật độ tế bào 45

3.4.2 pH 47

3.4.3 Nồng độ chất khô 47

3.4.4 Hàm lượng đường khử 47

3.4.5 Hàm lượng ethanol 48

3.4.6 Hàm lượng acid tổng 49

3.4.7 Hàm lượng acid dễ bay hơi 50

Chương 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 51 4.1 TỐI ƯU HOÁ QUÁ TRÌNH CỐ ĐỊNH NẤM MEN TRÊN CHẤT MANG BC THEO PHƯƠNG PHÁP HẤP PHỤ 51

4.1.1 Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố công nghệ đến quá trình cố định nấm men trên BC 51

4.1.2 Tối ưu hoá bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm quá trình cố định nấm men trên BC 62

4.2 KHẢO SÁT ĐỘNG HỌC SINH TRƯỞNG CỦA NẤM MEN CỐ ĐỊNH TRÊN CHẤT MANG BC TRONG THỜI GIAN Ủ TẠO CHẾ PHẨM 65

4.3 KHẢO SÁT VÀ SO SÁNH QUÁ TRÌNH LÊN MEN CHÍNH SỬ DỤNG NẤM MEN TỰ DO VÀ NẤM MEN CỐ ĐỊNH TRÊN BC Ở CÁC NGÀY Ủ KHÁC NHAU 68

4.3.1 Động học quá trình sử dụng cơ chất 68

4.3.2 So sánh tính chất các sản phẩm lên men 72

4.3.3 Kết luận chung 79

4.4 KHẢO SÁT MẬT ĐỘ TẾ BÀO NẤM MEN TRÊN CHẤT MANG SAU QUÁ TRÌNH LÊN MEN CHÍNH 79

Chương 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 82 5.1 KẾT LUẬN 82

5.2 KIẾN NGHỊ 82

TÀI LIỆU THAM KHẢO 84

Danh mục các bảng

Chương 2: TỔNG QUAN 3

Bảng 2.1: Thành phần của dịch nho và rượu vang thông thường .3

Bảng 2.2: Thành phần các một số acid hữu cơ chính trong dịch nho đỏ và rượu vang đỏ 5

Bảng 2.3: Một số loại chất mang trong cố định tế bào 14

Bảng 2.4: Ưu nhược điểm của các loại chất mang 14

Bảng 2.5: Một số vi khuẩn có khả năng tổng hợp cellulose 19

Bảng 2.6: Thành phần của nước dừa già 21

Bảng 2.7: So sánh các chất mang trong kĩ thuật cố định tế bào .32

Chương 3: NGUYÊN LIỆU và PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35 Bảng 3.1: Thành phần của dịch nho sau khi ép 36

Bảng 3.2: Đặc tính cấu trúc của BC sản xuất bằng phương pháp lên men bề mặt 36

Bảng 3.3: Tính chất của BC sản xuất bằng phương pháp lên men bề mặt 36

Bảng 3.4: Cách chuẩn bị các dung dịch đệm 41

Bảng 3.5: Các chất bổ sung vào dịch nho khi khảo sát động học sinh trưởng của nấm men trong giai đoạn ủ 42

Chương 4: KẾT QUẢ và BÀN LUẬN 51 Bảng 4.1: Mật độ tế bào được cố định và hiệu suất cố định nấm men trên BC với các mật độ tế bào trong huyền phù giống khác nhau 53

Bảng 4.2: Mật độ tế bào được cố định và hiệu suất cố định nấm men trên BC với các kích thước chất mang khác nhau 53

Bảng 4.3: Mật độ tế bào được cố định và hiệu suất cố định nấm men trên BC với khối lượng chất mang cố định khác nhau 55

Bảng 4.4: Mật độ tế bào được cố định và hiệu suất cố định nấm men trên BC với pH huyền phù giống khác nhau 57

Bảng 4.5: Mật độ tế bào được cố định và hiệu suất cố định nấm men trên BC với tốc độ lắc đảo khác nhau 58

Bảng 4.6: Mật độ tế bào được cố định và hiệu suất cố định nấm men trên BC với thời gian cố định khác nhau 60

Bảng 4.7: Ma trận quy hoạch cấu trúc có tâm cấp hai- hai yếu

tố và kết quả .63

Bảng 4.8: Các hệ số của phương trình hồi quy Y 63 Bảng 4.9: Mật độ tế bào nấm men cố định phụ thuộc vào

thời gian ủû 66

Bảng 4.10: Ảnh hưởng của việc cố định và thời gian ủ trong

quá trình cố định đến thời gian lên men rượu vang 70

Bảng 4.11: Ảnh hưởng của việc cố định và thời gian ủ trong

quá trình cố định đến tốc độ sử dụng đường trung bình trongquá trình lên men rượu vang của nấm men 71

Bảng 4.12: Hàm lượng đường sót trong quá trình lên men rượu

vang sử dụng nấm men cố định trên BC với thời gian ủ từ 0-3ngày và nấm men tự do 72

Bảng 4.13: Ảnh hưởng của việc cố định và thời gian ủ trong

quá trình cố định đến độ cồn của sản phẩm trong quá trìnhlên men rượu vang 73

Bảng 4.14: Ảnh hưởng của việc cố định và thời gian ủ trong

quá trình cố định đến tốc độ sinh tổng hợp cồn trung bình trongquá trình lên men rượu vang 73

Bảng 4.15: Ảnh hưởng của việc cố định và thời gian ủ trong

quá trình cố định đến hiệu suất sinh tổng hợp cồn trong quátrình lên men rượu vang 75

Bảng 4.16: Ảnh hưởng của việc cố định và thời gian ủ trong

quá trình cố định đến hàm lượng acid tổng và acid dễ bay hơisinh ra sau quá trình lên men rượu vang 78

Bảng 4.17: Ảnh hưởng của thời gian ủ chất mang đến mật độ

tế bào nấm men trên chất mang sau quá trình lên men rượu vangsử dụng nấm men cố định trên BC 81

Danh mục các hình vẽ

Chương 2: TỔNG QUAN 3

Hình 2.1: Nho xanh và nho đỏ 4

Hình 2.2: Quá trình nảy chồi của nấm men 7

Hình 2.3: Tế bào nấm men S cerevisiae chụp trên mặt phẳng và không gian 7

Hình 2.4: Các kỹ thuật cơ bản để cố định tế bào 9

Hình 2.5: Cấu trúc Bacterial Cellulose 16

Hình 2.6: Cellulose vi khuẩn và cellulose thực vật 17

Hình 2.7: Cấu trúc BC trong điều kiện nuôi cấy bề mặt 17

Hình 2.8: Cấu trúc BC trong điều kiện nuôi cấy bề sâu 18

Hình 2.9:Vi khuẩn Acetobacter Xylinum 19

Hình 2.10: Con đường sinh tổng hợp cellulose từ Acetobacter Xylinum .20

Hình 2.11: Sơ đồ quy trình lên men sản xuất BC 22

Hình 2.12: Màng BC được tạo thành trong điều kiện nuôi cấy tĩnh bề mặt 23

Hình 2.13: Màng BC được tạo thành trong điều kiện nuôi bề sâu .23

Hình 2.14: Con đường hình thành các chất tạo hương vị cho rượu vang 28

Hình 2.15: Hoạt tính bacteriocin của các lần tái sử dụng chế phẩm tế bào cố định trên BC để lên men 33

Hình 2.16: Sản lượng BC theo chu kì tái sử dụng trong chế phẩm cố định so với đối chứng 34

Chương 3: NGUYÊN LIỆU và PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35 Hình 3.1: Quy trình ép nho 35

Hình 3.2: Sơ đồ nghiên cứu 37

Hình 3.3: Quy trình cố định nấm men trên BC trong dung dịch đệm theo phương pháp hấp phụ 38

Hình 3.4: Quy trình cố định nấm men trên BC trong dịch nho theo phương pháp hấp phụ 39

Hình 3.5: Quy trình cố định nấm men trên chất mang BC bằng phương pháp hấp phụ- ủ 40

