Chiết tách collagen từ da cá tra để tổng hợp vật liệu nanocomposit collagen – aunps, ứng dụng trong y sinh

Đặt vấn đề nghiên cứu Collagen là một loại protein có nhiều trong da của cá và các loài động vật có vú với vai trò là cấu nối liên kết các mô [9], [10].. Ngoài ra, với nhiều đặc tính nổ

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN SƯ PHẠM

Sinh viên thực hiện : LÊ THỊ HÒA Giáo viên hướng dẫn : TS NGUYỄN BÁ TRUNG

ĐÀ NẴNG, 2014

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

KHOA HÓA

NHIỆM VỤ KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP

Họ và tên sinh viên: LÊ THỊ HÒA

Lớp: 10SHH

1 Tên đề tài: Chiết tách collagen từ da cá tra để tổng hợp vật liệu nanocomposit Collagen – AuNPs, ứng dụng trong y sinh .

2 Nguyên liệu, dụng cụ và thiết bị: Da cá tra, HAuCl4, NaOH, n-butanol, axit

axetic, NaCl, natricitrat, polyethylene glycol (PEG) 3350

3 Nội dung nghiên cứu: Chiết tách collagen từ da cá tra, tổng hợp nano vàng từ axit HAuCl4, kết hợp collagen và nano vàng để tạo vật liệu nanocomposit Collagen-AuNPs

4 Giáo viên hướng dẫn: TS Nguyễn Bá Trung

5 Ngày giao đề tài: 15/08/2013

6 Ngày hoàn thành 20/04/2014

Sinh viên đã hoàn thành và nộp báo cáo cho Khoa ngày 25 tháng 5 năm 2014

Kết quả điểm đánh giá: Ngày tháng năm 2014 CHỦ TỊCH

LỜI CẢM ƠN



Em xin bày tỏ lòng tri ân và biết ơn sâu sắc của mình tới TS Nguyễn Bá Trung, người đã hướng dẫn trực tiếp, giúp đỡ tận tình em trong thời gian nghiên

cứu, thực hiện đề tài

Em xin chân thành cảm ơn đến các thầy cô giáo trong tổ Hóa lý, Ban chủ nhiệm Khoa Hóa, trường Đại học Sư phạm Đà Nẵng đã tạo mọi điều kiện cho em học tập, nghiên cứu khóa luận

Em chân thành cảm ơn tất cả các thầy cô Khoa Hóa trường Đại học Sư Phạm

Đà Nẵng, những người đã có vai trò giảng dạy, cung cấp kiến thức cho em trong 4 năm học

Em cũng vô cùng cảm ơn sự quan tâm, ủng hộ của gia đình và bạn bè Đây chính là nguồn động viên về tinh thần rất lớn cho em trong thời gian làm khóa luận

Mặc dù đã cố gắng nhưng do trình độ nghiên cứu và thời gian có hạn nên báo cáo không tránh khỏi những thiếu sót Kính mong nhận được sự góp ý chân thành của các thầy cô

Em xin chân thành cảm ơn

LỜI CAM ĐOAN

Tôi, Lê Thị Hòa xin cam đoan:

1 Những nội dung trong báo cáo này là do tôi thực hiện dưới sự hướng dẫn của TS Nguyễn Bá Trung

2 Mọi tài liệu tham khảo dùng trong báo cáo đều được trích dẫn rõ ràng tên tác giả, tên công trình, thời gian, địa điểm công bố

3 Nếu có bất kỳ sự sao chép không hợp lệ, vi phạm quy chế đào tạo hay sự gian trá trong khoa học tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm

Đà Nẵng, ngày 25 tháng 05 năm 2014

Người thực hiện

Lê Thị Hòa

MỤC LỤC

LỜI MỞ ĐẦU Error! Bookmark not defined

1 Đặt vấn đề Error! Bookmark not defined

2 Mục đích nghiên cứu 2

3 Ý nghĩa của đề tài 2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Collagen 3

