Tách chiết collagen từ da cá tra

LUẬN VĂN THẠC SĨ TÁCH CHIẾT COLLAGEN TỪ DA CÁ TRA ¾ Phân tích các đặc tính của sản phẩm collagen chiết được như: Trọng lượng phân tử, thành phần acid amin, hàm lượng ẩm, hàm lượng các ch

Trang 1

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

NGÔ HỒNG BẢO CHÂU

Trang 2

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH Cán bộ hướng dẫn khoa học: TS Mai Thanh Phong

3 TS Nguyễn Đình Thành (Ủy viên)

4 TS Nguyễn Vĩnh Khanh (Ủy viên)

5 TS Mai Thanh Phong (Ủy viên)

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá luận văn và Bộ môn quản lý chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa

Chủ tịch Hội đồng đánh giá luận văn Bộ môn quản lý chuyên ngành

Trang 3

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHIÃ VIỆT NAM

- - -oOo -

Tp HCM, ngày 30 tháng 6 năm 2010

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Chuyên ngành: Công nghệ hóa học

MSHV: 00508392

(Pangasius hypophthalmus)

2- NHIỆM VỤ LUẬN VĂN:

• Khảo sát quá trình loại tạp chất trong da cá trước khi tách chiết

• Khảo sát quá trình chiết collagen bằng acid acetic và bằng enzyme pepsin

• Xác định phương trình động học các quá trình tách chiết

• Tinh chế collagen bằng CO2 siêu tới hạn

• Phân tích các tính chất của collagen : Trọng lượng phân tử, nhiệt độ biến

tính, chụp SEM xác định cấu trúc sợi, phổ hồng ngoại xác định các nhóm

chức có mặt trong collagen

3- NGÀY GIAO NHIỆM VỤ : 25/1/2010

4- NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ : 30/11/2010

5- HỌ VÀ TÊN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN : TS.MAI THANH PHONG

Nội dung và đề cương Luận văn thạc sĩ đã được Hội Đồng Chuyên Ngành

thông qua

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN CHỦ NHIỆM BỘ MÔN KHOA QL CHUYÊN NGÀNH

(Họ tên và chữ ký) QUẢN LÝ CHUYÊN NGÀNH (Họ tên và chữ ký)

(Họ tên và chữ ký)

Trang 4

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn Khoa Kỹ Thuật Hóa Học – Trường

Đại Học Bách Khoa TP.HCM đã hổ trợ trang thiết bị, máy móc, vật tư, phòng thí

nghiệm giúp em hoàn thành tốt luận văn này

Xin cảm ơn dự án RBE ( Research Based Education) - JICA đã hổ trợ trong

suốt quá trình thực hiện đề tài B1-07 ‘Fish collagen extraction and appication’, và

xin gửi lời tri ân đến quý thầy cô trong nhóm nghiên cứu collagen, PGS.TS Phan

Đình Tuấn, TS.Mai Thanh Phong (Bộ môn Quá trình thiết bị), TS Nguyễn Hoàng

Dũng, Cô Nguyễn Thị Nguyên (Bộ môn Công nghệ thực phẩm), và NCS Lê Thu

Hương đã hướng dẫn và tạo điều kiện làm việc tốt nhất cho luận văn

Cuối cùng, xin gửi lời chúc sức khỏe đến quý thầy cô và các bạn lớp cao học

K2008 – Ngành công nghệ hóa học

Xin cảm ơn

Trang 5

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ

Luận văn này hướng đến một đối tượng nghiên cứu khá hấp dẫn đó là collagen cá Trước nay, người ta thường sử dụng collagen trích từ động vật hữu nhủ ứng dụng trên các lĩnh vực mỹ phẩm, thực phẩm, và y dược học Tuy nhiên, trong những năm gần đây, trên thế giới đã bộc phát các căn bệnh như bệnh lở mồm long móng ở heo, bệnh bò điên ở bò Cho nên, các chế phẩm này không an toàn Luận văn này mở ra một hướng nghiên cứu mới về collagen từ loài cá tra trong nước Trong luận văn này, da cá tra qua quá trình loại tạp chất bằng LasNa 1%, 4h, nhiệt độ 4oC Sau đó, chúng được chiết với acid acetic 0.25 M – 1 M và enzyme pepsin 0.25 – 0.75 % (w/v) Dịch chiết được kết tủa bằng NaCl 0.9M thu được collagen thô Collagen thô tiếp tục được tinh chế qua màng cellophan và qua CO2

siêu tới hạn thành collagen sạch, sấy thăng hoa thu được sản phẩm collagen dạng

rắn, màu trắng đục

Trang 6

LUẬN VĂN THẠC SĨ TÁCH CHIẾT COLLAGEN TỪ DA CÁ TRA

MỤC LỤC

I ĐẶT VẤN ĐỀ 8

II.TỔNG QUAN 10

II.1 COLLAGEN 10

II.1.1 Cấu tạo, vị trí và chức năng: 10

II.1.2 Tính chất lý hóa của collagen 16

II.1.3 Các lĩnh vực ứng dụng của collagen: 18

II.2 CÁC VẤN ĐỀ TRONG TÁCH CHIẾT COLLAGEN: 25

II.2.1 Sự phá vỡ tế bào 25

II.2.2 Sự tách chiết protein collagen 26

II.2.3 Phương pháp tinh sạch collagen 27

II.2.4 Làm khô và bảo quản chế phẩm collagen 29

II.2.5 Sử dụng CO 2 siêu tới hạn trong tinh sạch collagen: 29

II.3 CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 34

II.3.1 Các công trình nghiên cứu collagen trên thế giới và ở nước ta hiện nay: 34

II.3.2 Những vấn đề còn tồn tại và hướng tập trung nghiên cứu giải quyết: 49

III NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 52

IV PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 53

IV.1 BẢO QUẢN NGUYÊN LIỆU: 53

IV.2 QUÁ TRÌNH TIỀN XỬ LÍ: 53

IV.3 PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT COLLAGEN 54

IV.3.1 Tách chiết collagen bằng acid: 54

IV.3.2 Tách chiết collagen bằng enzyme: 56

IV.4 PHƯƠNG PHÁP TINH SẠCH COLLAGEN 60

IV.4.1 Tách muối và các tạp chất có phân tử lượng thấp khỏi collagen: 60

IV.4.2 Tách béo trong collagen bằng CO 2 siêu tới hạn: 62

IV.5 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SẢN PHẨM COLLAGEN 64

Trang 7

IV.5.1 Phân tích hàm lượng ẩm 64

IV.5.2 Phân tích hàm lượng chất vô cơ hữu cơ 64

IV.5.3 Phân tích hàm lượng chất béo 65

IV.5.4 Phân tích hàm lượng hydroxyproline 66

IV.5.5 Phương pháp điện di 69

IV.5.6 Phương pháp xác định thành phần acid amin: 70

IV.5.7 Phương pháp đo độ nhớt dung dịch collagen 70

IV.5.8 Scanning electron microscopy (SEM) và transmission electron microscopy (TEM) 71