Chương 4: KẾT QUẢ và BÀN LUẬN

51 Hình 4.1: Ảnh hưởng của mật độ tế bào trong huyền phù

giống đến mật độ tế bào cố định trên BC 52

Hình 4.2: Ảnh hưởng của mật độ tế bào trong huyền phù

giống đến hiệu suất cố định nấm men trên BC 52

Hình 4.3: Ảnh hưởng của kích thước chất mang đến mật độ tế

bào cố định trên BC 54

Hình 4.4: Ảnh hưởng của kích thước chất mang đến hiệu suất

cố định nấm men trên BC 54

Hình 4.5: Ảnh hưởng của khối lượng chất mang chất mang đến

mật độ tế bào cố định trên BC 56

Hình 4.6: Ảnh hưởng của khối lượng chất mang chất mang đến

hiệu suất cố định nấm men trên BC 56

Hình 4.7: Ảnh hưởng của pH huyền phù giống đến mật độ tế

bào cố định trên BC 57

Hình 4.8: Ảnh hưởng của pH huyền phù giống đến hiệu suất

cố định nấm men trên BC 58

Hình 4.9: Ảnh hưởng của tốc độ lắc đảo đến mật độ tế bào

cố định trên BC 59

Hình 4.10: Ảnh hưởng của tốc độ lắc đảo đến hiệu suất cố

định nấm men trên BC 59

Hình 4.11: Ảnh hưởng thời gian cố định đến mật độ tế bào

cố định trên BC 61

Hình 4.12: Ảnh hưởng của thời gian cố định đến hiệu suất cố

định nấm men trên BC 61

Hình 4.13: Ảnh hưởng của mật độ tế bào trong huyền phù

giống và thời gian cố định đến hiệu suất cố định nấm mentrên BC 64

Hình 4.14: Mật độ tế bào nấm men cố định phụ thuộc vào

thời gian ủ 66

Hình 4.15: Kết quả chụp SEM của mẫu chất mang BC sau khi cố

định bằng phương pháp hấp phụ (không ủ) 67

Hình 4.16: Kết quả chụp SEM của mẫu chất mang BC sau khi cố

định bằng phương pháp bẫy -hấp phụ, thời gian ủ 2 ngày 67

Hình 4.17: Sự thay đổi hàm lượng đường trong quá trình lên men

rượu vang sử dụng nấm men cố định trên BC với thời gian ủ từ0-3 ngày và nấm men tự do 69

Hình 4.18: Ảnh hưởng của việc cố định và thời gian ủ trong

quá trình cố định đến tốc độ sử dụng đường trung bình trongquá trình lên men rượu vang 71

Hình 4.19: Ảnh hưởng của việc cố định và thời gian ủ trong

quá trình cố định đến tốc độsinh tổng hợp cồn trung bình trongquá trình lên men rượu vang 74

Hình 4.20: Ảnh hưởng của việc cố định và thời gian ủ trong

quá trình cố định đến hiệu suất sinh tổng hợp cồn trong quátrình lên men rượu vang 75

Hình 4.21: Sự thay đổi pH trong quá trình lên men rượu vang sử

dụng nấm men cố định trên BC và nấm men tự do 76

Hình 4.22: Ảnh hưởng của thời gian ủ chất mang BC đến hàm

lượng acid sinh ra sau quá trình lên men rượu vang sử dụng nấmmen cố định trên chất mang BC 77

Hình 4.23: Ảnh hưởng của thời gian ủ chất mang BC đến hàm

lượng acid dễ bay hơi sinh ra sau quá trình lên men rượu vang sửdụng nấm men cố định trên chất mang BC 78

Hình 4.24: Ảnh hưởng của thời gian ủ chất mang đến mật độ

tế bào nấm men cố định sau quá trình lên men rượu vang sửdụng nấm men cố định trên BC 79

Hình 4.25: Kết quả chụp SEM của mẫu chất mang BC sau quá

trình lên men sử dụng chất mang cố định bằng phương pháp hấpphụ- ủ, thời gian ủ 2 ngày 80

Danh mục một số thuật ngữ và

chữ viết tắt

 BC : Cellulose vi khuẩn (Bacterial Cellulose)

 SEM :Kính hiển vi điện tử quét (Scan Electronic

Microscope)

 CD : Nấm men cố định

 DCM : Delignified Cellulosic Material

 DEAE-cellulose : Diethylaminoethyl- Cellulose

 TD : Nấm men tự do

  : Tổng thời gian lên men, được xác định từ độ lên men Đơn

vị: h

 KS : Tốc độ sử dụng đường trung bình, là hàm lượng đường

trung bình được nấm men sử dụng trong một đơn

vị thời gian lên men Đơn vị: g/L/h

 KP : Tốc độ sinh tổng hợp cồn trung bình, là hàm lượng cồn

trung bình được nấm men sinh tổng hợp trong mộtđơn vị thời gian lên men Đơn vị: g/L/h

  : Hiệu suất sinh tổng hợp cồn, là số mol ethanol được tạo

thành từ một mol glucose được nấm men sửdụng Đơn vị: mol ethanol/ mol glucose

Chương 1: GIỚI THIỆU

Rượu vang là một trong những sản phẩm lên men có lịch sửlâu đời nhất Cho đến nay, rượu vang đã phổ biến rộng rãitrên thế giới với nhiều chủng loại và thương hiệu phong phú.Nó được ưa thích tại nhiều nơi trên thế giới bởi hương vị hết sứcđặc trưng, đem lại cảm giác sảng khoái và sức khỏe cho ngườisử dụng

Trong những giai đoạn phát triển đầu tiên, rượu vang được sảnxuất theo con đường lên men tự nhiên Song, với việc khoa học kĩthuật ngày càng phát triển mạnh, dần dần người ta đã phân

lập được chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae phù hợp cho

việc sản xuất và nâng cao chất lượng rượu vang Vài thập kỉgần đây, nhiều nhà khoa học đã ứng dụng kĩ thuật cố địnhnấm men để lên men rượu vang nhằm khắc phục những nhượcđiểm của lên men tự do như thời gian lên men dài, năng suấtthấp, tốn nhiều năng lượng, khả năng tái sử dụng thấp vàkhó tự động hoá.Hàng loạt các nghiên cứu ứng dụng cố địnhnấm men đã chứng minh được tính năng ưu việt của nó: tăngkhả năng sử dụng cơ chất, rút ngắn thời gian lên men, ổn địnhhoạt tính nấm men, dễ thu hồi sản phẩm, tăng khả năng táisử dụng và tự động hóa…

Nhiều loại chất mang đã được nghiên cứu ứng dụng, từ cácchất mang có khả năng hấp phụ nấm men lên bề mặt, cácmiếng trái cây, các loại cellulose, màng vi bao… Các chất manghấp phụ thường được cho là có hiệu suất cố định thấp, thờigian chuẩn bị cố định dài và khả năng tái sử dụng chưa đượchiệu quả Cho đến nay, loại chất mang thường sử dụng đểnghiên cứu cố định nấm men nhiều nhất là gel alginate, mộtpolysaccharide thu được từ rong mơ Song chúng cũng có nhữngnhược điểm là giá thành khá cao và quá trình tái sử dụng sẽ

bị hạn chế vì sau một vài chu kỳ, số hạt alginate bể vỡ khánhiều

Một vài năm gần đây, một số kết quả nghiên cứu chothấy việc lên men rượu vang sử dụng nấm men cố định trên bềmặt chất mang sẽ thu được sản phẩm có chất lượng cảm quantốt hơn những phương pháp khác Bên cạnh đó, nhiều nhà khoahọc ở châu Á đã đưa một loại chế phẩm sinh học là Cellulose vikhuẩn (BC) vào ứng dụng để cố định tế bào vi sinh vật, songviệc nghiên cứu cố định nấm men trên Cellulose vi khuẩn trênthế giới là còn khá hạn chế Cellulose vi khuẩn là loại chấtmang cố định tế bào theo phương pháp hấp phụ, song nó cũngđóng vai trò là giá thể để tạo điều kiện cho vi sinh vật sinhtrưởng bên trong lòng cấu trúc của nó Ưu điểm chính củachất mang này so với alginate là giá thành rẻ hơn nhiều, cấu

trúc chắc chắn và ít hỏng vỡ, tạo điều kiện cho việc tái sửdụng tốt hơn [4,6].

Trên cơ sở đó, chúng tôi đề xuất đề tài nghiên cứu

“Nghiên cứu quá trình cố định nấm men trên chất mang Cellulose

vi khuẩn và ứng dụng vào quá trình lên men chính rượu vangnho” Chúng tôi tiến hành nghiên cứu tối ưu hoá quá trình cốđịnh với hàm mục tiêu hiệu suất cố định, tối ưu thời gian ủchất mang sau giai đoạn cố định bề mặt và tiến hành so sánhkết quả lên men của các mẫu thí nghiệm ở các thời gian ủkhác nhau

Do quỹ thời gian hạn hẹp nên chúng tôi chỉ khảo sát độnghọc quá trình sử dụng cơ chất, sự thay đổi pH và một số kếtquả lên men như hàm lượng cồn, acid tổng, acid dễ bay hơi, mậtđộ tế bào cố định sau lên men mà chưa đề cập đến việc ảnhhưởng của một số yếu tố công nghệ đến động học quá trìnhlên men cũng như khảo sát các hợp chất tạo hương cho sảnphẩm

Chương 2: TỔNG QUAN

2.1 TỔNG QUAN VỀ RƯỢU VANG, NHO VÀ NẤM MEN DÙNG TRONG SẢN XUẤT RƯỢU VANG

2.1.1 Nho

Trong số các loại quả, nho là nguyên liệu lý tưởng nhất đểsản xuất rượu vang Nho ưa đất ít chua và khí hậu khô, nhiềunắng Vùng đất Khánh Hòa, Ninh Thuận, Bình Thuận là nhữngvùng nho mới và đang phát triển [10]