1.1.1 Giới thiệu về collagen 3

1.1.2 Nguồn nguyên liệu collagen 7

1.1.3 Phương pháp sản xuất collagen 7

1.1.4 Các phương pháp đánh giá và phân tích colagen 9

1.1.5 Những ứng dụng của collagen 11

1.2 Khái quát về công nghệ nano 13

1.2.1 Giới thiệu về công nghệ nano 13

1.2.2 Cơ sở khoa học của công nghệ nano 13

1.3 Các phương pháp điều chế vật liệu nano 14

1.3.1 Phương pháp từ trên xuống 15

1.3.2 Phương pháp từ dưới lên 15

1.4 Hạt nano vàng 16

1.4.1 Giới thiệu về kim loại vàng 16

1.4.2 Tổng hợp hạt nano vàng (AuNPs) 16

1.4.3 Ứng dụng của AuNPs 17

1.5 Vật liệu nanocomposit Collagen-AuNPs 21

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 23

2.1 Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị 23

2.1.1 Nguyên liệu 23

2.1.2 Hóa chất 23

2.1.3 Thiết bị 23

2.2 Phương pháp nghiên cứu 23

2.2.1 Chiết tách collagen 23

2.2.2 Tổng hợp và tối ưu hóa quá trình điều chế nano vàng 24

2.2.3 Chức năng hóa bề mặt nano vàng bằng PEG 25

2.2.4 Chế tạo vật liệu Collagen-AuNPs 25

2.2.5 Phân tích đặc trưng của vật liệu 25

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27

3.1 Chiết tách collagen từ da cá tra và xác định các đặc trưng của sản phẩm 27

3.1.1 Chiết tách collagen từ da cá tra 27

3.1.2 Xác định các đặc trưng của sản phẩm bằng các phương pháp phân tích vật lý 27

3.1.2.1 Phổ hấp thụ phân tử (UV-VIS) 27

3.1.2.2 Phổ hồng ngoại (IR) xác định đặc trưng cho collagen 28

3.2 Điều chế dung dịch keo nano vàng AuNPs 28

3.2.1 Khảo sát điều kiện tối ưu cho quá trình tổng hợp AuNPs 30

3.2.1.1 Ảnh hưởng của nồng độ HAuCl4 30

3.2.1.2 Ảnh hưởng của nồng độ natricitrat 31

3.2.1.3 Ảnh hưởng của tốc độ khuấy 33

3.2.2 Tổng hợp và xác định các đặc trưng vật lý của AuNPs 34

3.2.3 Biến tính bề mặt AuNPs bằng PEG 35

3.2.3.1 Phổ hấp thụ phân tử (UV-VIS) 36

3.2.3.2 Ảnh TEM 37

3.3 Vật liệu nanocomposit Collagen-AuNPs 37

4 Kết luận 38

TÀI LIỆU THAM KHẢO 39

DANH MỤC BẢNG, HÌNH ẢNH, SƠ ĐỒ

Hình 1.1: Minh họa sự gắn kết của các mô, tế bào của collagen 3

Hình 1.2: Hình cấu trúc xoắn ba của collagen 4

Hình 1.3: Các loại mỹ phẩm chứa collagen 13

Hình 1.4: Quá trình bổ sung hạt nano vàng lên dây nano bạc clorua 19

Hình 1.5: Hạt nano vàng được sử dụng làm chất vận chuyển thuốc đến tế bào mục tiêu 20

Hình 1.6: Hạt nano vàng trong cảm biến sinh học được sử dụng để phát hiện axit uric 21

Hình 2.1: Quy trình chiết tách collagen từ da cá 24

Hình 3.1: Collagen chiết tách từ da cá tra: a) Dạng ướt; b) Dạng khô 27

Hình 3.2: Phổ UV-Vis của collagen hòa tan trong CH 3 COOH 0,5 M (nồng độ 9mg/mL) 28

Hình 3.3: Phổ hồng ngoại của collagen 28

Hình 3.4: Sự đổi màu của dung dịch phản ứng trước (a) và sau khi thêm natricitrat (b) 29

Hình 3.5: Các mẫu trong thí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ HAuCl 4 đến quá trình tổng hợp AuNPs 30

Hình 3.6: Tín hiệu cộng hưởng plasmon bề mặt của dung dịch keo AuNPs được điều chế ở các nồng độ HAuCl 4 khác nhau 31

Hình 3.7: Các mẫu trong thí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ natricitrat đến quá

trình tổng hợp AuNPs 32

Hình 3.8: Tín hiệu cộng hưởng plasmon bề mặt của dung dịch keo AuNPs được

điều chế ở các nồng độ natricitrat khác nhau 32

Hình 3.9: Màu của dung dịch keo AuNPs được điều chế ứng với tốc độ khuấy khác

LỜI MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề nghiên cứu

Collagen là một loại protein có nhiều trong da của cá và các loài động vật có

vú với vai trò là cấu nối liên kết các mô [9], [10] Nguồn nguyên liệu cung cấp khá phong phú cùng với kĩ thuật chiết tách đơn giản, collagen đã được chú ý ứng dụng nhiều trong công nghiệp sản xuất dược liệu chăm sóc và chống lão hoá da [15] Ngoài ra, với nhiều đặc tính nổi bật như độ tương thích sinh học cao, tính kháng nguyên thấp, sự linh động trong việc thay đổi cấu trúc, phân tử chứa nhiều nhóm chức nên collagen còn được chú ý nhiều trong các ứng dụng y sinh như làm chất mang thuốc, cảm biến sinh học …[7], [9], [16]

