Một số phương pháp phân tích hóa sinh

Hiện tượng hóa lý xảy ra trong sắc ký trên giấy cũng tương tự như trong sắc ký phân bố nói chung, tức là dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất giữa 2 pha: pha cố định thường dùng l[r]

LỜI NÓI ĐẦU Ngày nay, Hóa sinh đã phát triển rất mạnh mẽ và được coi như là một ngành khoa học mũi nhọn, đã xâm nhập vào nhiều ngành khoa học khác nhau và được các ngành khoa học này tiếp nhận như là một công cụ sắc bén để giải quyết những nhiệm vụ của ngành mình

Trong y học, Hóa sinh có một vai trò đặc biệt không chỉ trong phạm vi để

mở rộng và nâng cao chất lượng đào tạo của ngành mà còn là một công cụ không thể thiếu được trong chẩn đoán, theo dõi điều trị và tiên lượng bệnh

Vì vậy, những kiến thức về hóa sinh cần trang bị cho học viên không chỉ khi họ còn đang được đào tạo trong nhà trường mà còn cần phải bổ túc thường xuyên cho họ trong quá trình công tác

Để nắm được kiến thức về hóa sinh và vận dụng được trong thực tiễn thì phần thực hành hóa sinh là không thể thiếu được Thực hành hóa sinh không chỉ

để chứng minh, minh hoạ cho lý thuyết mà nó còn giúp cho học viên nắm được nguyên lý và giá trị của các xét nghiệm hóa sinh lâm sàng, rèn luyện kỹ năng tay nghề cho học viên để họ có thể phục vụ được ngay sau khi họ rời khỏi ghế nhà trường Đó là những mục đích chính của giáo trình "Thực tập hóa sinh" này

Đối tượng chính của giáo trình "Thực tập hóa sinh" là học viên đại học đào tạo bác sỹ đa khoa Tuy nhiên trong khi biên soạn, các tác giả cũng đã chú ý bổ sung những vấn đề chuyên sâu, hiện đại và cập nhật để làm tài liệu tham khảo cho học viên sau đại học cũng như cho cán bộ và kỹ thuật viên phục vụ cho công tác giảng dạy hoá sinh và các labô hoá sinh làm lâm sàng

Nội dung chính của "Thực tập hóa sinh" là 7 bài thực tập của 2 học phần Trong đó từ bài 1 đến bài 4 nằm trong chương trình của học phần 1: "Hoá sinh cơ sở" Từ bài 5 đến bài 7 nằm trong chương trình của học phần 2:"Hoá sinh chức năng và lâm sàng" Ngoài ra các tác giả còn biên soạn thêm bài "Mở đầu" để giới thiệu một số phương pháp phân tích hoá sinh chính và phụ lục để giới thiệu một

số vấn đề như: Hệ thống đơn vị SI, nồng độ dung dịch, giá trị tham chiếu của các xét nghiệm hoá sinh để làm tài liệu tham khảo

Tái bản lần này các tác giả đã sửa chữa và bổ xung một số xét nghiệm mới phù hợp với chương trình đào tạo Tuy đã có nhiều cố gắng nhưng có thể còn có những thiếu sót, rất mong được sự đóng góp ý kiến của bạn đọc để giáo trình "Thực tập hoá sinh" được hoàn chỉnh hơn

Ngày 10 thánh 3 năm 2006 Thay mặt các tác giả

PGS.TS Hoàng Quang

Bài mở đầu

MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HÓA SINH

1 Phương pháp đo quang (Đo màu định lượng)

Đo quang là một phương pháp phân tích định lượng dựa trên cường độ màu của bản thân chất cần định lượng hoặc được tạo ra bằng các phương pháp thích hợp

1.1.1 Cơ sở:

Khi chiếu một tia sáng đơn sắc có cường độ I0 qua một dung dịch màu có chiều dày l, thì một phần ánh sáng bị phản xạ (IP), một phần bị hấp thụ bởi dung dịch màu (IH), phần còn lại ló ra ngoài (IL)

- Vì I0 không đổi, nên khi IH càng lớn thì IL càng nhỏ IH càng lớn nếu trên đường

đi ánh sáng gặp nhiều phân tử chất màu hay là khi nồng độ chất màu càng lớn và chiều dày dung dịch càng lớn Và ngược lại, khi IH càng nhỏ thì IL càng lớn

Thiết lập mối quan hệ giữa I0, IH, IL là nội dung cơ bản của định luật hấp thụ ánh sáng của dung dịch màu

1.1.2 Định luật Lambert – Beer:

Định luật Lamber - Beer phát biểu như sau: Lôgarit của tỷ số giữa cường độ ánh sáng tới (I0) và cường độ ánh sáng ló (IL) tỷ lệ thuận với nồng độ phân tử chất màu (C) và với chiều dày của lớp dung dịch (l) mà ánh sáng truyền qua:

1.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến màu của dung dịch và làm sai lệch định luật Lambert–Beer:

+ Phương pháp đo màu thường được tiến hành như sau:

- Cho chất thử X cần định lượng có trong dung dịch kết hợp với thuốc thử R

để tạo thành phức hợp RX có màu:

X + R XR

(không màu) (không màu) (có màu)

- Đo mật độ quang học (E) của dung dịch, xác định nồng độ XR và suy ra nồng

độ của X

Do mật độ quang học E chỉ tỷ lệ thuận với nồng độ XR, nên phải chuyển được toàn bộ X thành XR và màu của XR phải bền vững, không bị pha tạp bởi màu của các chất khác

+ Những điểm cơ bản cần chú ý:

- Thuốc thử R:

Đối với mỗi một chất cần định lượng X, phải chọn được thuốc thử R thích hợp

để phức hợp XR tạo thành có màu bền vững, ít phân ly Nói một cách khác, XR

I 0

E/D = lg = k.C.l

I L

E ~ C

phải có hằng số không bền khá nhỏ để có thể coi nồng độ phức hợp XR bằng nồng

- Pha loãng dung dịch phức hợp màu:

Do phản ứng tạo thành và phân ly của XR là một quá trình thuận nghịch và cường độ màu của dung dịch phụ thuộc vào tỷ số nồng độ giữa các dạng có màu

và không màu, nên khi pha loãng (hay làm giàu) dung dịch sẽ làm sai lệch định luật Lambert-Beer Vì vậy, khi cường độ màu của dung dịch vượt quá giới hạn đo thì phải pha loãng mẫu thử và làm lại xét nghiệm

Có thể hạn chế ảnh hưởng này bằng cách dùng chính thuốc thử R khi pha loãng dung dịch màu (chứ không dùng nước cất) để hạn chế sự tăng độ phân ly của XR

- pH của dung dịch:

Sự thay đổi pH (tăng hay giảm nồng độ H+) của dung dịch làm thay đổi màu của dung dịch Do :

pH ảnh hưởng đến sự tạo thành phức hợp XR và do đó làm thay đổi màu

Ví dụ, ở pH=1,8–2,5, ion Fe3+ kết hợp với sulfosalicylat tạo thành ion phức monosulfosalicylat [Fe(Sal)]2+ có màu đỏ; còn ở pH=8-11, ion Fe3+ kết hợp với sulfosalicylat tạo thành ion phức sulfosalixylat [Fe(Sal)3]2+ có màu vàng

pH ảnh hưởng đến sự phân ly và phân huỷ phức hợp màu

H+ trực tiếp tham gia vào phản ứng dẫn đến làm đổi màu của dung dịch Ví

dụ, trong phản ứng:

2 CrO 42 - + 2 H + CrO 2 - + H 2 O (vàng) (da cam)

Do đó, người ta phải nghiên cứu trước các dung dịch màu chuẩn để tìm ra khoảng pH thích hợp

- Ảnh hưởng của ion lạ:

Ion lạ có thể có màu riêng, có thể kết hợp với R thành một phức hợp có màu làm ảnh hưởng đến màu của phức hợp XR, có thể tạo với R một phức hợp không màu làm hao hụt thuốc thử R gây giảm sự tạo thành phức hợp XR

Để loại bỏ ảnh hưởng này, có thể:

Dùng một lượng R vừa đủ để tạo thành phức hợp XR nếu XR bền hơn phức hợp của R với ion lạ hoặc cho thừa nhiều R nếu XR kém bền hơn phức hợp của R với ion lạ

Dùng một hợp chất khác để tạo với ion lạ một phức hợp bền vững, gọi là

“khoá ion lạ”

Thêm vào dung dịch chuẩn một lượng ion lạ bằng lượng ion lạ có trong dung dịch cần định lượng

Tách riêng ion lạ bằng các phương pháp thích hợp trước khi định lượng X Đo màu ở bước sóng đặc hiệu của XR

Do tất cả những yếu tố trên, nên trong phân tích so màu phải tuân thủ chặt chẽ thành phần và liều lượng thuốc thử, pH của dung dịch, thời gian đo màu, bước sóng của ánh sáng tới, dung dịch đối chiếu

1.2 Máy đo quang:

Có nhiều loại máy đo quang: quang kế (Photometer), quang phổ kế (Spectrophotometer) với các bước sóng cố định (dùng kính lọc) hoặc có thể thay đổi (dùng cách tử) Nói chung, cấu tạo của các máy đo quang đều gồm các bộ phận chính sau:

+ Nguồn sáng: dùng đèn thường, đèn thuỷ ngân, đèn halogen, đèn cực tím + Bộ phận tạo ánh sáng đơn sắc: kính lọc hoặc cách tử

+ Cóng đo (cuvette): có chiều dày (l) không đổi (0,5 cm, 1 cm); bằng thạch anh, thuỷ tinh, nhựa

+ Tế bào quang điện: để biến đổi quang (ánh sáng ló) thành dòng điện

+ Bộ phận khuếch đại

+ Bộ phận đo và hiện kết quả: thang đo hoặc màn hình hiện số

Sơ đồ cấu tạo đơn giản của các máy đo quang như sau:

1 2 3 4 5 6

Nguồn sáng Kính lọc Cóng đo Tế bào Khuếch đại Hiện kết

(Đèn) hoặc cách tử quang điện quả

Hình 2: Sơ đồ cấu tạo đơn giản của máy đo quang

Ngoài các bộ phận chính trên, các máy còn có thể có thêm các phần khác như các bộ phận điều chỉnh, các bộ phận gá lắp thêm

1.3 Các phương pháp đo màu:

1.3.1 Đo màu bằng mắt:

Dùng khi không có máy đo quang hoặc khi chỉ cần đánh giá tương đối

1.3.1.1 Phương pháp dùng thang mẫu (hoặc gam màu mẫu):

+ Điều chế một dãy ống dung dịch chuẩn (ống chuẩn) có nồng độ tăng dần đã biết (CS) đựng trong các ống nghiệm đồng chất