IV.5.9 Phổ hồng ngoại IR 71

V KẾT QUẢ - NHẬN XÉT 72

V.1 KẾT QUẢ QUÁ TRÌNH TIỀN XỬ LÍ DA CÁ: 72

V.1.1 Kết quả phân tích các thành phần trong da cá 72

V.1.2 Kết quả khả năng loại béo của LasNa: 72

V.1.3 Ảnh hưởng của LasNa đến hàm lượng hydroxyproline trong da: 73

V.1.4 Ảnh hưởng của quá trình tẩy màu bằng H 2 O 2 76

V.2 KẾT QUẢ QUÁ TRÌNH CHIẾT COLLAGEN BẰNG ACID ACETIC 77

V.2.1 Kết quả chiết collagen bằng acid acetic 77

V.2.2 So sánh khả năng tách chiết của acid acetic và acid lactic 79

V.2.3 Động học của quá trình chiết collagen bằng acid acetic 82

V.3 TÁCH CHIẾT COLLAGEN BẰNG ENZYME PEPSIN 85

V.3.1 Hiệu suất tách chiết: 85

V.3.2 Thực nghiệm yếu tố toàn phần: 90

V.4 KẾT QUẢ QUÁ TRÌNH TINH SẠCH COLLAGEN 94

V.4.1 Phân tích hàm lượng chất béo 94

V.4.2 Phân tích các thành phần trong collagen thành phẩm 94

V.5 ĐIỆN DI 94

V.6 NHIỆT ĐỘ BIẾN TÍNH COLLAGEN 96

V.7 SEM VÀ TEM 98

Trang 8

V.8 Phổ IR 100

VI KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 102

TÀI LIỆU THAM KHẢO 105

PHỤ LỤC 107

Trang 9

DANH MỤC HÌNH

Hình 2 1 Cấu tạo phân tử acid amin 10

Hình 2 2 Chuỗi xoắn collagen gồm 3 dây xoắn chặt .13

Hình 2 3 Trật tự sắp xếp các acid amin trong collagen 13

Hình 2 4 Tổ chức bó sợi collagen 14

Hình 2 5 Từng bậc cấu tạo trong chuỗi collagen 14

Hình 2 6 Sản phẩm phomat có chứa collagen hydrolysate làm giảm hàm lượng chất béo .19

Hình 2 7 Sản phẩm kẹo dẻo có vỏ màng là collagen hydrolysate 19

Hình 2 8 Collagen hydrolysate làm chất kết dính trong thanh kẹo 19

Hình 2 9 Sản phẩm thịt nguội có chứa collagen hydrolysate 20

Hình 2 10 Collagen hydrolysate làm gạn trong các loại thức uống 20

Hình 2 11Viên nang mềm có lớp vỏ ngoài làm từ collagen .21

Hình 2 12 Viên nang cứng làm từ chất liệu collagen 22

Hình 2 13 Vai trò của collagen hydrolysate trong tái tạo khớp xương 23

Hình 2 14 Ứng dụng collagen hydrolysate trong kỹ thuật nội soi 23

Hình 2 15 Collagen hydrolysate trong các mảnh bọt biển sử dụng trong nha khoa 24 Hình 2 16 Mặt nạ dưỡng da collagen hydrolysate 25

Hình 2 17 Tóc bị hư tổn và phục hồi sau khi sử dụng sản phẩm chăm sóc tóc có chứa collagen hydrolysate 25

Hình 2 18 Quy trình tách chiết collagen 26

Hình 2 19 Giản đồ pha (áp suất – nhiệt độ) của carbon dioxide 32

Hình 2 20 Giản đồ pha (mật độ - áp suất) của carbon dioxide 32

Hình 2 21 Sơ đồ quy trình tách chiết bằng CO2 siêu tới hạn 33

Hình 2 22 Quy trình chiết collagen bằng cid acetic 35

Hình 2 23 Sắc kí điện di SDS-PAGE collagen loại I của da heo và collagen da cá 36

Hình 2 24 Quy trình chiết collagen bằng pepsin 38

Hình 2 25 Sắc kí điện di SDS-PAGE collagen loại I của da heo và collagen da cá nóc 40

Hình 2 26 Quy trình chiết collagen có mặt vi khuẩn Bacillus 43

Hình 2 27 Biểu đồ sự phụ thuộc độ nhớt theo nhiệt độ .46

Hình 2 28 Cấu trúc bề mặt collagen (a) và gelatin (b) 46

Hình 2 29 Phổ FTIR của ASC và PSC từ cá da trơn largefin longbarbel (Mystus macropterus) 48

Hình 2 30 Đồ thị đường chuẩn biểu thị mối tương quan giữa diện tích peak và hàm lượng acid amin 49

Hình 4 1Quy trình xử lí da cá nguyên liệu 53

Hình 4 2 Quy trình chiết collagen bằng acid acetic 54

Hình 4 3 Thiết bị Automatic lab reactor, Mettler Toledo, Labmax 55

Trang 10

Hình 4 4 Quy trình chiết collagen bằng pepsin 57

Hình 4 5 Sơ đồ quá trình tinh chế collagen 60

Hình 4 6 Màng cellophan 61

Hình 4 7 Thiết bị CO2 siêu tới hạn THAR SFC SN.11419 62

Hình 4 8 Sơ đồ quy trình tách béo collagen bằng CO2 siêu tới hạn .63

Hình 4 9 Sơ đồ quy trình phân tích hydroxyproline 68

Hình 4 10 Máy diện di BIORAD LABORATORY, 041 BR71844 70

Hình 5 1 Đồ thị hàm lượng chất béo theo thời gian xử lý da cá với LasNa 72

Hình 5 2 Đồ thị đường chuẩn hydroxyproline 73

Hình 5 3 Đồ thị hàm lượng hydroxyproline theo thời gian xử lý da cá bằng LasNa 1% 74

Hình 5 4 Đồ thị ảnh hưởng của quá trình xử lý da cá bằng LasNa 1% lên hàm lượng hydroxyproline và hàm lượng béo 75

Hình 5 5 Da cá trước và sau tẩy màu bằng H2O2 1% 76

Hình 5 6 Đồ thị chiết collagen bằng acid acetic ở các nồng độ khác nhau 78

Hình 5 7 Đồ thị chiết collagen bằng acid lactic ở các nồng độ khác nhau 80

Hình 5 8 Đồ thị so sánh hiệu suất chiết collagen bằng acid lactic 0.25M và acid acetic 0.25M 80

Hình 5 12 Đường động học của quá trình tách chiết collagen bằng acid acetic 0.25M 83

Hình 5 13 Đường động học của quá trình tách chiết collagen bằng acid acetic 0.5M .83

Hình 5 14 Đường động học của quá trình tách chiết collagen bằng acid acetic 0.75M 84

Hình 5 15 Đường động học của quá trình tách chiết collagen bằng acid acetic 1.0M .84

Hình 5 16 Đồ thị hiệu suất chiết collagen bằng pepsin ở 3oC, tỉ lệ L/R = 20 87

Hình 5 21 Hình ảnh điện di collagen ASC và PSC 94

Hình 5 22 Điện di collagen 95

Hình 5 23 Đồ thị đường cong biến tính nhiệt của dung dịch collagen 0.3% 97

Hình 5 24 Hình ảnh collagen ASC (phương pháp chụp SEM) 98

Trang 11

Hình 5 25 Hình ảnh collagen PSC (phương pháp chụp SEM) 98

Hình 5 26 Hình ảnh một bó sợi collagen ASC (phương pháp chụp TEM) 99

Hình 5 27 Hình ảnh collagen ASC bị biến tính khi để dịch chiết đến 48h 100

Hình 5 28 Phổ FTIR của collagen (ASC) da cá tra 100

Trang 12

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2 1 Phân loại và chức năng của protein 12

Bảng 2 2 So sánh thành phần acid amin trong collagen và các loại protein khác 15

Bảng 2 3 Sự so sánh các tính chất vật lý của các pha lỏng, khí, và SCF 30

Bảng 2 4 Thành phần amino acid của dung dịch collagen da cá nóc chiết bằng pepsin .41