Trong những năm gần đây, việc nghiên cứu ứng dụng nano kim loại ngày càng phổ biến rộng rãi Trong số đó, AuNPs được đặc biệt lưu ý trong các ứng dụng liên quan đến nghiên cứu y sinh, do ngoài những tính năng đặc trưng giống các nano kim loại khác như kích thước nhỏ, diện tích bề mặt riêng lớn, chúng có độ ổn định cao, bền trong môi trường sinh hoá, không độc, dễ dàng chức năng hóa với nhiều tác nhân sinh học khác nhau vì thế có khả năng phản ứng cao với tế bào sống Với những ưu điểm nổi bật trên, AuNPs được ứng dụng nhiều chẩn đoán và điều trị bệnh [8]

Ngoài các ưu điểm đã nêu, cả collagen và AuNPs đều có những hạn chế trong một vài ứng dụng Collagen có độ phân hủy sinh học và tính ổn định không cao trong những ứng dụng ở môi trường nội bào hay ngoại bào Với AuNPs, do có kích thước nano nên chúng dễ dàng xâm nhập vào trong nhiều loại tế bào khác nhau, gây khó khăn cho việc định hướng đến các mô, tế bào mục tiêu Vì vậy, sự kết hợp của AuNPs và collagen sẽ tạo ra vật liệu sinh học mới có nhiều tính chất ưu việt, mở ra nhiều ứng dụng có ý nghĩa như sử dụng nền collagen liên kết để tăng tính tương thích trong cảm biến sinh học, làm tác nhân phân bố thuốc đến tế bào,

mô mục tiêu trong điều trị bệnh [8], [9] Ngoài ra collagen và nano vàng đều được

ứng dụng trong sản phẩm cải thiện và chăm sóc da, do đó sự kết hợp này có thể tạo

ra một sản phẩm làm đẹp “hai trong một” mới, ứng dụng trong công nghiệp sản xuất mỹ phẩm

Vì vậy chúng tôi chọn đề tài: “Chiết tách collagen từ da cá tra để tổng hợp vật liệu nanocomposit Collagen-AuNPs, ứng dụng trong y sinh”

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Chiết tách được collagen từ da cá tra

- Tổng hợp và tối ưu hóa quá trình điều chế dung dịch keo AuNPs ổn định, có độ phân tán đồng đều

- Tổng hợp vật liệu nanocomposit từ collagen và AuNPs để ứng dụng trong y sinh

3 Ý nghĩa của đề tài

- Về mặt khoa học: Góp phần xây dựng phương pháp chiết tách collagen và tổng

hợp hạt nano vàng; hiểu biết về vật liệu tổ hợp giữa collagen và nano vàng từ đó mở

ra các hướng ứng dụng của vật liệu này trong các nghiên cứu y sinh

- Về mặt ứng dụng: Kết quả nghiên cứu này có khả năng ứng dụng cao trong y sinh

do cải thiện tính tương thích của loại vật liệu này trong các ứng dụng cảm biến sinh học, tác nhân vận chuyển thuốc, mỹ phẩm chăm sóc da…

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Collagen

1.1.1 Giới thiệu về collagen

1.1.1.1 Collagen là gì ?

Collagen là một loại protein được tìm thấy ở động vật, đặc biệt là trong các

mô thịt và mô liên kết của động vật có vú Nó là thành phần chính của mô liên kết,

và là loại protein có nhiều nhất trong các loài động vật có vú, chiếm khoảng 25% đến 35% protein cơ thể Collagen ở dạng sợi dài chủ yếu được tìm thấy trong các

mô xơ như dây chằng, gân và da; nó cũng có nhiều trong giác mạc, sụn, xương, mạch máu, ruột và đĩa đệm Nguyên bào sợi là tế bào phổ biến nhất tạo ra collagen Collagen có chức năng chính là kết nối các mô trong cơ thể lại với nhau Vì thế, các nhà khoa học thường ví collagen như một chất keo kết dính các bộ phận trong cơ thể người lại thành một khối hoàn chỉnh Nếu không có chúng, cơ thể người sẽ chỉ

là các phần rời rạc [1]

Hình 1.1: Minh họa sự gắn kết của các mô, tế bào của collagen

1.1.1.2 Thành phần và cấu trúc của collagen

Collgen có kết cấu rất phức tạp Tropocollagen hay “phân tử collagen” là một đơn vị lớn hơn của collagen gọi là các sợi Nó dài khoảng 300 nm, đường kính 1,5 nm, tạo thành bởi ba chuỗi polypeptit (peptit anfa), mỗi chuỗi này đều được sắp xếp theo một đường xoắn ốc phía tay trái Ba chuỗi xoắn ốc được cuộn cùng nhau theo chiều thuận tay phải, “đường xoắn ốc đặc biệt” hoặc đường xoắn ốc bộ ba Cấu trúc bậc bốn của collagen được ổn định bằng các liên kết hyđrô