+ Điều chế một ống dung dịch thử (ống thử) có nồng độ chưa biết (CT) theo các điều kiện giống hệt như khi điều chế các dung dịch chuẩn và đựng trong ống nghiệm đồng chất với các ống nghiệm của dung dịch chuẩn

+ So màu của ống thử với các ống chuẩn để tìm ống chuẩn có cường độ màu bằng cường độ màu của ống thử

Nồng độ của ống chuẩn chính là nồng độ của ống thử

Tuỳ theo từng dung dịch mà người ta có các cách quan sát cường độ màu khác nhau

1.3.1.2 Phương pháp hoà loãng:

So màu của dung dịch thử chứa chất cần định lượng có nồng độ chưa biết (CT) với một dung dịch chuẩn cũng chứa chất đó có nồng độ đã biết (CS) Màu của hai dung dịch được tạo ra trong cùng điều kiện

+ Lấy ở mỗi ống ra x ml dung dịch cho vào 2 ống nghiệm đồng chất tương ứng + Cho thêm thuốc thử R (hoặc nước cất) vào ống nào có cường độ màu lớn hơn (thường là ống thử) cho tới khi thấy cường độ màu của 2 ống bằng nhau Ghi

số ml thuốc thử R (hoặc nước cất) cho thêm (y)

+ Tính độ hoà loãng (d):

x + y

d =

x + Tính nồng độ của ống thử (CT) theo công thức:

1.3.2 So màu bằng máy:

1.3.2.1 Phương pháp so sánh (hay phương pháp dùng ống chuẩn):

+ Điều chế song song một dung dịch chuẩn chứa chất cần xác định có nồng độ

đã biết (CS) và một dung dịch thử chứa chất cần xác định có nồng độ chưa biết (CT) theo cùng một qui trình

+ Đo mật độ quang học (E) của ống chuẩn và ống thử trong cùng điều kiện (máy, bước sóng, cóng ), được ES và ET tương ứng

+ Tính kết quả theo công thức:

1.3.2.2 Phương pháp biểu đồ mẫu:

+ Điều chế một dãy dung dịch chuẩn chứa chất cần định lượng có nồng độ đã biết (CS) tăng dần

+ Đo mật độ quang học (E) của từng ống, được các ES tương ứng

+ Biểu diễn sự phụ thuộc của ES theo CS trên trục toạ độ, được một đường thẳng

C T C S

Hình 3: Phương pháp xác định nồng độ một dung dịch bằng biểu đồ mẫu

+ Điều chế một ống thử chứa chất cần định lượng có nồng độ chưa biết CT theo cùng một qui trình như đối với ống chuẩn

+ Đo mật độ quang học của dung dịch thử, được ET

+ Từ đồ thị tính được nồng độ CT

Chú ý : ET phải nằm trong khoảng của các ES.

Biểu đồ mẫu phải dựng hàng ngày

1.3.2.3 Phương pháp hệ số:

+ Điều chế một dãy ống chuẩn có nồng độ CS đã biết và tăng dần

+ Đo mật độ quang của các ống chuẩn được các ES tương ứng

+ Tính hệ số  (hoặc F) theo công thức:

 C S

 =

 E S

+ Điều chế một ống thử có nồng độ chưa biết (CT)

+ Đo mật độ quang của ống thử, được ET

để loại trừ ảnh hưởng này, khi đó E đo được là do chất màu cần định lượng gây ra

1.3.2.4 Đo bằng quả cầu Ulbricht:

Gần đây, trong phương pháp hoá sinh khô, người ta sử dụng các que thử để định lượng các chất trong máu hoặc bán định lượng các chất trong nước tiểu Que thử có thể gồm một hoặc nhiều ô thử, mỗi que thử thử một thông số (như máy Refotron) hoặc nhiều thông số (như máy Clinitek) Trong mỗi ô thử có sẵn các chất cần thiết cho phản ứng tạo màu đặc hiệu Khi ô thử tiếp xúc với huyết thanh hoặc nước tiểu thì phản ứng xảy ra, màu được tạo thành và việc đo màu định lượng được thực hiện trên các máy có quả cầu Ulbricht

Quả cầu Ulbricht là một quả cầu bằng thuỷ tinh có khe hở, mặt trong được tráng gương Bên trong quả cầu chứa:

C T =  E T

+ Nguồn sáng là đèn diode Ánh sáng phát ra từ đèn này được chiếu lên thành bên trong quả cầu rồi phản xạ qua khe hở đi tới băng thử (Io) và được băng thử hấp thu một phần, còn một phần thì phản xạ trở lại (Ip)

+ Hai đầu dò (detector): một đầu dò qui chiếu để đo ánh sáng tới (Io), một đầu

Ổ thử

Hình 4: Sơ đồ quả cầu Ulbricht

2 Phương pháp điện di

f v = - Ne E

Độ di động điện di của hạt được tính như sau:

 = v/E = Ne/F Đối với các phân tử đơn giản, được coi là hình cầu, như protein globulin của huyết thanh, hệ số ma sát f có giá trị là:

f = 6 ..r Trong đó r là bán kính của cầu và  là độ nhớt của dung môi

Thực tế, các phân tử protein được bao bọc bởi một lớp ion và nước, làm biến đổi điện tích thực và bán kính của nó Vì vậy, để trao đổi ion, pH phải lớn và phải

xa pH đẳng điện - pHi (ở pHi hạt không di chuyển) Ví dụ như, tất cả protein huyết thanh di chuyển trong điện trường về phía cực dương (anode) khi được đặt ở pH = 8,6

bề mặt của các kênh của bề mặt lỗ Khi đó, chất điện ly có thừa điện tích dương và

sẽ di chuyển về phía cực âm (cathode) Ảnh hưởng này phụ thuộc vào điện thế cuả lớp kép được tạo ra ở bề mặt của mao quản Điện thế này lại phụ thuộc vào bản chất của chất có lỗ được dùng, vào điện trường được đặt, vào lực ion của chất điện

ly và độ nhớt của chúng Có thể hạn chế đáng kể hiện tượng này bằng một số cách, như dùng một màng bán thấm để bọc chất giá ở mức độ điện cực, hoặc dùng một

Đệm Ngưng tụ Bốc hơi Dòng điện thẩm Nguồn điện Giá đỡ Giấy hoặc màng

+ Dòng điện đối lưu (electrorheophorese): là một dòng hơi do sự bốc hơi của

dung môi bởi nhiệt Để hạn chế hiện tượng này, khi chạy điện di điện thế thấp (230 V) dùng trong thực hành lâm sàng hàng ngày, người ta dùng nắp có mái để đậy máy; còn khi chạy điện di điện thế cao (trên 1000 V), người ta phải đặt trong hệ thống làm lạnh

2.4 Áp dụng:

+ Có nhiều kiểu điện di được dùng trong phòng thí nghiệm cũng như trong công nghiệp, tuỳ theo mục đích và điều kiện phân tích Trong hoá sinh y học thường ngày, điện di thường được dùng để phân tích các protein huyết thanh, nước tiểu cũng như các dịch sinh học khác Sự di chuyển của protein phụ thuộc vào bán kính r của nó, vào pH đẳng điện − pHi (pH mà ở đó, protein không mang điện tích hay có tổng điện tích âm bằng tổng điện tích dương)

+ Để nhận biết các protein đã phân chia, người ta dùng nhiều phương pháp tuỳ theo kỹ thuật điện di được sử dụng:

- Thông dụng nhất là dùng các chất nhuộm màu đặc hiệu (đỏ Ponceau, Amido đen, xanh Croomassie…), sau đó định lượng các phần đã phân chia

- Dùng kỹ thuật miễn dịch nhậy và đặc hiệu

Các acid nucleic cũng có thể phân chia bằng điện di, nhưng gần đây người ta thường dùng các kỹ thuật sinh học phân tử hơn

+ Phân tích kết quả: bằng densitometor

Densitometor cho phép đọc mật độ quang học của các băng và biểu thị theo nguyên lý đo quang phổ Cấu tạo của densitometor gồm: nguồn sáng, kính lọc (có bước sóng thích hợp với màu của băng), bộ nhân quang, bộ ghi, bộ tính toán và bộ

in

Khi chiếu ánh sáng đơn sắc vào băng màu, một phần ánh sáng bị hấp thụ, phần còn lại bị phản xạ Phần hấp thụ càng lớn khi mật độ chất màu ở băng màu càng lớn và do đó phần phản xạ càng nhỏ Đo ánh sáng phản xạ và biến đổi thành dòng

điện đo được sẽ xác định được mật độ chất màu (xem hình 6)

Thấu kính Nguồn sáng Lưới Khe Gương Gương Đầu dò (phản xạ)

Tấm gel điện di Đầu dò (truyền qua)

Hình 6: Nguyên tắc đọc densitometor

2.5 Các phương pháp điện di:

2.5.1 Điện di trong lòng dịch và điện di giấy , :

+ Điện di trong lòng dịch: đã được Tiselius mô tả đầu tiên để phân chia protein huyết thanh Hiện nay, nó không còn được dùng nữa, nhưng vẫn còn được xem như một qui chiếu để đo độ di động điện di thực, vì không có dòng thuỷ động gây nhiễu và không có sự can thiệp của chất giá

+ Điện di giấy: giấy là chất giá rắn được dùng lần đầu tiên, nhưng nay ít dùng vì

đã có các chất giá có khả năng giải quyết tốt hơn và thực tế hơn, song nó vẫn có những ưu điểm (ví dụ, trong phân loại rối loạn lipoprotein máu theo Fredrickson)

2.5.2 Điện di trên màng cellulose acetat:

Màng cellulose acetat là chất giá quen thuộc để phân chia protein huyết thanh trong xét nghiệm hàng ngày Chấm một lượng nhỏ huyết thanh trên màng cellulose acetat dưới dạng một vạch nhỏ bằng bộ chấm mẫu chuyên dụng Sau khi chạy điện

di (khoảng 30 phút ở 230V) và nhuộm các protein, màng được làm trong bằng sấy khô, rồi đọc kết quả trên máy đo mật độ (densitometor)

Hình 7: Kết quả phân chia protein trên màng cellulose acetat

và định lượng bằng densitometor

Ghi chú: Bên trái là điện di đồ protein huyết thanh, bên phải là hình ảnh sau khi đọc trên densitometor

Đường chấm mầu Globullnos Albumlne Albumlne Albumlne

20

2.5.3 Điện di trên gel:

2.5.3.1 Điện di trên gel acrylamid (PAGE):

Phương pháp này sử dụng một gel có lỗ thu được bằng sự copolymer hoá acrylamid và N-N’-methylen bis-acrylamid nhờ một phản ứng gốc dưới ánh sáng với sự có mặt của một chất xúc tác như persulfat ammon hoặc riboflavin

và vào tỷ lệ phần trăm acrylamid Các gel acrylamid dùng để phân chia protein huyết thanh thường chứa 7-12% acrylamid Có thể tạo ra gradient nồng độ acrylamid liên tục (ví dụ, từ 4 đến 30%) hoặc không liên tục