Bảng 2 5 Các thành phần trong collagen cá chỉ vàng: 51

Bảng 4 1 Thí nghiệm chiết collagen bằng acid acetic 55

Bảng 4 2 Các yếu tố ảnh hưởng và các mức cao thấp trong quy trình chiết collagen bằng pepsin 58

Bảng 4 3 Quy hoạch thực nghiệm chiết collagen bằng enzyme pepsin 59

Bảng 5 1 Thành phần da cá trước và sau xử lý với LasNa 1% 72

Bảng 5 2 Hàm lượng chất béo trước và sau xử lý với LasNa 1% 72

Bảng 5 3 Xây dựng đường chuẩn hydroxyproline 73

Bảng 5 4 Hàm lượng hydroxyproline trong da cá trước và sau xử lý với LasNa 1% .73

Bảng 5 5 Hàm lượng chất béo trong da cá trước và sau xử lý với LasNa 1% 75

Bảng 5 6 Hàm lượng hydroxyproline trong da cá sau quá trình tẩy màu 76

Bảng 5 7 Hiệu suất chiết collagen bằng acid acetic ở các nồng độ 77

Bảng 5 8 Hiệu suất chiết collagen bằng acid lactic ở các nồng độ 79

Bảng 5 9 Hệ số động học của quá trình chiết collagen bằng acid acetic 82

Bảng 5 10 Giá trị độ hấp thu đo được trong quá trình chiết collagen bằng enzyme pepsin 85

Bảng 5 11 Hàm lương hydroxyproline trong dịch chiết pepsin (mg/ml) 86

Bảng 5 12 Hiệu suất chiết collagen bằng enzyme pepsin (%) 87

Bảng 5 13 Các yếu tố theo tỉ lệ xích tự nhiên 90

Bảng 5 14 Ma trận quy hoạch thưc nghiệm yếu tố toàn phần 91

Bảng 5 15 Các hệ số b trong phương trình hồi quy 91

Bảng 5 16 Thí nghiệm ở tâm phương án 92

Bảng 5 17 Các giá trị t trong kiểm định theo tiêu chuẩn student 93

Bảng 5 18 Hàm lượng chất béo trong mẫu collagen ASC và PSC trước và sau quá trình loại béo bằng CO2 siêu tới hạn 94

Bảng 5 19 Các thành phần trong sản phẩm collagen 94

Bảng 5 20 Độ nhớt dung dịch collagen 0.3% theo nhiệt độ 96

Bảng 5 21 So sánh nhiệt độ biến tính collagen da cá tra với các loài khác 97

Trang 13

TÁCH CHIẾT COLLAGEN TỪ DA CÁ TRA

cá là sợi collagen có rất nhiều ứng dụng trong công nghiệp mỹ phẩm và dược phẩm Nếu chúng ta tách chiết được collagen trong da cá, hứa hẹn sẽ nâng cao giá trị kinh

tế của nó, đồng thời giải quyết được vấn đề ô nhiễm môi trường là một thực trạng cấp bách hiện nay của các nhà máy chế biến thủy sản nước ta

Mục tiêu chính của luận văn này là:

¾ Khảo sát các quá trình tẩy rửa loại tạp chất trong da cá trước khi đi vào tách chiết

¾ Khảo sát các quá trình tách chiết collagen bằng các tác chất khác nhau ở các nồng độ, nhiệt độ, thời gian khác nhau

¾ Tinh sạch collagen Tạo sản phẩm collagen có độ sạch nhất định để có thể ứng dụng trong các lĩnh vực công nghiệp mỹ phẩm, thực phẩm

¾ Tìm phương trình động học tách chiết collagen

Trang 14

¾ Phân tích các đặc tính của sản phẩm collagen chiết được như: Trọng lượng phân tử, thành phần acid amin, hàm lượng ẩm, hàm lượng các chất vô cơ hữu

cơ, hàm lượng chất béo, nhiệt độ biến tính collagen

Trang 15

II.TỔNG QUAN

II.1 COLLAGEN

II.1.1 Cấu tạo, vị trí và chức năng:

Trước khi tìm hiểu về collagen, chúng ta sơ lược đôi nét về protein Protein là một hợp chất đại phân tử được tạo thành từ rất nhiều các đơn phân là các acid amin (hình 2.1) Acid amin được cấu tạo bởi ba thành phần: một là nhóm amin (-NH2), hai là nhóm cacboxyl (-COOH) và cuối cùng là nguyên tử cacbon trung tâm đính với 1 nguyên tử hyđro và nhóm biến đổi R quyết định tính chất của acid amin Khoảng 20 acid amin đã được phát hiện trong thành phần của tất cả các loại protein khác nhau trong cơ thể sống

Hình 2 1 Cấu tạo phân tử acid amin Trong protein có bốn bậc cấu trúc:

9 Cấu trúc bậc một: Các acid amin nối với nhau bởi liên kết peptide hình thành nên chuỗi polypeptide Đầu mạch polypeptide là nhóm amin của acid amin thứ nhất và cuối mạch là nhóm cacboxyl của acid amin cuối cùng Cấu trúc bậc một của protein thực chất là trình tự sắp xếp của các acid amin trên chuỗi polypeptide Cấu trúc bậc một của protein có vai trò tối quan trọng vì trình tự các acid amin trên chuỗi polypeptide sẽ thể hiện tương tác giữa các phần trong chuỗi polypeptide, từ

đó tạo nên hình dạng lập thể của protein và do đó quyết định tính chất cũng như vai

Trang 16

trò của protein Sự sai lệch trong trình tự sắp xếp của các acid amin có thể dẫn đến

sự biến đổi cấu trúc và tính chất của protein

9 Cấu trúc bậc hai: là sự sắp xếp đều đặn các chuỗi polypeptide trong không gian Chuỗi polypeptide thường không ở dạng thẳng mà xoắn lại tạo nên cấu trúc xoắn α và cấu trúc nếp gấp β, được cố định bởi các liên kết hyđro giữa những acid amin ở gần nhau Các protein sợi như keratin, collagen (có trong lông, tóc, móng, sừng) gồm nhiều xoắn α, trong khi các protein cầu có nhiều nếp gấp β hơn

9 Cấu trúc bậc ba: Các xoắn α và phiến gấp nếp β có thể cuộn lại với nhau thành từng búi có hình dạng lập thể đặc trưng cho từng loại protein Cấu trúc không gian này có vai trò quyết định đối với hoạt tính và chức năng của protein Cấu trúc này lại đặc biệt phụ thuộc vào tính chất của nhóm -R trong các mạch polypeptide Chẳng hạn nhóm -R của cystein có khả năng tạo cầu đisulfur (-S-S-), nhóm -R của prolinE cản trở việc hình thành xoắn, từ đó vị trí của chúng sẽ xác định điểm gấp, hay những nhóm -R ưa nước thì nằm phía ngoài phân tử, còn các nhóm kị nước thì chui vào bên trong phân tử Các liên kết yếu hơn như liên kết hydro hay liên kết điện hóa trị có ở giữa các nhóm -R có điện tích trái dấu

9 Cấu trúc bậc bốn: Khi protein có nhiều chuỗi polypeptide phối hợp với nhau thì tạo nên cấu trúc bậc bốn của protein Các chuỗi polypeptide liên kết với nhau nhờ các liên kết yếu như liên kết hydro

