Mục đích của nghiên cứu này là bước đầu xây dựng quy trình thu nhận collagen từ da cá tra ở Việt Nam bằng phương pháp hoá học. Nghiên cứu này sẽ đề xuất được quy trình tách chiết collagen và xác định một số tính chất cơ bản của sản phẩm collagen.
Trang 1THÔNG BÁO KHOA HỌC
TÁCH CHIẾT COLLAGEN TỪ DA CÁ TRA
(Pangasius hypophthalmus) BẰNG PHƯƠNG PHÁP HĨA HỌC
ISOLATION COLLAGEN FROM CATFISH SKIN (Pangasius hypophthalmus)
BY CHEMICAL METHODS
Trần Thị Huyền1, Nguyễn Anh Tuấn2, Hồng Ngọc Anh3, Vũ Lệ Quyên4
Ngày nhận bài: 21/10/2011; Ngày phản biện thơng qua: 04/05/2012; Ngày duyệt đăng: 10/06/2012
TĨM TẮT
Quy trình tách chiết collagen từ da cá tra bằng phương pháp hĩa học được nghiên cứu Kết quả cho thấy để tăng hiệu quả cho quá trình tách chiết collagen, ban đầu da cá tra được xử lý bằng NaOH 0,2M, w/v=1/10, trong thời gian 20 giờ, thay dung dịch xử lý 2 giờ một lần, rồi tiếp tục xử lý axit citric 0,003M, w/v= 1/8, trong thời gian 30 phút Xử lý hydroperoxide (oxy già) là khơng hiệu quả để khử sắc tố trên da cá Quá trình chiết collagen được thực hiện với acid acetic 0,5M, w/v =1/10 trong 34 giờ, dịch chiết được kết tủa collagen bằng NaCl 2,5M Cơng đoạn làm sạch được thực hiện với dung mơi
Na 2 HPO 4 0,02M Hiệu suất thu collagen là 76,9% (tính theo % khối lượng khơ), khả năng giữ nước là 415%, nhiệt độ biến tính 39 0 C, collagen thu được cĩ 4 loại protein cĩ các khối lượng phân tử lần lượt là 217kDa, 185kDa, 156kDa, và 104kDa.
Từ khĩa: Collagen, chiết collagen, da cá Tra
ABSTRACT
The process of extracting collagen from catfi sh skin by chemical methods was studied The results showed that to increase the effi ciency of extracting collagen, fi rst, catfi sh skin was treated with 0.2 M NaOH, w / v = 1 / 10, during 20 hours, changing treatment solution every 2 hours, and then processing by 0.003 M citric acid, with a solid/solution ratio of 1/8, in 30 minutes Handling the skin with hydroperoxide (hydrogen peroxide) was not effective in reducing the pigment in the fi sh skin Collagen extraction process was performed with 0.5 M acetic acid, a solid/solution ratio of 1 / 10 in 34 hours, collagen extracts were precipitated with NaCl 2.5 M The purifi cation was done with solvent Na 2 HPO 4 0.02 M Yield of col-lagen is 76.9% (% of dry weight), water holding capacity is 415%, denaturation temperature was 39 0 C, collagen obtained
4 proteins of molecular weight 217kDa, 185kDa, 156kDa, and 104kDa.
Keywords: Collagen, extracting collagen, catfi sh skin
1 ThS Trần Thị Huyền, 2TS Nguyễn Anh Tuấn, 4KS Vũ Lệ Quyên: Khoa Cơng nghệ Thực phẩm - Trường Đại học Nha Trang
3 ThS Hồng Ngọc Anh: Viện Cơng nghệ Sinh học & Mơi trường - Trường Đại học Nha Trang
I ĐẶT VẤN ĐỀ
Cá tra là một lồi thủy sản được nuơi khá phổ
biến ở các tỉnh đồng bằng sơng Cửu Long trong đĩ
một lượng đáng kể là Pangasius hypophthalmus.