Với rượu vang, nho là nguyên liệu thích hợp nhất vì [10,104]:

 Từ nho cho rượu vang chất lượng tốt nhất, hương vị êmdịu, hài hòa

 Thành phần dịch quả nho rất thích hợp cho lên men vàthành phần rượu thành phẩm nhiều chất dinh dưỡng

Bảng 2.1: Thành phần của dịch nho và rượu vang thông thường

[90]

(ethanol và hàm lượng vết của

terpenes, glycerols và rượu bậc cao)

Acid hữu cơ

(tartaric, malic và một ít lactic,

(các flavonoid như là các chất màu

cùng với các nonflavonoid như là

cinnamic acid và vanillin)

Các hợp chất chứa nitơ

(protein, amino acid, humin, amide,

ammonia,…)

Các hợp chất hương

(các ester như là ethyl caproate, ethyl

butyrate,…)

2.1.1.1 Phân loại

Nho thuộc giới Plantae, ngành Magnoliophyta, lớp Magnoliopsida, bộ Vitales, họ Vitaceae, chi Vitis Trong đó, theo nghiên cứu và thực tế sản xuất, loài Vitis vnifera được cho là thích hợp nhất để

sản xuất rượu vang vì: nó chứa hàm lượng chất dinh dưỡng caocho sự phát triển của nấm men, chứa hàm lượng acid đủ cao đểức chế các vi sinh vật dại, hàm lượng đường thích hợp cho lênmen, và cuối cùng là có thể tạo hương vị phù hợp [98,99]

Nho có hai loại: nho đỏ để sản xuất rượu vang đỏ và nho xanhđể sản xuất rượu vang trắng.[1,10]

 Nho trắng: trái nho khi chín vỏ không có màu hoặc màuvàng lục nhạt

 Nho đỏ: trái nho khi chín vỏ có màu đỏ – tím ở những mứcđộ khác nhau

Hình 2.1: Nho xanh (a) và nho đỏ (b)

2.1.1.2 Thành phần hóa học chính

 Đường

Thông thường dịch nho để sản xuất rượu vang chứa 16 – 26%(w/v) đường Trong nho khô và trong nho thu hoạch trễ, hàm lượngđường có thể lên tới trên 30% (w/v) Dịch nho cô đặc với hàmlượng đường 35oBx được sử dụng để sản xuất rượu vang có hàmlượng cồn cao Hàm lượng đường cao có thể ảnh hưởng đếnkhả năng lên men của nấm men [58]

Dịch nho trước khi lên men thường chứa tỷ lệ cân bằng củaglucose và fructose Trong suốt quá trình lên men, tất cả các

chủng Saccharomyces cerevisiae đều ưu tiên sử dụng glucose hơn

là fructose Hàm lượng ethanol cao có tác động ức chế mạnh sựsử dụng fructose hơn là glucose Trong khi đó, bổ sung nitơ vàodịch nho sẽ kích thích sự sử dụng fructose hơn là glucose [23,28,78]

 Nitơ

Các hợp chất nitơ rất cần cho sự phát triển và trao đổi chấtcủa nấm men Trong số các chất dinh dưỡng mà nấm men cóthể sử dụng được trong suốt quá trình lên men dịch nho, về số

lượng, nitơ là thành phần quan trọng thứ hai sau các hợp chấtcarbon Có nhiều hợp chất chứa nitơ có mặt trong dịch nho, vớihàm lượng thay đổi từ 60 – 2400mg/L [41].

Saccharomyces cerevisiae có khả năng sử dụng các nguồn nitơ

khác nhau để phát triển, nhưng không phải tất cả các nguồnnitơ đều hỗ trợ phát triển tốt như nhau Các nguồn nitơ tốt làammonium, glutamine và asparagine, trong khi đó proline và ureađược xem như là những nguồn nitơ kém chất lượng [41]

 Acid hữu cơ

Trong nho và rượu vang, 6 acid chiếm thành phần chính là acidtartaric, acid malic, acid citric, acid lactic, acid succinic và acid acetic.Trong đó, acid acetic là hợp chất dễ bay hơi còn các acid khác làacid không bay hơi

Độ phân ly của các acid này giảm theo thứ tự sau: acid citric,acid tartaric, acid malic, acid succinic, acid lactic, và acid acetic

Bảng 2.2: Thành phần các một số acid hữu cơ chính trong dịchnho đỏ và rượu vang đỏ [79]

Acid hữu cơ Dịch nho

đỏ Rượu vangđỏAcid citric

Acid tartaricAcid malicAcid succinicAcid lacticAcid acetic

0,17 – 0,40g/L2,60` – 5,7g/L0,06 – 3,13g/L0,48 – 1,22g/L0,07 – 4,89g/L0,30 – 1,44g/L

 SO 2

Sulfur dioxide được sử dụng rộng rãi trong rượu vang như làmột chất chống oxy hóa, tác nhân kháng khuẩn và đồng thờicũng là tác nhân cho việc chọn lọc các loài hoặc chủng cóthể phát triển và đóng góp vào quá trình lên men Trong rượuvang, SO2 tồn tại ở 2 dạng: tự do và liên kết Nhưng chỉ SO2 tự domới có tính khử và diệt khuẩn Mặc dù vậy, một vài dạng SO2liên kết có thể chuyển hóa thành SO2 tự do và có thể bù lạicho lượng SO2 bị giảm trong quá trình lên men Vì thế, SO2 là mộtthông số quan trọng ảnh hưởng đến động học quá trình lên menvà chất lượng rượu vang [14,24] Bên cạnh đó, SO2 còn có ảnhhưởng xấu đến quá trình lên men rượu vang: dẫn tới kéo dàithời gian lên men hoặc quá trình lên men kết thúc khi hàmlượng đường sót còn cao, và ảnh hưởng đến tính chất cảmquan của rượu vang [40,62]

 Tannin

Tannin có ở 2 dạng là tannin ngưng tụ và tannin thủy phân[99]

Tannin thủy phân: có nguồn gốc từ các acid phenolic như là acidgallic và acid ellagic

Tannin ngưng tụ: là polymer của flavan-3-ol (epicatechin, catechin vàgallocatechin) và flavan-3,4-diol

Tannin có ở trong nho và rượu vang chủ yếu là các tanninngưng tụ [99]

Tannin có thể được thêm vào rượu vang dưới dạng acid tannicđể phản ứng và kết tủa với protein và để cải thiện độ trongcủa rượu vang Trong suốt quá trình ủ, sự thay đổi hàm lượngtannin ngưng tụ sẽ ảnh hưởng đến màu sắc và tính chất cảmquan của rượu vang, và khi đó, khối lượng phân tử của tannincó thể tăng lên [99]

2.1.2 Rượu vang

Rượu vang nho là sản phẩm thu được bằng con đường lên mencồn từ dịch nho Rượu vang nho có thể được sản xuất từ mộtgiống nho riêng biệt, hoặc từ hỗn hợp hai hay ba giống nho khácnhau Vì vậy sản phẩm vang nho có số lượng và chủng loại rấtphong phú, đa dạng Về mặt công nghệ, sản phẩm vang nhođược chia ra thành hai nhóm lớn [1]:

 Nhóm rượu vang không có gas

 Nhóm rượu vang có gas

Do quá trình lên men, thành phần của rượu vang khác với

thành phần của dịch nho ban đầu (bảng 2.1) [90].

2.1.3 Nấm men

Nấm men là vi sinh vật quan trọng, kiểm soát quá trình lênmen cồn trong sản xuất rượu vang Nấm men trong quá trình lênmen rượu vang có thể có từ 3 nguồn gốc khác nhau: bề mặttrái nho, bề mặt thiết bị và từ canh trường được cấy vào.Thành phần và chất lượng của rượu vang có liên quan chặt chẽđến nấm men Trong quá trình lên men, bên cạnh các sản phẩmchính là ethanol và CO2, nấm men tạo thành nhiều sản phẩmphụ, ví dụ như glycerol, acid acetic, acid succinic và đặc biệt là cáchợp chất hương, góp phần đáng kể vào chất lượng của rượuvang [15, 42, 44, 72, 76]

2.1.3.1 Đặc điểm của nấm men vang

Các loài nấm men sử dụng trong sản xuất rượu vang trước

đây có thể là: S vini, S oviformis, S bayanus, S ellipsoideus, S.

cerevisiae Từ năm 1984, nhà phân loại học người Hà Lan

Kreger-Van-Rij đã đề nghị một khóa phân loại mới cho nấm men Theo

ông, loài S cerevisiae bao gồm các chủng nấm men được sử

dụng trong sản xuất ethanol, rượu vang, bia, bánh mì, và một sốloại thức uống lên men khác [51]

Nấm men S cerevisiae là vi sinh vật đơn bào thuộc nhóm

Eucaryote Chúng có hình cầu, kích thước thay đổi trong khoảng2,5÷10μm x 4,5÷21μm, sinh sản chủ yếu bằng phương pháp nẩy

chồi.[Hình 2.2] Cấu tạo tế bào nấm men phức tạp bao gồm

màng tế bào, màng tế bào chất, tế bào chất, nhân, khôngbào, các hạt dự trữ (glycogen, voluten, ), ribosome (nơi tổng hợpprotein) và ty thể (nơi xảy ra các quá trình oxy hóa khử cung cấpnguồn năng lượng cho tế bào) [2]

S cerevisiae là vi sinh vật kỵ khí tùy tiện Trong môi trường có

oxy, S cerevisiae tổng hợp năng lượng theo con đường hô hấp

hiếu khí, chuyển đường glucose thành nước và CO2, sinh khối

phát triển mạnh mẽ Trong môi trường không có oxy, S.

cerevisiae tổng hợp năng lượng bằng quá trình lên men ethanol.