Hình 1.2: Hình cấu trúc xoắn ba của collagen

Một đặc điểm đặc trưng của collagen là sự sắp xếp đều đặn của các amino axit trong mỗi mắt xích của từng chuỗi xoắn ốc collagen Thông thường, các chuỗi sắp xếp các amino acid theo mẫu sau: Gly-Pro-Y hoặc Gly-X-Hyp, trong đó X và Y

là các axit amin còn lại Proline hoặc hydroxyproline tạo nên khoảng 1/6 tổng số chuỗi

Glycine chiếm 1/3 số chuỗi, điều này có nghĩa là khoảng nửa chuỗi collagen không chứa glycine, proline hoặc hydroxyproline, các nhóm GYX khác thường trong các chuỗi peptit collagen α Sự phân bố đều đặn với hàm lượng glycine cao được tìm thấy ở một số ít loại protein dạng sợi như sợi tơ tằm

1.1.1.3 Phân loại collagen

Collagen có ở khắp nơi trong cơ thể và có tới 29 loại collagen, trong đó tập trung chủ yếu ở các nhóm collagen tuýp I, II, III, IV và V

+ Collagen tuýp I: Có trong da gân thành mạch, dây chằng, nội tạng và thành phần chính của xương

+ Collagen tuýp II: Thành phần chính của sụn

+ Collagen tuýp III: Thành phần chính của sợi liên kết trên da, dây chằng v.v…

+ Collagen tuýp IV: Thành phần màng đáy

+ Collagen tuýp V: Thành phần chính của bề mặt tế bào, lông tóc và rau thai Đối với collagen thủy phân sẽ cung cấp cho cơ thể các nhóm thuộc tuýp I, II, III, IV, V

1.1.1.4 Tác dụng của collagen đối với cơ thể

- Tác dụng với da

Collagen chiếm khoảng 70% cấu trúc da và được phân bố chủ yếu ở lớp hạ

bì của da Collagen có tác dụng kết nối các tế bào, kích thích quá trình trao đổi chất

và tạo độ đàn hồi của da Sự suy giảm về chất lượng và số lượng collagen sẽ dẫn đến sự “lão hoá” của cơ thể, thể hiện rõ nhất trên da, khuôn mặt với các dấu hiệu nhận biết như: làn da bị khô, nhăn nheo bắt đầu từ các đường nhăn mảnh trên khoé mắt, khoé miệng, lâu dần thành nếp nhăn sâu; các đường nét khuôn mặt bị chùng nhão và chảy xệ Chính vì vậy, collagen được xem là một trong những chất quan trọng hàng đầu của ngành công nghiệp mỹ phẩm, đặc biệt là chăm sóc da, phẫu thuật thẩm mỹ, phẫu thuật bỏng…

- Collagen giúp vết thương nhanh lành sẹo

Sẹo được hình thành do liên kết collagen và elastin của da bị gãy và tổn thương Collagen có tác động tích cực đến việc sản sinh ra các tế bào da mới, giúp làn da hồi sinh nhanh chóng nên các vết thâm cũng sẽ bị làm mờ dần

- Tác dụng của collagen với xương

Bên cạnh Canxi, collagen chiếm 80% trong cơ cấu thành phần của xương Nếu so sánh cấu tạo xương như một ngôi nhà thì canxi chính là xi măng, còn collagen là bộ khung sắt Khi tuổi tác càng tăng, collagen cũng bị suy yếu và lão hoá làm giảm tính đàn hồi, dẻo dai của bộ xương Vì vậy, bổ sung collagen giúp xương chắc khỏe hơn và phòng chống các bệnh như loãng xương, xốp xương

- Tác dụng của collagen với sụn

Collagen chiếm 50% trong cơ cấu thành phần sụn Sự thiếu hụt collagen làm cho ma sát giữa các khớp xương lớn hơn, gây ra các biến dạng ở xương và sụn Việc bổ sung collagen giúp ngăn ngừa và giảm thiểu các bệnh liên quan đến khớp xương Ngoài ra collagen còn giúp phòng chống các bệnh như đau thắt lưng, thoát

vị đĩa đệm và một số bệnh về xương, sụn khác

- Tác dụng collagen với mắt

Collagen tồn tại nhiều trong giác mạc và thuỷ tinh thể của mắt dưới dạng kết tinh Sự thiếu hụt collagen làm cho giác mạc hoạt động kém, gây ảnh hưởng đến thị lực của mắt và làm cho thủy tinh thể mờ đi do chất amino bị lão hóa Đây chính là nguyên nhân gây ra bệnh đục thủy tinh thể mắt