Phân loại protein: Có nhiều loại protein, mỗi loại đảm nhiệm một vai trò

khác nhau trong cơ thể:

Trang 17

Bảng 2 1 Phân loại và chức năng của protein

Collagen là loại protein cấu trúc trong cơ thể động vật Nó được phân bố trong các bộ phận như da, cơ, gân, sụn, dây chằng xương và răng Trong thành phần của da, ở lớp bì chứa rất nhiều collagen tạo ra một hệ thống nâng đỡ, hỗ trợ cho các đặc tính cơ học của da như sức căng, độ đàn hồi, duy trì độ ẩm Tùy theo từng độ tuổi, điều kiện sống, tác nhân môi trường, da có thể bị lão hóa hoặc tổn thương, sợi collagen mất dần tính đàn hồi và săn chắc do cấu trúc collagen bị phá

vỡ

Về cấu trúc của phân tử collagen, phân tử collagen hay còn gọi là tropocollagen là một cấu trúc dạng sợi hình ống chiều dài khoảng 300nm, đường kính 1.5 nm Mỗi sợi collagen này được cấu tạo từ ba chuỗi polypeptide nối với nhau bằng các liên kết hydro và xoắn lại với nhau giống như sợi dây thừng (hình 2.2) Mỗi một vòng xoắn có độ dài là 3.3 gốc amino acid, chiều cao là 2.9 A0 Mỗi một chuỗi polypeptide trong collagen được cấu tạo từ các amino acid theo một trật

tự, thông thường là Gly - Pro - Y, hoặc Gly - X – Hyp (hình 2.3) Trong đó, X, Y là những đơn vị amino acid khác Proline (Pro) và hydroxyproline (Hyp) chiếm khoảng 1/6 chuỗi, glycine chiếm khoảng 1/3 chuỗi Tổng cộng chỉ riêng proline, hydroxyproline, và glycine chiếm ½ chuỗi collagen Các amino acid còn lại chiếm

½ Glycine đóng một vai trò hết sức quan trọng trong cấu trúc sợi siêu xoắn của

Protein cấu trúc Cấu trúc, nâng đỡ

Protein enzyme Xúc tác sinh học: tăng nhanh, chọn lọc các phản ứng sinh

hóa Protein hormone Điều hòa các hoạt động sinh lý

Protein vận chuyển Vận chuyển các chất

Protein vận động Tham gia vào chức năng vận động của tế bào và cơ thể

Protein thụ quan Cảm nhận, đáp ứng các kích thích của môi trường

Protein dự trữ Dự trữ chất dinh dưỡng

Trang 18

collagen Tropocollagen liên kết với nhau theo kiểu đầu nối đuôi hình thành collagen fibril Các collagen fibril này bó lại với nhau hình thành sợi collagen siêu cáp – collagen fiber (hình 2.4, 2.5) Vì thế collagen rất chắc, dai, và bền

Về phân loại collagen : Các nhà nghiên cứu đã xác định có khoảng 29 loại collagen trong cơ thể Trong đó, loại I, II, II, IV chiếm trên 90% Collagen loại I có trong da, gân, thành mạch máu, các bào quan, xương Collagen loại II có trong sụn Collagen loại III có trong các nguyên bào sợi, các động mạch, thành ruột, tử cung Collagen loại IV được tìm thấy trong cấu trúc của tóc, các tiểu cầu, trong thận, và màng tế bào

Hình 2 2 Chuỗi xoắn collagen gồm 3 dây xoắn chặt

Hình 2 3 Trật tự sắp xếp các acid amin trong collagen

1.5 nm

300 nm

Trang 19

Hình 2 4 Tổ chức bó sợi collagen

Hình 2 5 Từng bậc cấu tạo trong chuỗi collagen

Trang 20

Về thành phần các acid amin: trong collagen không chứa cystein và

tryptophan, nhưng chứa rất nhiều hydroxyproline Hydroxyproline này là một acid

amin đặc trưng của collagen mà các loại protein khác không có (bảng 2.2):

Bảng 2 2 So sánh thành phần acid amin trong collagen và các loại protein khác

Trang 21

II.1.2 Tính chất lý hóa của collagen

Collagen là một loại protein cấu trúc chính vì vậy chúng cũng có đầy đủ các

tính chất lý hóa của một protein

¾ Sự biến tính :

Dưới tác dụng của các chất hóa học như acid, base, muối, các dung môi

alcohol, và các tác nhân vật lý như khuấy trộn cơ học, nghiền, tia cực tím các cấu

trúc bậc hai, ba và bậc bốn của protein bị biến đổi làm cho các liên kết hydro, các

cầu nối disunfit, các liên kết ion bị phá vở nhưng không phá vỡ liên kết peptide, tức

là cấu trúc bậc một vẫn giữ nguyên, protein sẽ thay đổi tính chất so với ban đầu Đó

là hiện tượng biến tính protein Sau khi bị biến tính, protein thường có các tính chất

sau:

-Độ hòa tan giảm do làm lộ các nhóm kỵ nước vốn ở bên trong phân tử

protein Tức là khi protein chưa biến tính, các acid amin có các nhóm kỵ nước nằm

bên trong phân tử protein Khi bi biến tính, phân tử protein lúc này chỉ là trình tự

sắp xếp các acid amin mạch thẳng, làm cho các nhóm kỵ nước lộ ra ngoài cho nên

độ hòa tan giảm

-Khả năng giữ nước giảm Cấu trúc bậc bốn giúp cho protein có khả năng

hydrat hóa tạo thành màng hydrat bao quanh Khi biến tính mất đi cấu trúc bậc bốn

thì khả năng hydrat hóa không còn Vì thế protein giữ nước kém

Trang 22

- Hoạt tính sinh học ban đầu mất đi Điều này là hiển nhiên vì hoạt tính sinh học của một protein được quyết định bởi các cấu trúc bậc hai, bậc ba và bậc bốn Khi các cấu trúc này mất đi, protein chỉ là các polypeptide, và không có hoạt tính sinh học

-Tăng độ nhạy đối với sự tấn công của enzyme protease do làm xuất hiện các liên kết peptide ứng với trung tâm hoạt động của protease

-Tăng độ nhớt nội tại

-Mất khả năng kết tinh Protein có khả năng kết tinh trong các môi trường muối, hoặc cồn Ở các điều kiện pH nhất định dung dịch protein không bền và kết tủa, được gọi là pH đẳng điện Khi bị biến tính, điểm đẳng điện của prtein không còn, và chúng khó thể kết tinh

¾ Tính kỵ nước:

Do các gốc kỵ nước của các acid amin trong chuỗi polypeptide của protein hướng ra ngoài, các gốc này liên kết với nhau tạo liên kết kỵ nước Độ kỵ nước có thể giải thích là do các acid amin có chứa các gốc R- không phân cực nên nó không

có khả năng tác dụng với nước.Tính kỵ nước sẽ ảnh hưởng rất nhiều đến tính tan của protein

¾ Tính chất của dung dịch keo :

Khi hoà tan protein thành dung dịch keo thì nó không đi qua màng bán thấm Hai yếu tố đảm bảo độ bền của dung dịch keo là:

• Sự tích điện cùng dấu của các protein

• Lớp vỏ hydrat bao quanh phân tử protein

Khi dung dịch keo không bền, chúng sẽ kết tủa, có hai dạng kết tủa: kết tủa thuận nghịch và không thuận nghịch:

• Kết tủa thuận nghịch: Sau khi chúng ta loại bỏ các yếu tố gây kết tủa thì

protein vẫn có thể trở lại trạng thái dung dịch keo bền như ban đầu

Trang 23

• Kết tủa không thuận nghịch: Sau khi chúng ta loại bỏ các yếu tố gây kết

tủa thì protein không trở về trạng thái dung dịch keo bền vững như trước nữa

¾ Tính chất điện ly lưỡng tính :

Protein có tính chất lưỡng tính vì trong acid amin có chứa cả gốc acid (COO-)

và gốc base (NH2-) Cả acid amin và protein đều có tính chất lưỡng tính

II.1.3 Các lĩnh vực ứng dụng của collagen:

Collagen thủy phân gọi là collagen hydrolysate Tùy theo mức độ thủy phân

mà collagen có các ứng dụng khác nhau Collagen hydrolysate được sử dụng trong thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm, và công nghiệp nhiếp ảnh Chúng được sử dụng như chất đông, chất gây lắng trong thực phẩm Chúng được dùng như chất thay thế cao su, keo dán, xi măng, mực in lụa nhân tạo, là chất tạo kết dính trong diêm quẹt Chúng được dùng trong bộ lọc sáng cho đèn thủy ngân

Trong sản xuất thực phẩm : Collagen được dùng để làm vỏ bao xúc xích,

màng bọc kẹo, làm nguyên liệu sản xuất một số loại thực phẩm dinh dưỡng, thực phẩm chức năng Dĩ nhiên chúng phải trải qua một quá trình chế biến để đạt được những tính chất ứng dụng mong muốn, như tính tan chảy ở nhiệt độ cao và đông đặc ở nhiệt độ thấp, lúc này collagen đóng vai trò một chất keo bảo vệ ngăn chặn sự kết tinh của đường

Trong các sản phẩm phomat, người ta thêm vào một hàm lượng collagen hydrolysate nhằm ngăn chặn sự mất nước Ngoài ra, trong sản phẩm bơ sữa, collagen đóng vai trò quan trọng trong việc tạo độ mịn, độ sánh cho sản phẩm, cũng như thay thế hàm lượng chất béo trong các loại thực phẩm này (hình 2.6)

Trang 24

Hình 2 6 Sản phẩm phomat có chứa collagen hydrolysate làm giảm hàm lượng chất

béo

Trong sản phẩm kẹo dẻo, sự có mặt của collagen hydrolysate cung cấp cho sản phẩm độ dẻo, dai và mềm do chúng ngăn chặn sự kết tinh của đường Các sản phẩm như vỏ kẹo có chứa 0,5-1% hàm lượng collagen hydrolysate với vai trò làm giảm sự tan chảy (hình 2.7)

Hình 2 7 Sản phẩm kẹo dẻo có vỏ màng là collagen hydrolysate

Trong công nghiệp sản xuất kẹo mứt, collagen hydrolysate được sử dụng làm chất tạo gel, chất kết dính, tạo xốp, làm chậm quá trình tan kẹo trong miệng (hình 2.8)

Hình 2 8 Collagen hydrolysate làm chất kết dính trong thanh kẹo

Trang 25

Trong các sản phẩm như thịt hộp, thịt nguội… Collagen hydrolysate chiếm từ 1-5% giúp giữ hương vị tự nhiên của sản phẩm, đồng thời cũng là một chất kết dính giúp cho việc tạo hình sản phẩm dễ dàng hơn (hình 2.9)

Hình 2 9 Sản phẩm thịt nguội có chứa collagen hydrolysate

Trong công nghiệp sản xuất rượu bia và nước hoa quả, collagen hydrolysate

sử dụng làm chất làm trong với tỉ lệ 0,002-0,15% Nhờ vậy, sản phẩm khi làm ra có màu sắc trong suốt và óng ánh (hình 2.10)

Hình 2 10 Collagen hydrolysate làm gạn trong các loại thức uống

Trang 26

Collagen có khả năng hấp thụ nước gấp 5-10 lần thể tích của nó nên được sử dụng trong công nghiệp sản xuất đồ hộp để tránh hiện tượng rỉ nước

Trong y học và dược phẩm :

Collagen được sử dụng trong sản xuất bao con nhộng cứng và mềm Nó có tác dụng bảo vệ thuốc chống những tác nhân có hại như ánh sáng và oxi Thành phần chính của vỏ bao là collagen và các tá dược khác như: glycerol hay sorbitol, những chất hoạt động bề mặt, chất màu cho phép, hương liệu

Viên nang mềm có thể có hình viên bi, hình trứng, hình trụ, hình giọt, hình hạt đậu chứa dung dịch lỏng sánh (hình 2.11)

Hình 2 11Viên nang mềm có lớp vỏ ngoài làm từ collagen

Viên nang cứng gồm hai mảnh lồng khít vào nhau, hình con nhộng, thành mỏng (hình 2.12), kích cỡ 1/40mm, chế tạo bằng máy với quy mô lớn, đựng chất thuốc đã nghiền thành bột Viên thuốc với vỏ bao collagen đảm bảo cho bệnh nhân có thể nuốt viên thuốc một cách dễ dàng

Trang 27

Hình 2 12 Viên nang cứng làm từ chất liệu collagen

Collagen còn được sử dụng để làm ra các gạc vô trùng sử dụng trong giải phẩu…

Nhóm các nhà nghiên cứu trường Đại học Wisconsin-Madison đã tạo ra dạng collagen bền nhất được khoa học biết đến hiện nay Đây là giải pháp thay thế ổn định collagen ở người và một ngày nào đó có thể được dùng để điều trị chứng viêm khớp và các tình trạng thiếu collagen Collagen là dạng protein có nhiều nhất trong

cơ thể người, tạo ra các khối và bó dây chắc chắn, có tác dụng hỗ trợ cấu trúc của

da, các cơ quan, sụn và xương, đồng thời là tế bào liên kết giữa các bộ phận này Nhiều thập kỷ qua, các bác sĩ sử dụng collagen từ bò để điều trị các vết bỏng nghiêm trọng và các vết thương khác Collagen nhân tạo là liệu pháp chữa trị nhiều bệnh như viêm khớp do thoái hóa collagen tự nhiên trong cơ thể Để tạo ra loại collagen mới này, các nhà khoa học đã thay thế 2/3 lượng axit amin thông thường của protein bằng các dạng ít dẻo, giúp cấu trúc chung của protein cứng hơn và duy trì được hình dạng của chúng Tính đột phá của cách tiếp cận này là sử dụng các vật liệu cứng hơn có hình dạng tương tự với các hình dạng protein chức năng sau khi gấp nếp Dạng collagen mới gắn kết với nhau ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ collagen

tự nhiên phân rã Mặc dù được tạo thành chủ yếu từ các acid amin không có trong

tự nhiên, nhưng hình ảnh chụp tia X tinh thể cấu trúc 3 chiều của collagen tạo ra trong phòng thí nghiệm cho thấy, không có sự khác biệt với collagen tự nhiên Sản phẩm collagen bền vững thực sự là một bằng chứng về khả năng của hóa học protein hiện đại

Collagen đã được sử dụng rộng rãi trong phẫu thuật thẩm mỹ, hỗ trợ chữa bệnh cho bệnh nhân bỏng, làm tái tạo xương (hình 2.13) và rất nhiều trong nha khoa, phẫu thuật chỉnh hình Khi khớp xương bị thoái hóa, lượng chất nhầy giữa hai khớp mất đi, không còn có tác dụng làm trơn và vì thế cử động co duỗi khớp gối khó khăn và đau nhức Để tái tạo khớp, người ta tiến hành bó collagen hydrolysate xung quanh khớp, dần dần chúng thấm sâu vào trong, làm trơn, và cải thiện tình