Năng lượng nấm men tạo ra thấp, chỉ đủ để nấm men duy trì sựsống, sinh khối phát triển rất yếu

Saccharomyces có khả năng chịu đựng sự thay đổi của điều kiện môi trường với nồng độ ethanol và acid hữu cơ tăng và sự

cạn kiệt chất dinh dưỡng Như vậy, mặc dù có nhiều giống và

loài nấm men trong dịch nho, nhưng giống Saccharomyces, mà chủ yếu là loài Saccharomyces cerevisiae mới là loài đảm nhiệm

việc thực hiện các quá trình chuyển hóa sinh học quan trọng

trong lên men vang Chính vì thế, Saccharomyces cerevisiae còn được

gọi là “nấm men vang” [33, 41, 44, 70, 77, 90]

(a) (b) (c)

Hình 2.2: Quá trình nảy chồi của nấm men.

(a): Hình dáng tế bào nấm men nảy chồi ; (b): tiến trình sinh sản

bằng nảy chồi ở nấm men ; (c): vết sẹo sau khi nảy chồi

Hình 2.3: Tế bào nấm men S cerevisiae chụp trên mặt

phẳng và không gian

2.1.3.2 Chỉ tiêu chọn lựa nấm men vang

Ngoài vai trò quan trọng của nấm men vang là xúc tác việcchuyển hóa hoàn toàn và có hiệu quả đường thành cồn màkhông tạo ra các hương vị không mong muốn thì ngày nay, do yêu

cầu ngày càng cao, canh trường Saccharomyces cerevisiae cần

phải có nhiều đặc tính khác như sau: [10,41]

 Thích nghi nhanh với môi trường lên men, tốc độ sửdụng cơ chất và tạo thành sản phẩm cao, sử dụng đường cholên men gần như là hoàn toàn, kết lắng tốt, làm trong dịchrượu nhanh, chịu được độ rượu cao và độ acid của môi trường,cũng như các chất sát trùng, chịu áp suất thẩm thấu tốt, sinhkhối tạo thành vừa phải, tạo cho rượu vị thơm ngon thanh khiết

 Tạo thành ít sulphite, thiol, ít acid dễ bay hơi và rượu bậccao, hoạt tính esterrase thấp

 Có tính ổn định cao về mặt di truyền, khả năng chịusulphite cao, ít liên kết với sulphite, ít tạo bọt, có khả năng kếtbông, kết lắng cặn nhanh, nhu cầu nitơ thấp

Tuy nhiên, để có thể kiểm tra hết tất cả các chỉ tiêu nàythì tốn rất nhiều thời gian Regodon và cộng sự (1997) đã đưa ramột phương pháp đơn giản và hiệu quả để chọn lựa nấm menvang dùng trong sản xuất công nghiệp dựa trên các tính chấtcông nghệ của nấm men vang Phương pháp này chỉ bao gồm 2bước [77]:

 Bước thứ nhất: chọn lọc sơ bộ dựa trên khả năng chịuđựng đối với SO2, các loài có hại, khả năng phát triển tạinhiệt độ cao và sự tạo bọt thấp.

 Bước thứ hai: chọn lọc chính thức dựa trên hàm lượngacid dễ bay hơi và ethanol tạo thành cũng như hàm lượng đườngsót còn lại trong rượu vang

2.2 TỔNG QUAN VỀ CỐ ĐỊNH NẤM MEN VÀ CỐ ĐỊNH NẤM MEN TRÊN CHẤT MANG CELLULOSE VI KHUẨN

2.2.1 Sơ lược một số vấn đề về kỹ thuật cố định tế bào

2.2.1.1 Khái niệm

Thuật ngữ cố định tế bào (cell immobilization) được hiểu làviệc “giam” các tế bào vi sinh vật vào trong một vùng nhấtđịnh song vẫn giữ được các hoạt tính sinh học mong muốn củachúng Rộng hơn nữa, khái niệm “cố định” này không chỉ ápdụng cho tế bào mà còn có thể áp dụng cho enzyme đơn lẻ,hệ đa enzyme cũng như các tổ chức tế bào, có nghĩa là cóthể áp dụng cho mọi dạng xúc tác sinh học [8, 47, 67]

Theo định nghĩa của Hội nghị Công nghệ Enzyme lần thứnhất năm 1971, cố định tế bào có nghĩa là các tế bào vềmặt vật lý được giữ lại hay định vị lại trong một khu vực khônggian nhất định sao cho các tế bào đó giữ được các tính chấtxúc tác sinh học của chúng hoặc nếu có thể thậm chí là bắtbuộc giữ được khả năng sống của chúng và các tế bào đócó thể được sử dụng lại, liên tục [8]

Hiện nay, thuật ngữ cố định tế bào có thể được hiểu đơngiản hơn Đó là công việc đưa các tế bào vào những phariêng lẻ, những pha này được tách biệt với pha dung dịch tự do.Các tế bào cố định có thể được sử dụng trong bình lên menliên tục hoặc được sử dụng nhiều lần trong bình lên men giánđoạn [8]

2.2.1.2 Các kỹ thuật cố định tế bào

Việc ứng dụng các tế bào cố định đã đem lại rất nhiềuthuận lợi, vì vậy khá nhiều phương pháp cố định tế bào đãđược nghiên cứu và đề xuất Dựa vào các phương pháp và cơchế cố định, kĩ thuật cố định tế bào được chia thành bốn

nhóm chính như trong Hình 2.4.

Hình 2.4: Các kỹ thuật cơ bản để cố định tế bào [48]

a Cố định trên bề mặt chất mang rắn

 Nguyên tắc:

 Bản chất của phương pháp chính là tương tác vật lýkhông đặc trưng xảy ra giữa màng tế bào vi sinh vật và bềmặt chất mang Tương tác này xuất hiện khi tiến hành trộn lẫnhuyền phù tế bào vi sinh vật vào dung dịch chất mang đó [82]

 Kĩ thuật cố định tế bào trên bề mặt chất mangrắn được thực hiện nhờ vào lực hấp phụ, liên kết tĩnh điệnhoặc liên kết cộng hóa trị giữa màng tế bào và bề mặtchất mang rắn [47, 48, 25,82]

 Yêu cầu cơ bản đối với các chất mang dùng đểcố định tế bào vi sinh vật bằng phương pháp hấp phụ phải lànhững chất với bề mặt có cấu trúc xốp hoặc có chứa nhiềunhóm chức hoá học khác nhau [48]

 Các chất mang điển hình: vật liệu cellulose (DEAE- cellulose,gỗ, mùn cưa…), vật liệu vô cơ (sứ xốp, thủy tinh xốp, một sốoxide kim loại như oxide kẽm, titan)… Các vật liệu như cellulose vàthủy tinh có thể được tiền xử lý với polycation, chitosan… đểtăng cường khả năng hấp phụ [48].