- Collagen phòng ngừa tế bào ung thư

Các thí nghiệm khoa học tại Nhật đã chứng minh được rằng sử dụng collagen chiết xuất có tác dụng ngăn ngừa sự biến đổi tế bào gốc phôi (tế bào ES) thành tế bào ung thư

- Tác dụng của collagen với nội tạng

Collagen cũng tồn tại trong nội tạng trong cơ thể người và có tác dụng giữ cho các bộ phận nội tạng luôn khỏe mạnh Bổ sung collagen sẽ hạn chế các bệnh về tim mạch, gan, phổi…

- Tác dụng của collagen với răng

Collagen có nhiều trong lợi răng và được coi là tố chất đề kháng các bệnh về răng miệng như viêm nha chu

- Tác dụng của collagen với tóc, móng chân – tay

Collagen có trong chất sừng ở tóc, móng chân, móng tay và có tác dụng cung cấp chất dinh dưỡng hỗ trợ hoạt động của chất sừng này Do đó, việc bổ sung collagen giúp cho tóc, móng chân và móng tay trở nên bóng mượt, mịn màng, chắc khỏe, cũng như hạn chế sự rụng tóc Dầu gội đầu có chứa collagen có tác dụng giữ ẩm và làm suôn mượt tóc

- Tăng cường hệ miễn dịch

Collagen tăng cường khả năng hoạt động của vi khuẩn có vai trò quan trọng trong cơ chế miễn dịch của cơ thể Collagen tạo môi trường thích hợp cho hoạt động của các vi khuẩn có ích trong cơ thể Vì thế, collagen có tác dụng cải thiện chứng táo bón hay gặp ở phụ nữ, giữ da đẹp và tăng cường khả năng hoạt động của não

1.1.2 Nguồn nguyên liệu chứa collagen

Collgen là một loại protein có nhiều trong các mô liên kết ở các loài động vật

có vú Nguồn collagen truyền thống là từ các loại gia súc như trâu, bò, lợn… Tuy nhiên, do sự bùng phát các các loại bệnh như lở mồm long móng (FMD), bovine spongiform encephalopathy (BSE), transmissible spongiform encephalopathy (TSE), vì thế, người tiêu dùng lo lắng về việc sử dụng collagen được chiết suất từ những loại động vật này Do đó, việc sử dụng collagen từ da cá thay thế cho collagen từ các loại động vật có vú mang lại sự yên tâm cho người sử dụng, bởi da

cá là nguồn nguyên liệu sạch, không có liên quan đến những căn bệnh nguy hiểm nói trên [6]

1.1.3 Phương pháp sản xuất collagen

1.1.3.1 Quy trình sản xuất chung

Nhìn chung, quy trình thu nhận collagen gồm 3 giai đoạn chính:

 Giai đoạn 1: Phá vỡ tế bào

Do các phân tử collagen không có khả năng đi qua màng tế bào, vì vậy cần phá vỡ cấu trúc tế bào để chuyển collagen vào dung dịch Các phương pháp cơ học

có thể sử dụng như tiến hành nghiền với bột thủy tinh hoặc cát thạch anh, sau đó tiến hành đồng hóa (homogenizator) Thiết bị này có cấu tạo gồm chày thủy tinh gắn với môtơ quay có thể điều chỉnh tốc độ quay theo yêu cầu Các tế bào nằm giữa chày thủy tinh và thành cối sẽ bị phá vỡ Ngoài ra người ta còn sử dụng các dung môi hữu cơ như butanol, acetone kết hợp với các chất tẩy rửa Các hóa chất này giúp cho việc phá vỡ các bào quan của tế bào để thu lấy collagen

 Giai đoạn 2: Tách chiết collagen

Việc tách chiết collagen được tiến hành dễ dàng hơn sau khi phá vỡ cấu trúc

tế bào, collagen có thể được chiết tách bằng axit, muối hoặc sử dụng enzym Quá trình tách chiết collagen được thực hiện trong các reactor ở nhiệt độ lạnh và trong điều kiện vô trùng, kết hợp khuấy trộn liên tục để đảm bảo collagen thu được có chất lượng tốt nhất

 Giai đoạn 3: Tinh sạch collagen

Trong dịch chiết thô, ngoài collagen còn có protein tạp, các lipid, muối khoáng Để loại các thành phần này cần sử dụng các biện pháp khác nhau Muối khoáng được tách loại bằng phương pháp thẩm tích Để loại các protein tạp, người

ta tiến hành kết tủa phân đoạn bằng muối trung tính hoặc các dung môi hữu cơ, ngoài ra có thể dùng các phương pháp sắc ký trao đổi ion, phương pháp điện di, phương pháp lọc gel…