Sản lượng thu hoạch cá tra ở Việt Nam năm 2010
được ghi nhận là 1,141 triệu tấn, sản lượng xuất
khẩu đạt 645.000 tấn, kim ngạch xuất khẩu đạt 1,39
tỉ USD (Hiệp hội Chế biến & Xuất khẩu Thủy sản
Việt Nam) Ước tính nếu đưa vào sản xuất 700.000
tấn cá tra sẽ loại ra 100.000 tấn mỡ và khoảng 50.000 - 70.000 tấn phế liệu da và xương Như vậy nguồn phụ phẩm da cá là khá dồi dào để nghiên cứu sản xuất collagen
Collagen mà đặc biệt là collagen từ thủy sản được đánh giá cĩ khả năng ứng dụng cao khơng những trong ngành thực phẩm mà trong ngành mỹ phẩm và dược phẩm (C Meena và cộng sự, 1999, Bryan Jeun và cộng sự, 2002) Trên thế giới, việc
Trang 2Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 2/2012
nghiên cứu sản xuất collagen được quan tâm từ
những năm 1990 nhưng ở Việt Nam cho tới nay
chưa cĩ một cơng bố nào về nghiên cứu thu nhận
collagen được đưa vào ứng dụng
Các tác giả trên thế giới đã nghiên cứu thu
nhận collagen bằng phương pháp hĩa và phương
pháp hĩa học kết hợp với sinh học (Takeshi Nagai,
2000; LS Sensrsture, 2006; Sang Moo Kim,
2007) Mục đích của nghiên cứu này là bước
đầu xây dựng quy trình thu nhận collagen từ da
cá tra ở Việt Nam bằng phương pháp hố học
Nghiên cứu này sẽ đề xuất được quy trình tách chiết
collagen và xác định một số tính chất cơ bản của
sản phẩm collagen
II NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
1 Chuẩn bị mẫu
Da cá tra được lấy từ xí nghiệp chế biến cá
tra thuộc cơng ty cổ phẩn Nam Việt, khu cơng
nghiệp Mỹ Quý, phường Mỹ Quý, thành phố Long
Xuyên, tỉnh An Giang Da cá đã được sơ chế và
cấp đơng dạng block, đĩng gĩi PE, cĩ trọng lượng
6kg/block, đạt tiêu chuẩn xuất khẩu Nguyên liệu
đượ c cho và o thù ng xố p cá ch nhiệ t, duy trì nhiệt
độ bảo quản bằng nước đá gel rồi vậ n chuyể n về
phị ng thí nghiệ m bả o quả n đơng ở nhiệt độ <-20oC
cho tớ i khi sử dụ ng Cách chuẩn bị nguyên liệu cho
thí nghiệm: các bánh da cá sau khi được rã đơng tự
nhiên và rửa sơ bộ để loại bỏ bớt mỡ, thịt vụn cịn
sĩt lại, được đem đi cắt thành những miếng nhỏ kích
thước 1x1cm, phục vụ cho thí nghiệm
2 Phương pháp nghiên cứu
2.1 Phương pháp phân tích
Xác định màu mẫu thử bằng máy đo màu
Chroma meter CR- 400 Xác định nhiệt độ biến
tính: theo phương pháp của Kimura và cộng sự
(1988) Xác định khả năng giữ nước của
colla-gen theo phương pháp của Mc Connel và cộng
sự (1974) Hàm lượng collagen được xác định từ
hàm lượng hydroxyproline theo phương pháp của
C George Carlson và áp dụng cơng thức chuyển
protein tổng số bằng phương pháp Kjeldahl theo
TCVN 4295-86 Phân tích hà m lượ ng khống bằng
phương phá p nung theo TCVN 5105-90 Phân tích
điện di protein theo phương pháp của Weber và
Os-born 1969
2.2 Phân tích số liệu
Số liệu thí nghiệm được xử lý trên phần mềm
Microsoft Excel
2.3 Sơ đồ nghiên cứu
Các cơng đoạn nghiên cứu được bố trí theo sơ
đồ hình 1 Da cá sau khi rử a, cắ t nhỏ với kí ch thướ c khoả ng 1x1cm được xử lý qua kiềm NaOH để khử
cá c tạ p chấ t phi collagen như lipit, protein khống, sắc tố và một số chất trên nguyên liệu da cá
Để đạt được mục đích khử khống thì cần nghiên cứu chế độ xử lý axit citric thích hợp (nồng độ 0,001
÷ 0,005 M; thời gian 10 ÷ 50 phút và tỷ lệ xử lý w/v: 1/6, 1/8, 1/10) cho nguyên liệu da cá Da cá sau khi
xử lý axit citric được rửa lại bằng nước thường rồi đem xử lý oxy già để tẩy màu cho nguyên liệu nhằm mục đích sản phẩm collagen thu được cĩ màu sáng hơn