Các gel acrylamid dễ chuẩn bị trong các phòng xét nghiệm, nhưng cần thận trọng vì acrylamid là một chất độc thần kinh

Có nhiều kỹ thuật được dùng:

Điện di trên gel acrylamid Nguồn điện

Khớp nối Ống Làm lạnh

Đệm (a)

Đệm gel

Các hố Khoang Kẹp

21

Hình 8: Các kỹ thuật điện di

+ Điện di gel trong ống thuỷ tinh (điện di cột): (a) thường dùng ống dài 5-10 cm, đường kính 0,5- 0,8 mm

+ Điện di gel giữa hai tấm thuỷ tinh (b) hoặc điện di phiến gel (slab - gel electrophorese): cho phép so sánh dễ dàng giữa các mẫu thử vì được tiến hành trong cùng điều kiện giống hệt nhau

Kích thước của tấm có thể thay đổi: thường rộng từ 8-15 cm, cao 8-20 cm Các gel được dùng để xác định trình tự của acid nucleic thì dài hơn (30-40 cm) so với

để phân chia protein Chiều dày của gel thường dùng là 0,75 đến 2,5 cm Các hố được đục nhờ một que nhựa nhét vào giữa hai tấm thuỷ tinh khi polymer hoá Trên thị trường có bán các tấm có sẵn để dùng

+ Điện di gel trên phim nhựa: mẫu thử được đặt trong các hố nằm trong gel hoặc ở bề mặt gel để khuếch tán trong gel trước khi đặt trong điện trường

+ Điều kiện điện di: trong lưới gel acrylamid, các phân tử được phân chia theo kích thước (trọng lượng phân tử) và điện tích của chúng Do đó có hai kiểu điện di được dùng:

- Điện di không biến tính: trong một gel có lỗ hằng định, cả hai thống số kích thước và điện tích đều can thiệp vào sự di chuyển của các protein Còn trong một gel với gradient của acrylamid thì chỉ có kích thước là thông số can thiệp: các protein không qua được lỗ do kích thước của chúng lớn hơn kích thước lỗ Đối với các lipoprotein, người ta dùng một gel với 2 lớp acrylamid có nồng độ khác nhau (gradient không liên tục): lớp thứ nhất, nồng độ thấp hơn, có lỗ lớn hơn, chỉ cho các phân tử lớn (chylomicron) đi qua; lớp thứ hai có nồng độ acrylamid cao hơn, giữ lại các phân tử nhỏ hơn một chút (VLDL) và cho qua các phân tử nhỏ mà khi phân chia theo kích thước và điện tích của chúng sẽ thành LDL và HDL Như vậy, người ta tách được các lipoprrotein thành 4 lớp có ý nghĩa chẩn đoán và tiên lượng khác nhau Sự phân chia cũng được thực hiện bằng kỹ thuật siêu ly tâm nhưng có thể thực hiện với nhiều mẫu thử, tốn ít thời gian và dùng ít mẫu hơn

chylomicrons

VLDL

LDL

Hình 9: Điện di lipoprotein huyết thanh theo gradient

không liên tục của acrylamid

- Điện di biến tính: làm biến tính các protein bằng cách đun nóng trong dung dịch chứa các chất khử (như -mercapto-ẹthanol) để cắt các cầu disulfua và một chất tẩy, natri dodecyl-sulfat (SDS) SDS gắn với bề mặt protein làm cho chúng tích điện âm Sự di chuyển của protein trong gel acrylamid thực tế chỉ phụ thuộc duy nhất vào trọng lượng phân tử của chúng Phương pháp này đơn giản, nhanh, chính xác và thực tế được dùng thay cho phần lớn các phương pháp lý học (siêu ly tâm phân tích, khếch tán ánh sáng…) trong xác định trọng lượng protein Gần đây, cetyl-triammon-bromua (CTAB) đã được đề nghị sử dụng thay cho SDS, vì nó tương đối giữ được hoạt tính sinh học sau khi điện di, còn SDS thì không

2.5.3.2 Điện di trên các gel khác:

Gel tinh bột và gel agarose thu được bằng đun nóng sau đó làm lạnh là những polymer glucid Nó không có tác dụng sàng phân tử như acrylamid, nhưng kích thước lỗ lớn của gel cho phép nhận biết enzym Vì so với giấy hoặc màng cellulose acetat, chiều dày của gel cho phép chứa một lượng mẫu thử lớn hơn

2.5.4 Điện di hội tụ (Electrofocalisafion):

Đó là một kiểu điện di thực hiện trong gradient pH Các thành phần di chuyển theo điểm đẳng điện và dừng lại ở vùng có pH tương ứng với pH đẳng điện của chúng Gradient pH được tạo ra trong quá trình điện di bởi một hỗn hợp của một

số lớn các hạt aminoacid có pH đẳng điện khác nhau (ampholytes) Tuỳ theo thành phần của hỗn hợp, người ta thu được một thang pH nào đó và như vậy một khả năng giải quyết tốt hơn

Anode được tạo bởi acid, còn cathode được tạo bởi một base Sử dụng điện thế rất lớn: 1000 đến 2000 V và cần hệ thống làm lạnh

Phương pháp này được dùng trong nghiên cứu vì khả năng giải quyết của nó trong hoá sinh protein rất lớn

2.5.5 Điện di hai chiều (Electrophorese bidimensionnell):

Thực hiện 2 lần điện di theo 2 hướng vuông góc với nhau Có thể kết hợp điện

di acrylamide-agarosse, điện di đơn và điện di hội tụ… Trong thực hành, đầu tiên người ta thực hiện điện di hội tụ theo một hướng, rồi điện di gel acrylamide-SDS theo hướng thứ hai

2.5.6 Điện di mao quản (Electrophorese capillaire):

Gel acrylamide hoặc gel khác bền trong môi trường điện di và hạn chế được độ rộng của băng khi phân chia Các mao quản (có đường kính trong từ 10-100m) cho phép phân chia trong một thời gian ngắn và giá rẻ hơn Dùng mao quản sẽ làm tăng tỷ lệ bề mặt/thể tích làm cho dễ thoát nhiệt được sinh ra khi điện di và hạn chế sự khuếch tán do nhiệt

Trong điện di mao quản vùng, các nhóm sinanol của mao quản bị khử proton, cho một bề mặt âm tính Các cation của đệm di chuyển theo bề mặt này: bề mặt của dịch trở nên tích điện dương và di chuyển về phía cathode Các chất tan trung tính di chuyển với tốc độ của điện thẩm thấu; các chất tan tích điện dương di chuyển nhanh hoặc chậm hơn tuỳ theo điện tích của chúng; các chất tan tích điện

âm ngược lại bị hãm ít hoặc nhiều hơn

Khả năng phân chia phụ thuộc vào điện thế, hệ số khuếch tán, độ di động điện

di và dòng thẩm thấu

Cột mao quản có đường kính 0,05 mm  50 cm có thể tích bên trong 852 nl: thể tích đặt mẫu có thể vài nl Sự tích điện của thể tích nhỏ này có liên quan với: + Sự di chuyển điện: phụ thuộc vào điện tích và độ di động của chất tan được phân chia

+ Thuỷ động:

- Khi đặt một áp lực trên khoang mẫu ở đầu vào của mao quản

- Khi đặt một giảm áp ở đầu ra

- Bằng một siphon: đầu vào của mao quản ngâm trong mẫu

- Theo lượng được tiêm vào, sự phát hiện phải rất nhạy Điều này liên quan đến các kỹ thuật kinh điển (hấp phụ, huỳnh quang), vì vậy độ nhậy và độ chính xác có thể được tăng lên:

Ở mức độ cơ chất, bởi sự chênh lệch (trước và sau mao quản)

Ở mức độ nguồn (dùng laser)

Giới hạn thực tế đạt được trong vùng 10-18 – 20-20 mol

Có thể dùng các gel (điện di gel mao quản) hoặc các ampholyte (hội tụ điện mao quản)

Sử dụng lượng nhỏ và phân chia nhanh (tối đa vài phút) cho phép thực hiện nhiều thử nghiệm và tối ưu hoá qui trình Kỹ thuật vi phân tích này được dùng hạn chế trong lâm sàng, ví dụ để phân tích aminoacid huyết thanh

2.5.7 Điện di miễn dịch:

Điện di miễn dịch được thực hiện trong gel agarose trên một lam kính hoặc trên phim nhựa, cho phép phân tích đồng thời nhiều mẫu thử Kỹ thuật này kết hợp

2 giai đoạn kế tiếp:

+ Điện di trong một trường thứ nhất: các protein được phân chia bởi điện di bắt đầu từ một hố nhỏ được đục trong gel agarose Vì thế, mỗi protein được phân chia có hình ellip kéo dài

+ Khuếch tán miễn dịch trong một trường thứ hai: trong một máng được đục song song với hướng của giai đoạn một, người ta đặt một kháng huyết thanh vào

đó, nó sẽ khuếch tán vuông góc với máng Các protein đã phân chia cũng khuếch tán bắt đầu từ vết thu được sau điện di Ở điểm cân bằng, sẽ xuất hiện một cung kết tủa Cung này dễ nhận thấy khi nhuộm màu protein

Đây là một phương pháp phân tích rất hay dùng vì có khả năng phân chia cao

Nó có thể phân chia được gần 30 protein huyết thanh nhờ một kháng huyết thanh cừu kháng protein huyết thanh người Những bất thường về số lượng và chất lượng protein huyết thanh của bệnh nhân có thể phát hiện dễ dàng bằng cách so sánh với một huyết thanh chứng bình thường được đặt đối xứng qua máng và cùng chạy

Để đánh giá chính xác các bất thường, người ta dùng kháng thể monoclon đặc hiệu

3 Các phương pháp sắc ký

Sắc ký là một trong những phương pháp quan trọng trong các phương pháp phân tích hoá sinh Sắc ký được áp dụng rất rộng rãi với nhiều mục đích khác nhau như là được sử dụng để định tính, định lượng, điều chế các chất tinh khiết, xác định các hằng số hoá lý, nghiên cứu các quá trình động học và xúc tác Ngoài ra

nó còn được áp dụng ở các ngành có liên quan tới hoá học như y dược, nông nghiệp, thực phẩm, bảo vệ môi trường, luyện kim, dầu mỏ địa chất

3.1 Những khái niệm chung:

- Sắc ký khí

+ Phân loại theo pha cố định: dựa vào hình dạng giá tựa của pha cố định có thể

có các loại sắc ký như sau:

- Sắc ký cột

- Sắc ký giấy

- Sắc ký lớp mỏng

Hoặc được phân thành 2 loại: sắc ký cột và sắc ký phẳng

+ Phân loại theo cơ chế của quá trình tách: phương pháp phân loại này dựa vào

sự tương tác của chất được sắc ký với pha cố định và pha di động Theo cơ chế này

có 4 loại sắc ký như sau:

- Sắc ký hấp phụ: sự phân tách các chất là do ái lực khác nhau của chất phân tách đối với chất hấp phụ là chất rắn (pha cố định)

- Sắc ký phân bố: sự phân tách các chất là do sự hoà tan khác nhau (hay là sự phân bố khác nhau) của các chất giữa pha cố định là lỏng (được giữ bởi chất mang rắn) và pha di động Độ hoà tan phụ thuộc vào độ phân cực, do đó độ phân cực của chất được sắc ký cũng như của pha cố định và pha di động có ảnh hưởng đến quá trình tách

- Sắc ký trao đổi ion: sự phân tách các ion là do các ion được phân tách trong dung dịch có ái lực khác nhau với các trung tâm trao đổi ion (nhóm chứa ion) trên chất rắn là pha cố định Các chất đó gọi là các chất trao đổi ion mà thông thường nhất là các nhựa trao đổi ion

- Sắc ký rây phân tử: loại sắc ký này người ta dùng các vật rắn có độ xốp lớn,

độ xốp đó được tạo ra bởi các lỗ (mắt lưới) có kích thước cố định để rây chọn lọc các cấu tử Tuỳ theo kích thước và hình dạng của phân tử mà các chất di chuyển với tốc độ khác nhau Các chất xốp có thể là các chất xốp vô cơ, hữu cơ, các polymer tổng hợp ưa nước như là các loại sephadex được dùng để tách các chất có hoạt tính sinh học

Ngoài ra còn có các loại sắc ký kết tủa, sắc ký tạo phức, sắc ký oxy hoá - khử nhưng chúng ít có giá trị trong thực tế

3.1.3 Sắc đồ, sắc phổ, đường cong xuất:

Sắc đồ (trên cột) Sắc phổ

Sắc đồ (trên giấy) Sắc phổ

Hình 10: Sắc đồ và sắc phổ

Những chất không màu sau khi tách ta chưa nhìn thấy sắc đồ bằng mắt thường;

để hiện sắc đồ phải cho thêm 1 hoặc vài loại thuốc thử tác dụng với chất không màu đó để tạo thành chất có màu

Bằng các quang phổ kế người ta có thể ghi được sự phân bố nồng độ các cấu

tử dọc theo cột (trường hợp sắc ký cột) hoặc trên mặt phẳng (trường hợp sắc ký giấy hay sắc ký lớp mỏng), gọi là sắc phổ

Trong trường hợp sắc ký cột, nếu biểu diễn bằng đồ thị sự phụ thuộc của nồng

độ chất đi ra khỏi cột sắc ký vào thể tích dung môi rửa giải thì sẽ thu được một đường cong xuất hay đường cong rửa giải (còn gọi là đường cong giải hấp)

3.2 Sắc ký hấp phụ lỏng trên cột:

3.2.1 Nguyên tắc sắc ký hấp phụ lỏng:

Phương pháp sắc ký hấp phụ lỏng dựa vào tính chất hấp phụ khác nhau của các chất trong hỗn hợp cần phân tách Sự phụ thuộc của lượng chất bị hấp phụ vào nồng độ của nó trong dung dịch ở một nhiệt độ không đổi được đặc trưng bởi đường đẳng nhiệt hấp phụ

Có thể xem hấp phụ như là sự tập trung các phân tử chất khí hoặc chất lỏng ở ranh giới 2 pha: rắn-khí hay rắn-lỏng Trong sắc ký hấp phụ lỏng, sự tách xảy ra ở

ranh giới rắn-lỏng Trong đó pha di động là chất lỏng, pha cố định là chất rắn ở trạng thái xốp, mịn Các hợp chất phân cực bị hấp phụ mạnh hơn các hợp chất không phân cực bởi các chất hấp phụ phân cực

3.2.2 Chọn hệ sắc ký hấp phụ lỏng:

Để tách được tốt hỗn hợp các chất bằng sắc ký hấp phụ lỏng cần phải chú ý các yếu tố sau: chất hấp phụ; pha di động; lượng mẫu; phương pháp định lượng Trong đó việc lựa chọn chất hấp phụ và pha di động là quan trọng nhất

+ Chọn chất hấp phụ:

Chất hấp phụ phải đáp ứng được các yêu cầu sau:

- Yêu cầu chủ yếu là chất hấp phụ không có tương tác hoá học giữa chất hấp phụ và các cấu tử cần tách, không có hoạt tính xúc tác để tránh các phản ứng phụ

- Có tính chọn lọc, có nghĩa là ái lực hấp phụ của các cấu tử đối với chất hấp phụ khác nhau càng nhiều càng tốt

- Diện tích bề mặt riêng và kích thước hạt (độ mịn) phải thích hợp Hạt càng

bé, cân bằng hấp thụ thiết lập càng nhanh và càng hiệu nghiệm; nhưng mặt khác lại cản trở tốc độ pha di động Để khắc phục có thể dùng kỹ thuật chân không hay cao áp

- Chất hấp phụ phải ổn định và được tiêu chuẩn hoá để thu được các kết quả trùng lặp

Than hoạt tính: có khả năng hấp phụ rất tốt, nhưng tính chất không ổn định

và màu đen nên khó quan sát các vùng màu của sắc đồ Than hoạt tính thường dùng

để tách các chất cao phân tử hoặc dùng để tách các chất thuộc một dãy đồng đẳng + Chọn dung môi (pha di động):

Trong sắc ký hấp phụ, việc chọn đúng dung môi là rất quan trọng Khi chọn dung môi cần chú ý các yếu tố sau:

- Dung môi hoà tan tốt tất cả các cấu tử phân tích

- Bị hấp phụ tối thiểu trên pha cố định (chất hấp phụ)

- Không phản ứng hoá học với chất tan cũng như chất hấp phụ

- Dung môi phải tinh khiết, nhất là khi dùng các dung môi không phân cực, nó

không được chứa các dung môi phân cực

3.2.3 Thiết bị sắc ký:

Chọn đúng kích thước cột cũng có ý nghĩa quan trọng Nếu chọn ngắn quá thì không đủ khả năng tách, nếu dài quá sẽ kéo dài thời gian tách

Vật liệu làm cột thường là thuỷ tinh, đôi khi là thép, nhôm, đồng, chất dẻo Thường dùng cột dạng hình trụ, hình nón cột có thể dài vài centimét đến 10-

20 mét Đường kính có thể vài milimét đến 10-20 centimét Hiện nay người ta chưa

có cơ sở lý thuyết để chọn kích thước cột, phải chọn bằng thực nghiệm Tỷ lệ chiều dài cột và đường kính tối ưu là từ 40 đến 100

Có thể dùng phương pháp đi xuống (hình 11a) hoặc đi lên (hình 11b)

Phương pháp đi lên tách tốt hơn vì hiệu ứng thành nhỏ, nhưng phương pháp đi xuống có thiết bị đơn giản nên được dùng phổ biến hơn

Để làm tăng tốc dòng có thể dùng biện pháp thay đổi áp suất bằng kỹ thuật cao

áp (hình 11c) hoặc kỹ thuật chân không (hình 11d)

Tuy nhiên rất nhiều trường hợp dùng cột đơn giản (ví dụ: dùng buret chuẩn độ) cho kết quả tách cũng rất tốt Chỉ cần chú ý phải lắp cột thẳng đứng để giảm hiệu ứng thành

Hình 11: Các loại cột sắc ký

3.2.4 Lấy mẫu và phân tích mẫu:

Có 2 phương pháp để đánh giá kết quả phân tích sắc ký, đó là: xác định trực tiếp các cấu tử ngay trên cột và phân tích dung dịch chảy ra khỏi cột

+ Phân tích trực tiếp trên cột:

a b c d

Có thể phân tích định lượng một số chất theo sắc đồ trên cột Nhưng cách này

bị hạn chế đối với chất không màu, trong trường hợp này cần phải nhờ sự phát huỳnh quang của các chất đó hoặc thêm thuốc thử để tạo màu Có thể áp dụng phân tích trực tiếp trên cột đối với các chất phóng xạ hoặc các chất chứa các nguyên tử đánh dấu

+ Phân tích dung dịch chảy ra khỏi cột:

Trong thực tế, người ta hay dùng phương pháp này hơn vì thiết bị và thao tác đơn giản Có 2 cách: phân tích từng phân đoạn và phân tích liên tục

- Phân tích từng phân đoạn: có thể lấy từng thể tích xác định dung dịch chảy

ra khỏi cột và xác định hàm lượng các chất đó Phương pháp này đơn giản nhưng tốn nhiều công sức, do đó người ta tạo ra các máy thu phân đoạn tự động, gồm một

số lớn ống nghiệm được sắp xếp theo vòng tròn hay hàng dọc Dung dịch chảy ra khỏi cột được hứng vào ống nghiệm và sau một thể tích xác định máy tự động di chuyển sang ống khác theo dãy đã sắp xếp

- Phương pháp phân tích liên tục: người ta hướng dung dịch chảy ra khỏi cột

đi vào máy xác định nồng độ theo nguyên tắc đo chỉ số khúc xạ, độ dẫn điện, mật

độ quang, độ phóng xạ Trong trường hợp này phải dùng các cuvet có cấu trúc đặc biệt để có thể đo được liên tục

3.2.5 Ứng dụng của sắc ký hấp phụ lỏng trên cột:

Sắc ký hấp phụ lỏng trên cột thường được sử dụng để phân tách các hydrocarbon thơm, tách hỗn hợp parafin - naphten, xác định các thành phần dầu mỏ, tinh chế clobenzen, xác định các alcaloid, tách các sắc tố lá cây

3.3 Sắc ký phân bố trên cột:

3.3.1 Cơ sở lý thuyết:

Nguyên tắc của phương pháp sắc ký phân bố là dựa trên sự phân bố của các chất tan giữa 2 pha lỏng không trộn lẫn vào nhau, khi một chất lỏng là pha di động chuyển qua pha cố định cũng là một chất lỏng nhưng được hấp phụ trên bề mặt chất rắn (chất mang) Thông thường pha cố định cũng là nước hoặc dung môi phân cực khác Đôi khi pha cố định là chất lỏng ít phân cực hơn, khi đó pha di động phải là dung môi phân cực hơn

Do sự phân bố của các chất tan trong hỗn hợp giữa 2 pha là khác nhau, chất nào tan (phân bố) nhiều trong pha di động hơn pha cố định sẽ di chuyển nhanh, còn chất nào tan nhiều trong pha cố định hơn pha di động sẽ di chuyển chậm hơn