1.1.3.2 Những phương pháp chiết tách collagen từ da cá

Dựa vào loại dung môi được sử dụng, người ta phân chia thành 3 phương pháp chính để chiết tách collagen từ da cá: (1) phương pháp muối hòa tan collagen, (2) phương pháp axit hòa tan collagen và (3) phương pháp pepsin hòa tan collagen Các phương pháp chiết tách này đều bao gồm những bước cơ bản sau: (1) chuẩn bị

da cá, loại bỏ những mô không phải collagen, (2) hòa tan collagen; (3) ly tâm, kết tủa collagen và (4) xác định đặc tính của collagen Trong các phương pháp trên, phương pháp pepsin hòa tan collagen cho hiệu quả chiết tách cao nhất

1.1.4 Các phương pháp đánh giá và phân tích colagen

Có nhiều phương pháp đánh giá và phân tích collagen: phân tích độ nhớt, độ

ẩm, hàm lượng tro, xác định khối lượng phân tử, vi sinh, phân tích thành phần protein trong collagen, phân tích thành phần axit amin

1.1.4.1 Xác định trọng lượng phân tử collagen bằng phương pháp điện di

Collagen được hòa tan trong dung dịch axit axetic 0,5 M đến nồng độ 2,5 mg/ml Chỉnh pH của dung dịch collagen đến pH = 4,4 bằng dung dịch natriphotphat 0,2 M Ngay sau đó, hòa tan dung dịch này vào hỗn hợp chứa 1% sodium dodecyl sunfate (SDS) và urê 3,5 M (pH 7,2), khuấy liên tục ở nhiệt độ phòng Hỗn hợp được ly tâm để loại bỏ tạp chất không tan Dung dịch này được trộn theo tỉ lệ 1/1 (V/V) với dung dịch đệm tris-HCl 0,5 M (pH 6,8) có chứa 4 % SDS và 20% glycerol [2]

Dung dịch mẫu được đưa vào các giếng của gel polyacrylamide trong dung dịch đệm với cường độ dòng điện khoảng 20 mA Sau khi điện di, gel được nhuộm màu bằng dung dịch chứa co-omassie blue R-250 0,05% (w/v) trong metanol 15% (w/v) và axit axetic 5% (w/v) trong 1-2 giờ và tẩy màu bằng dung dịch metanol 30% (w/v) và axetic 5% (w/v) cho đến khi xuất hiện các vạch protein Thang

protein chuẩn được lập dựng bằng cách dùng protein chuẩn với trọng lượng phân tử

Dung dịch collagen 0,03% trong axit axetic 0,1 M, được khuấy đều cho tan hết Tiến hành đo độ nhớt trong bể điều nhiệt Nhiệt độ được gia tăng chậm khoảng

10C/ph Bắt đầu đo ở 330C và kết thúc ở 500C Ghi lại giá trị độ nhớt đo được sau mỗi phút

Độ nhớt tương đối của dung dịch collagen sau mỗi phút được xác định tương ứng ở các mức độ nhiệt độ như sau:

1.1.4.3 Phân tích hàm lượng hydroxyproline

Hydroxyproline là một axit amin đặc trưng cho collagen Chúng chỉ có mặt trong collagen mà không có trong bất kỳ một loại protein nào khác, ngoại trừ có một lượng nhỏ trong elastin Do đó, có thể định hướng collagen thông qua định lượng hydroxyproline và nhân với hệ số chuyển đổi 14,7 [Sadowska, Kolodziejska, Niecikowska, 2003]

Quy trình xác định hydroxyproline được thực hiện theo phương pháp của

Ignat’eva, Danilov, Averkiev, Oberzkova, Lunin, Sobol, 2005

Cấu trúc của hydroxyproline có chứa vòng pyrrolidine, nó có thể bị oxy hóa

để hình thành vòng pyrole Vòng pyrole này tác dụng với tác chất Ehrlich, 4-(N,N- đimethylamino) benzadehyde tạo thành hợp chất quinoid có màu (màu sắc phụ thuộc vào nhóm thế và thay đổi từ màu cam đến màu hoa cà) Thực hiện phương pháp so màu để tính hàm lượng hyđroxyproline

1.1.4.4 Đo quang phổ hồng ngoại (IR)

Phổ hồng ngoại IR là một trong những kỹ thuật phổ được sử dụng rộng rãi nhất Mục đích chính của việc phân tích phổ IR là xác định các nhóm chức hóa học

có trong mẫu Máy phổ hồng ngoại có thể làm việc với mẫu ở các trạng thái tập hợp khí, lỏng, rắn Kết quả phân tích phổ IR cho phép xác định các nhóm chức đặc trưng của collagen, từ đó khẳng định cấu trúc của hợp chất collagen đã chiết tách