Trang 28

hình khớp xương Dĩ nhiên là kỹ thuật này đòi hỏi chất lượng collagen rất cao và chuyên biệt cho khớp

Hình 2 13Vai trò của collagen hydrolysate trong tái tạo khớp xương

Trong phẩu thuật nội soi, collagen hydrolysate được ứng dụng để bôi vào các ống nội soi, có tác dụng bôi trơn, vì thế các bác sĩ dễ dàng đưa các ống này vào cơ thể bệnh nhân mà không gây đau Sau thời gian từ 40 – 60 phút, collagen sẽ tan hủy trong cơ thể bệnh nhân mà không gây hại gì (hình 2.14)

Hình 2 14 Ứng dụng collagen hydrolysate trong kỹ thuật nội soi

Trong nha khoa, collagen được chế tạo thành các mảnh bọt biển (sponges), chúng là một tác nhân cầm máu Những mảnh bọt biển này có khả năng hấp thụ một

Trang 29

lượng chất lỏng gấp 50 lần khối lượng của chúng, vì thế chúng có khả năng cầm máu nhanh chóng (hình 2.15) Một ứng dụng khá hay trong nha khoa là các bác sĩ tạo ra một lớp men răng nhân tạo bằng collagen hysrlysate có chứa các ion calcium, phosphate, fluoride áp lên bề mặt răng thật , vì thế răng được bảo vệ khỏi các tác nhân gây sâu răng

Hình 2 15 Collagen hydrolysate trong các mảnh bọt biển sử dụng trong nha khoa

Trong công nghệ mỹ phẩm:

Colagen chứa các tác nhân làm ẩm tự nhiên đối với cơ thể, có vai trò chống nhăn, giữ cho da mềm và sáng; hơn nữa colagen còn dùng làm nguyên liệu để sản xuất các sản phẩm như: mặt nạ, kem dưỡng da cao cấp, dầu gội, các sản phẩm dưỡng tóc cũng như các loại sữa tắm…

Collagen hydrolysate là thành phần trong các sản phẩm mặt nạ dưỡng da (hình 2.16) chúng kết hợp với các tinh chất trong mật ong, dầu oliu , tinh dầu hoa hồng… có tác dụng dưỡng ẩm cho da, tái tạo làn da mệt mỏi, bảo vệ da khỏi các tác nhân tia tử ngoại , khói bụi, hóa chất… Vì thế da được trẻ hóa, tươi tắn

Trang 30

Hình 2 16 Mặt nạ dưỡng da collagen hydrolysate Dưới tác dụng của các tác nhân tia tử ngoại, thuốc nhuộm tóc, thuốc duỗi tóc… tóc dễ bị tổn thương, chẻ ngọn, mất đi vẻ bong mượt trong các sản phẩm chăm sóc tóc thường có bổ sung một lượng collagen hydrolysate có tác dụng bảo vệ cho tóc, phục hồi hư tổn (hình 2.17)

Hình 2 17 Tóc bị hư tổn và phục hồi sau khi sử dụng sản phẩm chăm sóc tóc có

chứa collagen hydrolysate

II.2 CÁC VẤN ĐỀ TRONG TÁCH CHIẾT COLLAGEN:

II.2.1 Sự phá vỡ tế bào

Các phân tử collagen không có khả năng đi qua màng tế bào, cho nên cần phá

vỡ cấu trúc để chuyển collagen vào dung dịch Người ta có thể phá vỡ cấu trúc tế bào bằng các biện pháp cơ học như nghiền với bột thủy tinh hoặc cát thạch anh, làm

Trang 31

đồng hóa bằng thiết bị nghiền đồng thể (homogenizator) Thiết bị này có chày thủy tinh gắn với motor quay và có thể điều chỉnh tốc độ quay theo yêu cầu Các tế bào giữa chày thủy tinh và thành cối sẽ bị phá hủy Để tiện cho phá vỡ màng tế bào có hiệu quả, các mô tế bào thường được cho trương nước Ngoài ra còn có thể dùng sóng siêu âm, dùng các dung môi hữu cơ như butanol, acetone, và các chất tẩy rửa Các hóa chất này giúp cho việc phá vỡ các bào quan của tế bào do trong các cơ quan này thường chứa mỡ Điều này có thể giải thích tại sao trước khi tách chiết collagen, da cá thường được tẩy rửa với các hóa chất trên, một mặt là để loại sạch các tạp chất, mặt khác là để cho da được trương nở hoặc thành tế bào bị phá vỡ, giúp collagen dễ dàng đi vào dung dịch tách chiết

II.2.2 Sự tách chiết protein collagen

Sau khi cấu trúc tế bào bị phá vỡ, việc chiết tách collagen dễ dàng hơn, có thể chiết bằng các dung dịch acid hoặc enzyme theo quy trình như sau (hình 2.18):

Hình 2 18Quy trình tách chiết collagen

Chiết

Ly tâm

Tinh chế Kết tủa

Nguyên liệu

Acid (enzyme)

bã NaCl

Collagen sạch

Trang 32

Quy trình tách chiết collagen

Quá trình chiết collagen được thực hiện trong các reactor ở nhiệt độ lạnh, trong điều kiện vô trùng, khuấy trộn liên tục để đảm bảo chiết được collagen có chất lượng tốt

Cách thức hoạt động của emzyme pepsin : Điểm đẳng điện của pepsin khoảng

pH 1, pepsin thuỷ phân mạnh các liên kết peptide nối mạch do các nhóm amin của các acid amin thơm trong phân tử protein và peptide tạo thành, sản phẩm được tách

ra là các peptide và các acid amin tự do Hoạt động trong môi trường acid, pepsin hoạt động thích hợp nhất trong khoảng pH 1,5 - 2; ở điều kiện này pepsin không bền do có sự tiêu enzyme Pepsin có độ bền tối đa ở pH 4 - 5; ở vùng pH này, hoạt lực của pepsin thấp; từ pH 5,6 hầu như không có hoạt tính protease Dung dịch pepsin trong nước ở dạng pepsinogen và được hoạt hoá bởi H+ với pH = 1,5 - 2,0 Chúng phân giải gần 30% mạch peptide và biến protein thành polypeptide

PEPSINOGEN ⎯⎯→H+ PEPSIN

PROTEIN ⎯⎯⎯→Pepsin POLYPEPTIDE

II.2.3 Phương pháp tinh sạch collagen

Trong dịch chiết thô, ngoài collagen còn có các protein tạp, các lipid, muối khoáng, để loại chúng phải sử dụng nhiều biện pháp khác nhau Để loại muối khoáng thường dùng phương pháp thẩm tích đối nước hay đối các dung dịch đệm loãng hoặc bằng cách lọc qua gel sephadex Để loại bỏ các protein tạp có phương pháp kết tủa phân đoạn bằng muối trung tính hoặc các dung môi hữu cơ, các phương pháp sắc kí trao đổi ion, điện di, phương pháp lọc gel

¾ Phương pháp thẩm tích: Thẩm tích là sự khuếch tán vi phân qua màng vốn không thấm đối với những chất keo hòa tan (protein, một số các polysaccharide) nhưng thấm đối với các dung dịch các tinh thể (các muối, các hợp chất hữu cơ có trọng lượng phân tử thấp ) Các tinh thể có thể khuếch tán qua màng theo định luật Fick Nước sẽ khuếch tán từ dung dịch có nồng độ thấp hơn (thường là dung dịch rửa) vào dung dịch keo, trong khi đó các ion và các chất phân tử nhỏ sẽ chuyển từ dung dịch keo vào dung dịch có nồng độ thấp hơn Trong quá trình tách chiết và