Vì vậy sau một thời gian sắc ký các chất tan sẽ phân tách thành các vùng khác nhau trên cột

3.3.2 Tiến hành kỹ thuật:

+ Chuẩn bị pha cố định:

Người ta sử dụng chất lỏng mang (hấp phụ) trên bề mặt chất rắn xốp làm pha

cố định Cách làm như sau: Hoà tan một lượng chất lỏng pha cố định vào dung môi

dễ bay hơi, sau đó cho chất mang vào dung dịch đó để tẩm trước Cho dung môi bay hơi Trong quá trình làm bay hơi trộn đều chất mang, chất lỏng và dung môi

để cho chất lỏng phân bố đều trên bề mặt chất mang Đun nóng hoặc hút chân không để đuổi hết dung môi

Phương pháp chuẩn bị pha cố định liên kết hoá học phức tạp hơn nhiều, phải

xử lý các nhóm hydroxyl bề mặt chất mang xốp

+ Tải năng của pha lỏng và lượng mẫu:

Tải năng của pha lỏng là lượng chất lỏng được giữ trên một đơn vị khối lượng chất mang Đối với pha lỏng không liên kết hoá học, tải năng khoảng 1 - 40 phần trên 100 phần chất mang

Lượng chất lỏng trên pha cố định quyết định lượng mẫu Nói chung, lượng chất lỏng càng lớn thì lượng mẫu có thể phân tách được càng lớn Đối với cột có tải năng lớn, lượng mẫu có thể lên tới 10 mg Nếu mẫu quá lớn thì khả năng tách giảm Nếu cột có tải năng nhỏ, lượng mẫu khoảng 1mg

Sắc ký rây phân tử có thể dùng các gel hữu cơ loại dextran mạng (sephadex) với các kích cỡ lỗ khác nhau và hoạt tính hấp thụ không đáng kể Tuy nhiên gel hữu cơ bị trương lên trong các dung môi nên gây khó khăn cho kỹ thuật Dùng các rây phân tử vô cơ không có nhược điểm đó như là thuỷ tinh xốp, silicagel nhưng rây phân tử vô cơ có nhược điểm là khả năng hấp phụ lớn; do đó phải làm biến tính hoá học bề mặt của chúng

3.4.1 Nguyên tắc của phương pháp sắc ký rây phân tử:

Nguyên tắc của phương pháp sắc ký rây phân tử là dựa trên sự phân bố của chất tan giữa dung môi tự do và dung môi nằm trong các hốc của các vật xốp Dung môi tự do là pha di động, còn dung môi nằm trong các hốc là pha cố định Mức độ xâm nhập của phân tử chất tan chủ yếu phụ thuộc vào kích thước và hình dạng của chúng Chất tan nào mà kích thước phân tử lớn hơn kích thước lỗ của rây phân tử thì không thể xâm nhập vào các hốc, chúng chỉ có thể khuếch tán vào kẽ hở giữa các hạt rắn, do đó chúng di chuyển ra khỏi cột nhanh hơn Còn chất tan có kích thước phân tử nhỏ hơn kích thước lỗ thì chúng có khả năng xâm nhập vào lỗ của hạt; khi pha di động đi qua, các phân tử đó đi ra khỏi lỗ và di chuyển cùng với pha

di động ra khỏi cột chậm hơn

Như vậy, trong sắc ký rây phân tử, các cấu tử được ra khỏi cột theo thứ tự giảm dần kích thước phân tử của chúng Những chất có cấu trúc không gian gần giống nhau thì thứ tự phân tách theo chiều giảm trọng lượng phân tử Điều này chỉ đúng khi hiệu ứng hấp phụ không đáng kể

3.4.2 Kỹ thuật tiến hành sắc ký rây phân tử:

Thiết bị dùng trong sắc ký rây phân tử thực tế không khác các dạng sắc ký lỏng khác Có thể sử dụng các cột sắc ký thông thường Có thể dùng các cột thuỷ tinh kích thước khác nhau, dài từ 20 - 200 cm, đường kính từ 5 - 50 mm Nạp chất hấp phụ vào cột phải đồng đều, muốn vậy phải dùng các hạt hình cầu cùng kích thước

Lượng mẫu cho vào không được quá tải năng của cột Chú ý khi đưa mẫu polymer đặc vào cột, độ nhớt cao sẽ làm giảm tốc độ dòng

3.4.3 Ứng dụng của sắc ký rây phân tử:

Sắc ký rây phân tử được sử dụng để tách các hợp chất cao phân tử cũng như các chất có phân tử lượng nhỏ Sắc ký rây phân tử có thể dùng để xác định phân tử nhanh chóng đối với tất cả các polymer có thể tan được trong dung môi nào đó Các rây phân tử có kích thước lỗ gần bằng 5A0 thì hấp thụ được các hydrocacbon mạch thẳng, còn các hydrocarbon mạch nhánh không bị hấp phụ Sử dụng tính chất

đó người ta có thể tách rời hỗn hợp các hydrocarbon như hỗn hợp octan và isooctan

3.5 Sắc ký trao đổi ion:

3.5.1 Định nghĩa và phân loại ionit:

Những chất có khả năng trao đổi ion gọi là ionit Ionit là những đại phân tử acid hoặc base không tan trong nước và các loại dung môi, chúng chứa trên mạng lưới những ion linh động có khả năng trao đổi theo đương lượng và thuận nghịch

với các ion cùng dấu trong dung dịch chất điện ly khi tiếp xúc (hình 12) Ionit có

thể ở dạng rắn hay dạng lỏng

Dựa vào dấu điện tích của ion trao đổi, người ta phân chia thành cationit, anionit hay ionit lưỡng tính

Hình 12: Các ionit a) Trạng thái ban đầu; b) Trạng thái tiếp xúc

Khi ion trao đổi (gọi là ion linh động) mang điện tích dương (ion cố định của mạng lưới không mang điện tích âm), ionit tương ứng là cationit, chúng có công thức chung là HR, NaR, CaR2, MgR2

Phản ứng trao đổi của cationit như sau:

2NaR + CaCl R 2 Ca + 2 NaCl

3.5.2 Kỹ thuật sắc ký trao đổi ion:

3.5.2.1 Chọn cột trao đổi ion:

Cột chứa ionit dùng trong phòng thí nghiệm là các

cột thuỷ tinh hoặc thuỷ tinh hữu cơ có kích thước khác

nhau Phần dưới của cột để bông thuỷ tinh (3 - 10 mm) để

đỡ cho ionit không rơi xuống Phía trên cùng của cột để

hở hoặc đóng bằng phễu nhỏ giọt (hình 13), hoặc bằng

dụng cụ đặc biệt để dẫn dung dịch rửa

Ionit sau khi được ngâm trong nước, rót vào cột cùng

với nước để tránh bọt khí lẫn trong ionit Lượng ionit chỉ

cho khoảng 2/3 thể tích cột Trên lớp ionit nên để lớp

bông thuỷ tinh dày 3 - 5 mm và 1 lớp bi thuỷ tinh dày 1

- 2 cm để giữ cho ionit khỏi bị xáo trộn khi rót dung dịch

vào

3.5.2.2 Các giai đoạn của trao đổi ion:

+ Giai đoạn 1: hấp phụ ion của dung dịch phân tích

trên cột ionit

Để giữ toàn bộ ion trong dung dịch phân tích cần sử

dụng 1 lượng ionit lớn hơn lượng tính toán Nếu sử dụng cationit acid yếu dạng

RH hay anionit base yếu dạng ROH thì dung dịch chảy qua lớp ionit sẽ mang tính acid hay base, làm thay đổi pH của dung dịch, dẫn đến sự thay đổi giá trị trao đổi năng của ionit

+ Giai đoạn 2: giải hấp ion bị hấp thu trên ionit Trong giai đoạn này ion bị hấp thu được tách ra khỏi ionit bằng những dung dịch thích hợp như bằng acid có nồng

độ khác nhau, hoặc 1 số chất hữu cơ có khả năng tạo phức với ion cần tách + Giai đoạn 3: rửa ionit sau khi giải hấp; rửa ionit bằng các dung dịch thích hợp để đuổi hết dung dịch giải hấp còn nằm lại giữa kẽ hở của các hạt ionit

Hình 13:

Các loại cột trao đổi ion

+ Giai đoạn 4: tái sinh ionit Giai đoạn này đưa ionit về dạng ban đầu (RH,

ROH ) bằng cách cho chảy qua cột cationit dung dịch HCl 2 - 4%, qua cột anionit

+ Giai đoạn 5: rửa ionit đã được tái sinh: Rửa bằng nước cất để đuổi hết dung

dịch tái sinh còn nằm lại trong cột

3.5.2.3 Ứng dụng của sắc ký trao đổi ion:

+ Khử độ cứng của nước: độ cứng của nước là các loại muối tan của canxi và

magiê tạo thành Có thể khử độ cứng của nước bằng phương pháp trao đổi ion, sử

dụng cationit dạng RH hoặc RNa

2 RH + Ca(HCO 3 ) 2 = CaR 2 + 2 H 2 O + 2CO 2

2 RH + Mg(HCO 3 ) 2 = MgR2 + 2 H 2 O + 2CO 2

2 RH + CaCl 2 = CaR 2 + 2 HCl

2 RH + MgCl 2 = MgR 2 + 2 HCl + Khử độ khoáng của nước: là loại hoàn toàn cation và anion có trong nước

có thể bằng sắc ký trao đổi ion Cation trong nước bị hấp thụ trên cationit acid

mạnh

+ Tinh chế thuốc thử hoá học: có thể loại sắt ra khỏi acid chlohydric, tinh chế

chất không điện ly ra khỏi chất điện ly (như tinh chế glucose, glycerol khỏi các tạp

+ Làm giàu các nguyên tố vi lượng: bằng phương pháp trao đổi ion người ta

dễ dàng làm giàu các nguyên tố vi lượng (nguyên tố vết), vì ionit có khả năng trao