 Phương pháp cố định: thực hiện 1 trong 3 cách: [82]

 Phương pháp cổ điển: ngâm chất mang trong dungdịch huyền phù vi sinh vật Vi sinh vật sẽ tự động kết lắng vàliên kết với chất mang bằng cách hấp phụ trên chất mang đó

 Phương pháp cổ điển có cải tiến bằng cách sửdụng cánh khuấy: tế bào vi sinh vật và chất mang phân bốđều khắp trong dung dịch Diện tích tiếp xúc giữa chất mang và

vi sinh vật là cực đại, do đó hiệu suất gắn được cải thiện đángkể

 Phương pháp bơm canh trường vi sinh vật qua cột chứachất mang: cần có hồi lưu dòng canh trường để nâng cao hiệusuất gắn tế bào vào chất mang

 Những chất vừa kể trên có thể được chia làm hai loạidựa vào cấu trúc đặc trưng, đó là chất mang có cấu trúc vixốp (trong cấu trúc có nhiều lỗ mao quản) và chất mang cócấu trúc không vi xốp Có thể xảy ra ba trường hợp [48,66]:

 Trường hợp chất mang không có cấu trúc lỗ xốpnhư thuỷ tinh, tế bào vi sinh vật sẽ được gắn vào chất mangtheo từng lớp trên bề mặt

 Trường hợp chất mang có cấu trúc lỗ xốp như thanhoạt tính, tế bào vi sinh vật sẽ thâm nhập vào những lỗ xốpnày và được giữ cố định trong đó

 Nếu chất mang có tích điện như nhựa trao đổi ion, tếbào vi sinh vật và bề mặt chất mang sẽ hình thành các liênkết ion, từ đó mà tế bào vi sinh vật được giữ chặt trên bềmặt chất mang

 Không có lớp ngăn cách giữa các tế bào và môitrường dung dịch nên việc các tế bào bị tách ra và phân bốtrở lại môi trường là điều không thể tránh khỏi Vì vậy, sẽtồn tại một hệ cân bằng giữa các tế bào hấp phụ và tự do

 Quá trình khó điều khiển nên hiệu suất thườngkhông cao.

b Nhốt trong khung mạng xốp

 Nguyên tắc: Các tế bào được đưa vào bên trong mộtkhung mạng xốp để ngăn cản tế bào khuếch tán vào môitrường xung quanh mà vẫn cho phép sự vận chuyển các chấtdinh dưỡng và quá trình trao đổi chất diễn ra [48]

 Các loại cấu trúc chất mang: Các dạng cấu trúc gelpolymer cơ bản thường được tạo ra để cố định tế bào vi sinh vậttheo phương pháp này là [31, 69, 75]:

 Ion gel: hình thành khung gel bằng cách tạo liên kếtion giữa chất mang đa điện tích và dung dịch đa điện trái dấu

 Covalent gel: có cấu trúc mạng lưới dày khít tronglòng chất mang Mạng lưới này được hình thành bằng cách tạoliên kết cộng hoá trị giữa các phân tử polymer

 Non – covalent gel: khung gel trong lòng chất mang đượchình thành bằng cách tạo những loại liên kết khác liên kếtcộng hoá trị giữa các phân tử polymer

 Cryogel: khung gel để giữ các tế bào vi sinh vật đượchình thành ở nhiệt độ rất thấp

Để quá trình cố định tế bào vi sinh vật trong cấu trúc gelđạt được hiệu quả cao, người ta cần phải nâng cao những hiểubiết về phương pháp hình thành và tính chất của từng loại cấutrúc gel trên

 Các chất mang điển hình: gel aginates, -carrageenan, agar,chitosan, polygalaturonic acid, hoặc các mạng polymer khác nhưgelatin, collagen, polyvinyl alcohol, polyacrylamide … [48]

 Đặc điểm của phương pháp:

 Gel polymer chứa những tế bào vi sinh vật cố địnhcó thể thay đổi kích thước bằng cách nghiền nhỏ, đồng hoáhoặc ép qua rây có lỗ nhỏ rồi đem sấy khô ở nhiệt độ thấp[31, 69, 75]

 Khả năng sinh trưởng của tế bào cố định phụthuộc vào sự phân bố và độ xốp của vật liệu và lượng sinhkhối tích lũy [48]

 Sự phân bố tế bào không đồng nhất dẫn đến cáctế bào ở gần bề mặt sẽ có tính chất khác với các tế bàonằm sâu bên trong [48]

 Một vấn đề của kĩ thuật này là tồn tại một sốtế bào trên bề mặt hạt gel sinh trưởng và thoát khỏi môitrường cố định và hoạt động như các tế bào tự do Để khắcphục tình trạng này, gần đây các nhà khoa học đã nghiên cứu

tìm ra loại màng kép với nhân bên trong chứa các tế bào cốđịnh và lớp màng ngoài để tránh sự khuếch tán các tế bào

 Kích thước lỗ xốp, cấu trúc bên trong của chấtmang dễ điều chỉnh, hạn chế được lượng tế bào khuếch tán rangoài [24]

 Nhược điểm:

 Trong một số điều kiện, hoạt động sinh trưởng củatế bào có khả năng phá hủy hệ thống màng chắn bao bọc[12]

 Các tế bào vi sinh vật phân bố không đều, chỉcác tế bào nằm gần bề mặt màng chắn mới có khả năngtiếp xúc tốt với cơ chất [25]

 Các chất có phân tử lượng thấp mới có thểkhuếch tán nhanh chóng đến các tế bào vi sinh vật, nênphương pháp này không thích hợp với môi trường có các cơchất có phân tử lượng lớn [12, 31]

c Cố định nhờ vào keo tụ tế bào

 Nguyên tắc

 Làm gia tăng kích thước của khối tế bào để dễdàng sử dụng trong các bình phản ứng Có thể là keo tụ tựnhiên hoặc là keo tụ nhân tạo bằng cách tạo thành các liênkết ngang [48]

 Sự keo tụ tế bào là việc các tế bào kết chùm lạivới nhau thành những đơn vị lớn hơn hoặc các tế bào keo tụnhân tạo với nhau nhờ các liên kết ngang Kiểu cố định nàythường ứng dụng cho các tế bào thực vật, nấm mốc…

 Ưu điểm [48]:

 Đơn giản, dễ thực hiện

 Không ảnh hưởng đến quá trình truyền khối

 Nhược điểm [48]:

 Do không có màng chắn giữa các tế bào và dungdịch cho nên các tế bào dễ bị tách ra, làm tăng hàm lượng tếbào tự do trong dung dịch

d Nhốt tế bào bằng phương pháp cơ học bên trong một màng chắn

 Nguyên tắc: Kĩ thuật này thường sử dụng loại màng lọcmembrane dạng vi xốp hoặc cố định bằng kĩ thuật vi bao

 Ưu điểm [48]:

 Canh trường lên men không bị lẫn các tế bào, sảnphẩm không cần lọc

 Nhược điểm [48]:

 Hiệu quả truyền khối kém

 Màng có thể bị bẩn do cơ chất hấp phụ lên bềmặt màng

 Màng có thể bị hỏng khi sinh khối tăng quá nhiều

2.2.1.3 Chất mang trong cố định tế bào

Trong kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật, một yếu tố quantrọng quyết định đến việc lựa chọn phương pháp và tính hiệuquả của quá trình cố định chính là vật liệu cố định hay còn gọilà chất mang

Cùng với sự phát triển của nhiều ngành khoa học kỹthuật, ngày càng có nhiều loại vật liệu polymer (tự nhiên, bántổng hợp, tổng hợp) được đưa vào nghiên cứu và ứng dụngtrong kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật Do đó, việc lựa chọnloại chất mang thích hợp với điều kiện cố định cũng như với tếbào vi sinh vật cần cố định có thể được thực hiện dễ dànghơn [48]

Vật liệu dùng làm chất mang khi lựa chọn cần thỏa mãnnhững yêu cầu [24]

 Phù hợp với hình dạng của thiết bị phản ứng sinh học

 Có độ bền lý, hoá và sinh học cao

 Giá thành của chất mang thấp

 Quá trình cố định tế bào dễ tiến hành và điềukhiển, mức độ tạp nhiễm thấp

 Đảm bảo năng suất sản xuất của tế bào cố địnhcao trong thời gian dài

 Có thể tái sử dụng chất mang

 Chất mang dùng để cố định phải an toàn cho con ngườivà cho môi trường

Trong những năm đầu nghiên cứu, người ta thường sử dụngcác chất mang trao đổi ion như carboxyl methyl (CM –) cellulose,diethyl aminoethyl (DEAE –) cellulose, sephadex… Đến những năm 70 –

80, khuynh hướng sử dụng các chất mang polymer tổng hợp nhưpolyacrylamide, polyvinyl alcohol, polyethylene, polyhydroxylethyl, …

được phát triển rộng rãi Trong những năm gần đây, người talại tỏ ra quan tâm nhiều hơn đến những chất mang polymer sinhhọc tự nhiên như alginate, chitosan, … [24,48]

Thành tựu đạt được sau quá trình nghiên cứu và phát triểnkhông ngừng ấy là kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật ngàynay được trợ giúp bằng một hệ thống các chất mang đa dạng.Có thể kể đến một số loại chất mang thường được sử dụng

trong kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật như bảng 2.3 [69].