Trang 33

tinh sạch protein, để loại muối ra khỏi dung dịch protein thì cho dung dịch protein vào cái túi đặc hiệu làm bằng nguyên liệu bán thấm Thông thường người ta hay dùng túi cellophan Sau đó đặt cả túi vào bình chứa lượng lớn nước hoặc lượng lớn dung dịch đệm được pha loãng (ví dụ đệm phosphate có pH = 7, nồng độ 0,01M)

Vì màng cellophane là màng bán thấm, có kích thước lỗ chỉ cho các chất có trọng lượng phân tử nhỏ đi qua vào các dung dịch đệm loãng Như vậy, muối sẽ khuếch tán vào nước hoặc dung dịch đệm loãng (di chuyển theo hướng giảm nồng độ), còn nước hoặc đệm loãng sẽ di chuyển từ dung dịch rửa vào túi chứa protein Protein là những đại phân tử không thể vượt qua túi thẩm tích và được giữ lại trong túi Bằng cách thay thường xuyên dung dịch rửa có thể tẩy sạch muối ra khỏi protein Có thể làm giảm bớt hoặc loại trừ sự pha loãng như thế khi tiến hành thẩm tích dưới áp suất, có nghĩa là khi dung dịch được xử lý nằm dưới một áp suất thủy tĩnh đầy đủ,

để dòng thủy động học của nước từ dung dịch sẽ cân bằng sự khuếch tán của các phân tử vào dung dịch Phương pháp này thường đòi hỏi có thiết bị đặc biệt Phương pháp thẩm tích thông thường là cho dung dịch có kết tủa protein vào túi thẩm tích (không quá 2/3 thể tích túi) Cho thuốc sát trùng hoặc toluen để bảo quản protein (vì thời gian thẩm tích lâu, protein có thể bị thối hỏng) Buộc túi vào một que thủy tinh, gác que thủy tinh lên miệng chậu nước để giữ túi ở giữa chậu Cho vòi nước chảy nhẹ liên tục vào đáy chậu để thay đổi nước thường xuyên Muối hòa tan trong nước và bị loại dần Có thể tăng tốc độ thẩm tích bằng cách khuấy trộn dung dịch rửa Khi thẩm tích các protein thường người ta tiến hành tất cả các thao tác ở môi trường lạnh

¾ Sắc ký gel: Trong sắc kí gel, pha tĩnh là mạng polymer có lỗ rỗng, các lỗ rỗng này được phủ đầy bởi dung môi làm pha động Kích thước của lỗ rỗng phải đồng nhất, bởi vì kỹ thuật sắc kí gel dùng để tách các chất theo trọng lượng phân tử Các phân tử có kích thước lớn hơn kích thước lỗ rỗng sẽ không lọt vào bên trong lỗ rỗng và sẽ bị dòng chảy của dung môi đuổi ra khỏi cột Còn phân tử nào có kích thước nhỏ hơn kích thước lỗ rỗng sẽ chui vào nằm bên trong lỗ nên bị giải ly ra khỏi cột chậm hơn Sắc kí gel được ứng dụng trong việc tách một hổn hợp thành các

Trang 34

nhóm chất riệng rẽ, ứng dụng trong việc xác định trọng lượng phân tử của một hợp

chất có trọng lượng phân tử lớn, và ứng dụng để loại muối ra khỏi một hợp chất

II.2.4 Làm khô và bảo quản chế phẩm collagen

Tính cố định cấu trúc của protein được bảo đảm nhờ khả năng liên kết nước của chúng Nếu dung dịch protein bị khô ở độ nhiệt trong phòng thì đa số protein bị biến tính Protein chỉ có thể được giữ ở dạng khô trong trường hợp nếu việc sấy khô được tiến hành vô cùng nhanh hoặc ở nhiệt độ thấp Nhiều protein như chúng ta đã biết, ở độ nhiệt thấp có thể được kết tủa bằng rượu hoặc acetone Nếu kết tủa thu được bằng cách đó đem xử lý bằng rượu tuyệt đối, bằng acetone hoặc bằng ether và sau đó làm khô thật nhanh thì protein sẽ không bị biến tính Tuy nhiên, nhiều protein không chịu được cách xử lý như vậy Vì vậy, người ta sử dụng phương pháp làm đông khô Dung dịch protein đã được thẩm tích được làm đóng băng và làm thăng hoa băng ở áp suất 0,01-0,001 mm thuỷ ngân (được tạo ra nhờ máy hút chân không mạnh) Hơi nước được tạo ra đều được đóng băng trong bầu dự trữ ở độ nhiệt thấp hơn Sau một vài giờ chỉ còn lại bột protein Sau đó bột này (trong chân không)

có thể được giữ ở độ nhiệt cao hơn Protein đã được làm đông khô bằng cách như thế khi hoà tan trong nước cất sẽ cho dung dịch protein ngay sau một vài năm

II.2.5 Sử dụng CO 2 siêu tới hạn trong tinh sạch collagen:

Một chất lỏng siêu tới hạn (supercritical fluid – SCF) là bất kì một hợp chất nào có giá trị nhiệt độ và áp suất trên điểm tới hạn trong giản đồ pha Trên giá trị nhiệt độ tới hạn, thì phần tử khí không thể hóa lỏng ở bất kì áp suất nào Áp suất tới hạn là áp suất hơi của khí tại nhiệt độ tới hạn Trong môi trường siêu tới hạn, chỉ tồn tại một pha duy nhất gọi là fluid Pha fluid không phải là pha khí cũng không phải là pha lỏng Nó là trung gian giữa hai pha Pha fluid này có khả năng hòa tan tương tự như chất lỏng, đồng thời cũng khuếch tán tốt như chất khí

Dưới đây là bảng so sánh giữa các pha lỏng, khí, và SCF về khối lượng riêng,

độ nhớt và độ khuếch tán (bảng 2.3):

Trang 35

Cách thức hoạt động của SCF cũng giống như là một chất lỏng rất di động (mobile liquid) Nó có khả năng hòa tan như một chất lỏng, đồng thời cũng có khả năng vận chuyển như một chất khí Điều này giúp cho nó dễ xâm nhập vào mẫu và chiết xuất được cạn kiệt các hoạt chất Có thể coi SCF là một trạng thái chuyển tiếp, hay trạng thái trung gian giữa khí và lỏng Kết quả là tốc độ trích ly và sự chuyển khối rất nhanh so với các quy trình tách chiết thông thường Điều này giúp giảm bớt thời gian của quá trình Hơn thế nữa, điều kiện tiến hành có thể được kiểm soát để đạt hiệu quả cao trong quá trình tách chiết chọn lọc Tách chiết bằng chất lỏng siêu tới hạn (supercritical fluid extraction – SFE) phụ thuộc vào khối lượng riêng của pha fluid và có thể được điều khiển thuận lợi thông qua việc kiểm soát hệ thống nhiệt độ và áp suất Trong thực tế, SCF có thể được sử dụng để tách chiết các chất trong mẫu rắn cũng giống như tách chiết bằng dung môi lỏng theo phương pháp xưa nay Tuy nhiên không giống như phương pháp truyền thống ở chỗ là lượng dung môi cặn bã mà phương pháp SFE thảy ra môi trường rất nhỏ Chính vì thế phương pháp này được cho là thân thiện với môi trường