đổi với nguyên tố có một lượng nhỏ trong dung dịch như Cu2+ trong nước khi qua

cột cationit acid mạnh

2 RH + Cu 2+ = CuR 2 + 2 H +

3.6 Sắc ký khí:

Ngày nay sắc ký khí đã trở thành một trong những phương pháp sắc ký quan

trọng nhất để phân tách, xác định cấu trúc, nghiên cứu các thông số hóa, lý như:

hệ số hoạt độ, entanpi, nhiệt hóa hơi, hệ số khuyếch tán phân tử, động học xúc

tác Sắc ký khí được coi là phương tiện đầu tay của các nhà hóa học, đặc biệt là

các nhà hóa học hữu cơ

3.6.1 Nguyên lý hoạt động của sắc ký khí:

Mẫu phân tích sau khi được hóa hơi, nhờ có khí mang được chứa trong bom

Khi mẫu đi vào cột tách, chúng nhanh chóng phân bố vào 2 pha: pha lỏng là pha

cố định và pha khí là pha di động Do các chất trong hỗn hợp có hệ số phân bố khác nhau vào 2 pha cho nên chúng di chuyển với tốc độ khác nhau Sau khi các cấu tử rời khỏi cột tách tại các thời điểm khác nhau, các cấu tử này lần lượt đi vào detector, tại đó chúng được chuyển thành tín hiệu điện Tín hiệu này được khuếch đại rồi được chuyển sang bộ phận ghi (loại máy đơn giản thường dùng) hoặc chuyển sang phân tích kế có máy tính, các tín hiệu được xử lý ở đó và chuyển sang

bộ phận in kết quả (loại máy hiện đại) Thiết bị máy sắc ký được mô tả trên hình

14

Hình 14: Sơ đồ máy sắc ký khí

Tư liệu của quá trình sắc ký chính là sắc đồ Mỗi một đỉnh (pic) của sắc đồ ứng với một hoặc một nhóm cấu tử của hỗn hợp cần phân tách

3.6.2 Các loại khí sử dụng trong sắc ký khí:

Các khí thường được sử dụng trong sắc ký khí là khí argon, heli, nitơ, hydro Khi chọn khí mang cần chú ý đến detector sử dụng, độ tinh khiết và yêu cầu tách Khí mang được dùng phải không được thay đổi trạng thái lý, hóa khi đi qua máy sắc ký

+ Khí hydro thương mại thường đạt đủ tiêu chuẩn cho sắc ký khí Khi sử dụng khí hydro làm khí mang cần dùng khí nitơ làm khí bảo vệ thổi qua cột tách trước Khí hydro dùng cho các cột tách làm việc ở dưới 200oC

+ Khí heli là khí trơ về hóa học cho nên rất thích hợp cho sắc ký khí ở nhiệt độ cao Khi sử dụng detector ion hóa bằng tia phóng xạ phải sử dụng heli tinh khiết + Khí argon, cũng như các khí trơ khác không có hoạt tính hóa học, được dùng cho sắc ký ở nhiệt độ cao và ngày càng được sử dụng nhiều làm khí mang

+ Khí nitơ do không nguy hiểm, giá rẻ và dễ làm tinh khiết nên khí nitơ được

sử dụng rất nhiều trong sắc ký khí

3.6.3 Pha cố định:

Trong sắc ký khí-lỏng, pha cố định đóng vai trò chính trong việc tạo nên tương tác cần thiết để các cấu tử được tách khỏi nhau Chất lỏng (pha cố định) không được phản ứng không thuận với khí mang, với chất mang rắn và với các cấu tử cần phân tách

Không có qui tắc vạn năng nào để chọn pha cố định thích hợp với điều kiện tối

ưu nhất Hiện nay đã có gần 700 pha cố định được sử dụng Điều quan trọng là phải biết kết hợp một số qui tắc cơ bản với kinh nghiệm Có một nguyên tắc cơ bản cho việc lựa chọn pha cố định là: các chất giống nhau thì hòa tan tốt vào nhau

Ví dụ, để tách alcol phải chọn các pha lỏng phân cực, ngược lại để tách hydrocarbon no mạch thẳng phải dùng các pha lỏng không phân cực

3.6.4 Các chất mang:

Người ta thường sử dụng đất diatomit làm chất mang Nung loại chất này với CaCO3 ở 9000C người ta thu được chất bột có diện tích bề mặt khoảng 1-4 m2/g Thành phần chủ yếu là SiO2 và một ít Al2O3; ngoài ra còn chứa một số ít oxyt kim loại kiềm và kiềm thổ Sau khi xử lý loại đất này bằng các phương pháp khác nhau người ta được các loại chất mang có đặc tính khác nhau và đem tẩm pha cố định Trong quá trình tẩm, bề mặt ngoài và trong của chất mang được phủ đầy bởi pha

cố định

3.7 Sắc ký trên giấy:

Đầu tiên, sắc ký trên giấy chỉ dùng để phân tách các aminoacid, nhưng sau đó

đã được phát triển và trở thành một trong những phương pháp phổ biến nhất trong hóa sinh và trong hóa học nói chung

3.7.1 Nguyên tắc của phương pháp sắc ký trên giấy:

Hiện tượng hóa lý xảy ra trong sắc ký trên giấy cũng tương tự như trong sắc

ký phân bố nói chung, tức là dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất giữa 2 pha: pha cố định thường dùng là nước được giữ ở trên giấy sắc ký (ở khí quyển bão hòa hơi nước, giấy có thể giữ tới 15 - 22% nước tính theo trọng lượng giấy); pha di động thường là một dung môi hữu cơ bão hòa nước Dung môi hữu cơ di chuyển trên tờ giấy sắc ký theo mao dẫn Giấy đóng vai trò là giá tựa cho dung môi cố định (pha cố định)

Trong những điều kiện nhất định (dung môi, nhiệt độ ) mỗi chất được đặc trưng bởi một trị số nhất định gọi là hệ số Rf:

Rf = A/B

A : là khoảng cách di chuyển của chất phân tách

B : là khoảng cách di chuyển của dung môi

Có sự tương quan chặt chẽ giữa Rf và hệ số phân bố của chúng trong 2 pha dung môi Chất nào càng ít tan trong pha cố định (nước) và tan nhiều trong pha di động (dung môi hữu cơ) thì tốc độ di chuyển càng nhanh, có nghĩa là Rf lớn Ngược lại, chất nào càng tan nhiều trong pha cố định và tan ít trong pha di động thì tốc độ

di chuyển càng chậm, Rf càng nhỏ

3.7.2 Các bước chuẩn bị trong sắc ký giấy:

+ Chuẩn bị mẫu phân tích:

- Mẫu phân tích nào có chất cần phân tích có nồng độ cao và có cách hiện màu nhạy thì có thể cho chạy sắc ký ngay không cần chuẩn bị gì trước

- Mẫu phân tích nào có nồng độ chất phân tích loãng hoặc có các tạp chất mà ảnh hưởng đến việc tách và hiện màu thì phải cô đặc mẫu và loại bỏ các yếu tố ảnh hưởng bằng hút chân không, bằng thẩm tích, kết tủa bằng nhiệt, bằng dung môi hữu cơ

+ Chọn giấy sắc ký:

Yêu cầu về giấy như sau: giấy phải tinh khiết, trung tính về hóa học, đồng nhất về

tỷ trọng Thông thường dùng các loại giấy Whatman số 1, hoặc Schleicher-Schull

2043 a và b

Để tách tốt cần chú ý hướng sợi giấy trùng với hướng chuyển động của dung môi Các loại giấy thường ưa nước, do đó nếu dùng nước làm pha cố định thì không cần phải làm ẩm Nếu để tách hỗn hợp các chất hữu cơ không tan trong nước, cần chuyển giấy từ ưa nước thành kỵ nước bằng cách tẩm các chất kỵ nước khác nhau

và acetyl hoá

+ Chọn dung môi:

Chọn dung môi làm pha cố định và pha di động là yếu tố quan trọng nhất để tách các chất trong sắc ký giấy Dung môi di động thường là hỗn hợp của một dung môi hữu cơ chính và nước; có thể thêm một số thành phần khác như acid hay base

để làm tăng hay giảm độ hòa tan của một số chất Nếu tan nhiều quá trong dung môi di động, chất tan sẽ chuyển động theo tuyến dung môi; nếu tan ít quá, chất phân tách sẽ gần như không di chuyển và dừng ở ngay vị trí xuất phát Trong sắc

ký aminoacid trên giấy hỗn hợp, dung môi thích hợp nhất là: butanol-acid nước với tỷ lệ 4:1:5

acetic-3.7.3 Kỹ thuật chạy sắc ký:

Trong sắc ký giấy có thể tiến hành sắc ký một chiều đi lên hoặc đi xuống, sắc

ký hai chiều hoặc sắc ký vòng nằm ngang Kỹ thuật chạy sắc ký gồm các bước sau: + Chấm mẫu thử:

Vị trí chấm mẫu thử được đánh dấu trước bằng bút chì, nơi chấm tuỳ thuộc vào kiểu sắc ký và kích thước bình sắc ký Giữa các vết chấm phải cách nhau 2,5-3

cm để tránh chập vào nhau khi hiện hình Vết chấm phải tròn và nhỏ (đường kính tối đa là 10 mm), hoặc có thể chấm thành vạch ngang

Lượng mẫu thử cần chấm tuỳ thuộc vào độ nhậy của thuốc hiện hình Ví dụ, với aminoacid mỗi loại cần 5-10 mg, các đường đơn cần 5-50 mg cho mỗi chất Dùng các pipet vi lượng như loại dùng trong huyết học để chấm Khi chấm dùng máy sấy tóc để sấy khô mỗi lần chấm Tốt nhất là làm trên tủ chuẩn bị sắc ký + Chạy sắc ký:

Trong sắc ký một chiều đi lên, dung môi di động đặt ở đáy bình sắc ký Đầu tờ giấy có chấm mẫu thử nhúng vào dung môi di động sao cho các vết chấm cách mặt dung môi khoảng 2 cm

Trong sắc ký một chiều đi xuống, dung môi di động chứa trong máng được treo ở phía trên của bình sắc ký Đầu giấy có chấm mẫu nhúng vào dung môi di động và vắt qua một đũa thuỷ tinh nằm ngang, dùng đũa thuỷ tinh to khác để chặn

tờ giấy cho khỏi tụt xuống

Trong trường hợp sắc ký 2 chiều, chấm mẫu thử vào một góc tờ giấy vuông cách mỗi bờ vài cm Chạy với dung môi 1 Sau đó lấy tờ giấy ra phơi khô rồi cho chạy với dung môi 2 (có thành phần khác với dung môi 1), chiều chạy của dung môi này thẳng góc với dung môi 1 Sắc ký 2 chiều cho phép tách được các chất có cấu tạo hóa học gần giống nhau tức là có Rf rất gần nhau

Để đảm bảo bão hòa dung môi trong bình, bình sắc ký phải có nắp đậy thật kín,

có thể để trong bình sắc ký cốc đựng nước đã bão hòa dung môi di động để đảm bảo độ ẩm của giấy

Thời gian chạy tuỳ thuộc vào kích thước của giấy, khi nào dung môi di động

di chuyển đến gần hết tờ giấy thì lấy ra đánh dấu bằng bút chì vị trí tiền tuyến của dung môi Đem sấy khô tờ giấy và làm hiện hình

+ Hiện hình các vết:

Sắc ký đồ sau khi chạy xong lấy ra phơi khô cho bay hết dung môi ở nhiệt độ thường hoặc ở 800C Nếu dung môi là phenol phải để khô ở nhiệt độ phòng để tránh phá huỷ các chất