1.1.5 Những ứng dụng của collagen [1],[2]

1.1.5.1 Trong y học và dược phẩm

Collagen là một vật liệu có khả năng phân hủy sinh học Tác dụng của collagen dựa trên sự kết hợp khả năng tạo màng và tạo gel một cách tự nhiên Collagen không gây dị ứng và được hấp thụ hoàn toàn trong cơ thể con người Do

có tính tương thích sinh học cao cũng như khả năng cầm máu tốt, collagen có thể

được sử dụng để điều chế thành những dạng khác nhau và là một vật liệu sinh học

lý tưởng cho việc sản xuất các sản phẩm y học:

- Màng collagen được sử dụng cho những ứng dụng như làm chất bịt kín sinh học và cải thiện tính đáp ứng sinh học với mô cấy

- Collagen được sử dụng như một hệ thống sinh học cho ra các loại thuốc bao gồm thuốc tránh thai, kháng sinh, insulin, hormone tăng trưởng…

- Collagen được sử dụng rộng rãi trong phẫu thuật thẩm mỹ, chữa lành vết thương cho các bệnh nhân bị bỏng, tái tạo xương và nhiều mục đích khác thuộc nha khoa, phẫu thuật chỉnh hình

- Collagen là chất bổ sung, cải thiện tính linh hoạt của khớp; là phần nền giúp tích tụ canxi trong xương Nếu giảm hàm lượng collagen, canxi không thể tích

tụ làm cho xương giòn, dễ gãy; sụn dễ bị hao mòn tạo nên các cơn đau khớp gối và hông Như vậy, để xương cứng cáp hơn, ngoài canxi cần bổ sung một lượng lớn collagen

- Collagen được ứng dụng trong công nghệ dược phẩm như: chất keo bảo vệ các thành phần nhạy cảm khỏi tác động của sự oxy hóa dưới tác động của ánh sáng; chất hút ẩm; tạo mùi vị trung hòa; chất ổn định của hệ nhũ tương, huyền phù; chất tạo bọt và ổn định trong quá trình sản xuất chất bọt cầm máu Với các đặc tính trên, collagen được sử dụng trong các lĩnh vực sau: sản xuất thuốc, thành phần cầm máu

và hàn gắn vết thương, tác nhân thay thế máu, nuôi cấy mô và tế bào, ứng dụng trong kỹ thuật nội soi và phẫu thuật thẩm mỹ

1.1.5.2 Trong mỹ phẩm

Collagen chứa các tác nhân làm ẩm tự nhiên đối với cơ thể, có vai trò chống nhăn, giữ cho da mềm và sáng Collagen còn dùng làm nguyên liệu để sản xuất các

sản phẩm như: mặt nạ, kem dưỡng da cao cấp, dầu gội, các sản phẩm dưỡng tóc sữa tắm…

Hình 1.3: Các loại mỹ phẩm chứa collagen

Collagen hydrolysate là thành phần trong các sản phẩm mặt nạ dưỡng da, chúng kết hợp với các tính chất trong mật ong, dầu oliu, tinh dầu hoa hồng…có tác dụng dưỡng ẩm cho da, tái tạo làn da, bảo vệ da khỏi các tác nhân tử ngoại, khói bụi, hóa chất…vì thế da được trẻ hóa, tươi tắn

1.2 Khái quát về công nghệ nano

1.2.1 Giới thiệu về công nghệ nano

Công nghệ nano là ngành công nghệ liên quan đến việc thiết kế, phân tích, chế tạo và ứng dụng các cấu trúc, thiết bị và hệ thống bằng việc điều khiển hình dáng và kích thước ở quy mô nano mét (nm, 1nm = 10-9

m) Ở kích thước nano, vật liệu sẽ có những tính năng đặc biệt mà vật liệu truyền thống không có được là do sự thu nhỏ kích thước và việc tăng diện tích mặt ngoài

1.2.2 Cơ sở khoa học của công nghệ nano [3]

Công nghệ nano dựa trên các cơ sở khoa học chính sau đây:

- Chuyển từ tính chất cổ điển sang tính chất lượng tử: Ở mức độ vĩ mô các

tính chất vật lý của vật chất có thể giải thích bởi các định luật cơ học của Newton Tuy nhiên, khi kích thước vật chất ở mức nano mét hay nhỏ hơn thì các giải thích

theo định luật của Newton không còn chính xác Để giải thích các hiện tượng vật lý của vật chất ở mức độ này, một mảng vật lý mới đã ra đời với tên gọi “cơ học lượng tử” Cơ học lượng tử giải thích chính xác các hiện tượng vật lý xảy ra ở mức độ vi

mô Ở mức độ này, các tính chất lượng tử của vật chất được thể hiện rõ nét

- Hiệu ứng bề mặt: Cùng một khối lượng nhưng khi vật liệu ở kích thước

nano mét, số các nguyên tử nằm trên bề mặt sẽ chiếm tỷ lệ đáng kể so với tổng số nguyên tử Chính vì vậy, các hiệu ứng có liên quan đến bề mặt sẽ trở nên quan trọng, làm cho tính chất vật liệu có kích thước nano khác biệt so với vật liệu dạng khối Điều này có ý nghĩa rất quan trọng trong các ứng dụng của vật liệu nano liên quan tới khả năng tiếp xúc bề mặt của vật liệu như xúc tác, cảm biến sinh học, diệt khuẩn

- Kích thước tới hạn: Các tính chất vật lý, hóa học của các vật liệu đều có

một giới hạn về kích thước Nếu vật liệu mà nhỏ hơn kích thước này thì tính chất của nó hoàn toàn bị thay đổi, người ta gọi đó là kích thước tới hạn Vật liệu nano có tính chất đặc biệt là do kích thước của nó có thể so sánh được với kích thước tới hạn của các tính chất của vật liệu Ví dụ điện trở của một kim loại tuân theo định luật Ohm ở kích thước vĩ mô Nếu ta giảm kích thước của vật liệu xuống nhỏ hơn quãng đường tự do trung bình của điện tử trong kim loại, mà thường có giá trị từ vài đến vài trăm nm, thì định luật Ohm không còn đúng nữa Lúc đó điện trở của vật có kích thước nano sẽ tuân theo các quy tắc lượng tử Không phải bất cứ vật liệu nào có kích thước nano đều có tính chất khác biệt mà nó phụ thuộc vào tính chất mà nó được nghiên cứu Các tính chất khác như tính chất điện, tính chất từ, tính chất quang và các tính chất hóa học khác đều có độ dài tới hạn trong khoảng nm Chính

vì thế mà người ta gọi ngành khoa học và công nghệ liên quan là khoa học nano và công nghệ nano

1.3 Các phương pháp điều chế vật liệu nano

Về cơ bản có hai phương pháp được sử dụng để chế tạo vật liệu nano: phương pháp từ trên xuống và phương pháp từ dưới lên Phương pháp từ trên xuống

là phương pháp tạo hạt kích thước nano từ các hạt có kích thước lớn hơn; phương pháp từ dưới lên là phương pháp hình thành hạt nano từ tập hợp các nguyên tử

1.3.1 Phương pháp từ trên xuống

Ở phương pháp này, người ta dùng kỹ thuật nghiền và biến dạng để chuyển các vật liệu thể khối với tổ chức hạt thô về cỡ hạt có kích thước nano Đây là các phương pháp đơn giản, rẻ tiền nhưng rất hiệu quả, có thể tiến hành cho nhiều loại vật liệu với kích thước khá lớn (ứng dụng làm vật liệu kết cấu) Trong phương pháp nghiền, vật liệu ở dạng bột được trộn lẫn với những viên bi được làm từ các vật liệu rất cứng và đặt trong cối Máy nghiền có thể là nghiền lắc, nghiền rung hoặc nghiền quay (còn gọi là nghiền kiểu hành tinh) Các viên bi cứng va chạm vào nhau và phá

vỡ bột đến kích thước nano Kết quả thu được là vật liệu nano không chiều Phương pháp biến dạng được sử dụng với các kỹ thuật đặc biệt nhằm tạo ra sự biến dạng cự lớn (có thể >10nm) mà không làm phá huỷ vật liệu, đó là các phương pháp SPD điển hình Nhiệt độ có thể được điều chỉnh tùy thuộc vào từng trường hợp cụ thể Nếu nhiệt độ gia công lớn hơn nhiệt độ kết tinh lại thì được gọi là biến dạng nóng Ngược lại, gọi là biến dạng nguội Kết quả thu được là các vật liệu nano một chiều (dây nano) hoặc hai chiều (lớp có chiều dày nm) Ngoài ra, hiện nay, người ta thường dùng các phương pháp quang khắc để tạo ra các cấu trúc nano

1.3.2 Phương pháp từ dưới lên

Với phương pháp này, vật liệu nano được hình thành từ các nguyên tử hoặc ion Phương pháp từ dưới lên được phát triển rất mạnh mẽ vì tính linh động và chất lượng của sản phẩm cuối cùng Phần lớn các vật liệu nano mà chúng ta dùng hiện