Việc tẩy màu trong quy trình thu nhận collagen này cịn được bố trí thử nghiệm tại thời điểm thu kết tủa để so sánh hiệu quả tẩy trắng của oxy già để lựa chọn chế độ tẩy màu thích hợp (nồng độ
được các thơng số xử lý thích hợp thì da cá được nghiên cứu chiết xuất collagen bằng một số axit hữu
cơ khác nhau để tìm ra chế độ chiết hiệu quả nhất (axit axetic nồng độ 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6M; thời gian 16, 34, 52, 70 giờ; w/v là 1/8, 1/10, 1/12, 1/14), (Axit lactic nồng độ 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6M, thời gian
10, 22, 34, 46 giờ, w/v là 1/8, 1/10, 1/12, 1/14), (Axit citric nồng độ 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,125M, thời gian 7, 17, 27, 37 giờ, w/v là 1/6, 1/8, 1/10, 1/12)
Trang 3Kết tủa thu được tiếp tục được nghiên cứu làm
sạch các tạp chất bằng các phương pháp thẩm tích
pháp hoà tan kết tủa lặp lại 1lần, 2 lần Sản phẩm
của mỗi thí nghiệm được đem đi kiểm tra các chỉ tiêu
thích hợp để có cơ sở đề xuất quy trình tách chiết
collagen
III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
1 Xác định chế độ xử lý axít citric tách khoáng
Xác định được chế độ xử lý axit citric thích hợp
là nồng độ axit citric 0,003M; tỷ lệ da cá/ dd là 1/8
trong thời gian 30 phút, cho hiệu suất khử khoáng
giữ nước là 365% Khi tăng các giá trị nồng độ, tỷ lệ
và thời gian xử lý axit citric thì hiệu quả khử khoáng tăng lên nhưng nhiệt độ biến tính và khả năng giữ nước lại giảm Cơ chế loại khoáng của axit citric giải thích được hiện tượng này Các nhóm -COOH sẽ cho
đi một proton để tạo thành các muối citrat với các ion kim loại, các muối này dễ tan trong nước nên sẽ được loại bỏ trong chế độ rửa Tuy nhiên khi nồng độ axit citric, tỷ lệ da cá/dd và thời gian xử lý tăng lên thì mức độ tiếp xúc của da cá càng cao nên có tác dụng tháo xoắn và tác dụng lên các mạch thành phần của phân tử collagen làm cho khả năng chịu nhiệt của
NH2 làm cản trở liên kết hyđrô với phân tử nước nên khả năng hút nước của collegen giảm đi
2 Xác định chế độ chiết collagen
Hình 2 Ảnh hưởng của nồng độ, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi và thời gian chiết của các axit khác nhau đến khả năng giữ nước,
nhiệt độ biến tính và hiệu suất thu collagen
Trong đó a, b, c, d chiết bằng axit acetic; e, f, g, h chiết bằng axit citric; i, j, k,l chiết bằng axit lactic.
Trang 4Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 2/2012
2.1 Chiết bằng axit acetic
Khi tăng nồng độ axit acetic từ 0,3 ÷ 0,5M thì
khả năng giữ nước và nhiệt độ biến tính đều cĩ
khả năng tăng và đạt giá trị lớn nhất tại nồng độ
axit acetic là 0,5 M (lần lượt là 415% và 390C)
Tiếp tục thí nghiệm với nồng độ axit acetic 0,5M
thì thời gian chiết 34 giờ và tỷ lệ da cá/dd axit
ace-tic 1/10 cho khả năng giữ nước và nhiệt độ biến
tính lớn nhất Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng
của nồng độ axit acetic và thời gian chiết đến
hiệu suất thu chế phẩm collagen được trình bày
trong hình 2d Theo đĩ, ở cùng nồng độ chiết axit
acetic 0,3M nếu thực hiện chiết trong 34 giờ thì hiệu
suất thu collagen thấp hơn (48,6%) khi chiết trong
52 giờ (63,15%) Nhưng ở các nồng độ axit
ace-tic 0,4 và 0,5M thì ngược lại và hiệu suất thu chế
phẩm collagen cao nhất là 76,9% (tính theo khối
lượng khơ) ở nồng độ axit acetic 0,5M Từ kết quả
nghiên cứu này cho thấy chế độ chiết collagen bằng
axit acetic thích hợp là: axit acetic nồng độ 0,5 M,
thời gian chiết là 34 giờ, tỷ lệ da cá/ dd axít acetic
là 1/10
2.2 Chiết bằng axit citric