Hiện hình có thể bằng phương pháp lý hoặc hóa học Ví dụ, chất phân tách có thể phát huỳnh quang khi chiếu vào ánh sáng tử ngoại (thường dùng bước sóng 254-370 nm) Nhưng phổ biến nhất vẫn là hiện hình bằng các thuốc thử hóa học thích hợp Thuốc thử này được phun đều đủ làm ẩm tờ giấy sắc ký, không phun nhiều quá làm ướt sũng tờ giấy Hoặc tráng nhanh vào thuốc thử hiện màu Trong trường hợp sắc ký aminoacid, khi phun thuốc thử ninhydrin xong thường phải sấy khô ở 80-1000C

+ Phương pháp xác định các chất:

Có thể xác định các chất bằng các phương pháp sau:

- Căn cứ vào hệ số Rf để xác định vị trí của từng chất cần phân tách Tuy nhiên, cùng một hệ dung môi Rf có thể bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như là: độ dày, độ xốp, độ tinh khiết của giấy và nhiệt độ cũng ảnh hưởng đến sự phân bố giữa 2 pha Các tạp chất và tỷ lệ các chất trong hỗn hợp dung môi cũng làm thay đổi Rf Cho nên phương pháp này ít được dùng

- Thông thường và chính xác là dùng các chất chuẩn Các mẫu chuẩn có thể chấm bên cạnh mẫu thử hoặc có thể trộn ngay vào mẫu thử Đối với mẫu thử mà chưa loại hết tạp chất thì việc trộn lẫn mẫu chuẩn vào mẫu thử là rất cần thiết vì Rf

có thể bị ảnh hưởng bởi các tạp chất nên sẽ gây nhầm lẫn chất nọ với chất kia + Phương pháp định lượng các chất trong sắc ký đồ:

- Phương pháp làm thôi màu các vết bằng dung môi thích hợp rồi đo màu là phương pháp thông dụng và chính xác hơn cả Cắt các vết màu thành từng phần riêng biệt, nếu vết nào có diện tích lớn thì cắt nhỏ tiếp Cho các mẫu cắt này vào từng ống nghiệm đã chứa dung môi thôi màu, thỉnh thoảng lắc cho thôi hết màu khỏi giấy sau đó đem đo màu trên quang kế Đối chiếu với mẫu chuẩn cùng cho chạy sắc ký như trên để tính kết quả

Có trường hợp phải chiết rút các chất ra khỏi giấy để đảm bảo tính nguyên vẹn

về cấu trúc hóa học, không được nhuộm bằng thuốc hiện màu như trong trường hợp chiết rút để đo hoạt tính sinh học Phương pháp này được làm như sau: trên cùng một tờ giấy sắc ký cho chạy song song ở 2 đầu 2 vết mẫu chuẩn và mẫu thử, một vết mẫu thử nữa ở giữa Sau khi chạy sắc ký, cắt dọc 2 băng nhỏ ở 2 bên đem hiện hình Để xác định vị trí các vết cần tìm, dùng 2 băng đã lên màu làm chuẩn

để cắt ngang băng có chứa chất nghiên cứu Cho các mảnh giấy có chứa chất nghiên cứu vào các ống nghiệm có chứa dung môi chiết rút, thỉnh thoảng lắc Sau đó loại giấy đi Nếu cần thiết chiết rút 1 lần nữa bằng một ít dung môi trên

3.8 Sắc ký lớp mỏng:

Sắc ký lớp mỏng là một phương pháp cải biên của sắc ký trên cột và sắc ký trên giấy Sắc ký lớp mỏng có một số ưu điểm như sau:

+ Chỉ cần dùng một lượng rất ít mẫu thử

+ Khả năng phân tách tốt hơn sắc ký giấy

+ Thời gian rất nhanh chỉ cần 20-30 phút là đã nhận được kết quả

+ Có thể dùng để phân tách các chất kỵ nước như là lipid

+ Có thể dùng thuốc hiện màu acid hay base mạnh ở nhiệt độ cao (100-2000C) Tuy nhiên, sắc ký lớp mỏng khó bảo quản sắc ký đồ và độ lặp lại của hệ số Rf của các chất rất khó thực hiện

3.8.1 Nguyên tắc của sắc ký lớp mỏng:

Là dựa trên sự phân bố của các chất giữa 2 pha: pha cố định là chất hấp phụ được rải rộng trên phiến kính tạo thành một lớp mỏng và pha di động là một dung môi thích hợp Khi dung môi di chuyển sẽ làm chuyển dịch các thành phần trong mẫu thử Sau khi dung môi chạy xong, để bay hơi hết dung môi trên sắc ký đồ rồi hiện màu như trong sắc ký giấy Nói chung, lý thuyết của sắc ký lớp mỏng là một phần dựa trên lý thuyết của sắc ký hấp phụ và một phần dựa trên lý thuyết sắc ký giấy

3.8.2 Các bước chuẩn bị sắc ký lớp mỏng:

+ Chọn chất hấp phụ: cũng tương tự như sắc ký cột có thể dùng các chất hấp phụ là silicagel, nhôm oxyt, bột cellulose, tinh bột, sephadex

Để cho chất hấp phụ bám chắc vào phiến kính, người ta cho thêm chất dính vào chất hấp phụ Chất dính thường là CaSO4 với tỷ lệ khoảng 10%

+ Chuẩn bị phiến kính và lớp mỏng chất hấp phụ trên kính:

Các phiến kính thường có cỡ 20  5 cm, 20  20 cm, 7,5  2,6 cm Rửa sạch, sấy khô trước khi rải Cân 5 g bột silicagel cho vào cối nghiền đều với 10 ml nước cất, lượng này có thể rải trên 2 phiến kính cỡ 20  5 cm Sau đó rải ngay lên phiến kính bằng tay hoặc bằng máy Để khô ở nhiệt độ phòng sau đó sấy ở 1000Ctừ 30

- 120 phút tuỳ theo yêu cầu Độ dày chuẩn của lớp mỏng là 0,25 - 0,30 mm + Chuẩn bị mẫu thử: cũng giống như sắc ký giấy, các mẫu thử cần có cách chuẩn bị riêng để loại bỏ tạp chất và cô đặc mẫu Dùng ống vi quản chấm mẫu

cách bờ dưới phiến kính khoảng 1 - 2 cm Vết chấm phải nhỏ, đường kính 2 - 5

Khi dung môi di chuyển lên phiến kính sắc ký lớp mỏng được 10 - 11 cm thì lấy

ra, đánh dấu tiền tuyến dung môi rồi để bay hơi hết dung môi ở nhiệt độ phòng Sắc ký lớp mỏng có thể chạy đi lên (thông dụng nhất), đi xuống hoặc 2 chiều như sắc ký giấy

3.8.4 Phát hiện các vết trên sắc ký đồ:

Nói chung, các phương pháp phát hiện các chất trên sắc ký lớp mỏng cũng tương tự như sắc ký giấy Phương pháp tốt nhất vẫn là nên chạy song song những chất mẫu chuẩn trên cùng phiến kính đó Việc dựa vào Rf trong sắc ký lớp mỏng còn kém tin cậy hơn sắc ký giấy

Để phát hiện các chất hữu cơ, có thể dùng hơi iod Đặt phiến kính vào bình kín trong đó để một ít tinh thể iod Sau một thời gian ngắn, nền sẽ có màu tím, còn các hợp chất chưa no sẽ không màu, các hợp chất no khác có màu nâu

Việc định lượng các chất cũng tương tự như sắc ký giấy như: đo diện tích của vết màu, đo màu bằng densitometer Cách tương đối chính xác nhất là cạo vùng sắc ký đồ có vết cần phân tích, sau đó dùng dung môi thích hợp để chiết rút rồi làm phản ứng màu

4 Hướng dẫn sử dụng một số dụng cụ phương tiện trong phòng thí nghiệm

4.1 Một số dụng cụ thường dùng trong phòng thí nghiệm:

4.1.1 Dụng cụ đo thể tích:

Gồm ống đong (eprouvete), bình cầu (ballon), bình định mức (ballon jaugé), ống hút (pipette), buret (burette)

+ Cách xác định thể tích dung dịch:

- Để mắt nằm trên cùng mặt phẳng ngang của mặt khum của dung dịch

- Đối với phần lớn dung dịch: vạch định mức phải tiếp tuyến với mặt khum lõm xuống của dung dịch

- Đối với các dung dịch màu đậm đặc: vạch định mức phải tiếp tuyến với mặt khum cong lên của dung dịch

Nếu mắt để trên hoặc dưới mặt phẳng ngang sẽ đọc sai thể tích

Hình 15: Đọc đúng (a) và đọc sai (b)

+ Ống đong, cốc đong

- Dùng để đong một thể tích dung dịch hoặc để pha dung dịch

- Thường dùng loại có dung tích 5 - 10 - 20 - 30 - 50 - 100 - 125 - 250 - 500 -1000 ml

- Chia vạch 1ml đối với loại nhỏ; 5 - 10 - 100 ml đối với loại to

- Thường chỉ có dung tích toàn phần của ống đong là đúng

- Không dùng loại quá lớn để đo một thể tích nhỏ Đong 5 ml nên dùng loại 10ml hoặc 15 ml là cùng

- Không đun, không nghiền chất rắn bằng ống đong, cốc đong

+ Bình định mức

- Có các loại 5 - 10 - 25 - 50 - 100 - 250 - 500 - 1000 ml

- Có loại đáy tròn hoặc đáy phẳng

- Có cổ nhỏ so với phần thân (bầu) phình rộng, có nút mài

- Trên cổ có một vạch định mức để chỉ đúng thể tích của dung dịch ứng với vạch đó Có loại còn có thêm một vạch phụ để pha loãng nhanh chóng như 50 và

55 ml, 100 và 110 ml

- Cách dùng:

Cầm cổ bình, không cầm bầu để tránh làm thay đổi nhiệt độ của bình

Dùng phễu rót dung dịch vào bình gần đến vạch (cách vạch 1 - 2 cm)

Dùng ống hút nhỏ thêm từng giọt dung dịch cho đến vạch định mức

Không để dung dịch lâu trong bình, không đun nóng, không đong dung dịch phát nhiệt khi hoà tan mà phải để nguội rồi mới đong

Hình 16: Ống đong (a), bình định mức (b) và cốc đong (c)

Thường dùng các dung tích : 0,01 - 0,02 - 0,05 - 0,1 - 0,2 - 0,5 - 1 - 2 - 5 - 10 ml

Có 2 loại:

Loại thả hết: hút dung dịch đến vạch định mức và thả hết (không thổi)

Loại không thả hết: hút dung dịch đến vạch định mức và thả đến vạch dưới (không thả hết)

Ống hút định mức:

Để đo đúng thể tích của dung dịch

Có 2 loại:

Hình 17: Ống hút thả hết và không thả hết (a), 1 vạch và 2 vạch (b)