Mỗi loại chất mang đều có những ưu điểm và nhược điểmnhất định Ứng với từng phương pháp cố định tế bào vi sinhvật, sử dụng các loại chất mang khác nhau sẽ mang lại nhữnghiệu quả cố định khác nhau Chính vì thế mà ngày nay, cácnhà khoa học vẫn luôn cố gắng tạo ra những loại chất mangmới, thích hợp cho từng phương pháp cố định tế bào vi sinh vậtcũng như những chất xúc tác sinh học khác

Bảng 2.3: Một số loại chất mang trong kỹ thuật cố định tế

Dạng hỗn hợp cellulose – polyetylenimin, polysterol – albumin,Polyetylen – albumin, polyetylen – collagen,

…

Bảng 2.4: Ưu – nhược điểm của một số loại chất mang [69] Nhóm chất

Polymer tổng Bền cơ học, độ Giá thành cao,

không tương hợp sinhhọc và có nguy cơhuỷ hoại môitrường

Polymer sinh học

(alginate,

chitosan)

Là sản phẩmcủa tự nhiên, phongphú, rẻ tiền, dễkiếm, có khả năngphân huỷ sinh học

Kém bền cơ lý,độ trương thấp,không đồng nhất

Chất mang vô

Không tương hợpsinh học

2.2.2 Điều kiện cố định vi sinh vật

2.2.2.1 Lựa chọn tế bào và giai đoạn sinh

trưởng để cố định

Trong công nghệ cố định tế bào, có một câu hỏi đượcđặt ra là nên sử dụng tế bào ở giai đoạn nào trong chu trìnhsinh trưởng của chúng để đem đi cố định? Nếu tế bào sử dụngđang ở giai đoạn tăng trưởng, được cung cấp đầy đủ và cânđối các thành phần dinh dưỡng cũng như sử dụng đúng chứcnăng sinh học của nó thì sẽ mang nhiều thuận lợi Chúng sẽ làcác chất xúc tác sinh học có khả năng tự tái tạo, tự hìnhthành và hoạt tính xúc tác của tế bào trong giai đoạn này sẽđược duy trì lâu dài để phục vụ cho các quá trình hoạt động liêntục hay lặp đi lặp lại của tế bào Dù vậy, việc sử dụng tếbào ở giai đoạn tăng trưởng cũng có những hạn chế sau [69]:

 Để duy trì hoạt động của tế bào ở giai đoạn sinhtrưởng, như đã nói cần phải luôn có nguồn năng lượng và dinhdưỡng thích hợp Từ mục đích đó, tế bào có thể sử dụngnguồn dinh dưỡng được cung cấp từ sản phẩm hoặc cơ chất.Điều này dẫn đến việc làm giảm hiệu suất thu hồi sảnphẩm

 Trong một số trường hợp, khi sự phát triển quá cao,dẫn đến việc trội về số lượng làm cho tế bào có thể thoátkhỏi chất mang, gây ô nhiễm sản phẩm

Tóm lại, dù vẫn còn tồn tại nhiều hạn chế, cho đến nay,công nghệ cố định tế bào vẫn được xem là giữ vai trò thenchốt trong việc mang lại hiệu quả cao cho các quá trình sinh học

2.2.2.2 Điều kiện cố định

Để quá trình cố định đạt hiệu quả cao, ta cần phải đáp ứngđược một số điều kiện cơ bản như sau [48]:

 Chất mang có diện tích bề mặt đủ lớn và có cácgốc thích hợp để tế bào tạo các liên kết

 Chất mang dễ sử dụng và tái tạo

 Các tế bào cố định phải có khả năng sống sót caovà hoạt tính sinh học ổn định và lâu dài

 Quá trình thực hiện cố định không gây ảnh hưởng bấtlợi đến hoạt tính sinh học của tế bào

 Chất mang phải có độ xốp đồng đều và dễ điềukhiển, và phải cho phép cơ chất, sản phẩm, cofactor và khí vậnchuyển một cách tự do

 Chất mang phải có độ bền nhiệt,sinh học, hóa học, cơhọc và bền trước các tác động của dung môi, áp suất, enzymevà lực cắt, kéo từ môi trường

 Quá trình cố định phải dễ thực hiện, chi phí phù hợpvà có thể ứng dụng với quy mô lớn

2.2.3 Cố định nấm men trên Cellulose vi khuẩn (Bacterial Cellulose- BC)

2.2.3.1 Cấu trúc Cellulose vi khuẩn

Cellulose là đại phân tử tồn tại phổ biến nhất trên tráiđất, nó tạo thành cấu trúc cơ bản của vách tế bào hầu hếtcác loài thực vật, nấm và một số loài tảo Cellulose vi khuẩnđược định nghĩa là cellulose được tổng hợp từ vi khuẩn [6, 44, 46].Ngày nay, cấu trúc của BC đã được xác định nhờ vào các

kĩ thuật về công nghệ hiện đại, như kĩ thuật nhiễu xạ tia Xgiúp xác định kích thước và phân biệt cấu trúc BC Các kĩthuật khác như phổ Raman, phân tích phổ hồng ngoại, phổcộng hưởng từ hạt nhân giúp xác định các dạng kết tinh củacellulose [6, 43, 60]

BC là một chuỗi polymer do các glucopyranose nối với nhaubằng liên kết -1,4 glucan Những chuỗi glucan được vi khuẩntổng hợp nối lại tạo thành thớ sợi thứ cấp (subfibrils), có bềrộng 1,5 nm Đây là những thớ sợi tự nhiên mảnh nhất khi sosánh với sợi cellulose sơ cấp trong tượng tầng ở một vài loàithực vật Các thớ sợi thứ cấp (subfibrils) kết lại thành những visợi (microfibrils), những vi sợi tạo thành bó (bundles), những bótạo thành dải (ribbons) Dải có chiều dày 3-4 nm và chiều rộng70-80 nm Các dải siêu mịn của BC có chiều dài từ 1 đến 9 µ mtạo thành cấu trúc mắt lưới dày đặc, được ổn định nhờ cácliên kết hydro, đó là lớp màng film (pellicles) [6, 7, 43, 60, 95, 97]

Hình 2.5: Cấu trúc BC [43]

Cellulose vi khuẩn và cellulose thực vật tương tự nhau vềmặt hóa học, -1,4 glucans, nhưng mức độ polymer khác nhau,thực vật từ khoảng 13000-14000, và BC khoảng 2000-6000, trongvài trường hợp lên đến 16000-20000 Ngoài ra BC còn có chỉ sốkết tinh cao (trên 60%) Đường kính của BC chỉ vào khoảng 1/100đường kính của cellulose thực vật [7, 43]

Hình 2.6: a Cellulose vi khuẩn (2 m)

Hình 2.6: Cellulose thực vật [7]

Phân loại Cellulose vi khuẩn nào chiếm ưu thế, trong đó BC

I có thể chuyển hóa thành BC II

2.2.3.2 BC I: là dạng chuyển hóa nhiệt động

lực học của cellulose,

 Dựa vào đặc điểm cấu trúc mà BC được phân chiathành 2 loại khác nhau là BC I và BC II Tùy thuộc điều kiện môitrường nuôi cấy và giống vi khuẩn mà BC dạng các chuỗiglucan xếp song song nhau Có 2 loại là I và I Trong môi trườngnuôi cấy tĩnh thường xuất hiện dạng BC I này, chúng có đườngkính từ 0,05-0,1 m Dù vẫn thường được sử dụng song phươngpháp nuôi cấy tĩnh thường cho sản lượng thấp và mang tính thủcông BC tạo ra từ nuôi cấy tĩnh thường có dạng màng dàytrên bề mặt môi trường BC tổng hợp theo phương pháp nuôicấy bề mặt thường có ưu thế ở việc dễ tạo màng, phù hợpvới thiết bị lên men và độ chịu lực cao [6, 7, 43, 46, 60]

Hình 2.7: Cấu trúc BC trong điều kiện nuôi cấy bề mặt

 BC II: là dạng sợi cellulose ổn định về nhiệt động lựchọc Các chuỗi glucan sắp xếp đối song song với nhau và thườngđược tổng hợp trong môi trường nuôi cấy bề sâu Các sợicellulose này thường có dạng uốn cong, đường kính 0,1-0,2 m Sợicellulose vừa tổng hợp ra thường phân bố khắp môi trường nuôicấy hoặc chúng kết hợp lại với nhau tạo thành các dạng hạtnhỏ hay các hạt hình sao BC tổng hợp theo phương pháp nuôi cấybề sâu tuy có độ chịu lực không cao bằng phương pháp nuôicấy bề mặt nhưng có ưu thế ở độ trương nở và ngậm nướccao [6, 7, 43, 60]

Hình 2.8: Cấu trúc BC trong điều kiện nuôi cấy bề sâu

2.2.3.3 Đặc điểm của Cellulose vi khuẩn

 BC là dạng polymer có độ tinh sạch cao so với cácdạng cellulose khác, là cellulose sinh học duy nhất được tổng hợpkhông có gắn lignin và hemicellulose, có thể dễ dàng bị phânhủy bởi một số nhóm vi sinh vật, là nguồn năng lượng có thểphục hồi [53]

 Sợi Cellulose được tổng hợp có trọng lượng nhẹ, kíchthước ổn định và sức căng cao, có độ bền sinh học cao đặcbiệt là BC I [43, 53, 97]