Chế độ chiết cho khả năng giữ nước, nhiệt độ
biến tính của chế phẩm collagen lớn nhất tại nồng
độ axit citric 0,05 M, thời gian chiết 17 giờ và tỷ lệ
w/v 1/8 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng
độ axit citric và tỷ lệ da cá/ dd axit citric (w/v) đến
hiệu suất thu chế phẩm collagen được biểu diễn ở
hình 2h Ở cùng nồng độ dung mơi chiết thì hiệu
suất thu chế phẩm collagen giảm dần khi tăng tỷ lệ
w/v này và khi chiết với axit citric cĩ nồng độ 0,05M
thì hiệu suất thu chế phẩm collagen cũng cao hơn
khi chiết với nồng độ 0,075M Điều này cĩ thể do
độ mạnh của axit citric kết hợp với việc tăng tỷ lệ
w/v đã làm ảnh hưởng khơng tốt đến cấu trúc mạch
phân tử collagen làm cho collagen tan ra mà khơng
kết tủa lại được nên hiệu suất thu chế phẩm
col-lagen giảm Kết quả nghiên cứu này cho phép đề
xuất chế độ chiết collagen thích hợp bằng axit citric
là tại nồng độ 0,05M, tỷ lệ w/v là 1/8 trong thời gian
17 giờ
2.3 Chiết bằng axit lactic
Khi nồng độ axit lactic lớn hơn 0,3M thì nhiệt
độ biến tính của chế phẩm collagen giảm nhanh
mặc dù khả năng giữ nước giảm khơng đáng kể
Thời gian chiết là 22 và 34 giờ đều cho kết quả nhiệt
độ biến tính và khả năng giữ nước của chế phẩm
năng giữ nước và nhiệt độ biến tính cao hơn đáng
kể so với các tỷ lệ khác Từ kết quả thăm dị này tiếp
tục thực hiện nghiên cứu ảnh hưởng của các chế
độ chiết đã lựa chọn đến hiệu suất thu chế phẩm collagen Kết quả thu được biểu diễn trong hình 2
Rõ ràng với nồng độ axit lactic 0,3M và thực hiện chiết trong thời gian 22 giờ thì thu được nhiều chế phẩm collagen nhất Kết hợp với kết quả thăm
dị cho phép lựa chọn chế độ chiết collagen bằng axit lactic thích hợp là nồng độ axit lactic 0,3M, thời gian chiết 22 giờ, tỷ lệ w/v là 1/10
Các kết quả chiết collagen bằng 3 loại axit này cho phép đề xuất chế độ chiết collagen thích hợp là axit acetic 0,5M trong thời gian 34 giờ và tỷ lệ w/v
là 1/10
3 Nghiên cứu sử dụng hydro peroxit để khử màu
Bảng 1 Ảnh hưởng của hydroperoxit đến tính
chất collagen
Thời gian (phút)
Nồng
độ hiđro peroxit (‰)
Khả năng giữ nước (%)
Nhiệt độ biến tính
Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ hydroperoxit, thời gian xử lý đến hiệu quả khử màu sắc của chế phẩm collagen là khơng đáng kể Cụ thể mẫu collagen trước và sau khi xử lý hydro peroxit cĩ
độ trắng tăng từ 59,97 lên 64,94 Tuy nhiên nhiệt độ
Trang 5Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 2/2012
biến tính và khả năng giữ nước của chế phẩm
colla-gen lại giảm: nhiệt độ biến tính giảm từ 38,90C xuống
374% Từ kết quả trên cho thấy hydroperoxit cho
hiệu quả khử màu khơng cao mà cịn gây ảnh hưởng
đến đến các liên kết mạch bên của mạnh peptid làm
giảm khả năng chịu nhiệt và liên kết với nước của
collagen
4 Xác định chế độ làm sạch chế phẩm
collagen
4.1 Kết quả nghiên cứu thử nghiệm thẩm tích chế
phẩm collagen
Kết quả nghiên cứu thẩm tích chế phẩm
collgen cho thấy khi tăng thời gian thẩm tích thì hàm
lượng protein tăng và hàm lượng khống lại giảm
Cụ thể sau thời gian thẩm tích 24 thì hàm lượng
pro-tein tăng từ 82,6% lên 86,9%, hàm lượng khống
giảm từ 15,26% xuống 7,82% Tiếp tục tăng thời
gian thẩm tích lên 36 giờ thì hàm lượng protein tăng
lên 94,8% và hàm lượng khống cịn 2,26% Tuy
nhiên khi tiếp tục tăng thời gian thẩm tích lên 48 giờ
thì hiệu quả làm sạch tăng lên khơng đáng kể
4.2 Kết quả nghiên cứu thử nghiệm chiết lặp lại cho
chế phẩm collagen
Sau khi chế phẩm collagen được hồ tan và
kết tủa lại 1 lần và 2 lần thì hàm lượng prottein và