Loại có 1 vạch: hút dung dịch đến vạch, để thẳng đứng, dựa vào thành bình chứa, mở cho dung dịch chảy đến hết, không thổi Không được làm gãy đầu nhọn của ống hút

Loại có 2 vạch: hút đến vạch trên, mở cho dung dịch chảy từ từ đến vạch dưới thì dừng lại

Khi dùng ống hút cần thực hiện 3 đúng:

Đúng thuốc thử: pipette nào thuốc thử ấy

Đúng lượng: chọn ống hút thích hợp với lượng dung dịch cần lấy

Đúng qui cách sử dụng

- Ống hút tự động

Để lấy chính xác một lượng nhỏ dung dịch

Có cấu tạo tương tự như bơm tiêm có lò xo để đẩy kéo piston Đầu trên có các

bộ phận điều chỉnh Phần thân dài, đầu dưới có cổ để lắp với đầu hút (tip) thích hợp, có thể tháo ra thay thế dễ dàng

Có 2 loại:

Loại có thể tích cố định (10, 20, 50 100, 200, 500, 1000 l ): Đầu trên chỉ có nấc hút (1) và nấc xả (2), có số chỉ thể tích Những ống hút có dung tích dưới 100

l thì có tip màu vàng, trên 100 l thì có tip màu xanh

Loại có thể tích thay đổi (từ 5 - 200

l ): Đầu trên, ngoài 2 nấc hút (1) và xả

Có đáy tròn hoặc vuông

Có loại thường (không chia độ) và loại chia độ

Plston với Núm điều chỉnh nấc hút và xả thể tích

nẫy xả đầu típ Thân Rãnh hiện số

Đầu típ

Hình 18:

Ống hút tự động có thể tích thay đổi

Có loại có nút (cao su hoặc nút mài) và không nút

Có loại chuyên dụng (barcode)

Được đặt trên giá thích hợp (giá ống nghiệm)

Khi dùng: không đổ đầy quá 2/3 chiều cao ống

Cầm ống nghiệm bằng ngón 1, 2 và 3 tay trái (như cầm bút viết) ở 1/3 trên Trộn đều dịch trong ống nghiệm bằng cách:

Quay tròn cổ tay trái

Dùng ngón 2 (ngón trỏ) tay phải đập nhẹ vào phần dưới ống nghiệm

Đập nhẹ đáy ống nghiệm vào lòng bàn tay phải: khi mặt ngoài ống nghiệm khô, sạch

Khuấy bằng que thuỷ tinh nhỏ

Văn ống nghiệm giữa 2 lòng bàn tay: khi tránh sủi bọt

+ Burette

Cho biết thể tích dung dịch đã nhỏ ra, thường dùng để chuẩn độ

Có các loại 1 - 5 - 10 - 15 ml chia vạch 1/20 ml, loại 20 - 25 ml chia vạch 1/10ml

Có loại không có khoá (được nối với ống cao su có bi thuỷ tinh hoặc kẹp Mohr

để điều chỉnh) và loại có khoá nút mài

Khi dùng: cho dung dịch vào burette từ từ, tránh bọt, cao hơn vạch 0 từ 3-4

cm, mở khoá để về 0 Mở khoá bằng tay trái, cho dung dịch chảy từ từ, không cho chảy quá nhanh, tránh sai kết quả Ghi số ml đã dùng

Hình 19: Buret và giá

4.1.2 Một số dụng cụ khác:

+ Bình cầu:

Thường dùng loại thể tích 1/2 - 1l

Có loại đáy phẳng và đáy tròn, có cổ ngắn hoặc dài

Đáy phẳng: để pha dung dịch, đun nóng, đựng nước cất

Đáy tròn: để cất, đun sôi Khi đun: cặp cổ bình trên giá đỡ, đặt trên lưới amiang Đun xong, đặt bình trên lưới amiang cho đến khi nguội mới tháo bình, không đặt ngay trên bàn

+ Bình nón:

Còn gọi là bình tam giác, chủ yếu dùng để chuẩn độ

Có loại không nút và có nút mài

Có thể đun trực tiếp (loại dày, chịu nhiệt) hoặc đun trên lưới amiang (loại mỏng, không chịu nhiệt)

Khi cần trộn đều dịch chứa: cầm cổ bình và quay tròn

(a) (b)

Hình 20: Các loại bình chứa a): Bình cầu đáy tròn và đáy bằng; b): Bình nón không nút và có nút

+ Cốc thuỷ tinh

- Cốc có mỏ:

Có nhiều loại 25 - 50 - 100 - 250 - 500 - 100 ml

Có loại chia độ hoặc không

Có loại chịu nhiệt (dày, đun được) và không (mỏng, phải đun qua lưới amiang) Dùng để: rót chất lỏng, để hoà tan, rửa tủa, cân hoá chất

Được đặt trên giá có vòng đỡ hoặc cắm vào bình hứng

Rót dung dịch vào phễu qua que thuỷ tinh

Không đổ dung dịch quá đầy (cách miệng 10 - 15 mm)

Khi lọc: dàn giấy lọc cắt sẵn sao cho kín hết bề mặt trong của phễu để tăng tốc

đọ lọc Lọc lấy tủa: dùng giấy không gấp nếp, Lọc lấy dịch: dùng giấy gấp nếp

Để tách riêng các lớp dung dịch, như trong chuẩn bị dung môi sắc ký

Gồm một bầu, đầu trên có nút mài, đầu dưới có khoá để gạn

Cho hỗn dịch vào bình, lắc rồi để yên cho tạo lớp phân cách

Mở khoá và hứng lấy lớp dịch phía dưới

+ Bình kết tinh

Để kết tinh, làm bốc hơi, ngâm rửa tiêu bản, nhuộm tiêu bản

Dáng thấp, có đáy phẳng, mặt đáy rộng,

+ Bình rửa

Để rửa tủa, tách tủa ra khỏi bình đựng, giấy lọc, rửa cóng đo

Có 2 ống thuỷ tinh xuyên qua nút cao su, một ống để thổi, một ống để rửa Không đun khi còn đậy nút Muốn đun, phải bỏ nút ra

+ Bình Bunsen

Để lọc dưới áp suất giảm, có một vòi ra

Phễu lọc (Busne) được cắm xuyên qua nút bình Nối vòi ra của bình với một nhánh của bình 2 nhánh, nhánh kia nối với máy hút chân không

Nắp bôi vaselin Mở nắp bằng cách rê sang bên và để ngửa

Đáy bình để chất hút ẩm: silicagen, CaCl2, H2SO4…

Ngăn trên để chất cần làm khô

+ Ống sinh hàn

Để ngưng tụ hoặc làm lạnh

Gồm ống ngoài: cho nước đi qua để làm lạnh, ống trong thường xoắn ruột gà

để cho hơi đi qua

Có loại sinh hàn thẳng và sinh hàn ngược

Khi két bẩn: rửa ống ngoài bằng acid 10%, rồi rửa lại bằng nước cất

+ Cối chày sứ, bát sứ

- Cối chày sứ: để tán nghiền hoá chất hoặc tổ chức của động vật thí nghiệm

- Bát sứ: để đun khô, cô khô, đun chảy (parafin)

Chọn ống hút và chai thuốc thử cần lấy tương ứng

Cầm ống hút bằng các ngón 1, 3, 4 tay phải, nếu cần thì đỡ thêm bằng ngón 5; ngón 2 (ngón trỏ) tự do để sẵn sàng bịt mở đầu trên của ống hút

Cầm quả bóp bằng các ngón 2, 3, 4, 5 tay trái; ngón 1 (ngón cái) tự do (để bịt đầu van nếu quả bóp có van một chiều)

Cắm đầu dưới (nhọn) của ống hút thẳng đứng và gần sát xuống đáy chai thuốc thử

Dùng sức bóp của các ngón tay và lòng bàn tay trái bóp để đẩy hơi trong quả bóp ra Cắm thẳng đứng đầu nhọn của quả bóp vào đầu trên ống hút sao cho khít

Mở quả bóp ở tay trái từ từ để hút thuốc thử vào ống hút và quan sát Khi thuốc thử vượt qua vạch 0 thì nhanh chóng rút quả bóp ra theo phương thẳng đứng, khi đầu nhọn của quả bóp ra khỏi đầu trên cuả ống hút thì nhanh chóng đưa sang ngang Nhanh chóng bịt đầu ống hút bằng ngón 2 tay phải Chỉnh cho thuốc thử về đúng vạch 0

- Tay trái cầm ống nghiệm Tay phải để ống hút thẳng đứng, mở ngón 2 tay trái từ từ để thuốc thử chảy vào ống nghiệm khi tới vạch định mức thì bịt lại Để nguyên tay, thả hết thuốc thử dư trong ống hút vào chai đựng Đặt ống nghiệm và ống hút vào đúng vị trí trên giá

Cho chảy từ từ theo thành ống: để nghiêng ống nghiệm một góc 30 - 45o, cắm thẳng đầu ống hút vào thành ống, mở ngón 1 từ từ để dung dịch chảy theo thành ống xuống dưới Thao tác này để tạo bề mặt phân cách giữa 2 lớp dung dịch + Bằng ống hút tự động

- Lắp đầu tip thích hợp vào đầu dưới ống hút sao cho khít

- Cầm ống hút tự động bằng các ngón 2, 3, 4, 5 tay phải; ngón 1 tự do để nhấn thả các nấc hút (1) và nấc xả (2) giống như tư thế cầm dao găm

- Đặt thể tích hút:

Đối với ống hút có thể tích thay đổi: vặn núm điều chỉnh thể tích ở đầu trên theo chiều ngược kim đồng hồ cho đến khi hiện đúng thể tích mong muốn ở rãnh hiện số trên thân ống hút

Đối với ống hút có thể tích cố định: không thực hiện bước này

Dùng ngón 1 tay phải nhấn piston đến nấc hút (1) và giữ nguyên tư thế

Để ống hút thẳng đứng, cắm đầu tip của ống hút ngập xuống dưới bề mặt dung dịch khoảng 2 - 3 mm

Mở ngón 1 từ từ đến hết để cho dung dịch được hút vào đầu tip theo áp lực âm, tránh mở quá nhanh vì khi hút dễ tạo bọt

Rút cẩn thận ống hút ra, chạm nhẹ đầu tip vào thành bình chứa để loại bỏ dịch thừa bám ở mặt ngoài đầu tip (cũng có thể lau bằng gạc hoặc giấy thấm)

Cắm thẳng ống hút vào trong ống nghiệm, cách bề mặt dung dịch (nếu có) khoảng vài cm, nhấn nấc 1 (hút) từ từ cho dịch chảy ra, dừng một vài giây, nhấn tiếp nấc 2 (xả), dừng một vài giây cho dịch ra hết, giữ nguyên tư thế, rút ống hút ra