 Có khả năng giữ nước, độ ẩm cao do đó có thểđiều chỉnh được độ xốp [43, 53, 97]

 Cellulose vi khuẩn được tổng hợp một cách trực tiếp,

vì vậy việc sản xuất các sản phẩm mong muốn không cần quacác bước trung gian Đặc biệt vi khuẩn có thể tổng hợp đượccác loại màng mỏng và các sợi chỉ cực nhỏ [6, 53]

 Có thể kiểm soát các dạng kết tinh và trọng lượngphân tử bằng cách tác động lên các gen liên quan đến quátrình tổng hợp cellulose [19, 97]

2.2.3.4 Vi khuẩn sản xuất Cellulose vi khuẩn

Cellulose vi khuẩn được tổng hợp từ khá nhiều chủng vi

khuẩn (Bảng 2.5), song Acetobacter xylinum được biết đến như là

chủng vi khuẩn sinh tổng hợp BC hiệu quả nhất và được tậptrung nghiên cứu nhiều nhất do những đặc điểm ưu việt củanó như năng suất cao, cấu trúc BC phù hợp cho nhiều ứng dụng

ở các lĩnh vực khác nhau [6, 19, 43, 46, 95]

Bảng 2.5: Một số vi khuẩn có khả năng tổng hợp

Cellulose dị hìnhChưa xác định rõ cấu trúc

 Đặc điểm hình thái (Hình) [2, 6, 7]

 A.xylinum có dạng hình que, hơi cong, kích thước

khoảng 2 µm, có thể chuyển động hoặc không chuyển động,không sinh bào tử Là loại vi khuẩn gram âm, nhưng gram có thểthay đổi do tế bào già đi hoặc do điều kiện môi trường Chúngcó thể đứng riêng lẻ hoặc xếp thành chuỗi

 Khuẩn lạc có kích thước nhỏ, tròn, bề mặtnhầy và trơn bóng, phần giữa khuẩn lạc lồi lên, dày hơn vàsẫm màu hơn các phần xung quanh, rìa mép nhẵn

 A.xylinum là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc, vì thể

chúng sinh trưởng ở bề mặt tiếp xúc giữa môi trường lỏngvà khí

 Trên môi trường dinh dưỡng rắn sau 3-7 ngày

nuôi cấy, A.xylinum có dạng nhầy, có màu kem, hơi trong, nhưng

về sau thì to, đục, màu cà phê sữa, khô dần Trên môi trườnglỏng sau khi nuôi cấy 24h thì xuất hiện một lớp đục dày, sau 36đến 48 giờ hình thành một lớp trong và ngày càng dày lên

Hình 2.9: Vi khuẩn Acetobacter Xylinum

 Đặc điểm sinh trưởng: Theo khoá phân loại của Bergey,

pH tối ưu tùy vào giống Ở 37oC, tế bào sẽ suy thoái hoàn

toàn A.xylinum có khả năng chịu được pH thấp nên thường

người ta bổ sung acid acetic vào môi trường để tránh nhiễm các

vi sinh vật tạp [7, 83]

2.2.3.5 Sản xuất Cellulose vi khuẩn

2.2.3.5.1 Cơ chế sinh tổng hợp BC

BC là một loại polymer được sinh tổng hợp từ vi khuẩn

Acetobacter Xilinum Vi khuẩn này tạo BC ở giữa màng tế bào

chất và màng ngoài, một đơn vi khuẩn Acetobacter Xilinum có

thể polymer hoá trên 200.000 đơn vị glucose thành chuỗi β-1,4glucan/ giây [6, 7, 43]

Con đường sinh tổng hợp cellulose ở Acetobacter Xilinum là

một quá trình tổng hợp gồm nhiều bước liên tiếp nhau trong 2giai đoạn chính: giai đoạn polymer hoá và giai đoạn kết tinh [6, 7,43]:

 Giai đoạn polymer hoá: giai đoạn này có sự tham giacủa nhiều loại enzyme theo sơ đồ sau:

Hình 2.10: Con đường sinh tổng hợp cellulose từ Acetobacter Xylinum

 PTS: hệ thống của phosphotransferase

 UGP: UDP-glucose pyrophosphorylase

 Fru-bi-P: fructose-1,6-bi-phosphate

 Fru-6-P: fructose-6-phosphate

 Glc-6-P: glucose-6-phosphate

 Glc-1-P: glucose-1-phosphate

 PGA: phosphogluconic acid

 UDPGlc: uridine diphosphoglucose

 Giai đoạn kết tinh: Các chuỗi bắt đầu được tổnghợp nối với nhau bằng các liên kết β-1,4 glucan, các chuỗiglucan kết hợp với nhau bằng liên kết Van der Waals tạo nên lớpcác chuỗi glucan Lớp này chỉ tồn tại trong một thời gian ngắn,sau đó sẽ kết hợp với nhau bằng liên kết hydro tạo thành cácsợi cơ bản thường gồm 16 chuỗi glucan Các sợi cơ bản tiếp tụckết hợp với nhau thành vi sợi rồi các bó sợi

2.2.3.5.2 Sản xuất BC

BC được sản xuất từ quá trình lên men nước dừa già sử

dụng vi khuẩn Acetobacter Xilinium nuôi cấy trong những điều kiện

khác nhau tùy theo mục đích sử dụng

 Nước dừa già là môi trường cổ điển, thuận lợi trongviệc nuôi cấy vi sinh vật, chứa nhiều chất dinh dưỡng, khoáng,các loại vitamin và các yếu tố sinh trưởng…

Bảng 2.6: Thành phần nước dừa già [7, 11]

0,2 %0,39 %2,61 %

24 (mg/100g)0,29 (mg/100g)

25 (mg/100g)

PhosphoKaliNatriVitamin CFolateAcid béo noAcid béokhông no

20 (mg/100g)

250 (mg/100g)

105 (mg/100g)2,4 (mg/100g)3,0(mg/100g)0,176 (mg/100g)0,010 (mg/100g)Phần còn lại

Các khoángkhác

 Môi trường nhân giống cấp 1,2 và lên men: (tính trên 1lít nước dừa già)

 (NH4)2SO4: 8g

 (NH4)2HPO4 : 2g

 Glucose: 20g

 Cao nấm men: 2g

 pH: 4,5 (chỉnh bằng acid acetic)

Môi trường nhân giống đem đi tiệt trùng ở 121oC trong 20phút rồi được làm nguội, môi trường lên men được thanh trùngbằng cách đun sôi trong 20 phút

 Sau khi chuẩn bị môi trường, tiến hành lên men theo sơđồ sau:

Hình 2.11: Sơ đồ quy trình lên men sản xuất BC [6]

 Điều kiện nuôi cấy

 Nhận thấy tổng quát khoảng pH tối ưu cho

Acetobacter xylinum sản xuất cellulose là 4-7 Theo đặc điểm sinh

lý, A xylinum vừa sản sinh ra cellulose và cellulase Do đó nên ổn

định pH khoảng 4-4,5, nhỏ hơn 4 sẽ ức chế hoạt tính cellulase,còn lớn hơn 5 là điều kiện phù hợp cho việc sản sinh và tạo

hoạt tính enzyme này [3] Nhiệt độ phát triển tối ưu A.xylinum

sản xuất cellulose là 25-30o C Ở 24o C sản lượng cellulose thu đượcnhiều hơn 50% sau 72 giờ nuôi cấy nhưng điều kiệân này khôngcho kết quả mong muốn khi sản xuất công nghiệp.Ngoài ra sảnxuất BC còn phụ thuộc vào kiểu nuôi cấy, 2 kiểu nuôi cấychính thường được sử dụng [43, 45]:

 Nuôi cấy bề mặt: hay còn gọi là nuôi cấy tĩnh,người ta sử dụng những khay nhựa đã chuẩn bị môi trường nuôicấy với chiều cao lớp môi trường thấp, tiến hành nuôi cấy

chủng A.xylinum ở điều kiện tối ưu Trong điều kiện tĩnh, những

thớ sợi thứ cấp liên tục được lộ ra từ lỗ sắp xếp thẳng hàngtrên bề mặt của tế bào vi khuẩn, kết thành những vi sợi,lắng sâu xuống môi trường sinh trưởng, sau đó dải cellulosechồng chập và xoắn với nhau tạo tấm cellulose trên bề mặtcanh trường dinh dưỡng, ngay mặt phân cách pha lỏng khí giàu

oxy (hình 2.12) Dù vẫn được sử dụng để sản xuất BC nhưng lên

men tĩnh cho sản lượng hoàn toàn thấp và mang tính thủ công[6, 43]