collagen đều tăng Tuy nhiên sự tăng này là nhỏ
hơn so với phương pháp làm sạch bằng màng thẩm
tích Cụ thể sau 2 lần hịa tan và kết tủa lại hàm
lượng protein tăng từ 82,6% lên 87,2%, hàm lượng
collagen tăng từ 76,9% lên 78,4% Từ kết quả trên
cho thấy phương pháp làm sạch bằng cách hồ tan
và kết tủa lại cho hiệu quả khơng cao bằng phương
pháp thẩm tích
Như vậy bước đầu đề xuất chế độ làm sạch tốt
hơn trong hai chế độ thử nghiệm này là thực hiện
làm sạch chế phẩm collagen bằng cách thẩm tích
giờ, thay dung mơi 4 giờ một lần
5 Đề xuất quy trình thu nhận Collagen từ da cá
Tra
Từ các kết quả thu được cho phép đền xuất quy
trình thu nhận collagen bằng phương pháp hĩa học
như hình 3
6 Đánh giá chất lượng sản phẩm collagen thu được từ quy trình đề xuất
Collagen thu được được phân tích các thành phần hĩa học cơ bản và một số tính chất đặc trưng như sau:
1 Thành phần hĩa học cơ bản của sản phẩm Protein : 85,3%
Khống : 2.04%
Pb và As : khơng phát hiện
2 Khả năng giữ nước: 415%
3 Nhiệt độ biến tính: 390C
4 Màu sắc: 59,97
5 Hàm lượng collagen: 70,15% (theo % khối lượng khơ)
6 Khối lượng phân tử:
Kết quả phân tích điện di để xác định khối lượng phân tử của collagen thu được cho thấy trong sản phẩm collagen thu được cĩ 4 loại protein cĩ các khối lượng phân tử lần lượt là
Trang 6Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 2/2012
217kDa, 185kDa, 156kDa, và 104kDa Kết quả điện
di mẫu collagen biểu diễn trên hình 4
Hình 4 Kết quả điện di protein mẫu collagen
Land 1: hỗn hợp chuẩn protein;
Land 2: mẫu collagen (50µ protein)
IV KẾT LUẬN
Collagen cĩ thể thu được từ nguyên liệu da
cá tra bằng các cơng đoạn cơ bản như xử lý kiềm
để khử protein và xà phịng hĩa lipit, xử lý axit citric để khử bớt khống cho nguyên liệu, chiết bằng axit acetic và dung muối NaCl để thu kết tủa Kết tủa được làm sạch bằng phương pháp thẩm tích trong Na2HPO4 Sản phẩm collagen thu được cĩ các thành phần hĩa học và một số tính chất đặc trưng phù hợp với các tính chất của collagen thu nhận từ thủy sản (Muyonga, coleb, & Duodub, 2004; Nagai & Suzuki, 2001; Sadowska, Kollodziejka, & Niecikowska, 2003) ngoại trừ hàm lượng khống vẫn cịn hơi cao
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Bộ nơng nghiệp và phát triển nơng thơn (2008), Báo cáo kết quả thực hiện kế hoạch tháng 12 và năm 2008 ngành Nơng nghiệp
và Phát triển Nơng thơn
2 Nguyễn Cảnh (1995), Quy hoạch thực nghiệm, Đại học Bách Khoa, Tp Hồ Chí Minh
3 Trần Thị Huyền (2009) Nghiên cứu quy trình sản xuất collagen từ da cá tra Luận văn Thạc sĩ Kỹ thuật, Trường Đại học Nha Trang
4 HaiYing Liu, Ding Li, ShiDong Guo (2007), Studies on collagen from the skin of channel catfi sh (Ictalurus punctaus), Food chemistry, pages 621-625
5 K A Nam, S G You, and S M.Kim (2007), Physicochemical properties of squid skin collagen, proceedings of the 11th international symposium on the effi cient application and preservation of marine biological resources, Nha Trang university, pages 72-89
6 Takeshi Nagai, Nobutaka Suzuki (2000), Isolation of collagen from fi sh waste materials- skin, bone, and fi ns, Food chemistry, pages 277-281
7 Takeshi Nagai, Masami Izumi, Masahide Ishii (2004), Fish scale collagen-preparation and partial characterization, International Journal of Food Science and, Technology, pages 239-244
8 Vittayanont, Bebjakul (2005), The extracting collagen from chicken feet, from http://ift.confex.com/ift/2005/techprogram/ paper_31440.htm