Nguyên tắc cơ bản của phương pháp SFE là độ hòa tan của một chất trong một dung môi sẽ khác nhau trong những điều kiện nhiệt độ và áp suất khác nhau Ở điều kiện môi trường (25oC, áp suất 1 bar), độ hòa tan của một chất trong pha khí

Trang 36

thường có quan hệ trực tiếp tới áp suất hơi của nó và nói chung là không đáng kể Tuy nhiên trong dung môi siêu tới hạn, độ hòa tan của một chất tăng đến 10 lần

Sự hòa tan của một chất trong pha lỏng siêu tới hạn là do sự kết hợp giữa áp suất hơi và ảnh hưởng tương tác giữa chất tan và dung môi Nghĩa là sự hòa tan của nó không chỉ đơn thuần phụ thuộc vào áp suất

Mặc dù sự hòa tan của chất rắn dễ bay hơi trong dung môi siêu tới hạn cao hơn trong khí lí tưởng nhưng người ta vẫn mong muốn làm tăng độ hòa tan cao hơn nữa nhằm làm giảm lượng dung môi cho quy trình tách chiết Do đó, khả năng hòa tan của một chất trong SCF có thể được cải thiện bằng cách thêm vào một chất được gọi là chất trợ dung môi (cosolvent) Chất trợ dung môi có vai trò như một chất trung gian dễ bay hơi, giúp cho sự hòa tan một chất vào dung môi dễ dàng hơn Chất trợ dung môi đã đưa ra một cơ chế, mà trên cơ sở này chúng ta có thể dựa vào đó để việc chiết xuất có chọn lọc được tiến hành thuận lợi Tiềm năng thương mại của công nghệ SCF có thể được cải tiến đáng kể nhờ vào việc sử dụng chất trợ dung môi Tuy nhiên, cũng cần cân nhắc rằng dù thêm một lượng rất nhỏ chất trợ dung môi vào cũng sẽ làm thay đổi đáng kể tính chất tới hạn của dung môi

Giản đồ pha của carbon dioxide Trong giản đồ hình 2.19, đường sôi phân chia miền khí và lỏng, kết thúc tại điểm tới hạn Tại đây, pha lỏng và pha khí biến mất để trở thành một pha siêu tới hạn duy nhất Điều này có thể được quan sát trong giản đồ hình 2.20 – giản đồ mật độ và áp suất Dưới nhiệt độ tới hạn, ví dụ ở 280K, khi áp suất tăng, khí bị nén lại, và cuối cùng đến khoảng trên 40 bar, ngưng tụ thành một chất lỏng đặc hơn nhiều, thể hiện trên đường đứt khúc Hệ bao gồm hai pha cân bằng: pha lỏng có mật độ dày đặc và pha khí có mật độ thấp Khi nhiệt độ tiến tới 300K, mật độ của pha khí tại trạng thái cân bằng trở nên dày đặc hơn và mật độ của pha lỏng thấp hơn Tại điểm tới hạn (304,1K; 7,38 MPa-73,8 bar), không có sự khác biệt về mật độ và hai pha lỏng – khí gộp lại thành một pha duy nhất gọi là fluid phase Vì vậy, trên nhiệt độ tới hạn, chất khí không thể hóa lỏng dưới một áp suất nào Trên nhiệt độ tới hạn một chút, trong vùng lân cận của áp suất tới hạn, đườngbiểu hiện gần như là một đường thẳng đứng Một sự gia tăng nhỏ áp suất làm cho

Trang 37

mật độ của pha siêu tới hạn tăng lên rất lớn Nhiều tính chất vật lý khác, ví dụ như

độ nhớt và mối quan hệ giữa hằng số điện môi với nồng độ dung môi, tất cả đều có liên hệ chặt chẽ tới mật độ Ở nhiệt độ cao hơn, fluid bắt đầu hoạt động như một chất khí (xem hình 2.20) Ví dụ đối với CO2, 400K, mật độ tăng gần như tuyến tính với áp suất

Hình 2 19 Giản đồ pha (áp suất – nhiệt độ) của carbon dioxide

Hình 2 20 Giản đồ pha (mật độ - áp suất) của carbon dioxide

Chúng ta tìm hiểu quy trình tách chiết bằng SCF qua sơ đồ hình 2.21:

Trang 38

Hình 2 21Sơ đồ quy trình tách chiết bằng CO2 siêu tới hạn

Sơ đồ này có đường hoàn lưu dung môi, trong đó:

1 Thiết bị tồn trữ CO2

2 Thiết bị làm lạnh: CO2 đi vào thiết bị làm lạnh để duy trì trạng thái lỏng trước khi vào bơm cao áp

3 Presurisation – thiết bị tạo áp suất: Tại đây, áp suất được giữ ở 300bar

4 Reheating: Nhiệt độ được nâng lên đến 31oC bằng thiết bị trao đổi nhiệt

5 Cột tách

6 Thiết bị giảm áp: Áp suất được giảm xuống trả CO2 về trạng thái khí cho phép tách CO2 khỏi dịch chiết

7 Reheating: Nhiệt độ được duy trì ở 30oC

8 Separation: Phân riêng lần 1, tách CO2 khỏi dịch chiết bằng trọng lực

9 Under pulling: Dịch chiết được giảm sức nén một cách từ từ để cho an toàn

10 Cyclonic separation: Phân riêng lần 2, tách CO2 khỏi dịch chiết bằng lực ly tâm

Trang 39

11 Liquefaction – thiết bị hóa lỏng: Vẫn trong trạng thái khí, CO2 được làm lạnh để hóa lỏng)

II.3 CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ

II.3.1 Các công trình nghiên cứu collagen trên thế giới và ở nước ta hiện

nay:

-Năm 2000 Nagai, Suzuki, [10] đã nghiên cứu quá trình tách chiết

collagen từ phụ phẩm da, xương, vây của các loài cá ngừ (Katsuwonus pelamis),

cá pecca nhật bản (Lateolabrax japonicus), cá thu (Scomber japonicus), cá tráp vàng (Dentex tumifrons), cá mập (Heterodontus japonicus) Da, xương và vây

được bảo quản ở 25oC đến khi sử dụng Tất cả các quá trình từ bước tiền xử lí đến tách chiết đều tiến hành ở 4 oC (hình 2.22)

Trang 40

Hình 2 22Quy trình chiết collagen bằng cid acetic

Chỉ nói về phần da cá, trước tiên là bước tiền xử lý bằng NaOH 1% để loại các chất non-collagen (chất béo, chất màu, chất gây mùi tanh) Da tiếp tục được xử

lý với butyl alcohol 10% để loại tiếp tạp chất Sau đó là quá trình tách chiết collagen bằng acid acetic 0.5M trong 3 ngày Ly tâm lấy phần dịch, còn phần bã đem chiết lần 2 cũng với acid acetic 0.5M trong 2 ngày nữa Ly tâm lấy phần dịch Cả hai phần dịch chiết thu được là dịch lỏng, hơi sánh, gọi là acid-soluble collagen Để kết

Màng cellophan Thẩm tích

Nước bẩn Butyl alcohol

Acetic 0.5M

Da cá Loại tạp chất Loại tạp chất Chiết

Kết tủa NaCl

Nước

Ly tâm Sấy thăng hoa

Nước

Collagen sạchNaOH Nước bẩn

Định dạng
Số trang	122
Dung lượng	2,82 MB