Hình 2.12: Màng BC được tạo thành trong điều kiện nuôi cấy tĩnh

bề mặt

 Nuôi cấy bề sâu: Tiến hành nuôi cấy trong thùnglên men chứa dịch môi trường có cánh khuấy và thổi khí oxyhoặc khay lắc Vi khuẩn phân bố đều trong toàn dung dịch vàphát triển theo chiều sâu của môi trường Cellulose được tạo ra

có dạng viên hình cầu, elip…(hình 2.13) Đây là kĩ thuật nuôi

cấy mong đợi sẽ đem lại hiệu quả tạo BC cao, có thể ứng dụng

trong sản xuất BC thương mại nhưng hiện nay BC sản xuất chỉ với

sản lượng thấp Sản xuất cellulose từ Acetobacter xylinum trong

nuôi cấy chìm bị bao quanh bởi nhiều vấn đề lớn, nhất là điềukiện không ổn định khi nuôi cấy Tính không ổn định được biểuthị bởi sự mất khả năng sản xuất cellulose và thay thế dầndần tế bào sản xuất cellulose bằng chủng đột biến không sảnxuất [11, 43]

Hình 2.13: BC được tạo thành trong điều kiện nuôi cấy bề sâu

2.2.3.6 Các phương pháp cố định vi sinh vật

trên chất mang Cellulose vi khuẩn

Theo [6], có hai phương pháp phổ biến thường được dùngđể cố định vi sinh vật trên BC là phương pháp hấp phụ vàphương pháp hấp phụ- ủ

2.2.3.6.1 Phương pháp hấp phụ

Cũng như nhiều chất mang như miếng trái cây, vỏ nho,cam, DEAE- cellulose, DCM-cellulose, phương pháp cố định hấp phụtrên BC cũng dựa vào lực hấp phụ trên bề mặt chất mang cócấu trúc xốp, nhiều mao quản Phương pháp được thực hiệnbằng cách ngâm chất mang BC trong dung dịch huyền phù vi sinhvật, BC sẽ trương nở dần và vi sinh vật sẽ tự động kết lắngvà liên kết với chất mang bằng cách hấp phụ trên chất mangđó [48]

Đây là phương pháp sử dụng những chất mang sạch, vệsinh, rẻ tiền, sản phẩm lên men có hương vị tốt đồng thời cókhả năng ứng dụng lên men ở nhiệt độ thấp Song ưu điểmcủa BC là trong quá trình cố định, BC sẽ trương nở hoàn toàntạo điều kiện hấp phụ tốt hơn những chất mang có cấu trúccellulose thực vật Theo[6], khi sử dụng BC để cố định vi khuẩn

Acetobacter Xilinum, hiệu suất cố định đạt 73 %, cao hơn hẳn các

chất mang hấp phụ khác.[21, 48, 60]

Tuy nhiên, phương pháp hấp phụ tốn khá nhiều thời giancố định so với việc cố định qua màng chắn như Na- alginates Vớicác chất mang là các miếng trái cây, thời gian cố định thườngkéo dài khoảng 24h, các chất mang cellulose, vỏ trái câythường được cố định trong 5-8h; trong khi đó thời gian thực hiệncố định với Na-alginates chỉ khoảng vài chục phút [21, 48, 60]

Theo Nguyễn Thúy Hương và các cộng sự, trong thí nghiệm

cố định vi khuẩn Acetobacter Xilinum trên bề mặt BC, mật độ tế

bào đã hấp phụ là 1,09 109 (tế bào/ g chất mang), song mật độtế bào hấp thụ trên bề mặt chất mang là cao hơn rất nhiều sovới hấp phụ trong lòng chất mang (58 lần) Hơn nữa, những liênkết hấp phụ yếu giữa vi sinh vật và bề mặt chất mang thườngkhông bền vững, do đó dễ dẫn đến hiện tượng rửa trôi tếbào cố định trong quá trình lên men [6]

2.2.3.6.2 Phương pháp hấp phụ- ủ

Do cấu trúc và thành phần hóa học đặc biệt của mình, visinh vật cố định trên BC sau thời gian hấp phụ có thể sử dụngchất dinh dưỡng còn lại của BC để sinh trưởng tăng sinh khối, vìvậy cố định vi sinh vật trên BC sẽ thu được mật độ tế bào cốđịnh cao hơn hẳn các loại chất mang cùng phương pháp Phươngpháp cố định hấp phụ- ủ gồm hai giai đoạn chính như sau [6 ]:

 Giai đoạn 1: BC đóng vai trò là chất nền (matrix) đểhấp phụ vi sinh vật cần cố định Sau khi ngâm BC trong dịchgiống vi sinh vật, BC trương nở, vi sinh vật sẽ theo dịch trong quátrình trương nở bám xung quanh mặt ngoài và một phần nhỏ lenlỏi vào bên trong mạng cellulose

 Giai đoạn 2: BC đóng vai trò là giá đỡ (supporter) đểnhân giống thu sinh khối vi sinh vật Như vậy sau thời gian ủ,mật độ vi sinh vật gia tăng trong mạng lưới celluose và vi khuẩncố định trong BC lúc này bao gồm số vi sinh vật hấp phụ banđầu trên chất nền và số vi sinh vật hình thành sau giai đoạn ủ

Theo [6] trong nghiên cứu cố định vi khuẩn Acetobacter

Xilinum trên BC bằng phương pháp bẫy -hấp phụ, sau thời gian ủ

3 ngày, mật độ vi sinh vật từ 1,09 109 (tế bào/g chất mang)tăng lên 2,865 109 (tế bào/g chất mang) (cao hơn 2,6 lần), trongkhi đó, mật độ vi sinh vật trên bề mặt lúc này chỉ cao hơnmật độ bên trong chất nền là 2,9 lần (ở giai đoạn hấp phụ, tỉlệ này là 57 lần)

BC hứa hẹn sẽ là một chất mang cố định mới và hiệuquả không chỉ vì khả năng tăng sinh khối trong thời gian ủ tạomật độ tế bào cao hơn hẳn ban đầu mà nó còn có khả năngổn định mật độ vi sinh vật cố định trong một thời gian dài bảoquản ở nhiệt độ phòng Theo [bài báo], chế phẩm BC ban đầuvới mật độ 4,8 109 (tế bào/g chất mang) sau 1 tháng và 3tháng bảo quản ở nhiệt độ phòng có mật độ tế bào lầnlượt là 4,1 109 (tế bào/ g chất mang) và 3,4 109 (tế bào/ g chấtmang) [6 ]

2.2.3.7 Ưu nhược điểm của việc cố định

nấm men trên chất mang cellulose vi khuẩn

Bên cạnh các ưu nhược điểm của phương pháp cố định bềmặt chất mang, phương pháp cố định nấm men trên BC còn cócác ưu nhược điểm riêng sau [5, 6]:

 Ưu điểm [4, 5,6]:

 Do đặc điểm cấu trúc của mình, BC có thể sử dụngđể cố định nấm men theo phương pháp hấp phụ- ủ 2 giai đoạn:giai đoạn hấp phụ chủ yếu là cố định trên bề mặt BC và giaiđoạn ủ tạo điều kiện cho nấm men sinh trưởng tăng mật độ tếbào ở bên trong cấu trúc của nó Vì vậy, cố định trên BC chohiệu suất và mật độ tế bào cao hơn hẳn các phương pháp cốđịnh trên bề mặt khác

 Phù hợp hình dạng thiết bị phản ứng sinh học

 Tính chất cơ lý bền và ổn định, BC không tan trongmôi trường lên men

 BC có độ trương nở tốt

 BC đã qua xử lý không gây tác động kìm hãm đếnhoạt động sống của vi sinh vật cố định

 Giá thành thấp, có khả năng tái sử dụng, an toàncho môi trường

 Nhược điểm [6]:

 Do bản chất vẫn chủ yếu là cố định trên bề mặtnên hiệu suất cố định và mật độ tế bào cố định trên BCvẫn không cao bằng các phương pháp cố định bằng cách nhốttrong khung mạng xốp như alginates

 Không thể cố định các vi sinh vật sinh ra cellulose vìbản chất của chất nền là cellulose

2.2.4 Ảnh hưởng của việc cố định nấm men

Việc cố định tế bào sẽ dẫn đến việc thay đổi về sinhtrưởng, sinh lý, hình thái và các hoạt động trao đổi chất củatế bào nấm men Rất nhiều nhà khoa học như Melzoch-1994;Norton và D’Amore-1994; Walsh và Malone- 1995 đã nghiên cứu vàđưa ra các lý do để giải thích cho những sự thay đổi này Songthật khó để dự đoán chính xác những thay đổi này, nhất lànhững thay đổi về các hoạt động trao đổi chất Khá nhiều cácthông số đã được đưa ra để giải thích như sự giảm khả năngtruyền khối bằng khuếch tán (Webb- 1986), ảnh hưởng của ứngsuất bề mặt và áp suất thẩm thấu (Vijayalakshmi- 1979), sựgiảm hoạt độ nước aw (Mattiasson-1984), những tương tác giữacác tế bào với nhau (Shuler-1985)… Đồng thời, nhiều nghiên